Настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, которые могут связываться с сывороточным альбумином.
В частности, настоящее изобретение относится к одиночным вариабельным доменам иммуноглобулина и, в частности, к одиночным вариабельным доменам тяжелой цепи, которые могут связываться с сывороточным альбумином.
Как описано в данном документе, одиночные вариабельные домены иммуноглобулина, иммуноглобулина обеспечиваемые изобретением, предпочтительно являются такими, что они могут (по меньшей мере) связываться (и, в частности, специфически связываться) с человеческим сывороточным альбумином. Более предпочтительно, как дополнительно описано в настоящем документе, эти одиночные вариабельные домены иммуноглобулина предпочтительно являются также такими, что они перекрестно реагируют (как описано в настоящем документе) с человеческим сывороточным альбумином и сывороточным альбумином по меньшей мере одного из других видов млекопитающих.
Изобретение также относится к белкам, полипептидам и другим конструкциям, соединениям, молекулам или химическим веществам, которые содержат по меньшей мере один из одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, связывающихся с сывороточным альбумином, которые описаны в настоящем документе.
Одиночные вариабельные домены иммуноглобулина также в общем упоминаются в настоящем документе посредством сокращений «ISV» или «ISVD» (которые будут использоваться здесь взаимозаменяемо).
Одиночные вариабельные домены иммуноглобулина, связывающиеся с сывороточным альбумином, которые описаны в настоящем документе, также будут называться здесь «аминокислотными последовательностями по изобретению» или «связывающими сывороточный альбумин агентами по изобретению». Как дополнительно описано в настоящем документе, связывающие альбумин агенты по изобретению могут, в частности, представлять собой нанотела (как дополнительно описано в настоящем документе).
Белки, полипептиды и другие конструкции, соединения, молекулы или химические вещества, которые включают по меньшей мере один из связывающих сывороточный альбумин агентов по изобретению, также будут обозначаться в данном документе как «соединения по изобретению» или как «полипептиды по изобретению». Предпочтительно соединения по изобретению представляют собой белки или полипептиды, и в частности, могут представлять собой гибридные белки.
Другие аспекты, варианты осуществления, признаки, применения и преимущества изобретения будут понятны для специалиста на основании описания в данном документе.
В настоящей заявке аминокислотные остатки/ положения в вариабельном домене тяжелой цепи иммуноглобулина будут обозначены нумерацией по Kabat. Для удобства на фиг. 1 приведена таблица, в которой перечислены некоторые положения аминокислот, которые будут конкретно упоминаться в данном документе, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации (такими, как Aho и IMGT. Примечание: если явно не указано иное, то в настоящем описании и формуле изобретения нумерация Kabat является решающей; другие системы нумерации приведены только для справки).
Что касается CDR, как хорошо известно в данной области техники, существует множество соглашений для определения и описания CDR из VH или VHH фрагмента, таких как определение Kabat (которое основано на вариабельности последовательности и является наиболее часто используемым) и определение Chothia (которое основано на расположении структурных петлевых областей). Ссылка делается, например, на веб-сайт http://www.bioinf.org.uk/abs/. Для целей настоящего описания и формулы изобретения, даже несмотря на то, что CDR по Kabat также могут быть упомянуты, CDR наиболее предпочтительно определяются на основе определения Abm (которое основано на программном обеспечении для моделирования антител AbM от Oxford Molecular), так как это считается оптимальным компромиссом между определениями Kabat и Chothia. Ссылка снова делается на веб-сайт http://www.bioinf.org.uk/abs/).
Соответственно, в настоящем описании и формуле изобретения все CDR определены в соответствии с соглашением Abm, если здесь явно не указано иное.
ISVD (и, в частности, нанотела), которые могут связываться с сывороточным альбумином, и их применение хорошо известны в данной области техники, например, из WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400, WO 2015/173325 и PCT/EP2016/077973, которые описывают ISVD, связывающие сывороточный альбумин, и их использование для продления периода полужизни в сыворотке (как определено в этих заявках) терапевтических соединений, фрагментов и веществ. Например, в WO 2006/122787 в качестве SEQ ID NO: 62 раскрыто гуманизированное нанотело, связывающее сывороточный альбумин, обозначенное как Alb-8 (см. SEQ ID NO: 1 в настоящем документе). В WO 2012/175400 в качестве SEQ ID NO: 6 раскрыто гуманизированное нанотело, связывающее сывороточный альбумин, обозначенное как Alb-23D (см. SEQ ID NO: 2 в настоящем документе). Аминокислотные последовательности Alb-8 и Alb-23D и их CDR (которые одинаковы для Alb-8 и Alb-23D) приведены в таблице A ниже как SEQ ID NO: 1, 2 и 3-8, соответственно.
Некоторые другие ссылки, которые раскрывают ISVD против сывороточного альбумина, включают WO 2003/035694, WO 2004/003019, EP 2139918, WO 2011/006915 и WO 2014/111550.
На фиг. 3A и 3B показаны выравнивания Alb-8 (эталон), Alb-23D (эталон), SEQ ID NO: 18 (по изобретению) и SEQ ID NO: 19 (по изобретению).
Настоящее изобретение направлено на создание усовершенствованных агентов, связывающих сывороточный альбумин, и в частности, агентов, связывающих сывороточный альбумин, которые обладают улучшенными свойствами по сравнению с агентами, связывающими сывороточный альбумин, известными в данной области техники. В частности, целью изобретения является создание агентов, связывающих сывороточный альбумин, которые могут связываться с сывороточным альбумином собаки и/или которые обладают улучшенной перекрестной реактивностью между человеческим сывороточным альбумином и собачьим сывороточным альбумином (т.е. по сравнению со связывающим альбумин агентами из предшествующего уровня техники, такими как Alb-8 и/или Alb -23D).
Таблица A: Alb-8, Alb-23D и их CDR
ID NO
(WO 2006/122787; SEQ ID NO: 62)
(WO 2012/175400; SEQ ID NO: 6)
- SEQ ID NO NO: 1 и 2 разделяют одни и те же CDR в соответствии с Kabat. Однако, если определять CDR в соответствии с соглашением Abm, то SEQ ID NO: 1 имеет отличающий CDR1 в SEQ ID NO: 2 по сравнению с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 1 содержит S в положении 30 вместо R.
- SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:8 являются идентичными.
- все CDR определены в соответствии с соглашением Abm, если не указано иное.
Таблица B: SEQ ID NO: 18 и 19 и их CDR.
ID NO
- все CDR определены в соответствии с соглашением Abm, если не указано иное.
Как правило, ISVD, связывающие сывороточный альбумин, обеспеченные настоящим изобретением, представляют собой варианты последовательностей SEQ ID NO: 18 и 19, в которых:
- они имеют одни и те же CDR (или по существу те же CDR), что и последовательность SEQ ID NO: 18 или последовательность SEQ ID NO: 19; и
- они имеют определенную степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19 (эта степень идентичности последовательности является такой, как описано далее).
В частности, ISVD, связывающие сывороточный альбумин, обеспечиваемые настоящим изобретением, обычно будут иметь (ограниченный) ряд «аминокислотных различий» (как описано в настоящем документе) по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19. Эти аминокислотные различия могут присутствовать в CDR (при условии, что полученные аминокислотные последовательности таковы, что они сохраняют дополнительные свойства аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению, которые изложены в настоящей заявке) и/или присутствовать в каркасных областях, и могут в частности присутствовать в каркасных областях (как определено в соответствии с Kabat и/или в соответствии с Abm). Например, и без ограничения, этими аминокислотными различиями могут быть, например, гуманизирующие замены; замены, которые улучшают экспрессию в желаемой клетке-хозяине или организме-хозяине; замены, которые улучшают стабильность и/или устойчивость к деградации и/или к протеазам; мутации, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами, и/или другие мутации, которые предназначены для оптимизации последовательности аминокислотных последовательностей по изобретению; или любая подходящая комбинация таких аминокислотных различий. Ссылка делается на дальнейшее раскрытие в данном документе.
В первом аспекте изобретение относится к ISVD, который может связываться (и в частности, специфически связываться) с человеческим сывороточным альбумином, и который имеет:
- CDR1 (в соответствии с Kabat), который представляет собой аминокислотную последовательность SYVMG (SEQ ID NO: 9) или аминокислотную последовательность, которая имеет различие (различия) по 2 или 1 аминокислотам (как определено в настоящем документе) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9; и
- CDR2 (согласно Kabat), который представляет собой аминокислотную последовательность AISRSGGYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10) или аминокислотную последовательность, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное различие (различия) (как определено в настоящем документе) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10; и
- CDR3 (согласно Kabat), который представляет собой аминокислотную последовательность GRYSAWYSQSYEYDY (SEQ ID NO: 14) или аминокислотную последовательность, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное различие (различия) (как определено в настоящем документе) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14.
В частности, связывающий сывороточный альбумин агент в соответствии с этим аспектом изобретения, может быть (и предпочтительно является) таким, как дополнительно описано в настоящем документе.
В более конкретном аспекте изобретение относится к ISVD, который может связываться (и в частности, специфически связываться) с человеческим сывороточным альбумином, и который имеет:
- CDR1 (согласно Kabat), который представляет собой аминокислотную последовательность SYVMG (SEQ ID NO: 9); и
- CDR2 (согласно Kabat), который представляет собой аминокислотную последовательность AISRSGGYTYYADSVKG (SEQ ID NO: 10); и
- CDR3 (согласно Kabat), который представляет собой аминокислотную последовательность GRYSAWYSQSYEYDY (SEQ ID NO: 14).
Опять же, связывающий сывороточный альбумин агент в соответствии с этим аспектом изобретения может быть (и предпочтительно является) таким, как дополнительно описано в настоящем документе.
В другом аспекте изобретение относится к ISVD, который может связываться (и в частности, специфически связываться) с человеческим сывороточным альбумином, и который имеет:
- CDR1 (в соответствии с Abm), который представляет собой аминокислотную последовательность GSNISSYVMG (SEQ ID NO: 11) или GSTISSYVMG (SEQ ID NO: 12), или аминокислотную последовательность, которая имеет 2 или 1 аминокислотное различие (различия) (как определено в настоящем документе) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12; и
- CDR2 (в соответствии с Abm), который представляет собой аминокислотную последовательность AISRSGGYTY (SEQ ID NO: 13), или аминокислотную последовательность, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное различие (различия) (как определено в настоящей заявке) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13; и
- CDR3 (в соответствии с Abm), который представляет собой аминокислотную последовательность GRYSAWYSQSYEYDY (SEQ ID NO: 14) или аминокислотную последовательность, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное различие (различия) (как определено в настоящем документе) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14.
В частности, агент, связывающий сывороточный альбумин, в соответствии с этим аспектом изобретения может быть (и предпочтительно является) таким, как дополнительно описано в настоящем документе.
В более конкретном аспекте изобретение относится к ISVD, который может связываться (и в частности, специфически связываться) с человеческим сывороточным альбумином, и который имеет:
- CDR1 (в соответствии с Abm), который представляет собой аминокислотную последовательность GSNISSYVMG (SEQ ID NO: 11) или GSTISSYVMG (SEQ ID NO: 12); и
- CDR2 (в соответствии с Abm), который представляет собой аминокислотную последовательность AISRSGGYTY (SEQ ID NO: 13); и
- CDR3 (в соответствии с Abm), который представляет собой аминокислотную последовательность GRYSAWYSQSYEYDY (SEQ ID NO: 14).
Опять же, агент, связывающий сывороточный альбумин, в соответствии с этим аспектом изобретения может быть (и предпочтительно является) таким, как дополнительно описано в настоящем документе.
Как правило, связывающие сывороточный альбумин агенты в соответствии с различными аспектами изобретения предпочтительно являются такими, что они имеют:
- степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19 (в которой CDR и любое С-концевое удлинение, которые могут присутствовать, не учитываются для определения степени идентичности последовательности) по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;
и/или такими, которые имеют:
- и/или имеют не более 7, предпочтительно не более 5, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящем документе, без учета удлинения CDR и любого С-концевого удлинения, которое может присутствовать) с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19.
Агенты, связывающие сывороточный альбумин, в соответствии с различными аспектами изобретения обычно предпочтительно являются такими, что они связываются с человеческим сывороточным альбумином с константой диссоциации (KD) от 10-5 до 10-12 моль/литр или менее, и предпочтительно от 10-7 до 10-12 моль/литр или менее, и более предпочтительно от 10-8 до 10-12 моль/литр, и/или с аффинностью связывания по меньшей мере 107 М-1, предпочтительно по меньшей мере 108 М-1, более предпочтительно по меньшей мере 109 М-1, такой как по меньшей мере 1012 М-1, как определено с использованием ProteOn (ссылка приводится на Пример 1). Предпочтительно, связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению будет связываться с желаемым антигеном с аффинностью менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, например, менее 500 пМ, опять же, как определено с использованием ProteOn (ссылка снова делается на Пример 1).
