СПОСОБ ОЦЕНКИ АРОМАТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии репродукции, и может быть использовано для оценки ароматазной активности.

Ароматаза р450 - ферментный комплекс, катализирующий превращение C19-андрогенных стероидов в эстрогены, реализуя биосинтез эстрона из андростендиона и эстрадиола из тестостерона. У человека ароматаза р450 обнаружена во многих тканях и органах, таких как гонады, головной мозг, жировая ткань, плацента, печень, кожа, кости, кровеносные сосуды, эндометрий, а также в эндометриоидных гетеротопиях, в тканях лейомиомы, при раке эндометрия и раке молочной железы. Ген ароматазы человека локализуется на 15-й хромосоме. В литературе встречаются описания больных с дефектом гена ароматазы р450 CYP19. Клиническая картина у больных женского пола зависит от активности данного фермента и выражается внутриутробной вирилизацией различной степени тяжести, гипергонадотропным гипогонадизмом, недоразвитием вторичных половых признаков, первичной аменореей, бесплодием. Кроме того, частичный дефект гена ароматазы р450 CYP19 может быть ответственен за недостаточную продукцию эстрадиола доминантным фолликулом и играть роль в патогенезе ановуляции и бесплодия.

Известен способ оценки ароматазной активности по сопоставлению содержания андрогенов и эстрогенов в крови или фолликулярной жидкости {Мишарина Е.В. Содержание эстрона, андростендиона и β-эндорфина у женщин с ожирением и гормональной недостаточностью яичников: автореф. Дис. … канд. мед. наук. - СПб., 1993]. Однако этот метод приемлем для косвенной оценки ароматазной активности в группах больных, но не приемлем для ее определения у конкретного больного.

Известен способ оценки ароматазной активности путем белкового иммуноблоттинга [Lin L. Variable phenotypes associated with aromatase (CYP19) insufficiency in humans / L. Lin [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2007. - V.92. P.982-990]. В процессе определения ароматазной активности используется электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине или по трехмерной структуре нативных белков. Далее белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану, где ароматаза определяется с использованием специфических антител. Этот метод отличает трудоемкость и необходимость специальной аппаратуры.

Известен способ оценки ароматазной активности путем иммуногистохимического исследования в различных тканях и органах [Suzuki Т. Quantitation of P450 aromatase immunoreactivity in human ovary during the menstrual cycle: relationship between the enzyme activity and immunointensity / T.Suzuki [et al.] // J.Histochem. Cytochem. - 1994. - Vol.42, N12. - P.1565-1573]. Способ основан на связывании немаркированных первичных кроличьих поликлональных антител с ароматазой р450 с образованием иммунного комплекса. Далее иммунный комплекс визуализируется при помощи вторичных меченых антител, при этом первичные антитела служат для вторичных антигенами. Иммуногистохимическое исследование проводится на парафиновых срезах. Срезы ткани толщиной 5 мкм помещаются на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина. Количественную оценку результатов иммуногистохимических реакций проводят на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа, цифровой камеры, персонального компьютера, программного обеспечения АСТ-1, версия 2.12 и «Видеотест-Морфология 5.0». Фотосъемку поводят на увеличении 400х (окуляр 10х, объектив 40х), с полным закрытием апертурной диафрагмы, при поднятом консендоре, в режиме Photo, время экспозиции 1/20 с, чувствительность камеры - максимальная, размер изображения 1280×1024 пикселей, графический формат изображения JPEG (normal). Определяется ароматазная активность в гранулезных клетках доминантного фолликула, используя показатель интегральной оптической плотности и количества клеток гранулезы в объекте.

Недостатком способа является необходимость инвазивных процедур, определение ароматазной активности только в яичниках, чрезвычайная трудоемкость.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности способа, получение точных данных об уровне ароматазной активности более простыми средствами.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки ароматазной активности согласно изобретению определяют содержание гормонов ЛГ (лютеонизирующий гормон), ФСГ (фолликулостимулирующий гормон), эстрадиола, общего тестостерона и свободного тестостерона до и через 48 часов после перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола и по изменению ЛГ, ФСГ, а также отношений эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон оценивают ароматазную активность в баллах. Присваивают баллы определенным образом (табл.1), при этом оценивают сниженную ароматазную активность, нормальную и повышенную.

Таблица 1 Гормоны Динамика показателей Баллы ФСГ, МЕ/л Не повышается 0 Повышается менее чем на 2,8 МЕ/л 1 Повышается менее чем на 49,3% от исходного уровня 1 Повышается от 2,8 МЕ/л до 5,5 МЕ/л 2 Повышается от 49,3% до 100,6% от исходного уровня 2 Повышается более чем на 5,5 МЕ/л 3 Повышается более чем на 100,6% от исходного уровня 3 ЛГ, МЕ/л Не повышается 0 Повышается менее чем на 2,4 МЕ/л 1 Повышается менее чем на 88,4% от исходного уровня 1 Повышается от 2,4 МЕ/л до 5,2 МЕ/л 2 Повышается от 88,4% до 205,4% от исходного уровня 2 Повышается более чем на 5,2 МЕ/л 3 Повышается более чем на 205,4% от исходного уровня 3 Отношение эстрадиола к общему тестостерону Не снижается 0 >88,2 пмоль/л/нмоль/л 1 От 53,6 пмоль/л/нмоль/л до 88,2 пмоль/л/нмоль/л 2 <53,6 пмоль/л/нмоль/л 3 Отношение эстрадиола к свободному тестостерону Не снижается 0 >47,8 пмоль/л/пмоль/л 1 От 11,8 пмоль/л/пмоль/л до 47,8 пмоль/л/пмоль/л 2 <11,8 пмоль/л/пмоль/л 3

