СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕАКТОГЕННОСТИ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к медицине и вакцинологии, и предназначается для оценки поствакцинальных реакций при иммунизации, для объективной оценки реактогенности, иммунологической безопасности и эффективности существующих и вновь разрабатываемых вакцин.

Общераспространенными критериями оценки реактогенности вакцинных препаратов являются такие показатели, как степень выраженности общих и местных реакций. Регистрируется повышение температуры тела, проявления интоксикации организма (головная боль, недомогание и т.д.), изменения при проведении общего клинического анализа крови, мочи, определения функциональной активности печени по количественному содержанию ферментов. При оценке местных реакций учитывается гиперемия и инфильтрация в месте введения вакцины, а также увеличение и болезненность лимфатических узлов.

Предварительная оценка вакцинных препаратов производится на лабораторных животных, у которых наряду с термометрированием и взвешиванием проводят при вскрытии макроскопический осмотр внутренних органов и гистологически исследования иммунной, кроветворной и нервной систем.

Однако эти параметры, хотя и необходимы, но не дают полного представления о степени нежелательных воздействий вакцинных препаратов и, как правило, не позволяют прогнозировать и предупреждать поствакцинальных осложнения.

Предложены способы определения иммунологической безопасности вакцин. Известно, что функция иммунной системы заключается не только в обеспечении невосприимчивости организма к инфекции. Иммунная система обеспечивает поддержание иммунологического гомеостаза, осуществляет иммунологический надзор, создает толерантность к "своему", препятствует развитию злокачественных новообразований, реагирует на все патофизиологические нарушения внутренней среды организма.

Предложены различные иммунологические реакции для контроля иммунологической безопасности вакцин. Предусматривается два уровня изучения влияния вакцин на иммунную систему: лабораторно-экспериментальное (доклиническое) и клиническое испытание.

На лабораторных животных вакцины исследуют, определяя гематологические показатели (полный клинический анализ крови по общепринятой методике), морфологии иммунной системы (гистологическое изучение тимуса, селезенки, лимфатических узлов разной локализации, лимфоидного аппарата кишечника, костного мозга), иммунокомпетентные клетки селезенки (абсолютное и относительное количество ядросодержащих клеток, макрофагов, Т-, В-лимфоцитов и их субпопуляций), определяют фагоцитарную активность макрофагов, ставят цитотоксический и розеточный тесты, РБТЛ спонтанную и под действием митогенов ФГА, Кон-А, ЛПС, ставят реакцию Ерна, исследуют иммунореактивность на неродственные антигены (например, эритроциты барана), определяют аллергизирующее действие вакцин и аутоиммунные реакции в реакциях гиперчувствительности замедленного и немедленного типа. ГЗТ определяют по отеку лапки мыши или в РТМЛ.

На этапе клинических испытаний, кроме обычных клинических обследований и кожных тестов на неродственные антигены, определяют ин витро абсолютное и относительное содержание лейкоцитов, нейрофилов, лимфоцитов, моноцитов цитотоксическим тестом, методом розеткообразования, люминесцентным методом с помощью моноклональных антител к поверхностным маркерам клеток, фагоцитарную активность макрофагов с дрожжеподобными грибами Candida albicans и стафилококком, функциональную активность лимфоцитов в РБТЛ с Т- и В-клеточными митогенами; определяют численность и функциональную активность регуляторных Т-лимфоцитов в РБТЛ, содержание в сыворотке иммуноглобулинов основных классов, антитела на тканевые аутоантигены иммуноферментным анализом.

Предлагается также критерий оценки повреждающего действия вакцин на гематологические показатели, в целом на стволовые кроветворные клетки в тестах определения эндо- и экзоколониеобразования в селезенке.

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), как указано выше, предлагается для определения ГЗТ как при испытании вакцины на доклиническом этапе, так и при клинических исследованиях.

Этот способ определения реактогенности и иммунологической безопасности вакцин был выбран нами в качестве ближайшего аналога.

Однако известный "Порядок и методы контроля безопасности вакцин." предусматривает применение многих известных методов анализа клеточного и гуморального иммунитета, трудоемок, требует сложного специального оборудования и дорогостоящих реактивов.

Известный способ является близким к описываемому по технической сущности и по достигаемому результату, на основании чего выбран нами в качестве аналога.

Однако описываемый нами способ принципиально отличается от предложенного способа тем, что вместо многих (около 20) иммунологических тестов используется один интегративный тест клеточной миграции лейкоцитов крови на микрокультуры, ин витро и реакция ставится в присутствии Шига токсина в специально подобранных разведениях. Наряду с торможением миграции лейкоцитов учитывается альтернативный феномен стимуляция миграции лейкоцитов, выявление и степень выраженности которой свидетельствует о наличии и тяжести иммунопатологических нарушений в организме в результате иммунизации.