Агенты, связывающий сывороточный альбумин, в соответствии с различными аспектами изобретения предпочтительно также являются такими, что они конкурируют с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18 за связывание с (человеческим) сывороточным альбумином и/или что они «перекрестно блокируют» (как определено в настоящем документе) связывание аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 с (человеческим) сывороточным альбумином.
Предпочтительно связывающие альбумин агенты по изобретению являются такими, что они связываются по существу с теми же аминокислотными остатками и/или эпитопами в человеческом сывороточном альбумине, что и SEQ ID NO: 18, и еще более предпочтительно, они имеют по существу те же самые аминокислотные взаимодействия, что и SEQ ID NO: 18. Для этой цели, в соответствии с конкретным, но не ограничивающим аспектом, связывающие альбумин агенты по изобретению предпочтительно либо имеют те же CDR, что и последовательность SEQ ID NO: 18, либо по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 18 предпочтительно содержат внутри своих CDR только такие мутации (такие, как консервативные аминокислотные замены), которые все еще позволяют им подвергаться таким же или по существу таким же аминокислотным взаимодействиям с человеческим сывороточным альбумином, что и для SEQ ID NO: 18.
Связывающие сывороточный альбумин агенты в соответствии с различными аспектами изобретения обычно предпочтительно также являются такими, что они перекрестно реагируют с человеческим сывороточным альбумином и сывороточным альбумином по меньшей мере от одного, предпочтительно от по меньшей мере двух, более предпочтительно от по меньшей мере трех и по существу всех следующих видов млекопитающих: собака, крыса, мышь, кролик, морская свинка, свинья, овца, корова и яванская макака. В частности, связывающие сывороточный альбумин агенты в соответствии с различными аспектами изобретения являются такими, что они (по меньшей мере) перекрестно реагируют с человеческим сывороточным альбумином и собачьим сывороточным альбумином, и предпочтительно также либо с человеческим сывороточным альбумином и/или собачьим сывороточным альбумином с одной стороны, и по меньшей мере одним, предпочтительно по меньшей мере двумя, более предпочтительно всеми тремя из сывороточного альбумина крысы, сывороточного альбумина мыши и сывороточного альбумина яванской макаки, с другой стороны. В этом отношении связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению могут иметь усовершенствованную перекрестную реактивность (в частности, с человеческим сывороточным альбумином, с одной стороны, и собачьим сывороточным альбумином, с другой стороны), по сравнению с агентами, связывающими сывороточный альбумин, которые имеют (по существу) такие же CDR. как Alb-11 и/или Alb-23D. Приводится ссылка на данные в экспериментальной части ниже.
Для справки на фиг. 11 приведено выравнивание сывороточного альбумина у разных видов млекопитающих (источник: http://macromoleculeinsights.com/albumin.php, нумерация аминокислот на фиг. 11 - это нумерация, использованная на указанной веб-странице). Для удобства в последовательности человеческого сывороточного альбумина выделены участки аминокислот, которые, как предполагается, являются частью предполагаемого эпитопа аминокислотных последовательностей по изобретению. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом или гипотезой, предполагается, что аминокислотные последовательности по изобретению (по существу) способны к связыванию (одного или нескольких аминокислотных остатков внутри) соответствующих удлинений из аминокислотных остатков, которые присутствуют внутри аминокислотной последовательности тех альбуминов сыворотки млекопитающих, с которыми перекрестно реагируют аминокислотные последовательности по изобретению.
Как правило, связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению можно рассматривать как перекрестно реагирующие с человеческим сывороточным альбумином и сывороточным альбумином одного из этих видов, когда они могут связываться с человеческим сывороточным альбумином с аффинностью менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ. более предпочтительно менее 10 нМ; а также с сывороточным альбумином указанных видов с аффинностью менее 500 нМ, предпочтительно менее 200 нМ, более предпочтительно менее 10 нМ, опять же, как определено с использованием ProteOn (ссылка снова делается на Пример 1).
Агенты, связывающие сывороточный альбумин, в соответствии с различными аспектами изобретения предпочтительно также являются либо такими, что:
- они имеют период полужизни в сыворотке у человека (выраженный как t1/2 бета), который составляет более 6 часов, предпочтительно более 12 часов, более предпочтительно более 24 часов, еще более предпочтительно более 72 часов; например, около одной недели, двух недель и до периода полужизни сывороточного альбумина у человека (по оценкам, около 19 суток);
и/или такими, что:
- когда они связываются с терапевтическим фрагментом или веществом, они придают полученному полипептиду по изобретению период полужизни в сыворотке у человека (выраженный как t1/2 бета), который составляет более 6 часов, предпочтительно более 12 часов, более предпочтительно более 24 часов, еще более предпочтительно более 72 часов; например, около одной недели, двух недель и до периода полужизни сывороточного альбумина у человека (по оценкам, около 19 суток).
Период полужизни у видов млекопитающих, отличных от человека, среди прочих факторов будет в основном зависеть от связывающих свойств (таких как аффинность) связывающего альбумин агента по изобретению в отношении сывороточного альбумина от указанных видов млекопитающих, а также от периода полужизни интактного сывороточного альбумина у указанных видов. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, когда связывающий сывороточный альбумин агент согласно изобретению является перекрестно-реагирующим (как определено в настоящем документе) с человеческим сывороточным альбумином и сывороточным альбумином от другого вида млекопитающих, тогда период полужизни связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению (и/или соединения по изобретению, содержащего указанный агент, связывающий сывороточный альбумин), как определено для указанных видов, предпочтительно составляет по меньшей мере 5%, например, по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 25%, например, около 50% и возможно, до 100% от периода полужизни интактного сывороточного альбумина у указанных видов.
По сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 18, связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению предпочтительно также содержат (по меньшей мере):
- одну или несколько гуманизирующих замен;
и/или
- одну или несколько мутаций (то есть аминокислотных замен, делеций или добавок и, в частности, замен), которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами;
и могут при необходимости содержать одну или несколько дополнительных мутаций, как описано в настоящем документе.
Для подходящих гуманизирующих замен (и их подходящих комбинаций), например, приводится ссылка на WO 09/138519 (или на предшествующий уровень техники, цитируемый в WO 09/138519) и WO 08/020079 (или на предшествующий уровень техники, цитируемый в WO 08/020079), а также таблицы с A-3 по A-8 из WO 08/020079 (которые представляют собой списки, показывающие возможные гуманизирующие замены). Некоторыми предпочтительными, но не ограничивающими примерами таких гуманизирующих замен являются Q108L и A14P или их подходящая комбинация. Такие гуманизирующие замены могут также подходящим образом сочетаться с одной или несколькими другими мутациями, как описано в настоящем документе (например, с одной или несколькими мутациями, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами).
Что касается подходящих мутаций, которые могут уменьшать связывание предсуществующими антителами (и подходящими комбинациями таких мутаций), ссылка приводится, например, на WO 2012/175741 и WO 2015/173325, а также, например, на WO 2013/024059 и WO 2016/118733. Как описано в них, такие мутации могут включать (подходящую комбинацию) одну или несколько аминокислотных замен, делеций или добавлений (и, в частности, замен), которые часто будут находиться в так называемой C-концевой области ISV. Например, такие мутации могут содержать мутации (и в частности, замены) в одном или нескольких положениях 11, 13, 14, 15, 40, 41, 42, 82, 82a, 82b, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 103, 108 и/или мутации в одном или нескольких положениях в С-концевой последовательности VTVSS (то есть в положениях 109, 110, 111, 112 и 113), где одна или несколько мутаций в положениях 11, 89, 110 и/или 112 являются особо предпочтительным. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры таких мутаций представляют собой подходящие замены (где это необходимо), так что после мутации в указанном положении присутствует один из следующих аминокислотных остатков: 11L, 11K, 11V, 14A, 14P, 41A, 41L, 41P, 41S, 41T, 42E, 42G, 87A, 87T, 89A, 89L, 89T, 108L, 110K, 110Q, 112K и/или 112Q (где 11L, 89A, 89L, 89T, 110K, 110Q, 112K и/или 112Q являются особо предпочтительным); или любую подходящую комбинацию таких замен, такую как, например, 11V в сочетании с 89L или 89T; 11V в сочетании с 110 К или 110Q; или 11V в сочетании с 89L и 110K или 110Q, но не ограничиваясь ими. Такие мутации, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами, также могут подходящим образом сочетаться с одной или несколькими другими мутациями, как описано в настоящем документе (например, с одной или несколькими гуманизирующими заменами).
Где это уместно (как дополнительно описано в настоящем документе, и в частности, когда связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению присутствует и/или образует С-концевую часть соединения по изобретению, в котором он присутствует), для уменьшения связывания предсуществующими антителами связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению (и, как дополнительно описано в настоящем документе, также соединения по изобретению) также могут содержать C-концевое удлинение (такое, как C-концевой остаток аланина). Как описано в WO 2012/175741, такое C-концевое удлинение уменьшает связывание предсуществующими антителами. Подходящее C-концевое удлинение может быть в целом дополнительно описано в настоящем документе и, в частности, может иметь формулу -(X)n, в которой X может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту (но предпочтительно не цистеин), а n может составлять 1, 2, 3, 4 или 5. Снова делается ссылка на WO 2012/175741, а также, например, на WO 2015/173325, WO 2013/024059 и WO 2016/118733. Присутствие такого C-концевого удлинения также может быть подходящим образом комбинировано с одной или несколькими другими мутациями, описанными в данном документе (например, с одной или несколькими гуманизирующими заменами и/или одной или несколькими мутациями, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами).
Другие мутации, которые могут присутствовать в связывающих сывороточный альбумин агентах по изобретению, например, включают одну или несколько мутаций (в частности, замен), которые улучшают экспрессию в желаемой клетке-хозяине или организме-хозяине, одну или несколько мутаций (и в частности, замен), которые улучшают стабильность и/или устойчивость к деградации и/или к протеазам, и/или одну или несколько других мутаций, которые предназначены для оптимизации последовательности аминокислотных последовательностей по изобретению (например, одну или несколько мутаций, которые (дополнительно) уменьшают какую-либо склонность агентов, связывающих альбумин, к образованию димеров, но не ограничиваясь этим); или любую подходящую комбинацию таких мутаций, но не ограничиваются ими.
Некоторыми неограничивающими примерами таких мутаций являются подходящие замены (при необходимости), так что после мутации в указанном положении присутствует один из следующих аминокислотных остатков: 28T, 39Q, 74S, 76N, 78L и 83R; или любую подходящую комбинацию таких замен (например, чтобы образовать мотив SKN в положениях 74-76). Кроме того, в случае необходимости (как дополнительно описано в настоящем документе), связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению могут иметь D в положении 1 (то есть мутацию E1D по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19), в частности, когда связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению присутствует и/или образует N-концевую часть соединения по изобретению, в котором он присутствует. Такие мутации могут снова подходящим образом сочетаться с одной или несколькими другими мутациями, как описано в настоящем документе (например, с одной или несколькими гуманизирующими заменами и/или одной или несколькими мутациями, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами).
Другие мутации, которые могут присутствовать в аминокислотных последовательностях по изобретению, будут понятны специалисту на основании раскрытия в данном документе.
Также возможно, что одна мутация (или подходящая комбинация мутаций) обеспечивает множество функциональных возможностей или преимуществ. Например, и без ограничения, гуманизирующая замена Q108L также может снижать связывание предсуществующими антителами.
Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры аминокислотных остатков (то есть мутаций по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18), которые могут присутствовать в аминокислотных последовательностях по изобретению (т.е. сами по себе или в подходящей комбинации), включают: 11V (т.е. L11V), 14P (т.е. A14P), 28T (т.е. N28T), 39Q (т.е. R39Q), 74S (т.е. A74S), 76N (т.е. K76N), 78L (т.е. A78L), 83R (т.е. E83R), 89L (т.е. V89L), 89T (т.е. V89T), 110K (например, T110K) или 110Q (например, T110Q); а также, где это необходимо (как дополнительно описано в настоящем документе), 1D (например, E1D) и/или С-концевое удлинение (X)n, как определено в данном документе (например, 114A). Ссылка также делается на последовательности и мутации, показанные на Фиг.4А и 4В. Например, некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры подходящих комбинаций таких аминокислотных остатков (то есть мутаций по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18) включают:
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, A74S, K76N, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, A74S, A78V, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, K76N, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, K76N, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, A78V, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, A74S, K76N, A78V, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, K76N, A78V, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, A74S, A78L, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, A78L, E83R, V89L;
- L11V, A14P, N28T, A74S, K76N, A78L, E83R, V89L; и
- L11V, A14P, N28T, R39Q, A74S, K76N, A78L, E83R, V89L;
и другие подходящие комбинации, которые будут понятны для специалиста на основании раскрытия в данном документе.
Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие аминокислотные последовательности по изобретению представляют собой такие, в которых (i) положение 11 представляет собой V, а положение 89 представляет собой L; (ii) положение 89 представляет собой Т; (iii) положения 74-76 образуют мотив SKN; (iv) положение 11 представляет собой V, положение 89 представляет собой L, а положения 74-76 образуют мотив SKN; где аминокислотные последовательности по изобретению являются такими, как описано далее в настоящем документе (и соответственно, могут также подходящим образом содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных мутаций, как описано в настоящем документе).
Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры аминокислотных последовательностей по изобретению приведены на фиг. 2 как:
- SEQ ID NO: 18-31, которые являются примерами аминокислотных последовательностей по изобретению без C-концевого аланинового удлинения;
- SEQ ID NO: 32-45, которые являются примерами аминокислотных последовательностей по изобретению с C-концевым удлинением (в каждом случае, примером которого является C-концевое аланиновое удлинение, которое обычно является предпочтительным C-концевым удлинением); и
- SEQ ID NO: 46-59, которые являются примерами аминокислотных последовательностей по изобретению с N-концевой мутацией E1D).
На основании дальнейшего раскрытия в данном документе для специалиста будет понятно, что на практике:
- связывающие альбумин агенты по изобретению с С-концевым удлинением (такие, как из SEQ ID NO: 32-45) часто будут использоваться/ присутствовать на С-концевой части полипептидов по изобретению (как определено в настоящем документе), в которых они присутствуют;
- связывающие альбумин агенты по изобретению с мутацией E1D (такие, как мутации с SEQ ID NO: 46-59) часто будут использоваться/ присутствовать на N-концевой части полипептидов по изобретению, в которых они присутствуют;
- связывающие альбумин агенты по настоящему изобретению без C-концевого удлинения и без мутации E1D (такой, как мутации SEQ ID NO: 18-31) часто будут присутствовать где-то в «середине» полипептида по изобретению.
Каждая из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18-59, а также белки, полипептиды и другие соединения и конструкции, содержащие их (как дополнительно описано в настоящем документе), образуют дополнительные аспекты настоящего изобретения.
В дополнительном аспекте изобретение относится к аминокислотной последовательности, которая является одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 или SEQ ID NO: 59; и каждая из этих аминокислотных последовательностей по изобретению (а также полипептиды по изобретению - как определено в настоящем документе - которые содержат такую аминокислотную последовательность по изобретению) образует дополнительный аспект настоящего изобретения.
Как дополнительно описано в данном документе, аминокислотные последовательности, обеспечиваемые изобретением, представляют собой белки, которые могут связываться и, в частности, могут специфически (как описано в настоящем документе) связываться с человеческим сывороточным альбумином. Таким образом, их можно использовать в качестве связывающих единиц или связывающих доменов для связывания с (человеческим) сывороточным альбумином, например, для обеспечения увеличения времени полужизни (как определено в настоящем документе) терапевтических соединений, фрагментов или веществ. Что касается использования связывающих сывороточный альбумин доменов для увеличения периода полужизни терапевтических соединений, фрагментов или веществ, то, например, приводится ссылка на WO 2004/041865, WO 2006/122787, EP 2139918, WO 2011/006915, WO 2012/175400 и/или WO 2014/111550. Связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению, как правило, можно использовать таким же образом и для тех же целей, что и связывающие сывороточный альбумин агенты, описанные в этих ссылках.
В некоторых дополнительных неограничивающих аспектах изобретение также относится к:
- белкам, полипептидам и другим конструкциям, молекулам или химическим веществам, которые содержат или по существу состоят по меньшей мере из одного связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению, как описано в настоящем документе (опять же, также упоминаемым в настоящем документе как «соединения по изобретению» или как «полипептиды по изобретению»);
- способам экспрессии/ получения связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению и/или соединения по изобретению;
- клетке-хозяину, организму-хозяину или другой (экспрессирующей) системе, которая может экспрессировать или продуцировать связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и/или соединение по изобретению;
- композициям и продуктам (таким как фармацевтические композиции и продукты), которые содержат связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и/или соединение по изобретению;
- нуклеотидным последовательностям и нуклеиновым кислотам, таким как (экспрессирующие) векторы, которые кодируют связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и/или соединения по изобретению;
- применению соединений по изобретению и/или соединениям по изобретению, такому как применение соединения по изобретению для увеличения (сывороточного) периода полужизни терапевтических соединений, фрагмента или вещества и терапевтического и/или профилактического применения соединения по изобретению.
Эти и дополнительные аспекты, варианты осуществления, преимущества, приложения и применения изобретения станут понятными из дальнейшего описания, приведенного в данном документе.
В настоящем описании:
- термин «одиночный вариабельный домен иммуноглобулина» (также называемый «ISV» или «ISVD») обычно используется для обозначения вариабельных доменов иммуноглобулина (которые могут быть доменами тяжелой цепи или легкой цепи, включая домены VH, VHH или VL), которые могут формировать функциональный антигенсвязывающий участок без взаимодействия с другим вариабельным доменом (например, без взаимодействия VH/VL, как требуется между доменами VH и VL обычного 4-цепочечного моноклонального антитела). Примеры ISVD будут понятны для специалиста и, например, включают нанотела (включая VHH, гуманизированный VHH и/или камелизированные VH, такие как камелизированные человеческие VH), IgNAR, домены, (однодоменные) антитела (такие как dAbs™), которые являются доменами VH или получены из домена VH, и (однодоменные) антитела (такие как dAbs™), которые являются доменами VL или получены из домена VL. Если здесь явно не указано иное, ISVD, которые основаны и/или получены из вариабельных доменов тяжелой цепи (таких как домены VH или VHH), обычно являются предпочтительными. Наиболее предпочтительно, если здесь явно не указано иное, ISVD будет нанотелом.
- термин «нанотело» в целом является таким, как он определен в WO 2008/020079 или WO 2009/138519, и таким образом, в конкретном аспекте, как правило, обозначает VHH, гуманизированный VHH или камелизированный VH (такой как камелизированный человеческий VH) или обычно VHH, оптимизированный по последовательности (такой как, например, оптимизированный по химической стабильности и/или растворимости, максимальному перекрыванию с известными человеческими каркасными областями и максимальной экспрессии). Следует отметить, что термины «нанотело» или «нанотела» являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V. и, следовательно, могут также упоминаться как Нанотело® и/или Нанотела®);
- как правило, если здесь не указано иное, ISVD, нанотела, полипептиды, белки и другие соединения и конструкции, упомянутые в настоящем документе, будут предназначены для использования в профилактике или лечении заболеваний или расстройств у человека (и/или при необходимости также у теплокровных животных, и в частности млекопитающих). Таким образом, как правило, ISVD, нанотела, полипептиды, белки и другие соединения и конструкции, описанные в настоящем документе, предпочтительно являются такими, что они могут быть использованы в качестве и/ или подходящим образом быть частью (биологического) лекарственного средства или другого фармацевтически или терапевтически активного соединения и/или фармацевтического продукта или композиции. Такое лекарственное средство, соединение или продукт предпочтительно является таким, что оно подходит для введения человеку, например, для профилактики или лечения субъекта, нуждающегося в такой профилактике или лечении, или, например, в рамках клинического испытания. Как дополнительно описано в настоящем документе, для этой цели такое лекарственное средство или соединение может содержать другие фрагменты, вещества или связывающие единицы, помимо ISVD, обеспечиваемых изобретением (которые, как также описано в настоящем документе, могут, например, представлять собой одну или несколько других дополнительных терапевтических групп и/или один или несколько других фрагментов, которые влияют на фармакокинетические или фармакодинамические свойства биологических препаратов на основе ISVD или нанотел, таких как их период полужизни). Подходящие примеры таких дополнительных терапевтических или других фрагментов будут понятны для специалиста в данной области техники и, например, обычно могут включать любой терапевтически активный белок, полипептид или другой связывающий домен или связывающую единицу, а также, например, такие модификации, как описано на страницах 149-152 WO 2009/138159. Биологический препарат на основе ISVD или биологический препарат на основе нанотел предпочтительно является терапевтическим средством или предназначен для использования в качестве терапевтического средства (что включает профилактику и диагностику) и для этой цели предпочтительно содержит по меньшей мере один ISVD против терапевтически релевантной мишени (такой как, например, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 или другие интерлейкины и т.д.). Для некоторых конкретных, но не ограничивающих примеров таких биологических препаратов на основе ISVD или нанотел приводится ссылка на Примеры 8-18, а также, например, на различные применения Ablynx N.V. (такие как, например, и без ограничения, WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 и WO 2009/068627), а также, например, (и без ограничения) на такие применения, как в WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 и WO 2007/085814. Кроме того, как дополнительно описано в настоящем документе, дополнительный фрагмент может представлять собой ISVD или нанотело, как описано в настоящем документе, направленное против (человеческого) сывороточного белка, такого как (человеческий) сывороточный альбумин, и такое ISVD или нанотело также может найти терапевтическое применение, в частности, в целях и/или для увеличения периода полужизни агентов, связывающих TNF, описанных в этом документе. Ссылка приводится, например, на WO 2004/041865, WO 2006/122787 и WO 2012/175400, которые в целом описывают использование связывающих сывороточный альбумин нанотел для увеличения времени полужизни. Кроме того, в настоящем описании, если здесь явно не указано иное, все термины, упомянутые в данном документе, имеют значение, приведенное в WO 2009/138519 (или в предшествующем уровне техники, процитированном в WO 2009/138519) или WO 2008/020079 (или в предшествующем уровне техники, цитированном в WO 2008/020079). Кроме того, когда способ или методика конкретно не описаны в данном документе, его можно выполнять, как описано в WO 2009/138519 (или в предшествующем уровне техники, цитируемом в WO 2009/138519) или WO 2008/020079 (или в предшествующем уровне техники, цитируемом в WO 2008/020079). Кроме того, как описано в настоящем документе, любой фармацевтический продукт или композиция, содержащая любой ISVD или соединение по изобретению, также может содержать один или несколько дополнительных компонентов, известных как таковые для использования в фармацевтических продуктах или композициях (т.е. в зависимости от предполагаемой фармацевтической формы) и/или, например, одно или несколько других соединений или активных компонентов, предназначенных для терапевтического применения (т.е. для обеспечения комбинированного продукта).
Кроме того, при использовании в настоящем описании или формуле изобретения следующие термины имеют то же значение, которое дано, и/или, где это применимо, могут быть определены способом, описанным на страницах 62-75 WO 2009/138519: «агонист», «антагонист», «обратный агонист», «неполярный незаряженный аминокислотный остаток», «полярный незаряженный аминокислотный остаток», «полярный заряженный аминокислотный остаток», «идентичность последовательности», «точно такой же» и «аминокислотное различие» (при ссылке на сравнение последовательностей двух аминокислотных последовательностей), «(в) по существу выделенной (форме)», «домен», «связывающий домен», «антигенная детерминанта», «эпитоп», «против» или «направленный против» (антигена), «специфичность» и «период полужизни». Кроме того, термины «модулирующий» и «модулировать», «сайт взаимодействия», «специфичный для», «перекрестно блокировать», «перекрестно блокированный» и «перекрестное блокирование» и «по существу независимые от рН» являются такими, как определено (и/или могут быть определены, как описано) на страницах 74-79 WO 2010/130832 от Ablynx NV. Кроме того, когда ссылаются на конструкцию, соединение, белок или полипептид по изобретению, такие термины, как «одновалентный», «двухвалентный» (или «поливалентный»), «биспецифичный» (или «полиспецифичный») и «бипаратопный» (или «полипаратопный») может иметь значение, приведенное в WO 2009/138519, WO 2010/130832 или WO 2008/020079.
Используемый в настоящем документе термин «период полужизни» в отношении ISVD, нанотела, биологического вещества на основе ISVD, биологического вещества на основе нанотела или любой другой аминокислотной последовательности, соединения или полипептида, на которые здесь ссылаются, обычно может быть определен, как описано в параграфе о) на странице 57 WO 2008/020079, и как упомянуто в нем, относится к времени, которое требуется для снижения концентрации в сыворотке аминокислотной последовательности, соединения или полипептида на 50% in vivo, например, из-за деградации последовательности или соединения и/или клиренса или секвестрации последовательности или соединения естественными механизмами. Период полужизни in vivo аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по изобретению может быть определен любым известным способом, таким как фармакокинетический анализ. Подходящие методики будут понятны специалисту в данной области техники и могут, например, в целом соответствовать описанному в параграфе (о) на странице 57 WO 2008/020079. Как также упомянуто в параграфе (о) на странице 57 WO 2008/020079, период полужизни может быть выражен с использованием таких параметров, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под фармакокинетической кривой (AUC). В этом отношении следует отметить, что термин «период полужизни», используемый в данном документе, в частности, относится к t1/2-бета или терминальному периоду полужизни (в котором t1/2-альфа и/или AUC или оба могут не рассматриваться). Ссылка приводится, например, на экспериментальную часть ниже, а также на стандартные справочники, такие как Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Ссылка также приводится на “Pharmacokinetics», M Gibaldi & D Perron, опубликованную Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Аналогично, термины «увеличение периода полужизни» или «увеличенный период полужизни» также определены в параграфе (о) на странице 57 WO 2008/020079 и, в частности, относятся к увеличению t1/2-бета, с увеличением или без увеличения t1/2-альфа и/или AUC, или обоих.