Ароматазную активность оценивают по сумме набранных баллов:

0-7 баллов - сниженная ароматазная активность; 8-14 баллов - нормальная; 15 баллов и более - повышенная.

Для определения критериев оценки было обследовано 13 женщин репродуктивного возраста (средний возраст составил 28±0,7 лет) с сохраненным овуляторным циклом, подтвержденным ультразвуковым исследованием органов малого таза и уровнем прогестерона в крови на 20-21-й день менструального цикла. Пробу с летрозолом проводили на 2-й день менструального цикла. Содержание гонадотропинов и половых стероидов в крови определяли до приема летрозола и на 2-й, 3-й и 4-й день после приема препарата. Наиболее выраженные изменения (снижение уровня эстрадиола в крови, повышение уровня тестостерона, ФСГ и ЛГ) приходились на 3-й день (через 48 часов) после приема летрозола.

В табл.2 представлены данные гормонального обследования (М±m) и границы доверительных интервалов (при р=0,05) до и после приема 10 мг летрозола женщинами репродуктивного возраста с полноценным овуляторным циклом (n=13).

Как следует из данных, представленных в табл.2, под влиянием летрозола у здоровых женщин происходит снижение эстрадиола в крови на 44,2±9,8 пмоль/л (26,6±5,4%). Согласно механизму отрицательной обратной связи на 3-й день пробы происходило увеличение содержания в крови ФСГ на 4,1±0,6 МЕ/л (74,9±11,8%) и увеличение ЛГ на 3,8±0,6 МЕ/л (146,9±26,8%). Однако изменение уровня тестостерона в крови под влиянием летрозола не было статистически значимым. Учитывая разнонаправленность изменений андрогенов и эстрогенов под влиянием летрозола, для оценки реакции на препарат следует использовать отношение эстрадиол/общий тестостерон и отношение эстрадиол/свободный тестостерон. В группе здоровых женщин на 3-й день пробы граница доверительного интервала (при р=0,05), отношения эстрадиол/общий тестостерон колебалась от 88,2 до 53,6, а отношения эстрадиол/свободный тестостерон от 47,8 до 11,7.

Способ осуществляют следующим образом.

В 9 часов утра на 2-й день менструального цикла из локтевой вены больной забирают 10 мл крови для гормонального исследования. Затем больная принимает 10 мг ингибитора ароматазы летрозола per os. Через 48 часов производят повторное взятие крови. В обеих порциях крови определяют уровень ФСГ, ЛГ, эстрадиола, тестостерона и свободного тестостерона иммуноферментным методом. Об ароматазной активности судят с помощью балльной системы, учитывающей динамику оцениваемых показателей, при этом сумма баллов составляет при сниженной ароматазной активности от 0 до 7 баллов; при нормальной ароматазной активности - от 8 до 14 баллов; при повышенной ароматазной активности - от 15 баллов и более.

Сущность способа иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная И., 31 года, хроническая нормогонадотропная ановуляция и бесплодие.

Реакция на летрозол больной И. представлена в табл.3. Как следует из табл.3, в ответ на прием летрозола у данной больной произошло парадоксальное повышение уровня эстрадиола в крови с 91,7 пмоль/л до 113,7 пмоль/л (23,9%), абсолютное повышение эстрадиола равнялось 22 пмоль/л. Уровень тестостерона повысился, с 0,1 нмоль/л до 1,0 нмоль/л, т.е. на 0,9 нмоль/л, при этом содержание свободного, метаболически активного тестостерона осталось, практически, на прежнем уровне - 0,6 пмоль/л, по сравнению с исходным уровнем (0,7 пмоль/л). Содержание ЛГ в крови возросло с 1,6 МЕ/л до 2,3 МЕ/л (37,5%), при этом абсолютный прирост составил всего 0,6 МЕ/л. Реакция ФСГ была еще менее выраженной (4,2%), абсолютный прирост составил 0,2 МЕ/л. Отношение эстрадиол/общий тестостерон на 3-й день пробы равнялось 113,7, отношение эстрадиол/свободный тестостерон - 189,5, что значительно превышало соответствующие показатели у здоровых женщин (табл.3).