Это достигается путем постановки теста клеточной миграции, позволяющего учитывать не только торможение, но и, главным образом, ускорение миграции клеток на микрокультуры, например, СТКМ и использованием в качестве разрешающего антигена Шига токсина, выявляющего антигеннеспецифическую гиперчувствительность лейкоцитов крови при патологических нарушениях в организме. Метод отличается тем, что для определения реактогенности вакцин, для оценки течения поствакцинальных реакций и вакцинального процесса берут тест определение миграционной активности лейкоцитов периферической крови на микрокультуры ин витро, который отражает сложные взаимоотношения между Т-, В-лейкоцитами и макрофагами, лимфокинами, включая количественные, качественные и функциональные особенности этих компонентов реакции в момент исследования. В качестве разрешающего антигена берут широко распространенный среди бактерий Шига токсин в специально подобранных разведениях, выявляющих раннюю антигеннеспецифическую гиперчувствительность лейкоцитов крови и проявляющуюся в ускорении их миграционной активности при иммунопатологических нарушениях в организме.

1. Определение реактогенности К-сальмонеллезного антигена на животных.

Мышам линии СВА вводят поверхностный К-сальмонеллезный антиген, приготовленный методом трихлоруксусной экстракции из мутантного штамма S.typhimurium 20 красный (ТХУ 30 кр), предназначенный в качестве вакцинного препарата. Препарат вводят в дозах 100,0, 10,0, 1,0, 0,1 мкг/мышь внутрибрюшинно. Все испытуемые дозы не вызывали гибели мышей, хотя в пересчете на килограмм веса составляют соответственно 100, 10, 1, 0,1 человеческих доз. (Одна человеческая доза составляет 400 мкг для взрослого человека). Через 3 ч, 1,2 недели исследуют миграционную активность (МАЛ) в скрининговом тесте клеточной миграции (СТКМ) в некоторой модификации: периферическую кровь берут из ретроорбитального синуса мышей каждой группы, состоящей из 2-3 животных, в общем объеме 0,2-0,3 мл в пробирку с коническим дном, содержащую 0,5-1,0 мл разводящего раствора специального состава, отстаивают, из надосадка получают лейкоциты, разводят до концентрации 2-4 млн/мл и с помощью специального штатива для направленной фиксации наконечников разливают в лунки плоскодонных штативов, предварительно заполненных культуральной средой специального состава, содержащей в двух рядах лунок соответственно: исследуемый К-антиген и Шига токсин в предварительно подобранных концентрациях (10^-4 - 10^-10 мг/мл).

После образования микрокультуры и инкубации ее с тестируемыми антигенами в CO₂-инкубаторе при 37 ^oC в течение 18 ч учитывают результаты. Определяют процент торможения или ускорения миграции (ИМ) по сравнению с контролем (без антигенов в среде культивирования). Достоверными измерениями МАЛ считали ИМ более ±20 к контролю. Пример определения реактогенности К-сальмонеллезного антигена представлен на фиг.1. Через 3 ч после введения мышам К-антигена в дозе 100,0 мкг МАЛ к гомологичному антигену характеризовалась незначительными изменениями (±20). Доза 10 мкг вызывала небольшое торможение МАЛ (-22), меньшие дозы 1,0 и 0,1 мкг вызывали значительное торможение (-40 и -38 соответственно) МАЛ в присутствии К-антигена. Отсутствие стимуляции МАЛ при К-антигене в среде соответствует ранее полученным данным о безопасности К-антигена как вакцинного препарата. Вместе с тем отсутствие или слабо выраженное торможение МАЛ на очень большие дозы (100,0 и 10,0 мкг) позволяет заключить, что они не безразличны для проявления клеточного иммунитета и, по-видимому, угнетают его. Дозы 1,0 и 0,1 мкг, дающие выраженное торможение МАЛ, являются оптимальными для создания протективного иммунитета к заражению вирулентным штаммом, что было установлено ранее проведенными исследованиями на мышах. На основании этих данных были подобраны ориентировочные оптимальные дозы для человека. При разрешении СТКМ ин витро Шига токсином эти данные не только были подтверждены, но получены более четкие результаты. На большие дозы (100,0 и 10,0 мкг) отмечена стимуляция МАЛ, на дозы 1,0 и 0,1 мкг выраженное торможение. Ускорение МАЛ к Шига токсину свидетельствует о большей чувствительности МАЛ к этому антигену и неблагоприятном патологическом воздействии больших доз К-антигена на организм. Таким образом, определение МАЛ на специфический антиген вакцинного препарата и Шига токсин может быть использовано для определения реактогенности, антигенспецифической и антигеннеспецифической безопасности и оценки эффективности вакцинных препаратов на стадии доклинических испытаний. Антигеннеспецифическая стимуляция Шига токсином МАЛ периферической крови является ранним высокочувствительным информативным показателем ин витро реактогенности вакцин. Этот метод можно использовать уже через 3 ч после введения препарата и на протяжении 7-10 сут, в течение которых показатели МАЛ постепенно снижаются. Раннее выявление начала поствакцинальных осложнений делает возможным принятие предохранительных мер против поствакцинальных осложнений.