Когда термин конкретно не определен в данном документе, он имеет свое обычное значение в данной области техники, что будет понятно специалисту в данной области техники. Ссылка делается, например, на стандартные справочники, такие как Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., “Immunobiology” (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), а также на общий уровень техники, цитируемый в настоящем документе.
Также, как уже указывалось в настоящем документе, аминокислотные остатки нанотела пронумерованы в соответствии с общей нумерацией VH, приведенной Kabat et al. («Sequence of proteins of immunological interest», US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), применительно к доменам VHH верблюдовых в статье Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; или упоминается в настоящем документе. Согласно этой нумерации, FR1 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 из нанотела содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, а FR4 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В связи с этим, следует отметить, что - как хорошо известно в данной области техники для доменов VH и доменов VHH - общее количество аминокислотных остатков в каждом из CDR может меняться и может не соответствовать общему количеству аминокислотных остатков, обозначенных нумерацией по Kabat (то есть одно или несколько положений согласно нумерации по Kabat не могут быть заняты в фактической последовательности, или фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, допустимое для нумерации по Kabat). Это означает, что, как правило, нумерация по Kabat может соответствовать или не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в фактической последовательности. В целом, однако, можно сказать, что в соответствии с нумерацией Kabat и независимо от количества аминокислотных остатков в CDR положение 1 согласно нумерации Kabat соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 согласно нумерация Kabat соответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 в соответствии с нумерацией Kabat соответствует началу FR3 и наоборот, а положение 103 в соответствии с нумерацией Kabat соответствует началу FR4 и наоборот].
Альтернативные методы нумерации аминокислотных остатков доменов VH, которые также могут быть применены аналогичным образом к доменам VHH верблюдовых и к нанотелам, представляют собой метод, описанный Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое «определение AbM» и так называемое «контактное определение». Однако в настоящем описании, аспектах и фигурах будет использована нумерация по Kabat применительно к доменам VHH предложенная Riechmann и Muyldermans, если не указано иное.
Следует также отметить, что фигуры, любой список последовательностей и экспериментальная часть/примеры приведены только для дополнительной иллюстрации изобретения и не должны интерпретироваться или толковаться как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения каким-либо образом, если здесь явно не указано иное.
Как дополнительно описано в настоящем документе, связывающие сывороточный альбумин агенты по изобретению могут быть использованы с преимуществом в качестве фрагмента, связывающего звена или партнера по слиянию, чтобы увеличить период полужизни терапевтических соединений, фрагментов или веществ, таких как полипептиды, белки, соединения (включая малые молекулы, но не ограничиваясь ими) или другие терапевтические вещества.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к полипептидам, белкам, конструкциям, соединениям или другим химическим веществам, которые включают или по существу состоят из связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению и одной или нескольких других аминокислотных последовательностей, (связывающих) доменов, связывающих единиц, или других фрагментов или химических веществ.
В частности, изобретение относится к полипептидам, белкам, конструкциям, соединениям или другим химическим веществам, которые содержат связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и одну или несколько (например, одну или две) терапевтических составляющих (которые могут быть одинаковыми или разными, и могут, например, быть направлены против одной и той же мишени или разных мишеней, и когда они направлены на одну и ту же мишень, они могут быть направлены на одинаковые или разные эпитопы, части, домены или субъединицы указанной мишени), подходящим образом связанных друг с другом либо напрямую, либо через один или несколько подходящих линкеров или спейсеров. Такие полипептиды, белки или конструкции могут, например, и без ограничения, быть гибридным белком, как дополнительно описано в настоящем документе.
Изобретение, кроме того, относится к терапевтическому применению таких полипептидов, белков, конструкций или соединений, и к фармацевтическим композициям, содержащим такие полипептиды, белки, конструкции или соединения.
В одном аспекте по меньшей мере один терапевтический фрагмент включает или по существу состоит из терапевтического белка, полипептида, соединения, фактора или другого вещества. В предпочтительном варианте осуществления терапевтический фрагмент направлен против желаемого антигена или мишени, способен связываться с желаемым антигеном (и, в частности, способен специфически связываться с желаемым антигеном) и/или способен взаимодействовать с желаемой мишенью. В другом варианте осуществления по меньшей мере один терапевтический фрагмент включает или по существу состоит из терапевтического белка или полипептида. В дополнительном варианте осуществления по меньшей мере один терапевтический фрагмент содержит или по существу состоит из связывающего домена или связывающей единицы, такой как иммуноглобулин или последовательность иммуноглобулина (включая фрагмент иммуноглобулина, но не ограничиваясь им), такого как антитело или фрагмент антитела (включая фрагмент ScFv, но не ограничиваясь им) или другого подходящего белкового каркаса, такого как домены белка A (такие как Affibodies™), тендамистат, фибронектин, липокалин, CTLA-4, T-клеточные рецепторы, сконструированные анкириновые повторы, авимеры и PDZ домены (Binz et al., Nat. Biotech 2005, Vol. 23: 1257) и связывающие фрагменты на основе ДНК или РНК, включая аптамеры ДНК или РНК (Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8): 619-32), но не ограничиваясь ими.
В еще одном аспекте по меньшей мере один терапевтический фрагмент содержит или по существу состоит из вариабельного домена антитела, такого как вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи.
В предпочтительном аспекте по меньшей мере один терапевтический фрагмент содержит или по существу состоит по меньшей мере из одного одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, такого как доменное антитело, однодоменное антитело, «dAb» или нанотело (такое как VHH, гуманизированный VHH или камелизированный VH) или домен IgNAR.
В конкретном варианте осуществления по меньшей мере один терапевтический фрагмент включает или по существу состоит по меньшей мере из одного одновалентного нанотела или двухвалентной, поливалентной, биспецифической или полиспецифической конструкции нанотела.
Полипептиды, (гибридные) белки, конструкции или соединения, которые содержат связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и одну или несколько терапевтических групп, как правило, могут быть (получены и использованы), как описано в предшествующем уровне техники, цитированном выше (таком как WO 04/041865, WO 06/122787, WO 2012/175400 и WO 2015/173325; также приводится ссылка, например, на WO 2004/003019, EP 2139918, WO 2011/006915 и WO 2014/111550), со связывающим сывороточный альбумин агентом по изобретению вместо компонентов, повышающих период полужизни, описанных в указанном выше.
Полипептиды, (гибридные) белки, конструкции или соединения, которые содержат связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и одну или несколько терапевтических групп, как правило, и предпочтительно будут иметь увеличенный период полужизни (как описано в настоящем документе и предпочтительно выражено как t1/2-бета), по сравнению с терапевтическим фрагментом или фрагментами как таковыми.
Как правило, соединения, полипептиды, конструкции или гибридные белки, описанные в настоящем документе, предпочтительно имеют период полужизни (снова, как описано в настоящем документе, и предпочтительно выраженный как t1/2-бета), который по меньшей мере в 1,5 раза, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, например, по меньшей мере в 5 раз, например, по меньшей мере в 10 раз или более, чем в 20 раз, больше, чем период полужизни соответствующего терапевтического фрагмента как такового (как измерено у человека или подходящего животного, такого как мышь или яванская макака).
Также предпочтительно, любое такое соединение, полипептид, гибридный белок или конструкция имеют период полужизни (опять же, как описано в настоящем документе и предпочтительно выражено как t1/2-бета) у человека, который повышен по меньшей мере на 1 час, предпочтительно более чем на 2 часа, более предпочтительно более чем на 6 часов, например, более чем на 12 часов, по сравнению с периодом полужизни соответствующего терапевтического компонента как такового.
Также предпочтительно, соединение или полипептид по изобретению имеет период полужизни (опять же, как описано в настоящем документе, и предпочтительно выраженный как t1/2-бета) у человека, который составляет более 1 часа, предпочтительно более 2 часов, более предпочтительно более 6 часов, например, более 12 часов и, например, около одного дня, двух дней, одной недели, двух недель и до периода полужизни сывороточного альбумина у человека (по оценкам, около 19 дней).
Как упомянуто, в одном аспекте, связывающий сывороточный альбумин агент по настоящему изобретению используют для увеличения периода полужизни (одного или нескольких) одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, таких как доменные антитела, однодоменные антитела, dAb, VHH или нанотела (такие, как VHH, гуманизированные VHH или камелизированные VH, такие как камелизированные человеческие VH).
Таким образом, один из вариантов осуществления изобретения относится к полипептиду, конструкции или гибридному белку, который содержит связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и одну или несколько (например, одну или две) последовательности одиночного вариабельного домена иммуноглобулина, которые подходящим образом связаны друг с другом, либо напрямую, либо при необходимости через один или несколько подходящих линкеров или спейсеров. Как упомянуто в настоящем документе, каждый такой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, присутствующий в таком полипептиде, конструкции или гибридном белке, может независимо представлять собой доменное антитело, однодоменное антитело, «dAb» или нанотело (такое как VHH, гуманизированный VHH или камелизированный VH, такой как камелизированный человеческий VH); и в соответствии с одним конкретным, но не ограничивающим аспектом, по меньшей мере один (и до всех) из этих вариабельных доменов иммуноглобулина содержит два или три дисульфидных мостика. Предпочтительно все ISVD, присутствующие в таком соединении по изобретению, представляют собой нанотела.
Когда соединение по изобретению имеет ISVD на своем С-конце (такой, как связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению или ISVD, который направлен против терапевтической мишени), тогда указанный С-концевой ISVD (и, таким образом, путем удлинения, все соединение по изобретению) предпочтительно имеет С-концевое удлинение на своем С-конце. Это С-концевое удлинение будет напрямую связано с последним С-концевым аминокислотным остатком ISVD, который обычно будет аминокислотным остатком в положении 113 по Kabat (если только ISVD не содержит одну или несколько аминокислотных делеций, так что последовательность ISVD заканчивается до позиции 113). Таким образом, как правило, С-концевое удлинение будет напрямую связано с С-концевой последовательностью VTVSS (SEQ ID NO: 15) из С-концевого ISV (и, таким образом, путем удлинения, с С-концевой последовательностью TVTSS из соединения по изобретению) или C-концевой последовательностью из C-концевого ISVD, которая соответствует C-концевой последовательности ISVD (например, где указанная C-концевая последовательность C-концевого ISVD содержит одну или несколько замен или делеций по сравнению с обычной последовательностью VTVSS, такой как T110K, T110Q, S112K или S112K).
Специалисту в данной области техники также будет понятно, что в случае, когда соединение по изобретению содержит связывающий сывороточный альбумин агент по настоящему изобретению на своем С-конце, указанный связывающий сывороточный альбумин агент по настоящему изобретению будет нести указанное С-концевое удлинение.
Как правило, любое C-концевое удлинение, которое используется в данном документе (то есть на C-конце соединения по изобретению и/или на C-конце связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению), как правило, может быть таким, как описано в WO 2012/174741 или WO 2015/173325 (ссылка также приводится, например, на WO 2103/024059 и WO2016/118733). В частности, C-концевое удлинение может иметь формулу (X)n, в которой n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например 1); и каждый X представляет собой (предпочтительно природный) аминокислотный остаток, который независимо выбран из природных аминокислотных остатков (хотя согласно предпочтительному одному аспекту, он не содержит никаких остатков цистеина) и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I).
Согласно некоторым предпочтительным, но не ограничивающим аспектам таких C-концевых удлинений, X(n), X и n могут быть следующими:
(а) n = 1 и X = Ala;
(б) n = 2 и каждый X = Ala;
(с) n = 3 и каждый X = Ala;
(d) n = 2 и по меньшей мере один X = Ala (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
(e) n = 3 и по меньшей мере один X = Ala (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
(f) n = 3 и по меньшей мере два X = Ala (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
(g) n = 1 и X = Gly;
(h) n = 2 и каждый X = Gly;
(i) n = 3 и каждый X = Gly;
(j) n = 2 и по меньшей мере один X = Gly (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
(k) n = 3 и по меньшей мере один X = Gly (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
(l) n = 3 и по меньшей мере два X = Gly (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
(m) n = 2 и каждый X = Ala или Gly;
(n) n = 3 и каждый X = Ala или Gly;
(o) n = 3 и по меньшей мере один X = Ala или Gly (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой природной аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile); или
(p) n = 3 и по меньшей мере два X = Ala или Gly (причем оставшийся аминокислотный остаток (остатки) X независимо выбран из любой встречающейся в природе аминокислоты, но предпочтительно независимо выбран из Val, Leu и/или Ile);
причем аспекты (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) и (n) являются особо предпочтительными, причем аспекты, в которых n = 1 или 2, являются предпочтительными, и аспекты в которой n = 1, является особо предпочтительным.
Следует также отметить, что предпочтительно любое С-концевое удлинение, присутствующее в связывающем сывороточный альбумин агенте по изобретению, не содержит (свободного) остатка цистеина (если только указанный остаток цистеина не используется или не предназначен для дальнейшей функционализации, например, для пегилирования).
