СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ НИЗКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИЛОВЫХ СУЛЬФИДНЫХ ГРЯЗЕЙ Российский патент 2013 года по МПК A61K35/10 B01D11/02 C10F7/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения биологически активной субстанции - гуминовые кислоты - из специфических органических соединений низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому является способ получения препарата на основе гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей для физиотерапии (1). Данный препарат получают обработкой раствором соляной кислоты, добавлением к осадку раствора натрия гидроксида, щелочной экстракцией препарата, подкислением серной кислотой щелочного экстракта, повторной многократной щелочной экстракцией, повторным осаждением препарата серной кислотой, заливанием осадка раствором гидроксида натрия, пропусканием щелочного экстракта через колонку с катионитом и высушиванием препарата.

В известном способе (1) препарат получают из некондиционных лечебных грязей с использованием хлороводородной кислоты, которая оказывает влияние на нативную структуру препарата, вызывая деструктуризацию последнего. Учитывая ненасыщенный характер гуминовых веществ пелоидов, очевидно, что хлороводородная кислота способна присоединяться по алкеновым фрагментам, понижая восстановительные свойства соединения, и может включаться в состав конечного продукта. Присутствие хлора в биологически активной субстанции является нежелательным фактором. Недостатком данного способа (1) является использование хлороводородной кислоты, которая негативно влияет на нативную структуру органических веществ, вступая с ними в реакции присоединения и уменьшая их антиоксидантные свойства. Использование для осаждения препарата 50%-ной серной кислоты вызывает значительную декструкцию макромолекул гуминовых кислот. Кроме того, многочисленные процедуры осаждения и экстракции препарата обуславливают низкий выход конечного продукта.

Описанный способ взят за прототип.

Цель изобретения - получение биологически активной субстанции гуминовых кислот и увеличение выхода продукта.

Поставленная цель достигается тем, что удаление минеральных компонентов низкоминерализованной иловой сульфидной грязи проводят трехкратной обработкой одномолярным раствором хлорной кислоты, четырехкратной обработкой осадка раствором натрия гидроксида, отстаиванием щелочного экстракта в течение суток, подкислением экстракта 30%-ной серной кислотой до кислотности 2,0, экстрагированием осадка после промывания водой 0,1 молярным раствором натрия гидроксида, осаждением 30%-ной серной кислотой, экстрагированием осадка 0,01 молярным раствором натрия гидроксида.

Заявленный технический результат основан на оценке выхода продукта, полученного по методике прототипа (Д1) и по предлагаемой методике. По методике прототипа (Д1) из 1 кг нативной грязи было получено около 0,5 г гуминовых кислот, что составляет 0,05%; из воздушно-сухой грязи - 40 г, что составляет около 4%. Предлагаемые изменения в методике получения гуминовых кислот позволяют получить из 1 кг воздушно-сухой грязи приблизительно 65-70 г продукта, что составляет 6,5-7%. Реализация предлагаемого способа позволит получить гуминовые кислоты с выходом в 1,7 раза выше, чем по методу (1).

Предлагаемый способ имеет дополнительные преимущества, так как удаление минеральных компонентов с помощью одномолярного раствора хлорной кислоты уменьшает время получения продукта (с 298 до 180 часов), позволяет удалить большинство металлов, увеличивает выход гуминовых кислот, уменьшает воздействие на нативную структуру органического вещества, так как хлорная кислота не вступает во взаимодействие с ненасыщенными олефиновыми фрагментами и практически в используемых концентрациях не проявляет окислительных свойств. Уменьшение концентрации серной кислоты с 50 до 30% определяет экономию реактива в 1,7 раза. Использование на стадии извлечения гуминовых кислот после осаждения серной кислотой 0,1 молярного раствора натрия гидроксида вместо 0,02 молярного позволяет сократить количество циклов экстрагирования в 2 раза и повысить выход конечного продукта в 1,7 раза. Уменьшение концентрации раствора натрия гидроксида на последней стадии в 2 раза позволяет увеличить время работы катионита в 1,8 раза и сократить время, затрачиваемое на выполнение данного этапа, сохранив качественные и количественные характеристики субстанции.