2. Использование способа для определения реактогенности и иммунологической безопасности вакцинных препаратов на клиническом этапе.

Для определения миграционной активности лейкоцитов можно использовать любой метод, позволяющий определять как торможение, так и, что особенно важно, ускорение миграции клеток, например, СТКМ. Постановка СТКМ у людей осуществляется, в основном, по описанной методике. Внесенные нами изменения касаются адаптации методики для исследования минимальных количеств периферической крови (из пальца 0,2-0,3 мл). В качестве разрешающего антигена используют Шига токсин, выявляющий антигеннеспецифическую гиперчувствительность лейкоцитов при патологических состояниях организма. Кроме того, используют специфические антигены, входящие в состав вакцинного препарата. Например, при испытании брюшнотифозной вакцины берут О-, Ви-, К-антигены. Взрослые добровольцы (67 чел) были иммунизированы новой брюшнотифозной вакциной (Ту ТХУ) /9/, содержащей О-, Ви- и К-антигены в дозах 200,0; 400,0; 800,0 мкг, одно- и друкратно; коммерческой спиртовой брюшнотифозной вакциной (СВ) в дозе 500 млн м.кл. + 400 мкг Ви-антигена и спиртовой вакциной, обогащенной Ту ТХУ-вакциной в разных дозовых сочетаниях. Отбор лиц, подлежащих вакцинации, и наблюдение после нее проводились по общепринятым клиническим и лабораторным критериям: учитывались общие и местные реакции, проводилось термометрирование, анализ крови, мочи, определяли ферменты печени и пр. Параллельно до иммунизации и через 48 ч, 1, 3 нед и 4-6 мес после иммунизации ставили СТКМ с О-, Ви-, К-антигенами и Шига токсином ин витро. На основании общепринятых показателей ТуТХУ-вакцина оказалась слабо реактогенным препаратом в дозах 200-400 мкг, вызывающим, в основном, слабые общие реакции (температура до 37,5 ^oC) в 33-65 случаев, соответственно, значительно уменьшающиеся через 24 ч и полностью исчезающие через 48 ч. Вакцина не вызывала местных реакций даже в дозе 800,0 мкг. При сочетанном применении ТХУ + СВ препаратов установлено увеличение реактогенности, в особенности при увеличении доз: появлялись средние и сильные температурные реакции, спиртовая вакцина обусловливала появление местных реакций. При использовании теста определения миграционной активности лейкоцитов в присутствии Шига токсина значительно увеличивалась информативность исследований при оценке ректогенности вакцин. Усиление МАЛ к Шига токсину и ее выраженность коррелировали с выраженностью температурных реакций, являющихся основным интегральным показателем иммунопатологических нарушений в организме после приема вакцин (фиг.2). Сопоставление показателей усиления МАЛ с обычно используемыми показателями реактогенности вакцин (СОЭ, местные реакции) свидетельствует о преимуществах предлагаемого способа (таблица). Таким образом, определение МАЛ к Шига токсину является высоко чувствительным антигеннеспецифическим показателем гиперчувствительности лейкоцитов при иммунопатологических нарушениях при вакцинации. Усиление МАЛ к Шига токсину является тестом для определения реактогенности и иммунологической безопасности вакцинных препаратов.

Основным преимуществом способа, особенно при использовании в качестве разрешающего антигена Шига токсина, является его высокая чувствительность и эффективность при выявлении патологических отклонений гомеостаза, в том числе иммунного, при разработке и испытании (доклиническом и клиническом) вакцинных препаратов. Способ отличается от известных общепринятых методов определения реактогенности и иммунологической безопасности относительной простотой и доступностью, возможностью использования одного показателя миграционной активности лейкоцитов крови в интегративном тесте взаимодействия многих иммунокомпетентных клеток и их медиаторов в микрокультуре в том естественном количественном соотношении, функциональном состоянии, в котором они находятся в организме на момент исследования.

Изобретение обладает большой экономической эффективностью, величина которой будет зависеть от широты его использования в вышеперечисленных областях научно-экспериментальных и клинических исследований.

Назначение: медицина, вакцинология, для оценки реактогенности, иммунологической безопасности и эффективности существующих и вновь разрабатываемых вакцин. Сущность: исследуют миграционную активность лейкоцитов крови до и после вакцинации в присутствии Шига-токсина in vitro и при выявлении стимулирования миграционной активности более, чем на 20 % по сравнению с контролем, оценивают вакцину как реактогенную и иммунологически небезопасную. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ оценки реактогенности и иммунологической безопасности вакцины, включающий взятие крови до и после вакцинации, исследование количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток, оценку полученных результатов, отличающийся тем, что исследуют миграционную активность лейкоцитов крови in vitro в присутствии Шига-токсина и при уровне стимуляции миграционной активности более 20% по отношению к контролю оценивают вакцину как реактогенную и иммунологически небезопасную. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация Шига-токсина составляет 10^-4 10^-10 мг/мл.