Некоторыми конкретными, но не ограничивающими примерами полезных C-концевых удлинений являются следующие аминокислотные последовательности: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA или GAG.
Также предпочтительно, когда соединение по изобретению имеет ISVD на своем С-конце (такой, как связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению или ISVD, который направлен против терапевтической мишени), тогда (по меньшей мере) указанный С-концевой ISVD предпочтительно содержит, еще более предпочтительно в дополнение к C-концевому удлинению, как описано в настоящем документе, одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами (то есть, как описано в настоящем документе для связывающих сывороточный альбумин агентов по изобретению, и как более широко описано в WO 2012/175741 и WO 2015/173325, а также, например, в WO 2013/024059 и WO 2016/118733). В этом отношении специалисту будет понятно, что в случае, когда соединение по настоящему изобретению имеет связывающий сывороточный альбумин агент по настоящему изобретению на своем С-конце, тогда (по меньшей мере) указанный связывающий сывороточный альбумин агент по настоящему изобретению предпочтительно будет содержать такие мутации (т.е. предпочтительно в дополнение к C-концевому удлинению).
В более общем смысле, в соответствии с конкретным аспектом изобретения, когда соединение по изобретению содержит два или более ISVD (например, связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и один или несколько ISVD против терапевтической мишени), тогда предпочтительно все эти ISVD содержат мутации, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами (опять же, предпочтительно в дополнение к C-концевому удлинению, которое связано с C-концевым ISVD, если соединение по изобретению имеет ISVD на своей C-конце).
Когда соединение по изобретению имеет ISVD на своей N-концевой части (такой, как связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению или ISVD, который направлен против терапевтической мишени), тогда указанный N-концевой ISVD (и, таким образом, путем удлинения, все соединение по изобретению) предпочтительно содержат D в положении 1. В этом отношении специалисту в данной области техники снова будет понятно, что в случае, когда соединение по изобретению имеет связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению на N-конце, то указанный связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению предпочтительно будет иметь D в положении 1 (например, мутацию E1D, по сравнению, например, с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19, такой как аминокислотные последовательности из изобретения SEQ ID NO: 46-59).
В некоторых дополнительных аспектах изобретение относится к белку, полипептиду или другому соединению или конструкции, которое содержит или по существу состоит из по меньшей мере одного (и предпочтительно, только одного) связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению, и по меньшей мере одного (например, одного, двух или трех) терапевтических фрагментов или веществ (в которых указанный связывающий сывороточный альбумин агент и один или несколько терапевтических фрагментов или веществ соответствующим образом связаны, при необходимости через один или несколько подходящих линкеров), причем этот белок, полипептид, соединение, конструкция являются такими, что:
- когда они имеют ISVD на своем C-конце, тогда указанный белок, полипептид, соединение, конструкция (их C-концевой ISVD) имеет C-концевое удлинение (X)n (как дополнительно описано в настоящем документе) на своем C-конце; и/или
- когда они имеют ISVD на своем C-конце, тогда по меньшей мере указанный C-концевой ISVD содержит одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание предсуществовавших антител (как дополнительно описано в настоящем документе);
- когда они имеют ISVD на своем N-конце, тогда указанный белок, полипептид, соединение, конструкция (их N-концевой ISVD) предпочтительно содержит D в положении 1; и/или
- в которых белок, полипептид или другое соединение могут также иметь ISVD на своей N-конце, и в этом случае указанный N-концевой ISVD предпочтительно имеет D или E1D в положении 1;
- предпочтительно, по существу все ISVD, присутствующие в указанном белке, полипептиде, соединении, конструкции, содержат одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание предсуществующих антител (как дополнительно описано в настоящем документе).
Согласно одному конкретному аспекту изобретения все терапевтические фрагменты, присутствующие в соединении по изобретению, представляют собой ISVD (т.е. ISVD против терапевтической мишени), и в частности ISVD тяжелой цепи, и более конкретно, нанотела (т.е. нанотела против терапевтической мишени).
Например, и без ограничения, такие соединения по изобретению могут содержать:
- одну копию связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению и один ISVD (и предпочтительно нанотело) против терапевтической мишени; или
- одну копия связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению и два ISVD (и предпочтительно два нанотела) против терапевтической мишени (где ISVD могут быть одинаковыми или разными, и когда они разные, то могут быть направлены против одной и той же мишени, против разных эпитопов на одной и той же мишени или против различных терапевтических мишеней); или
- одну копию связывающего сывороточный альбумин агента по изобретению и три ISVD (и предпочтительно три нанотела) против терапевтической мишени (где ISVD могут быть одинаковыми или разными, и когда они разные, то могут быть направлены против одной и той же мишени, против разных эпитопов на одной и той же мишени или против различных терапевтических мишеней).
Некоторые неограничивающие примеры конструкций, гибридных белков или полипептидов по изобретению могут быть схематически представлены следующим образом, где «[Альб]» представляет собой связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению, «[терапевтический фрагмент 1]» и «[терапевтический фрагмент» 2]» представляют терапевтические фрагменты (которые, как упоминалось, могут независимо представлять собой одиночный вариабельный домен иммуноглобулина), «-» представляет подходящий линкер (который является необязательным; подходящими примерами являются линкеры 9GS и 35GS), и N-конец находится с левой стороны, а С-конец - с правой стороны:
[Альб] - [терапевтический фрагмент 1]
[терапевтический фрагмент 1] - [Альб] -X(n)
[Альб] - [терапевтический фрагмент 1] - [терапевтический фрагмент 1]
[терапевтический фрагмент 1] - [терапевтический фрагмент 1] - [Альб] -X(n)
[терапевтический фрагмент 1] - [Альб] - [терапевтический фрагмент 1]
[Алью] - [терапевтический фрагмент 1] - [терапевтический фрагмент 2]
[терапевтический фрагмент 1] - [терапевтический фрагмент 2] - [Альб] -X(n)
[терапевтический фрагмент 1] - [Альб] - [терапевтический фрагмент 2]
Когда терапевтические фрагменты представляют собой ISVD (и предпочтительно нанотела) против терапевтической мишени, предпочтительные, но не ограничивающие конструкции, гибридные белки или полипептиды по изобретению могут быть схематически представлены следующим образом, где «[Альб]» представляет собой связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению, «[терапевтический ISVD 1]» и «[терапевтический ISVD 2]» представляют собой ISVD против терапевтической мишени (где ISVD могут быть одинаковыми или разными, и когда они разные, то могут быть направлены против одной и той же мишени, против разных эпитопов на одной и той же мишени или против различных терапевтических мишеней), «-» представляет подходящий линкер (который является необязательным), X(n) представляет С-концевое удлинение, как описано в данном документе, и N-конец находится на левой стороне, а C- конец находится на правой стороне:
[Альб] - [терапевтический ISVD 1] -X(n)
[терапевтический ISVD 1] - [Альб] -X(n)
[Альб] - [терапевтический ISVD 1] - [терапевтический ISVD 1] -X(n)
[терапевтический ISVD 1] - [терапевтический ISVD 1] - [Альб] -X(n)
[терапевтический ISVD 1] - [Альб] - [терапевтический ISVD 1] -X(n)
[Альб] - [терапевтический ISVD 1] - [терапевтический ISVD 2] -X(n)
[терапевтический ISVD 1] - [терапевтический ISVD 2] - [Альб] -X(n)
[терапевтический ISVD 1] - [Альб] - [терапевтический ISVD 2] -X(n).
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к полиспецифической (и в частности, биспецифической) конструкции нанотела, которая содержит связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и по меньшей мере одно другое нанотело (такое, как одно или два других нанотела, которые могут быть одинаковыми или разными), где указанное по меньшей мере один другое нанотело предпочтительно направлено против желаемой мишени (которая предпочтительно является терапевтической мишенью) и/или другое нанотело, которое полезно или пригодно для терапевтических, профилактических и/или диагностических целей. Опять же, связывающий сывороточный альбумин агент по изобретению и другие нанотела могут быть подходящим образом связаны друг с другом либо напрямую, либо при необходимости через один или несколько подходящих линкеров или спейсеров.
Для общего описания поливалентных и полиспецифических полипептидов, содержащих одно или несколько нанотел, и их получения также приводится ссылка на Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; а также, например, WO 96/34103, WO 99/23221, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
В качестве иллюстрации некоторые примеры соединений по настоящему изобретению приведены в SEQ ID NO: 61-67 с использованием анти-HER2-нанотела SEQ ID NO: 60 в качестве типичного примера нанотела, направленного против мишени, и с составляющими нанотела, находящимися в разных положениях в соединении по изобретению. Соединения SEQ ID NO: 61-64 являются примерами, иллюстрирующими двухвалентные биспецифичные соединения по изобретению, а соединения SEQ ID NO: 65-67 являются примерами, иллюстрирующими трехвалентные биспецифичные соединения по изобретению. В каждом случае соединения содержат мутацию E1D и C-концевой остаток аланина и содержат репрезентативные, но не ограничивающие примеры использования подходящих линкеров (то есть линкера 15GS в SEQ ID NO: 62 и 63 и или линкеров 35GS в SEQ ID NO: 61 и 64 - 67).
Некоторые другие примеры некоторых конкретных полиспецифичных и/или поливалентных полипептидов по изобретению можно найти в заявках Ablynx N.V., упомянутых в настоящем документе. В частности, для общего описания поливалентных и полиспецифичных конструкций, включающих по меньшей мере одно нанотело против белка сыворотки для увеличения времени полужизни, нуклеиновых кислот, кодирующих его, композиций, содержащих их, приготовления вышеупомянутого, и использования вышеупомянутого приводится ссылка на указанные выше международные заявки WO 04/041865 и WO 06/122787 (описанные в настоящем документе связывающие сывороточный альбумин агенты, как правило, можно использовать аналогично описанным в них нанотелам с увеличенным периодом полужизни, таким как Alb-8), а также на общее описание и конкретные примеры таких конструкций, приведенные, например, в WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям или нуклеиновым кислотам, которые кодируют связывающие альбумин агенты, соединения или полипептиды по изобретению. Изобретение, кроме того, включает генетические конструкции, которые включают вышеуказанные нуклеотидные последовательности или нуклеиновые кислоты и один или несколько элементов для генетических конструкций, известных как таковые. Генетическая конструкция может быть в форме плазмиды или вектора. Опять же, такие конструкции обычно могут быть такими, как описано в опубликованных патентных заявках Ablynx N.V., таких как, например, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
Изобретение также относится к хозяевам или клеткам-хозяевам, которые содержат такие нуклеотидные последовательности или нуклеиновые кислоты и/или которые экспрессируют (или способны экспрессировать) связывающие альбумин агенты, соединения или полипептиды по изобретению. Опять же, такие клетки-хозяева могут быть в целом такими, как описано в опубликованных патентных заявках Ablynx N.V., таких как, например, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
Изобретение также относится к способу получения связывающего альбумин агента, соединения или полипептида по изобретению, который включает культивирование или поддержание клетки-хозяина, как описано в настоящем документе, в условиях, при которых указанная клетка-хозяин продуцирует или экспрессирует связывающий альбумин агент, соединение или полипептид по изобретению, и при необходимости дополнительно включает выделение связывающего альбумин агента, соединения или полипептида по изобретению, полученного таким образом. Опять же, такие способы могут быть выполнены, как в целом описано в опубликованных патентных заявках Ablynx N.V., таких как, например, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере одно соединение или полипептид по изобретению, и при необходимости по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Такие препараты, носители, наполнители и разбавители обычно могут быть такими, как описано в опубликованных патентных заявках Ablynx NV, таких как, например, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
Однако, поскольку соединения или полипептиды по изобретению имеют увеличенный период полужизни, их предпочтительно вводят в кровоток. Как таковые, их можно вводить любым подходящим способом, который позволяет соединению или полипептиду по изобретению поступать в кровоток, например, внутривенно, посредством инъекции или инфузии, или любым другим подходящим способом (включая пероральное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, введение через кожу, интраназальное введение, введение через легкие и т.д.). Подходящие способы и пути введения будут понятны специалисту, опять же, например, также из учения опубликованных заявок на патент Ablynx NV, таких как, например, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, которое можно предотвратить или лечить с помощью соединения или полипептида по изобретению, причем этот способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтически активного количества соединения или полипептида по изобретению и/или фармацевтической композиции, содержащей его. Заболевания и расстройства, которые могут быть предотвращены или излечены с использованием соединения или полипептида по изобретению, как описано в настоящем документе, в целом будут такими же, как заболевания и расстройства, которые можно предотвратить или лечить с использованием терапевтического фрагмента или фрагментов, которые присутствуют в соединении или полипептиде по изобретению.
В контексте настоящего изобретения термин «профилактика и/или лечение» включает не только профилактику и/или лечение заболевания, но также обычно включает предотвращение возникновения заболевания, замедление или обращение прогрессирования заболевания, предотвращение или замедление развития одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение и/или ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, уменьшение тяжести и/или продолжительности заболевания и/или любых связанных с ним симптомов, и/или предотвращение дальнейшего усиления тяжести заболевания и/или любых связанных с ним симптомов, предотвращение, уменьшение или устранение любого физиологического повреждения, вызванного заболеванием, и как правило, любое фармакологическое действие, которое полезно для пациента, подвергающегося лечению.
