АМИНОКИСЛОТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА RANK-L, И ПОЛИПЕПТИДЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ИХ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И НАРУШЕНИЙ КОСТЕЙ Российский патент 2013 года по МПК C07K16/22 C12N15/13 C12N15/63 A61K38/02 A61P19/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение раскрывает аминокислотные последовательности, которые направлены на RANK-L, а также соединения или конструкции, и, в частности, белки и полипептиды, которые включают или по существу состоят из одной или нескольких таких аминокислотных последовательностей. Изобретение также раскрывает нуклеиновые кислоты, кодирующие такие аминокислотные последовательности и полипептиды; способы получения таких аминокислотных последовательностей и полипептидов; клетки-хозяева, экспрессирующие или способные экспрессировать такие аминокислотные последовательности или полипептиды. Раскрыты также композиции и, в частности, фармацевтические композиции для профилактики и/или лечения болезней и нарушений кости, которые включают такие аминокислотные последовательности, полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или клетки-хозяева. Показана возможность применения аминокислотных последовательностей или полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев и/или композиций в профилактических, терапевтических или диагностических целях. Поливалентная конструкция по изобретению имеет время полужизни в сыворотке человека от 12 часов до 19 дней. 8 н. и 25 з.п. ф-лы, 30 ил., 24 табл., 17 пр.

1. Поливалентная конструкция, направленная на RANK-L и/или специфически связывающаяся с RANK-L, по существу состоящая из двух Нанотел, которые направлены на RANK-L и/или которые могут специфически связываться с RANK-L, в которых:
- CDR1 выбрано из группы, состоящей из:
a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:200;
b) аминокислотной последовательности, которая обладает, по меньшей мере, 80%-ной идентичностью аминокислот с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:200;
c) аминокислотной последовательности, которая отличается по 3, 2, или 1 аминокислоте от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:200; и
- CDR2 выбрано из группы, состоящей из:
a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:324;
b) аминокислотной последовательности, которая обладает, по меньшей мере, 80%-ной идентичностью аминокислот с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:324;
c) аминокислотной последовательности, которая отличается по 3, 2, или 1 аминокислоте от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:324, и
- CDR3 выбрано из группы, состоящей из:
a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO:448;
b) аминокислотной последовательности, которая обладает, по меньшей мере, 80%-ной идентичностью аминокислот с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:448;
c) аминокислотной последовательности, которая отличается по 3, 2, или 1 аминокислоте от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:448, где нанотела связаны либо непосредственно друг с другом, и/или через один или несколько подходящих линкеров или спейсеров.

2. Поливалентная конструкция по п.1, где два Нанотела модулируют, ингибируют и/или предотвращают связывание RANK-L с RANK.

3. Поливалентная конструкция по п.1, где два Нанотела предотвращают и/или ингибируют дифференцировку и/или пролиферацию остеокластов.

4. Поливалентная конструкция по п.1, где два Нанотела являются V_HH-последовательностью, частично гуманизированной V_HH-последовательностью, полностью гуманизироваппой V_HH-последователыюстью, камелизированным вариабельным доменом тяжелых цепей или Нанотелом, которое было получено с помощью такого метода, как созревание аффинности.

5. Поливалентная конструкция по п.1, где два Нанотела по существу состоят из Нанотела, которое
i) имеет, по меньшей мере, 80%-ную идентичность аминокислот, по меньшей мере, с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-22, 560-621, 622-729, 730-757, 759-762, 765 и 766-773, в которой для определения степени идентичности аминокислот аминокислотные остатки, которые образуют последовательности CDR, не учитывают;
и в котором:
ii) предпочтительно один или более аминокислотных остатков в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108 в соответствии с нумерацией Кабата выбирают из характерных остатков, указанных в таблице А-3.

6. Поливалентная конструкция по п.1, по существу состоящая из двух Нанотел, в которых последовательности CDR указанных Нанотел имеют, по меньшей мере, 70%-ную идентичность аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 80%-ную идентичность аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ную идентичность аминокислот, например, 95%-ную идентичность аминокислот или более, или по существу даже 100%-ную идентичность аминокислот с последовательностями CDR аминокислотной последовательности SEQ ID NO:572.

