СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА АКТИВНОСТЬ СКВАЛЕНДЕГИДРОГЕНАЗЫ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗАХ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ВВЕДЕНИИ В ИНКУБАЦИОННЫЙ РАСТВОР СОДЕРЖИМОГО ГЕРПЕСНЫХ ПУЗЫРЬКОВ БЕРЕМЕННОЙ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Цель работы - представить способ прямого действия вируса герпеса на синтез холестерина в плаценте путем определения гистохимическим методом активности сквалендегидрогеназы, принимающей участие в формировании сквалена - ключевого продукта синтеза холестерина.

Синтез холестерина проходит много последовательных этапов [1, 2, 3, 5]. Однако ключевыми этапами принято считать синтез мевалоновой кислоты, сквалена и дегидрохолестерина. После образования мевалоновой кислоты происходит ее фосфорилирование и декарбоксилирование с образованием изопентилпирофосфата, а затем фарназилпирофосфата, две молекулы которого в свою очередь конденсируются концами, несущими пирофосфатные группы и превращаются в сквален [4, 5]. Перед стадией циклизации сквален превращается, в эндоплазматическом ретикулуме, в 2, 3-оксидсквален под действием сквален-эпоксидазы [7]. Этот этап протекает с участием кислорода и фермента сквалендегидрогеназы. Сквален занимает ключевую позицию на дальнейшем пути синтеза холестерина.

Холестерин - циклический стероид, без которого невозможен синтез плацентарных гормонов во время беременности.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

1. Исследовали плаценту рожениц (15 женщин), не болевших герпес-вирусной инфекцией ни до начала беременности, ни в период беременности;

2. Материал забирали в течение 60 мин после родов и в криостате изготовляли срезы, которые помещали на предметные стекла;

3. При температуре 37°C был заготовлен инкубационный раствор следующего состава (согласно рекомендации Z.Lojda (1962; 1965):

а) 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,6 - 1 мл;

б) 2 ммоль раствора сквалена (фирмы "Ferak", Германия);

в) нитросиний тетразолий (фирма "ICN") 1 мг/мл фосфатного буфера (5 ммоль);

г) НАДФ (фирмы "Serva") 1 мг/мл фосфатного буфера (5 ммоль);

д) инкубация производилась при 37°C в течение 30 мин,

е) к инкубационному раствору добавляли содержимое из герпесных пузырьков, расположенных на слизистой гениталий беременных женщин в количестве 0,1 мл;

4. Контрольной инкубационной средой служил раствор, к которому не добавляли содержимое из герпесных пузырьков;

5. После инкубации срезы ополаскивались в дистиллированной воде и заключались в глицерин-желатину. Аналогичные операции проводились и с контрольными срезами.

В существующей литературе нет сведений, касающихся выявления активности сквалендегидрогеназы in vitro с добавлением в инкубационный раствор содержимого герпесных пузырьков, взятого у беременных;

6. После изготовления срезы просматривались под электрофотомикроскопом "Opton" (Германия), а участки срезов, как контрольных, так и опытных препаратов, фотографировали на одну пленку "Kodak color" (USA). После проявки сфотографированные участки цитофотометрировали с помощью компьютерной программы на цитофотометрической установке "Mekos" (регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/1282-01). Руководство по эксплуатации 27543786.9443 001 РЭ;

7. Титр антител к вирусу герпеса определяли в крови рожениц иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA);

8. Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН учреждения Российской академии медицинских наук. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выявления влияния герпес-вирусной инфекции на активность сквалендегидрогеназы гистохимическим методом на гистологических срезах плаценты при введении в инкубационный раствор содержимого герпесных пузырьков беременной со слизистой гениталий.

Прототипом аналогичного исследования может служить работа Довжиковой И.В. и Луценко М.Т. («Воздействие лазерного излучения на активность гистохимической реакции холестеринового обмена in vitro», журнал «Информатика и системы управления», 2009, №2 (20)). Однако эта работа существенно не сравнима с представленной заявкой по следующим показателям:

1. В ней речь идет об оценке изменения активности синтеза холестерина на заключительном его этапе - 7-дегидрохолестериндегидрогеназы, а не сквалендегидрогеназы; как разбирается в настоящей заявке;

2. Фактором воздействия на синтез холестерина в прототипе избрано действие лучей лазера, влияющих на конформацию молекулы холестерина. В представленной работе действующим началом является биологический объект - вирус герпеса, подавляющий синтез сквалендегидрогеназы, что угнетает дальнейший путь синтеза в направлении холестерина, а следовательно, и плацентарного гормонообразования, что, как общеизвестно, создает угрозу формирования фетоплацентарной недостаточности.

Активность сквалендегидрогеназы в наших исследованиях выявлялась по принципу метода, позволяющего оценить гистохимическим методом интенсивность стероидных дегидрогеназ, предложенному З.Лойда (1965).

- Реакция проходила, как предполагалось, когда в инкубационный раствор добавляется живой вирус герпеса, который может изменить активность реакции.