Субъектом, подлежащим лечению, может быть любое теплокровное животное, но, в частности, это млекопитающее и, в частности, человек. Как будет понятно специалисту в данной области техники, подлежащим лечению субъектом будет, в частности, человек, страдающий или подверженный риску заболеваний и расстройств, упомянутых в настоящем документе.
В другом варианте воплощения изобретение относится к способу иммунотерапии, в частности к пассивной иммунотерапии, который включает введение субъекту, страдающему или подверженному риску заболеваний и расстройств, упомянутых в настоящем документе, фармацевтически активного количества соединения или полипептида по изобретению и/или фармацевтической композиции, содержащей их.
Соединение или полипептид по изобретению и/или композиции, содержащие их, вводят в соответствии с режимом лечения, который подходит для профилактики и/или лечения заболевания или расстройства, которое необходимо предотвратить или лечить. Клиницист, как правило, сможет определить подходящую схему лечения, в зависимости от таких факторов, как заболевание или расстройство, которое нужно предотвратить или лечить, тяжесть заболевания, подлежащего лечению, и/или тяжесть его симптомов, специфический полипептид по изобретению, которое следует использовать, конкретный путь введения и фармацевтический состав или композиция, которые должны использоваться, возраст, пол, масса тела, диета, общее состояние пациента и подобные факторы, хорошо известные врачу.
Обычно схема лечения будет включать введение одного или нескольких соединений или полипептидов по изобретению, или одной или нескольких композиций, содержащих их, в одном или нескольких фармацевтически эффективных количествах или дозах. Конкретное количество (количества) или дозы, которые следует вводить, могут быть определены врачом, опять же, на основе факторов, указанных выше.
Как правило, для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств, упомянутых в настоящем документе, и в зависимости от конкретного заболевания или расстройства, подлежащего лечению, активности и/или периода полужизни соединений или полипептидов по изобретению, которые следует использовать, конкретного пути введения и конкретной используемой фармацевтической композиции или состава, соединения или полипептиды по изобретению, как правило, будут применяться в количестве от 1 грамма до 0,01 микрограмма на кг массы тела в сутки, предпочтительно от 0,1 грамма до 0,1 микрограмма на кг массы тела в сутки, таком как приблизительно 1, 10, 100 или 1000 микрограмм на кг массы тела в сутки, либо непрерывно (например, путем инфузии), в виде однократной суточной дозы, либо в виде нескольких разделенных доз в течение дня. Клиницист, как правило, сможет определить подходящую суточную дозу в зависимости от факторов, упомянутых здесь. Также будет ясно, что в определенных случаях врач может выбрать отклонение от этих количеств, например, на основе факторов, упомянутых выше, и своего экспертного заключения. Как правило, некоторые указания относительно вводимых количеств можно получить из количеств, обычно применяемых для сопоставимых обычных антител или фрагментов антител против одной и той же мишени, вводимых по существу одним и тем же путем, принимая во внимание, однако, различия в аффинности/авидности, эффективности, биораспределении, периоде полужизни и подобных факторах, хорошо известных специалисту.
Кроме того, поскольку соединения по изобретению содержат связывающий сывороточный альбумин агент, увеличивающий время полужизни по изобретению, их не нужно вводить по существу непрерывно (например, путем инфузии), но их можно вводить с подходящими интервалами (которые определяет специалист в данной области техники). Например, их можно вводить (в подходящей дозе) один раз каждые два дня, один раз каждые четыре дня, один раз в неделю, один раз каждые две недели и в некоторых случаях один раз каждые четыре недели или даже реже, например, путем инъекции или инфузии.
Один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение или полипептид по изобретению, где указанная композиция предназначена для введения с интервалом от одного раза в неделю до одного раза каждые 4 недели, и в частности, от одного раза каждые 7 дней до одного раза каждые 21 день, например, один раз каждые 7 дней или 14 дней.
Обычно в вышеуказанном способе будет использоваться один полипептид по изобретению. Однако в объем изобретения входит применение двух или более полипептидов по изобретению в комбинации.
Полипептиды по изобретению также могут быть использованы в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями или веществами, то есть в качестве комбинированной схемы лечения, которая может приводить или не приводить к синергетическому эффекту. Опять же, клиницист сможет выбрать такие дополнительные соединения или вещества, а также подходящую комбинированную схему лечения, основываясь на вышеупомянутых факторах и своем экспертном заключении.
В частности, полипептиды по изобретению можно использовать в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или веществами, которые используются или могут быть использованы для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств, которые можно предотвратить или лечить гибридными белками или конструкциями по изобретению, и в результате чего может быть достигнут или не достигнут синергетический эффект.
Эффективность схемы лечения, используемой в соответствии с изобретением, может быть определена и/или отслежена любым способом, известным как таковые для данного заболевания или расстройства, как будет понятно врачу. Врач также сможет, в случае необходимости и в каждом конкретном случае, изменять или модифицировать конкретную схему лечения, чтобы достичь необходимого терапевтического эффекта, чтобы избежать, ограничить или уменьшить нежелательные побочные эффекты, и/или для обеспечения надлежащего баланса между достижением необходимого терапевтического эффекта, с одной стороны, и предотвращением, ограничением или уменьшением нежелательных побочных эффектов, с другой стороны.
Как правило, режим лечения будет соблюдаться до тех пор, пока не будет достигнут необходимый терапевтический эффект и/или до тех пор, пока должен поддерживаться необходимый терапевтический эффект. Опять же, это может определить врач.
Другие аспекты, варианты осуществления, преимущества и применения изобретения станут понятными из дальнейшего описания, приведенного здесь.
Теперь изобретение будет дополнительно описано посредством следующих неограничивающих предпочтительных аспектов, примеров и фигур, на которых:
фиг. 1 представляет собой таблицу, в которой перечислены некоторые положения аминокислот, которые будут конкретно упоминаться в данном документе, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации (такими как Aho и IMGT);
на фиг. 2 перечислены аминокислотные последовательности, упомянутые в настоящем документе;
фиг. 3А и 3В демонстрируют выравнивание последовательностей SEQ ID NO: 18 и 19 (по изобретению) с последовательностями из предшествующего уровня техники SEQ ID NO: 1 и 2;
фиг. 4 демонстрирует выравнивание SEQ ID NO: 18-59;
фиг. 5 демонстрирует выравнивание сывороточного альбумина от разных видов млекопитающих;
фиг. 6 представляет собой график, показывающий связывание SEQ ID NO: 1 (эталон)-cMycHis6 с покрытием из человеческого сывороточного альбумина в присутствии связывающего сывороточный альбумин агента из SEQ ID NO: 20 (по изобретению). 1,5 нМ SEQ ID NO: 1-cMycHis6 и серии концентраций His6Flag3-SEQ ID NO: 1 (эталон), Flag3His6-SEQ ID NO: 20 (по изобретению) или cAblys3-Flag3His6 (эталон) инкубировали на покрытии из HSA. Связанный SEQ ID NO: 1-cMycHis6 проявляли с использованием козьих анти-сМус и меченных пероксидазой хрена кроличьих анти-козьих антител;
фиг. 7 представляет собой график, показывающий связывание HSA с FcRn в присутствии связывающего сывороточный альбумин агента из SEQ ID NO: 20 (по изобретению). Гетеродимер человеческого FcRn- человеческого β2-микроглобулина иммобилизовали на чипе CM5. Связывание 1 мкМ HSA при отсутствии или в присутствии 2 мкМ нанотела в 50 мМ NaPO4 + 150 мМ NaCl + 0,05% Tween-20 pH 6,0 контролировали на приборе Biacore T100.
Полное содержание всех ссылок (включая литературные ссылки, изданные патенты, опубликованные патентные заявки и находящиеся на рассмотрении патентные заявки), процитированных в настоящем документе, настоящим включено посредством ссылки, в частности, для тех раскрытий, на которые есть ссылки выше.
Экспериментальная часть
Пример 1. Аффинность к сывороточному альбумину
Аффинность связывающего сывороточный альбумин агента SEQ ID NO: 19 (по изобретению) к сывороточному альбумину человека (Sigma-Aldrich A3782), яванской макаки (полученному самостоятельно), мыши (Albumin Bioscience 2601), крысы (Sigma-Aldrich A4538), кролика (Sigma-Aldrich A0764), морской свинки (Gentaur GPSA62), свиньи (Sigma-Aldrich A4414), овцы (Sigma-Aldrich A3264), собаки (Abcam 119814) и быка (Sigma-Aldrich A3059) оценивали посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе ProteOn XPR36 (BioRad). Сывороточный альбумин был иммобилизован посредством связывания по аминогруппе на чипе GLC ProteOn с использованием набора для иммобилизации по аминогруппе ProteOn (BioRad). Различные концентрации (300 нМ, 100 нМ, 33,3 нМ, 11,1 нМ, 3,7 нМ и 1,23 нМ) связывающего сывороточный альбумин агента SEQ ID NO: 19 (по изобретению) вводили в буфере HBS-P + pH 7,4 (GE Healthcare) со скоростью 45 мкл/мин в течение 120 сек, с последующей диссоциацией в течение 900 сек. Наблюдалось отсутствие или очень низкое связывание для SEQ ID NO: 19 с СА овцы и быка. Аффинность SEQ ID NO: 19 к СА человека, яванской макаки, крысы, мыши и морской свинки находилась в пикомолярном диапазоне (таблица 1). Кроме того, отмечена перекрестная реакция SEQ ID NO: 19 с СА собаки, а также связывание со слабой аффинностью с СА свиньи и кролика.
Таблица 1. Кинетические параметры связывания для связывающего сывороточный альбумин агента SEQ ID NO: 19 (по изобретению) с СА разных видов.
(s-1M-1)
(s-1)
(M)
(s-1M-1)
(s-1)
(M)
Длительный период полужизни альбумина в крови обусловлен в основном двумя характеристиками: (i) большой размер (65 кДа) альбумина ограничивает его клубочковую фильтрацию; и (ii) альбумин связывается с FcRn при низком значении pH (pH 6), что защищает альбумин от деградации в лизосомах после пассивного эндоцитоза в эндотелиальных и эпителиальных клетках путем рециркуляции из ранней эндосомы обратно во внеклеточную среду. Чтобы альбумин-связывающие нанотела приводили к длительному периоду полужизни в сыворотке за счет связывания альбумина и последующей рециркуляции, они должны оставаться связанными с альбумином в диапазоне рН от 5,0 до 7,4. Скорость диссоциации связывающего сывороточный альбумин агента SEQ ID NO: 19 (по изобретению) с HSA при pH 5, pH 6 и pH 7,4 измеряли на приборе ProteOn, как описано выше, включая SEQ ID NO: 1 в качестве эталона. Связывающие сывороточный альбумин агенты SEQ ID NO: 19 (по изобретению) и SEQ ID NO: 1 вводили при 500 нМ и 300 нМ, соответственно, в буфере HBS-P+ pH 7,4. Буферы диссоциации представляли собой 50 мМ NaOAc/ HOAc + 150 мМ NaCl + 0,05% Твин-20, рН 5,0; 50 мМ NaOAc/ HOAc + 150 мМ NaCl + 0,05% Твин-20, рН 6,0; и HBS-P+ рН 7,4, соответственно. Диссоциацию анализировали в течение 2700 с. Скорости диссоциации для SEQ ID NO: 19 существенно не различаются в диапазоне pH от 5,0 до 7,4 (таблица 2).
Таблица 2 Скорость диссоциации связывающего сывороточный альбумин агента SEQ ID NO: 19 (по изобретению) с HSA при различных значениях рН.
Диссоциацию контролировали при рН 5,0; 6,0 и 7,4 на приборе ProteOn.
Пример 2. Эпитоп
Связывание с эпитопами анализировали в конкурентном ELISA. Человеческий сывороточный альбумин наносили в концентрации 125 нг/мл в PBS при 4°С в течение ночи. После блокирования с помощью PBS + 1% казеин добавляли 1,5 нМ SEQ ID NO: 1-cMycHis6 и серии концентраций конкурентов (His6Flag3-SEQ ID NO: 20, His6Flag3-SEQ ID NO: 1 в качестве положительного контроля или связывающее лизоцим куриного яйца однодоменное антитело cAblys3-Flag3His6 в качестве отрицательного контроля). Связанный SEQ ID NO: 1-cMycHis6 проявляли с использованием козьих антител против cMyc (Abcam ab19234) и HRP-меченых кроличьих анти-козьих (Genway 18-511-244226) антител. Связывающий альбумин агент SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 1 не связывали идентичные эпитопы на HSA (фиг. 6).