7. Поливалентная конструкция по п.1, по существу состоящая из двух Нанотел, которые перекрестие блокируют связывание с RANK-L, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:572 и SEQ ID NO:750-756 и/или связывание которых с RANK-L перекрестно блокируется, по меньшей мере, одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:572 и SEQ ID NO:750-756, как обнаруживают в анализе Biacore и/или в анализе ELISA.

8. Поливалентная конструкция по п.1, по существу состоящая из двух Нанотел, которые выбирают из SEQ ID NO:572 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более 80%, предпочтительно более 90%, более предпочтительно более 95%, например, 99% или более идентичности последовательностей (как определено в этом документе), с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:572.

9. Поливалентная конструкция по п.1, по существу состоящая из двух Нанотел, которые являются гуманизированным Нанотелом, которое выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:750-756, или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более 80%, предпочтительно более 90%, более предпочтительно более 95%, например, 99% или более идентичности последовательностей (как определено в этом документе), по меньшей мере, с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:750-756.

10. Поливалентная конструкция по п.1, по существу состоящая из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:625, 631, 637, 640-645, 649, 655, 661, 667, 673, 676-681, 685, 691, 761, 766 и 772.

11. Поливалентная конструкция по п.1, дополнительно содержащая как минимум одну связывающую единицу, направленную на другую мишень, и представляющая собой полиспецифичную конструкцию.

12. Поливалентная конструкция по п.1, которая дополнительно содержит одну или несколько групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличенное время полужизни по сравнению с соответствующей поливалентной конструкцией без дополнительных групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц.

13. Поливалентная конструкция по п.12, в которых одна или более других связывающих единиц обеспечивают поливалентную конструкцию с увеличенным временем полужизни по сравнению с соответствующей поливалентной конструкцией самой по себе по любому из пп.1-11.

14. Поливалентная конструкция по п.13, в которой указанные одну или более групп, остатков, фрагментов или других связывающих единиц, которые обеспечивают поливалентную конструкцию с увеличенным временем полужизни, выбирают из группы, состоящей из белков сыворотки крови или их фрагментов, связывающих единиц, которые способны связываться с белками сыворотки крови, Fc-фрагмента и небольших белков или пептидов, которые способны связываться с белками сыворотки.

15. Поливалентная конструкция по п.13, в которой указанные одну или более других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, которые обеспечивают поливалентную конструкцию с увеличенным временем полужизни, выбирают из группы, состоящей из человеческого сывороточного альбумина или его фрагментов.

16. Поливалентная конструкция по п.13, в которой указанные одну или более других связывающих единиц, которые обеспечивают поливалентную конструкцию с увеличенным временем полужизни, выбирают из группы, состоящей из связывающих единиц, которые способны связываться с сывороточным альбумином (например, с человеческим сывороточным альбумином) или с сывороточным иммуноглобулином (например, с IgG).

17. Поливалентная конструкция по п.13, в которой указанные одну или более других связывающих единиц, которые обеспечивают поливалентную конструкцию с увеличенным временем полужизни, выбирают из группы, состоящей из доменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для применения в качестве доменного антитела, однодоменных антител, аминокислотных последовательностей, которые подходят для применения в качестве однодоменного антитела, «dAb», аминокислотных последовательностей, которые подходят для применения в качестве dAb, или Нанотел, которые способны связываться с сывороточным альбумином (например, с человеческим сывороточным альбумином) или с сывороточным иммуноглобулином (например, с IgG).

18. Поливалентная конструкция по п.13, в которой указанные одну или более других связывающих единиц, которые обеспечивают поливалентную конструкцию с увеличенным временем полужизни, выбирают из SEQ ID NO:790-791.

19. Поливалентная конструкция по п.13, которая имеет время полужизни в сыворотке:
- которое, по меньшей мере, в 1,5 раза, предпочтительно, по меньшей мере, в 2 раза, например, по меньшей мере, в 5 раз, например, по меньшей мере, в 10 раз или более чем в 20 раз больше чем время полужизни соответствующей поливалентной конструкции самой по себе; и/или которое увеличено более чем на 1 ч, предпочтительно более чем на 2 ч, более предпочтительно более чем на 6 ч, например, более чем на 12 ч, или даже более чем на 24, 48 или 72 ч, по сравнению с соответствующей конструкцией самой по себе.