Пример: 1 кг низкоминерализованной иловой сульфидной грязи заливают 2,5-3,0 дм³ одномолярным раствором хлорной кислоты в емкости объемом не менее 4 дм³, содержимое перемешивают в течение 1-3 минут до прекращения интенсивного пенообразования и оставляют на 24 часа. Жидкость с осадка декантируют, осадок вновь заливают 2,5-3,0 дм³ хлорной кислоты, оставляют на 24 часа, после декантации осадок еще раз заливают 2,0 дм³ хлорной кислоты и оставляют на 24 часа, после декантации осадок заливают водой, перемешивают и отстаивают в течение 1 часа, операцию повторяют, после чего осадок переносят на воронку Бюхера, промывают водой через рыхлый бумажный фильтр до отрицательной реакции на ионы кальция (проба с оксалатом аммония) и ионы железа (проба с тиоцианатом аммония). Освобожденный от растворимых минеральных примесей осадок переносят в емкость на 3 дм³, заливают 2,5 дм³ 0,5-молярным раствором натрия гидроксида, плотно закрывают для предотвращения контакта с оксидом углерода (IV) воздуха и оставляют на 12 часов, жидкость с осадка декантируют в приемник, плотно укупоривают с целью предотвращения контакта с оксидом углерода (IV) воздуха, операцию щелочной экстракции повторяют трехкратно и экстракты объединяют. Щелочной раствор, представляющий собой темноокрашенную жидкость, отстаивают 12 часов (под плотной крышкой), декантируют с небольшого осадка, фильтруют через рыхлый бумажный фильтр на воронке Бюхнера. К фильтру небольшими порциями прибавляют 30%-ный раствор серной кислоты при постоянном перемешивании до кислотности 2, раствор оставляют до следующего дня. Жидкость с осадка декантируют, осадок переносят на воронку Бюхнера и промывают водой до отрицательной реакции на сульфат-ионы (проба с бария хлоридом). Осадок переносят в емкость на 3,0 дм³, заливают 2 дм³ 96°-ного этанола и оставляют на 12 часов, после чего растворитель заменяют, повторяя операцию до исчезновения коричневого (бурого) окрашивания. Осадок заливают 0,1 молярным раствором натрия гидроксида и оставляют на 12 часов. Щелочной экстракт фильтруют через бумажный фильтр. К полученному темно-коричневому раствору приливают 30%-ную серную кислоту до кислотности 2 и оставляют на 12 часов. Полученный осадок фильтруют водой через бумажный фильтр до отрицательной реакции на сульфаты (проба бария с хлоридом). Очищенный осадок растворяют в 0,01 молярном растворе натрия гидроксида и фильтруют через рыхлый бумажный фильтр. Раствор натрия гумата переводят в Н-форму, пропуская через делительную воронку, заполненную катионитом марки КУ-2 в Н-форме, высотой слоя 20-30 см до постоянного значения кислотности раствора, контролируемого с помощью универсального индикатора, препарат высушивают в тонком слое при температуре 35-40°С с принудительной вентиляцией. Готовый продукт представляет собой темноокрашенные чешуйки со слабым характерным запахом, зольность препарата <1%. Препарат следует хранить в бюксах с притертой пробкой в защищенном от света месте.

Идентификация выделенного препарата и отнесение его к гуминовым кислотам проводились в соответствии с общепринятыми диагностическими признаками, определенными для гуминовых кислот почв (2), к которым относятся элементный состав в массовых и мольных процентах, доля ароматичности, степень бензоидности, коэффициент цветности. Элементный анализ осуществляли на CHNS-анализаторе. Интенсивности окраски 0,001%-ного раствора натрия гумата измеряли на спектрофотометре СФ-56. Для сравнения исследуемых образцов гуминовых кислот использовали соотношение поглощения при длинах волн 465 и 665 нм (Е₄:Е₆), толщине кюветы 1 см. Спектры пропускания получены на спектрофотометре ИК-Фурье Spectrum 100 (Perkin Elmer), условия записи: интервал длин волн 4000-400 см^-1, подавление сигналов воды и углекислого газа, спектры записаны относительно воздуха. Результаты всех приведенных экспериментов обрабатывались методом вариационной статистики с использованием коэффициента Стьюдента на персональном компьютере. Зольность полученного образца составляет 0,95%. Результаты проведенных физико-химических экспериментов приведены в приложении 1 и 2. Содержание элементов и таких характеристик, как степень бензоидности, коэффициент цветности полученных образцов гуминовых кислот с использованием хлорной кислоты, находятся в том же интервале значений, которые характерны для гуминовых кислот почв (2). ИК-спектр гуминовых кислот приведен в приложении 3, а в приложении 4 приведено отнесение полос пропускания. Интерпретация полос пропускания в области 1400-1000 см^-1 не является однозначной, так как в ней проявляются деформационные колебания большого числа структурных фрагментов.

Биологическая активность полученного препарата определялась по противовоспалительному действию на модели адъювантного артрита. Хроническое иммунное воспаление моделировали у белых беспородных крыс массой 180-200 грамм субплантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ в вазелиновом масле). Введение гуминовых кислот в виде 0,1% водного раствора (кислотность 7,4) начинали с 14-го дня после индукции воспаления и проводили ежедневно в течение 12 дней. Воспалительная реакция оценивалась на 3, 7, 12 сутки после начала введения гуминовых кислот, соответственно на 17, 21 и 26 сутки после индукции воспаления. Гистологические исследования проводили, используя кусочки селезенки, печени и лимфатические узлы, которые помещали в 10%-ный забуференный формалин (кислотность 7,2-7,4), проводили через спирты возрастающей концентрации по стандартной методике и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, азур-эозином. Морфологическое наблюдение осуществляли на автоматизированной аналитической системе, включающей микроскоп «Olympus СХ 21 FS 1», цифровую фотокамеру «Olympus» С - 4000 ZOOM и системный блок на базе процессора Intel Pentium 4 с использованием программы «Видео-тест-морфо».