Пример 3. Интерференция с взаимодействием между SA и FcRn
Для связывающего сывороточный альбумин агента SEQ ID NO: 19 (по изобретению) с целью обеспечения длительного периода полужизни посредством связывания альбумина и последующей рециркуляции не должно быть интерференции со связыванием альбумина с FcRn. Это было проанализировано в SPR на приборе Biacore T100 (GE Healthcare). Гетеродимер человеческого FcRn - человеческого β2-микроглобулина (Sino Biological CT009-H08H) иммобилизовали на чипе СМ5 с помощью стандартной иммобилизации по аминогруппе (набор для иммобилизации по аминогруппе Biacore). Смесь 1 мкМ HSA и 2 мкМ нанотела (His6Flag3-SEQ ID NO: 20, His6Flag3-SEQ ID NO: 1 или cAblys3-Flag3His6) в 50 мМ NaPO4 + 150 мМ NaCl + 0,05% Tween-20, pH 6,0, вводили со скоростью 10 мкл/мин в течение 120 секунд с последующей диссоциацией в течение 600 секунд. Кривые связывания качественно сравнивали с кривой связывания 1 мкМ HSA в отсутствие нанотела. Связывающий альбумин агент из SEQ ID NO: 20 (по изобретению) не влиял на связывание HSA с FcRn (фиг. 7).
Пример 4: Фармакокинетический профиль у собаки.
Фармакокинетику трехвалентной конструкции нанотела (SEQ ID NO: 68) после однократного внутривенного введения изучали у собак. Трехвалентная конструкция была получена в Pichia pastoris и содержала два нанотела против респираторно-синцитиального вируса (RSV) со связывающим альбумин нанотелом SEQ ID NO: 19 на С-конце(где три нанотела связаны друг с другом с помощью (Gly4Ser )7 линкеров).
Фармакокинетический профиль конструкции оценивали в фармакокинетическом исследовании (не-перекрестном, однодозовом) у двенадцати здоровых собак породы бигль натощак (здоровых, как определено предварительным исследованием здоровья). Конструкцию вводили внутривенно.
Животные не получали пищи (без ограничения доступа к воде) в течение ночи перед введением дозы и перед сбором образцов крови перед введением препарата, через 24, 168 и 336 часов после введения препарата (общее время голодания не более 24 часов). Пищу возвращали через 4 часа после введения препарата или сразу после взятия крови через 24, 168 и 336 часов. Массу тела также регистрировали и контролировали во время исследования.
1 мл цельной крови (или 2-3 мл перед введением препарата и через 24, 168 и 336 часов) для получения плазмы отбирали из периферического сосуда перед введением препарата и через 5, 15, 30 мин и через 1, 4, 8, 12, 24, 72, 168, 240, 336, 504 и 672 часа после начального введения препарата. Собранные образцы для обработки сыворотки хранили при комнатной температуре и обеспечивали возможность свертывания. Кровь центрифугировали при 10000 об./мин в течение 2 минут с использованием центрифуги с охлаждением (установленной для поддержания 4°C). Образцы замораживали в течение 30 минут с момента сбора и хранили до передачи для анализа (включая измерение концентрации соответствующей конструкции нанотела).
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> АБЛИНКС НВ
<120> УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН
<130> 202811
<150> US62/446,992
<151> 2017-01-17
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reference
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reference
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 (Kabat)
<400> 3
Ser Phe Gly Met Ser
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 (Kabat)
<400> 4
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 (Kabat/Abm)
<400> 5
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 (Abm)
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 (Abm)
<400> 7
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 (Kabat/Abm)
<400> 8
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 (Kabat)
<400> 9
Ser Tyr Val Met Gly
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 (Kabat)
<400> 10
Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 (Abm)
<400> 11
Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr Val Met Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 (Abm)
<400> 12
Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr Val Met Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 (Abm)
<400> 13
Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 (Abm)
<400> 14
Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-terminal sequence
<400> 15
Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15 GS linker
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 17
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 35 GS linker
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 18
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 33
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 42
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 44
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 45
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 46
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 46
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 47
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 47
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 48
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 49
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 50
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 51
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 52
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 53
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 54
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 55
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 56
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 57
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 58
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ISVD
<400> 59
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-HER2-Nanobody
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 278
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bivalent bispecific compound
<400> 61
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Arg
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly
195 200 205
Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala
245 250 255
Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Ala
275
<210> 62
<211> 258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bivalent bispecific compound
<400> 62
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ile Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Lys Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln
225 230 235 240
Ser Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Ala
<210> 63
<211> 258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bivalent bispecific compound
<400> 63
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
130 135 140
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
145 150 155 160
Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr
165 170 175
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser
180 185 190
Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
210 215 220
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala
225 230 235 240
Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Ala
<210> 64
<211> 278
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bivalent bispecific compound
<400> 64
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr
180 185 190
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
195 200 205
Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg
245 250 255
Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Ala
275
<210> 65
<211> 431
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trivalent bispecific compound
<400> 65
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly
195 200 205
Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln
245 250 255
Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
305 310 315 320
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser
325 330 335
Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
340 345 350
Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
355 360 365
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr
370 375 380
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
385 390 395 400
Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu
405 410 415
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425 430
<210> 66
<211> 431
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trivalent bispecific compound
<400> 66
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys
85 90 95
Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Arg
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly
195 200 205
Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala
245 250 255
Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala
340 345 350
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp
355 360 365
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly
405 410 415
Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425 430
<210> 67
<211> 431
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trivalent bispecific compound
<400> 67
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr
180 185 190
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
195 200 205
Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg
245 250 255
Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
325 330 335
Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala
340 345 350
Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp
355 360 365
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly
405 410 415
Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
420 425 430
<210> 68
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trivalent compound
<400> 68
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Leu Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ser Tyr Ile Tyr Ile Trp
100 105 110
Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
165 170 175
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
180 185 190
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
195 200 205
Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
210 215 220
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
225 230 235 240
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
245 250 255
Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Thr Ser Thr Asn Pro Gly Ser Tyr Ile Tyr
260 265 270
Ile Trp Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
325 330 335
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr
340 345 350
Ile Ser Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu
355 360 365
Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
385 390 395 400
Lys Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
405 410 415
Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Ala Trp Tyr Ser Gln Ser
420 425 430
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
435 440 445
<210> 69
<211> 609
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu
<210> 70
<211> 607
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 70
Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala
1 5 10 15
Phe Ser Arg Gly Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His
20 25 30
Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile
35 40 45
Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys
50 55 60
Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu
65 70 75 80
Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
85 90 95
Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp
100 105 110
Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His
115 120 125
Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu
130 135 140
Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His
145 150 155 160
Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys
180 185 190
Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val
195 200 205
Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser
210 215 220
Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys
245 250 255
Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys
275 280 285
Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr
305 310 315 320
Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln
325 330 335
Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr
340 345 350
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu
355 360 365
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys
370 375 380
Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe
385 390 395 400
Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp
405 410 415
Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val
420 425 430
Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
435 440 445
Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro
450 455 460
Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu
465 470 475 480
Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val
485 490 495
Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser
500 505 510
Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu
515 520 525
Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys
530 535 540
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro
545 550 555 560
Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln
565 570 575
Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser
580 585 590
Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala
595 600 605
<210> 71
<211> 608
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 71
Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala
1 5 10 15
Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ile
50 55 60
Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Asn Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Gly Glu Leu Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Phe Gln Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Gln Glu Asn Pro Thr Ser Phe Leu Gly
145 150 155 160
His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Lys Tyr Asn Glu Val Leu Thr Gln Cys
180 185 190
Cys Thr Glu Ser Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala
195 200 205
Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ala Ala Val Arg Gln Arg Met Lys Cys
210 215 220
Ser Ser Met Gln Arg Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr
245 250 255
Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Ile Asn Lys Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Ala Cys Cys Asp
290 295 300
Lys Pro Val Leu Gln Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Ile Glu His Asp
305 310 315 320
Asn Ile Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp
325 330 335
Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Glu Gly Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu
385 390 395 400
Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu
450 455 460
Pro Glu Ala Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile
465 470 475 480
Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Lys Glu
530 535 540
Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Glu Asp Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Ala
565 570 575
Gln Phe Val Asp Lys Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Asn Cys Phe
580 585 590
Ala Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala
595 600 605
<210> 72
<211> 607
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 72
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Glu Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser
115 120 125
His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn
130 135 140
Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys
180 185 190
Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu Thr Met
195 200 205
Arg Glu Lys Val Leu Thr Ser Ser Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala
210 215 220
Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys
245 250 255
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
275 280 285
Asp Asn Gln Asp Thr Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala
305 310 315 320
Ile Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys
325 330 335
Asp Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Ala Phe Leu Gly Ser
340 345 350
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val
355 360 365
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Glu Cys Cys
370 375 380
Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys Leu
385 390 395 400
Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Asp
405 410 415
Gln Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val
420 425 430
Arg Tyr Thr Arg Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
435 440 445
Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro
450 455 460
Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu
465 470 475 480
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val
485 490 495
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
500 505 510
Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys
515 520 525
Leu Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys
530 535 540
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro
545 550 555 560
Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala
565 570 575
Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala
580 585 590
Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Val Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala
595 600 605
<210> 73
<211> 607
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 73
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Lys Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ser Gln His Leu Gln Gln Cys Pro Tyr Glu Glu His Val
50 55 60
Lys Leu Val Arg Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Ala Ile Pro Ser Leu Arg Glu His Tyr Gly Asp Leu Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asn Asp Asn Pro Asp Ile Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Val
130 135 140
Ala Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Glu Gln Lys Phe Trp Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Tyr Tyr Ala Ile Ile Tyr Lys Asp Val Phe Ser Glu Cys Cys
180 185 190
Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu His Leu
195 200 205
Arg Glu Lys Val Leu Thr Ser Ala Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala
210 215 220
Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Leu Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Glu Ile Ser Lys
245 250 255
Ile Val Thr Asp Leu Ala Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
275 280 285
Glu Asn Gln Asp Thr Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Ala Lys Arg Asp Glu
305 310 315 320
Leu Pro Ala Asp Leu Asn Pro Leu Glu His Asp Phe Val Glu Asp Lys
325 330 335
Glu Val Cys Lys Asn Tyr Lys Glu Ala Lys His Val Phe Leu Gly Thr
340 345 350
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu
355 360 365
Leu Leu Arg Ile Ala Lys Ile Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys
370 375 380
Ala Lys Glu Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Phe
385 390 395 400
Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu
405 410 415
Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val
420 425 430
Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
435 440 445
Val Ala Arg Lys Leu Gly Leu Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Arg Pro
450 455 460
Glu Glu Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Val Leu
465 470 475 480
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val
485 490 495
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
500 505 510
Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Lys Pro Lys Glu Phe Val Glu Gly
515 520 525
Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys
530 535 540
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro
545 550 555 560
His Ala Thr Glu Glu Gln Leu Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Ala Ala
565 570 575
Phe Val Gln Lys Cys Cys Ala Ala Pro Asp His Glu Ala Cys Phe Ala
580 585 590
Val Glu Gly Pro Lys Phe Val Ile Glu Ile Arg Gly Ile Leu Ala
595 600 605
<210> 74
<211> 608
<212> PRT
<213> Canis lupus
<400> 74