20. Поливалентная конструкция по п.13, которая имеет время полужизни в сыворотке человека, которое составляет, по меньшей мере, около 12 ч, предпочтительно, по меньшей мере, 24 ч, более предпочтительно, по меньшей мере, 48 ч, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 72 ч или более; например, по меньшей мере, 5 дней (например, примерно от 5 до 10 дней), предпочтительно, по меньшей мере, 9 дней (например, примерно от 9 до 14 дней), более предпочтительно, по меньшей мере, около 10 дней (например, примерно от 10 до 15 дней), или, по меньшей мере, около 11 дней (например, примерно от 11 до 16 дней), более предпочтительно, по меньшей мере, около 12 дней (например, примерно от 12 до 18 дней или более), или более чем 14 дней (например, примерно от 14 до 19 дней).

21. Поливалентная конструкция по п.12, включающая или по существу состоящая из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:697, 703, 709, 712-717, 721, 727 и 759.

22. Нуклеиновая кислота, которая кодирует поливалентную конструкцию по любому из пп.1-21.

23. Нуклеиновая кислота по п.22, которая функционально связана с одним или более регуляторным элементом, последовательностью 3'- или 5'-нетранслируемой области (UTR), лидерной последовательностью, селекционным маркером, маркером экспрессии/репортерным геном и/или последовательностью, которая способствует усилению трансформации или интеграции.

24. Клетка-хозяин, которая экспрессирует или которая в подходящих условиях способна экспрессировать поливалентную конструкцию по любому из пп.1-21 и которая включает нуклеиновую кислоту по п.22 или 23.

25. Организм-хозяин, который экспрессирует или который в подходящих условиях способен экспрессировать поливалентную конструкцию по любому из пп.1-21 и который включает нуклеиновую кислоту по п.22 или 23.

26. Композиция, включающая эффективное количество, по меньшей мере, одной поливалентной конструкции по любому из пп.1-21 или нуклеиновую кислоту по пп.22 и 23 и при необходимости один или более дополнительных компонентов таких композиций, известных как таковые, для использования в профилактике и/или лечении болезней или нарушений кости.

27. Композиция, включающая эффективное количество, по меньшей мере, одной поливалентной конструкции по любому из пп.1-21 или нуклеиновую кислоту по пп.22 и 23 и при необходимости один или более дополнительных компонентов таких композиций, известных как таковые, для использования в диагностике болезней или нарушений кости.

28. Композиция по п.26, которая является фармацевтической композицией.

29. Композиция по п.28, которая является фармацевтической композицией, которая дополнительно включает, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и/или вспомогательное средство и которая необязательно включает один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений.

30. Способ получения поливалентной конструкции по любому из пп.1-21, которые можно получить с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, причем указанный способ, по меньшей мере, включает стадии:
- экспрессии в подходящей клетке-хозяине или организме-хозяине, или в другой подходящей экспрессионной системе нуклеиновой кислоты по п.22 или 23, или
- выращивания и поддержания организма-хозяина или клетки-хозяина по п.24 или 25 в условиях, в которых указанный хозяин или клетка-хозяин экспрессируют и/или продуцируют, по меньшей мере, одну поливалентную конструкцию по любому из пп.1-21, которую можно получить с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, необязательно с последующим
- выделением и/или очисткой поливалентной конструкции по любому из пп.1-21, которую можно получить с помощью экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, полученной таким образом.

31. Применение поливалентной конструкции по любому из пп.1-21 при получении фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или нарушения кости.

32. Поливалентная конструкция по любому из пп.1-21 для предотвращения и/или лечения заболеваний или расстройств ассоциированных с дисбалансом в метаболическом пути RANK-L/RANK/OPG.

33. Поливалентная конструкция по любому из пп.1-21 для предупреждения и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или нарушения кости.