- Интенсивность реакции оценивалась цитофотометрически.

- В литературе не затрагивался вопрос исследования активности сквалендегидрогеназы, принимающей участие в синтезе холестерина, как предшественники плацентарных гормонов.

Причиной нарушения цепной реакции синтеза холестерина в плаценте мы избрали действие герпес-вирусной инфекции, взятой у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции различной степени агрессивности; из герпесных пузырьков слизистой гениталий.

Цитофотометрический компьютерный анализ показал, что после добавления в инкубационный раствор 0,1 мл содержимого герпесных пузырьков со слизистой гениталий беременной, перенесшей обострение герпес-вирусной инфекции с титром антител к вирусу герпеса 1:3200, интенсивность реакции на сквалендегидрогеназу в плаценте снижалась до 3,01±0,28 усл.ед. (контроль - 3,81±0,5 усл.ед.; p<0,001). Если титр антител к вирусу герпеса в крови беременной определялся 1:6400, то активность сквалендегидрогеназы на срезах плаценты уменьшалась до 2,65±0,25 усл.ед. И, наконец, при увеличении титра антител к вирусу герпеса в крови беременной до

1:12 800, активность сквалендегидрогеназы снижалась до 2,31±0,3 усл.ед. (фигура 1, 2). Полученные данные показывают, что обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности угнетающе действует на сквалендегидрогеназу и тем сильнее, чем выше титр антител к вирусу герпеса. Снижение активности скваленлегидрогеназы угнетает синтез холестерина, который крайне необходим для синтеза плацентарных стероидных гомонов, что в свою очередь создает угрозу формирования фетоплацентарной недостаточности.

На фигуре 1 изображена реакция на сквалендегидрогеназу в синцитиотрофобласте плаценты здоровой женщины через 60 мин после родов. Интенсивная реакция - 3,81±0,5 усл.ед.

На фигуре 2 изображена реакция на сквалендегидрогеназу в синцитиотрофобласте плаценты через 60 мин после родов. При выполнении реакции в инкубационный раствор добавлено 0,1 мл содержимого пузырьков герпеса G2 типа, взятых у беременной. Интенсивность реакции резко снизилась до 2,31±0,3 усл.ед.

Литература

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - 3-е изд. переработ. и доп. - М.: "Медицина", 1998. - 704 с.

2. Евстигнеева Р.П., Звонкова Г.А., Серебреннеков Г.А. Химия липидов. - М.: 1983. - 296 с.

3. Климов А.Н., Полякова Э.Д., Васильева Л.Е. - 1987. - Т.52. - в.2. - С.239-246.

4. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. - СПб. Изд-во "Питер-Пресс", 1995. - 228 с.

5. Марир М., Гренер Д., Мейес П. Биохимия человека. - М.: "Мир", 1993. - Т.1. 384 с.

6. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Перевод с английского. - М.: «Мир», 1962. - 265 с.

7. Lojda Z. Remark on histochemical detection of dehydrogeniases. Intracellular localization. Folia Morphology. - 1965. - №3. - P.84-96.

8. Viola F., Brusa P., Balliano G. Inhibition of 2, 3 oxidosqualenecyclase and sterol biosynthesis by 10-and 19 azasqulene derivatives. // Biochem. Pharmacol. - 1995. - Vol.50. - №6. - P.787-796.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для выявления влияния герпес-вирусной инфекции на активность сквалендегидрогеназы у беременных. Сущность способа: на гистологических срезах плаценты при введении в инкубационный раствор содержимого герпесных пузырьков проводят гистохимическую реакцию при температуре 37°C и осуществляют цитофотометрический анализ. Затем устанавливают, что при титре антител к вирусу герпеса 1:3200 в крови беременной, активность сквалендегидрогеназы определяется как 3,01±0,28 усл.ед.; при титре антител к вирусу герпеса 1:6400 - 2,65±0,25 усл.ед.; при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 определяется как 2,31±0,3 усл.ед. Снижения синтеза сквалена отражаются на синтезе холестерина и образований на его базе плацентарных стероидных гормонов, что становится, по общепринятым установкам, угрозой формирования фетоплацентарной недостаточности во время беременности. 2 ил.

Способ выявления влияния герпес-вирусной инфекции на активность сквалендегидрогеназы на гистологических срезах плаценты при введении в инкубационный раствор содержимого герпесных пузырьков беременной, и после проведения гистохимической реакции при температуре 37°C на гистологических препаратах, проведения цитофотометрического анализа устанавливается, что при герпес-вирусной инфекции с титром антител к вирусу герпеса 1:3200 в крови беременной активность сквалендегидрогеназы определяется как 3,01±0,28 усл. ед. (контроль - 3,81±0,5 усл. ед.; р<0,001); при титре антител к вирусу герпеса 1:6400 - 2,65±0,25 усл. ед.; при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 определяется как 2,31±0,3 усл. ед., что угнетает синтез холестерина и плацентарных стероидных гормонов, и у беременной формируется угроза фетоплацентарной недостаточности.