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Phe Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Leu Val Arg Arg Glu Ala Tyr Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu
35 40 45
Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Ala Lys Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Ala Cys Ala Ala Glu
65 70 75 80
Glu Ser Gly Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Asp Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Asp Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ala
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Pro Pro Leu Val Ala Pro Glu Pro
130 135 140
Asp Ala Leu Cys Ala Ala Phe Gln Asp Asn Glu Gln Leu Phe Leu Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Gln Tyr Lys Gly Val Phe Ala Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Gly Pro Lys Ile Glu Ala
195 200 205
Leu Arg Glu Lys Val Leu Leu Ser Ser Ala Lys Glu Arg Phe Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Ile Ser
245 250 255
Lys Val Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp
290 295 300
Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Val Glu Arg Asp
305 310 315 320
Glu Leu Pro Gly Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp
325 330 335
Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Thr Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Lys Leu Gly Lys Val Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys
450 455 460
Pro Glu Ser Glu Arg Met Ser Cys Ala Glu Asp Phe Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Gly Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Ala Glu
530 535 540
Lys Gln Val Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asn Lys Glu Gly Cys Phe
580 585 590
Ser Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Val
595 600 605
<210> 75
<211> 608
<212> PRT
<213> Felis catus
<400> 75
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Thr Arg Arg Glu Ala His Gln Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu
35 40 45
Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Gly Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Gln Ser Ala Ala Asn Cys Glu Lys Ser Leu His Glu Leu Leu Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Gly Gln Leu Val Thr Pro Glu Ala
130 135 140
Asp Ala Met Cys Thr Ala Phe His Glu Asn Glu Gln Arg Phe Leu Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Glu Tyr Lys Gly Val Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Glu Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala
195 200 205
Leu Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ile His Lys Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly
290 295 300
Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ser Glu Val Glu Arg Asp
305 310 315 320
Glu Leu Pro Ala Asp Leu Pro Pro Leu Ala Val Asp Phe Val Glu Asp
325 330 335
Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro His Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Thr His
450 455 460
Pro Glu Ala Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Gln Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Ser Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Ala Glu
530 535 540
Lys Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly
565 570 575
Ser Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ala
595 600 605
<210> 76
<211> 607
<212> PRT
<213> Ovis aries
<400> 76
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Gln Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val
50 55 60
Lys Leu Val Lys Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser His Ala Gly Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Glu Leu Cys Lys Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Asn
115 120 125
His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp
130 135 140
Thr Leu Cys Ala Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys
180 185 190
Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Asp Ala Met
195 200 205
Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala
210 215 220
Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Val Thr Lys
245 250 255
Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
275 280 285
Asp His Gln Asp Ala Leu Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys
290 295 300
Pro Val Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Asp Lys Asp Ala
305 310 315 320
Val Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys
325 330 335
Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Ser
340 345 350
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val
355 360 365
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys
370 375 380
Ala Lys Glu Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Leu
385 390 395 400
Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Lys Asn Cys Glu
405 410 415
Leu Phe Glu Lys His Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val
420 425 430
Arg Tyr Thr Arg Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
435 440 445
Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Thr Lys Cys Cys Ala Lys Pro
450 455 460
Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu
465 470 475 480
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val
485 490 495
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
500 505 510
Asp Leu Thr Leu Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Pro Phe Asp Glu Lys
515 520 525
Phe Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys
530 535 540
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro
545 550 555 560
Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala
565 570 575
Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Gly Cys Phe Val
580 585 590
Leu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ser Thr Gln Ala Ala Leu Ala
595 600 605
<210> 77
<211> 607
<212> PRT
<213> Equus caballus
<400> 77
Met Lys Trp Val Thr Phe Val Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Leu Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Lys His Phe Lys Gly Leu Val Leu
35 40 45
Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Lys Cys Ala Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Ala Thr Tyr Gly Glu Leu Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Thr
115 120 125
His Lys Asp Asp His Pro Asn Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp
130 135 140
Ala Gln Cys Ala Ala Phe Gln Glu Asp Pro Asp Lys Phe Leu Gly Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Gly Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Phe His Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Asp Phe Thr Glu Cys Cys
180 185 190
Pro Ala Asp Asp Lys Leu Ala Cys Leu Ile Pro Lys Leu Asp Ala Leu
195 200 205
Lys Glu Arg Ile Leu Leu Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ser
210 215 220
Ser Phe Gln Asn Phe Gly Glu Arg Ala Val Lys Ala Trp Ser Val Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Val Ser Lys
245 250 255
Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
275 280 285
Glu His Gln Asp Ser Ile Ser Gly Lys Leu Lys Ala Cys Cys Asp Lys
290 295 300
Pro Leu Leu Gln Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Lys Glu Asp Asp
305 310 315 320
Leu Pro Ser Asp Leu Pro Ala Leu Ala Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys
325 330 335
Glu Ile Cys Lys His Tyr Lys Asp Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr
340 345 350
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu
355 360 365
Leu Leu Arg Ile Ala Lys Thr Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys
370 375 380
Ala Glu Ala Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Arg Thr Val Phe Asp Gln Phe
385 390 395 400
Thr Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Ser Leu Val Lys Lys Asn Cys Asp
405 410 415
Leu Phe Glu Glu Val Gly Glu Tyr Asp Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val
420 425 430
Arg Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
435 440 445
Ile Gly Arg Thr Leu Gly Lys Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Leu Pro
450 455 460
Glu Ser Glu Arg Leu Pro Cys Ser Glu Asn His Leu Ala Leu Ala Leu
465 470 475 480
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Ile
485 490 495
Thr Lys Cys Cys Thr Asp Ser Leu Ala Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser
500 505 510
Ala Leu Glu Leu Asp Glu Gly Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu
515 520 525
Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys
530 535 540
Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro
545 550 555 560
Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Thr Val Leu Gly Asn Phe Ser Ala
565 570 575
Phe Val Ala Lys Cys Cys Gly Arg Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala
580 585 590
Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ser Ser Gln Leu Ala Leu Ala
595 600 605
<210> 78
<211> 608
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 78
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala
20 25 30
His Arg Phe Asn Asp Val Gly Glu Glu His Phe Ile Gly Leu Val Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ala
50 55 60
Lys Leu Val Lys Glu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ala Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Asp Ile Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Ile Cys Ala Leu Pro Ser Leu Arg Asp Thr Tyr Gly Asp Val Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu His
115 120 125
His Lys Asp Asp Lys Pro Asp Leu Pro Pro Phe Ala Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Asp Val Leu Cys Lys Ala Phe His Asp Asp Glu Lys Ala Phe Phe Gly
145 150 155 160
His Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Lys Tyr Lys Ala Ile Leu Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala
195 200 205
Leu Glu Gly Lys Ser Leu Ile Ser Ala Ala Gln Glu Arg Leu Arg Cys
210 215 220
Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Ala Trp Ala Leu
225 230 235 240
Val Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Ile Ser
245 250 255
Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met
275 280 285
Cys Glu His Gln Glu Thr Ile Ser Ser His Leu Lys Glu Cys Cys Asp
290 295 300
Lys Pro Ile Leu Glu Lys Ala His Cys Ile Tyr Gly Leu His Asn Asp
305 310 315 320
Glu Thr Pro Ala Gly Leu Pro Ala Val Ala Glu Glu Phe Val Glu Asp
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Glu Glu Ala Lys Asp Leu Phe Leu Gly
340 345 350
Lys Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Gly Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Lys Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Thr Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu
385 390 395 400
Phe Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Tyr Asn Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Glu Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asp Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Gly Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Thr Glu
530 535 540
Arg Lys Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro His Ala Thr Asn Asp Gln Leu Lys Thr Val Val Gly Glu Phe Thr
565 570 575
Ala Leu Leu Asp Lys Cys Cys Ser Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe
580 585 590
Ala Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly
595 600 605
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| УЛУЧШЕННЫЕ ОДИНОЧНЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ | 2017 |
|
RU2765384C2 |
| УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ ВЕЩЕСТВА | 2018 |
|
RU2789495C2 |
| PD1/CTLA4-СВЯЗЫВАЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА | 2016 |
|
RU2755724C2 |
| СВЯЗЫВАЮЩИЕ ADAMTS ИММУНОГЛОБУЛИНЫ | 2018 |
|
RU2781182C2 |
| ММР13-СВЯЗЫВАЮЩИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ | 2018 |
|
RU2784069C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА | 2015 |
|
RU2746738C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА | 2015 |
|
RU2809788C2 |
| УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ TNF | 2016 |
|
RU2774823C2 |
| ПОЛИПЕПТИДЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ADAMTS5, MMP13 И АГГРЕКАНОМ | 2018 |
|
RU2786659C2 |
| ИММУНОГЛОБУЛИН С ОДНИМ ВАРИАБЕЛЬНЫМ ДОМЕНОМ ПРОТИВ F-БЕЛКА PCB | 2016 |
|
RU2730671C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISVD), способному специфически связываться с сывороточным альбумином, способу его получения, а также к белковой конструкции и композиции, содержащим вышеуказанный ISVD. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный ISVD, нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанную белковую конструкцию, а также клетки, содержащие вышеуказанные нуклеиновые кислоты. Изобретение также относится к способу получения вышеуказанной белковой конструкции. Изобретение эффективно для увеличения времени полужизни терапевтических соединений, фрагментов или веществ. 10 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 4 пр.
1. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD), способный специфически связываться с сывороточным альбумином, который имеет:
CDR1 в соответствии с Abm, который представляет собой аминокислотную последовательность GSNISSYVMG, представленную в SEQ ID NO: 11, или GSTISSYVMG, представленную в SEQ ID NO: 12; и
CDR2 в соответствии с Abm, который представляет собой аминокислотную последовательность AISRSGGYTY, представленную в SEQ ID NO: 13; и
CDR3 в соответствии с Abm, который представляет собой аминокислотную последовательность GRYSAWYSQSYEYDY, представленную в SEQ ID NO: 14.
2. ISVD по п. 1, который может связываться с человеческим сывороточным альбумином с аффинностью менее чем 500 нМ, предпочтительно менее, чем 200 нМ, более предпочтительно менее чем 10 нМ, например менее чем 500 пМ, как определено с использованием ProteOn.
3. ISVD по любому из пп. 1, 2, который представляет собой одиночный вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина.
4. ISVD по любому из пп. 1-3, который представляет собой VHH, гуманизированный VHH или камелизированный VH и, в частности, камелизированный человеческий VH.
5. ISVD по любому из пп. 1-4, который является таким, что:
имеет период полужизни в сыворотке у человека, выраженный как t1/2 бета, который составляет более 6 часов, предпочтительно более 12 часов, более предпочтительно более 24 часов, еще более предпочтительно более 72 часов;
и/или такой, что:
когда он связан с терапевтическим фрагментом или веществом, он обеспечивает для полученного полипептида по изобретению период полужизни в сыворотке у человека, выраженный как t1/2 бета, который составляет более 6 часов, предпочтительно более 12 часов, более предпочтительно более 24 часов, еще более предпочтительно более 72 часов.
6. ISVD по любому из пп. 1-5, который имеет:
степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19 по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, где любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности;
и/или которая имеет:
не более 7, предпочтительно не более 5, например только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» с последовательностью SEQ ID NO: 18 и/или 19, не учитывая любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и CDR.
7. ISVD по любому из пп. 1-6, который имеет:
степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 18 по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, где любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности;
и/или который имеет:
не более 7, предпочтительно не более 5, например только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» с последовательностью SEQ ID NO: 18, не учитывая любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и CDR.
8. ISVD по любому из пп. 1-6, который имеет:
степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 19 по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, где любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности;
и/или который имеет:
не более 7, предпочтительно не более 5, например только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» с последовательностью SEQ ID NO: 19, не учитывая любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и CDR.
9. ISVD по любому из пп. 1-8, который содержит, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 18, одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание предсуществующими антителами.
10. ISVD по любому из пп. 1-9, который представляет собой VHH и который содержит, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 18, одну или несколько гуманизирующих замен.
11. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, способный специфически связываться с человеческим сывороточным альбумином и выбранный из SEQ ID NO: 18–59.
12. Белковая конструкция, которая специфически связывается с человеческим сывороточным альбумином и содержит белок, полипептид или другую конструкцию и по меньшей мере один ISVD против человеческого сывороточного альбумина, отличающаяся тем, что указанный ISVD представляет собой ISVD по любому из пп. 1-11.
13. Белковая конструкция по п. 12, которая содержит также по меньшей мере один терапевтический фрагмент или вещество.
14. Белковая конструкция по п. 12 или 13, которая представляет собой гибридный белок.
15. Белковая конструкция по любому из пп. 12-14, которая имеет период полужизни в сыворотке у человека, выраженный как t1/2 бета, который составляет более 6 часов, предпочтительно более 12 часов, более предпочтительно более 24 часов, еще более предпочтительно более 72 часов.
16. Белковая конструкция по любому из пп. 12-15, являющаяся такой, что:
когда она имеет ISVD на своей C-концевой части, тогда C-концевой ISVD указанной белковой конструкции имеет C-концевое удлинение (X)n на своей C-концевой части, где n представляет собой от 1 до 10, а каждый X независимо выбран из природных аминокислотных остатков; и/или
когда она имеет ISVD на своей C-концевой части, тогда по меньшей мере указанный C-концевой ISVD содержит одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание предсуществующих антител; и/или
когда она имеет ISVD на своей N-концевой части, тогда N-концевой ISVD указанной белковой конструкции предпочтительно содержит D в положении 1; и/или
предпочтительно, по существу все ISVD, присутствующие в указанной белковой конструкции, содержат одну или несколько мутаций, которые уменьшают связывание предсуществующих антител.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая белковую конструкцию по любому из пп. 12-16 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
18. Нуклеиновая кислота, кодирующая ISVD по любому из пп. 1-11, при необходимости включенная в генетическую конструкцию.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая белковую конструкцию по любому из пп. 12-16, при необходимости включенная в генетическую конструкцию
20. Клетка-хозяин для экспрессии ISVD по любому из пп. 1-11, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 18.
21. Клетка-хозяин для экспрессии белковой конструкции по любому из пп. 12-16, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 19.
22. Способ получения ISVD по любому из пп. 1-11, включающий культивирование или поддержание клетки-хозяина по п. 20 в таких условиях, чтобы указанная клетка-хозяин продуцировала или экспрессировала ISVD по любому из пп. 1-11, и при необходимости дополнительно включающий выделение ISVD по любому из пп. 1-11, полученного таким способом.
23. Способ получения белковой конструкции по любому из пп. 12-16, включающий культивирование или поддержание клетки-хозяина по п. 21 в таких условиях, чтобы указанная клетка-хозяин продуцировала или экспрессировала белковую конструкцию по любому из пп. 12-16, и при необходимости дополнительно включающий выделение белковой конструкции по любому из пп. 12-16, полученной таким способом.
24. Белковая конструкция по любому из пп. 13-16 для применения в способе профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, которое можно предотвратить или лечить путем применения терапевтического фрагмента(ов) или вещества(в), которые присутствуют в белковой конструкции по любому из пп. 13-16.
| WO2012175400, 27.12.2012 | |||
| WO2008028977 A2, 13.03.2008 | |||
| US2013129727 A1, 23.05.2013 | |||
| EA200900955 A1, 30.04.2010 | |||
| US2014186365 A1, 03.07.2014. |