В результате проведенных гистологических исследований получены следующие результаты:

- отсутствие признаков токсического действия гуминовых кислот пелоидов на организм крыс при парентеральном введении;

- применение гуминовых кислот пелоидов в значительной степени купировало воспалительный процесс, вызванный парентеральным введением адъюванта Фрейнда. Под влиянием гуминовых кислот в динамике происходило уменьшение как количества лимфоидных узелков с герминативными центрами, так и размеров этих центров. У животных, которым вводили гуминовые кислоты, в печени сохраняется структура большинства долек, отсутствуют некрозы, а явления кариопикноза и кариорексиса единичны.

Продукт, полученный предлагаемым способом, можно использовать для приготовления растворов при лечении и профилактике различных воспалительных заболеваний (артриты, гинекологические заболевания, остеохондрозы) в режиме физиотерапии (электрофорез, микроэлектрофорез по БАТ), суппозиториев (при лечении геморроя и хронического простатита), мазей (ранозаживляющее), кремов (косметология).

Приложение 1

Характеристика гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей с использованием хлорной кислоты

Элементные соотношения Степень бензоидности Степень окисленности Коэффициент цветности Н/С О/С 0,336 0,1 2,46 0,92 0,55      

Приложение 2

Элементный состав в мольных и массовых процентах гуминовых кислот

Содержание углерода, % Содержание азота, % Содержание водорода, % Содержание серы, % Содержание кислорода, % Масс. Мол. Масс. Мол. Масс. Мол. Масс. Мол. Масс. Мол. 52,70 41,44 4,30 2,78 3,52 33,21 2,40 0,71 37,08 21,86

Приложение 3

ИК - спектр пропускания препарата гуминовых кислот, полученных с использованием хлорной кислоты

Приложение 4

Отнесение полос пропускания ИК-спектра гуминовых кислот, полученных с использованием хлорной кислоты

Интервал частот, см^-1 3500-2800 1714 1619 1400-1000 Структурные фрагменты метальные и метиленовые группы карбонильная группа ненасыщенные связи С=С спиртовые и эфирные связи С-O

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Патент RU 2043107 С1.

2. Орлов Д.С. Органическое вещество почв России // Почвоведение. 1998. №9. С.1049-1057.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения гуминовых кислот из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей. Способ получения гуминовых кислот из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, который включает трехкратную обработку раствором хлорной кислоты с последующим отстаиванием и промыванием водой до отрицательной реакции на ионы кальция и железа, четырехкратную обработку осадка раствором гидроксида натрия, отстаивание щелочного экстракта, декантирование и фильтрование, подкисление серной кислотой, отделение осадка и промывание водой до отрицательной реакции на сульфат-ионы, экстрагирование примесей этанолом и экстрагирование осадка раствором гидроксида натрия, переосаждение серной кислотой, промывание осадка, экстрагирование осадка раствором гидроксида натрия, пропускание через катион КУ-2 и высушивание при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет повысить выход конечного продукта. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ получения гуминовых кислот из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей путем декальцинирования и десульфирования трехкратной обработкой раствором кислоты с последующим промыванием водой до отрицательной реакции на ионы кальция и железа, обработкой осадка 0,5 молярным раствором гидроксида натрия в соотношении осадок:раствор щелочи, равном 1:3, отстаивания щелочного экстракта в течение суток, декантирования и фильтрования через рыхлый бумажный фильтр, подкисления серной кислотой и выдерживания в течение суток, отделения осадка и промывания водой до отрицательной реакции на сульфат-ионы, экстрагирования примесей 96° этанолом, экстрагирования осадка раствором гидроксида натрия и переосаждения серной кислотой, промывания осадка, экстрагирования осадка раствором гидроксида натрия, пропускания через катион КУ-2 и высушивания, отличающийся тем, что декальцинирование и десульфирование проводят одномолярным раствором хлорной кислоты, осадок обрабатывают раствором натрия гидроксида четырехкратно, отстаивают щелочной экстракт в течение суток, подкисляют экстракт 30%-ной серной кислотой до кислотности 2,0, после промывания водой осадок экстрагируют 0,1 молярным раствором натрия гидроксида, переосаждают 30%-ной серной кислотой, осадок экстрагируют 0,01 молярным раствором натрия гидроксида.