СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГРОЗЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ СНИЖЕНИИ ПИРУВАТА НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 

1. Цель изобретения - разработать способ оценки снижения содержания пирувата в синцитиотрофобласте плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа, позволяющего выяснить причину снижения в синцитиотрофобласте плаценты содержания пирувата в связи с обострением на третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции.

3. Раскрытие изобретения

Углеводы, жирные кислоты и аминокислоты окисляются через цикл лимонной кислоты до CO₂ и H₂O. Прежде чем эти вещества вовлекаются в заключительный этап катаболизма, их углеродная цепь превращается в двухуглеродный фрагмент в форме ацетил-КоА [1,5-7]. В этой форме углеводы, жирные кислоты и аминокислоты включаются в цикл лимонной кислоты [7]. Основным источником в этой цепи превращений в сторону образования ацетил-КоА является пировиноградная кислота (пируват), образующаяся в реакциях катаболизма глюкозы и аминокислот [1, 7]. Превращение пирувата в ацетил-КоА происходит при участии набора ферментов, объединенных под названием пируватдегидрогеназного комплекса. Окислительное декарбоксилирование пирувата происходит в матриксе митохондрий синцитиотрофобласта. Окислительное декарбоксилирование пирувата сопровождается образованием NADH⁺, поставляющим электроны в дыхательную цепь и обеспечивающим синтез 3 молей АТФ на 1 моль пирувата путем окислительного фосфорилирования [4]. Таким образом, пируват в нормальных условиях жизнедеятельности клеток можно рассматривать как основной источник восстановления начального этапа цикла Кребса, поскольку происходит восстановление ацетил-КоА и одновременно формируется основной источник энергии - АТФ. В случае нарушения этого цикла происходит подавление гликолиза и выработка продуктов энергетического обмена, что создает угрозу ферментативной системе в плаценте. Таким образом, оценка характера функционирования пируватной системы приобретает особое значение, поскольку это будет отражаться на функционировании плаценты в целом и создавать угрозу развития плода.

4. Новая техническая задача

Разрабатывается новый способ оценки функционирования плаценты с учетом работы пируватного комплекса в условиях обострения на третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции, что может отражаться на развитии плода.

5. Оценку работы пируватного комплекса проводили в плаценте при обострении во время гестации герпес-вирусной инфекции (Довжикова И.В.) [2]. В отличие от указанного прототипа в данной работе имеются существенные отличия.

1. Активность пируватного комплекса изучалась при обострении цитомегаловирусной инфекции.

2. Изменения активности пирувата изучались не на 5-6 неделях гестации, а на третьем триметре беременности.

3. Контролем, подтверждающим подавление активности пирувата, послужила оценка его Содержания в гомогенате плаценты.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 22 беременных в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ХЦМВИ) в стадии обострения на 25-26 неделях гестации и 15 беременных не болевших ЦМВИ. Диагноз обострения ХЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.2. Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0» (StatSoft Inc., США). Для определения достоверности различий использовали непарный параметрический критерий Стьюдента. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Критический уровень значимости был принят за 5% (0,05). Данные представлены как среднее арифметическое (M) ± стандартная ошибка среднего арифметического (m).

6.3. Гистохимическая реакция на выявление активности пирувата выполнялась согласно рекомендации Kuwahara, Cogan J. [3].

6.4. Определение содержания пирувата в гомогенате плаценты проводилось по методу Умбрайта [8].

7. Полученные данные

Исследования показали, что при обострении ХЦМВИ на третьем триместре гестации до титра антител к ЦМВ 1:1600 у беременной в гомогенате плаценты содержание пирувата снижалось до 0,015±0,002 ммоль/л (контроль - 0,1 ммоль/л). Одновременно на гистологических срезах после проведение гистохимической реакции, изученной под цифровым микроскопом (Япония), соединенным с компьютером по программе Scion (США) автоматически было отмечено, что содержание пируватдегидрогеназы в плаценте при обострении на третьем триместре гестации цитомегаловирусной инфекции до титра антител к ЦМВ 1:1600 снижалось до 35,0±0,95 усл. ед. (контроль - 85,0±1,2 усл. ед.) (фигура 1, 2). Снижение в синцитиотрофобласте и гомогенате плаценты пирувата при обострении цитомегаловирусной инфекции создается угроза нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на пируватдегидрогеназу в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты роженицы. Отмечается снижение активности реакции на пируватдегидрогеназу до 35,0±0,95 усл. ед. Реакция выполнена по методу Kuwahara, Cogan. Увеличение 10×100.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на пируватдегидрогеназу в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты роженицы не болевшей на всем протяжении гестации. Реакция выполнена по методу Kuwahara, Cogan. Увеличение 10×100.

Литература

1. Березов Т.Т., Коровин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина. 1998. 704 с.

2. Довжикова И.В. Активность пируватдегидрогеназы в плаценте при беременности, осложненной обострением герпетической инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2008. Вып. 28. С. 17-20.

3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир. 1969. 624 с.

4. Мари Р. Биохимия человека. М.: Мир. 1993. Т. 1. 384 с.

5. Пустовалова Л.М. Основы биохимии. Ростов-на-Дону: Феникс. 2004. 448 с.

6. Радзинский В.Е., Смалько П.Я. Биохимия плацентарной недостаточности. М.: РУДН. 2001. 273 с.

7. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. Основы биохимии. М.: Мир. 1981. Т. 1. 534 с.

8. Умбрайт Медицинские лабораторные технологии. Санкт-Петербург: Интермедика. 1999. С. 83.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для определения угрозы нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода при снижении содержания пирувата на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации. Для этого в периферической крови беременных измеряют титр антител к цитомегаловирусу, содержание пирувата в гомогенате плаценты, после чего выполняют цитофотометрический анализ выполненных гистологических срезов плаценты после проведения гистохимической реакции с последующим определением содержания пируватдегидрогеназы, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении содержания пирувата в гомогенате плаценты до 0,015±0,002 ммоль/л и пируватдегидрогеназы до 35,0±0,95 усл. ед. создается угроза нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода. Способ позволяет оценить угрозу нарушения функционирования плаценты в целом и развития плода. 2 ил.

Способ определения угрозы нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода при снижении содержания пирувата на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации, включающий измерение в периферической крови беременных титра антител к цитомегаловирусу, содержания пирувата в гомогенате плаценты, а также цитофотометрический анализ выполненных гистологических срезов плаценты после проведения гистохимической реакции с последующим определением содержания пируватдегидрогеназы, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении содержания пирувата в гомогенате плаценты до 0,015±0,002 ммоль/л и пируватдегидрогеназы до 35,0±0,95 усл.ед. создается угроза нарушения ферментативной активности в плаценте и развития плода.