Таблица 3 Гормоны Уровень гормонов в крови (М±m) Абсолютная разница % от исходного 1-й день пробы 3-й день пробы ФСГ, МЕ/л 4,7 4,9 0,2 4,2 ЛГ, МЕ/л 1,6 2,3 0,6 37,5 Эстрадиол, пмоль/л 91,7 113,7 22 23,9 Общий тестостерон, нмоль/л 0,1 1,0 0,9 900 Свободный тестостерон, пмоль/л 0,7 0,6 -0,1 -14,3 Отношение эстрадиола к общему тестостерону 917 113,7 - - Отношение эстрадиола к свободному тестостерону 131 189,5 - -

Для оценки ароматазной активности больной И. проведен подсчет баллов (табл.4).

Таблица 4 Гормоны Динамика уровня гормонов в крови через 48 часов Баллы ФСГ, МЕ/л Повышается менее чем на 2,8 МЕ/л 1 Повышается менее чем на 49,3% от исходного уровня 1 ЛГ, МЕ/л Повышается менее чем на 2,4 МЕ/л 1 Повышается менее чем на 88,4% от исходного уровня 1 Отношение эстрадиола к общему тестостерону Превышает 88,2 1 Отношение эстрадиола к свободному тестостерону Превышает 47,8 1

Как следует из табл.4, сумма баллов равна 6. Результаты пробы указывают на сниженную ароматазную активность как по конверсии андрогенов в эстрогены, так и по реакции гонадотропинов.

Заключительный диагноз: частичный дефицит ароматазы, нормогонадотропная ановуляция, вторичная аменорея, первичное бесплодие.

Пример 2. Больная А., 27 лет, неклассическая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников, нормогонадотропная недостаточность яичников, ановуляция, опсоменорея, гирсутизм I, угревая сыпь.

Реакция на летрозол больной А. представлена в табл.5.

Таблица 5 Гормоны Уровень гормонов в крови (М±m) Абсолютная разница % от исходного 1-й день пробы 3-й день пробы ФСГ, МЕ/л 4,3 8,0 3,7 86 ЛГ, МЕ/л 1,0 2,8 1,8 180 Эстрадиол, пмоль/л 121,4 103,7 -17,7 -14,6 Общий тестостерон, нмоль/л 1,7 1,4 -0,3 -17,6 Свободный тестостерон, пмоль/л 2,2 5,2 3,0 136,4 Отношение эстрадиола к общему тестостерону 71,4 74,1 - - Отношение эстрадиола к свободному тестостерону 55,2 20,0 - -

Как следует из табл.5, на 3-й день пробы у данной больной произошло снижение содержания эстрадиола в крови с 121,4 пмоль/л до 103,7 пмоль/л (14,6%), абсолютное снижение эстрадиола равнялось 17,7 пмоль/л. Уровень тестостерона снизился с 1,7 нмоль/л до 1,4 нмоль/л (17,6%), абсолютное снижение тестостерона составило 0,3 нмоль/л. Содержание свободного тестостерона увеличилось с 2,2 пмоль/л до 5,2 пмоль/л (136,4%), абсолютное повышение свободного тестостерона равнялось 3,0 пмоль/л. Содержание ФСГ в крови увеличилось с 4,3 МЕ/л до 8,0 МЕ/л (86%), абсолютный прирост составил 3,7 МЕ/л. Уровень ЛГ в крови повысился с 1,0 МЕ/л до 2,8 МЕ/л (180%), абсолютное повышение составило 1,8 МЕ/л. Отношение эстрадиол/общий тестостерон на 3-й день пробы равнялось 74,1, отношение эстрадиол/свободный тестостерон - 20,0. Показатели укладываются в пределы реакции у здоровых женщин.

Для оценки ароматазной активности больной А. произведен подсчет баллов (табл.6).

Таблица 6 Гормоны Динамика уровня гормонов в крови через 48 часов Баллы ФСГ, МЕ/л Повышается от 2,8 МЕ/л до 5,5 МЕ/л 2 Повышается от 49,3% до 100,6% от исходного уровня 2 ЛГ, МЕ/л Повышается менее чем на 24 МЕ/л 1 Повышается от 88,4% до 205,4% от исходного уровня 2 Отношение эстрадиола к общему тестостерону Находится в пределах от 53,6 до 88,2 2 Отношение эстрадиола к свободному тестостерону Находится в пределах от 11,8 до 47,8 2

Сумма баллов равна 11. Таким образом, ароматазная активность не выходит за пределы нормальных колебаний. Это не позволяет связать развитие нормогонадотропной ановуляции у данной больной с дефицитом ароматазы р450.

Пример 3. Больная Г., 17 лет, нормогонадотропная недостаточность яичников, связанная с потерей массы тела, ановуляция, вторичная аменорея, гирсутизм I ст., угревая сыпь, диффузный ФАМ молочных желез.

Реакция на летрозол у больной Г. представлена в табл.7. Как следует из табл.7, на 3-й день пробы у данной больной произошло снижение содержания эстрадиола в крови с 115,4 пмоль/л до 93,5 пмоль/л (18,9%), абсолютное снижение эстрадиола равнялось 21,9 пмоль/л, что укладывается в пределы реакции у здоровых женщин. Уровень тестостерона повысился с 1,8 нмоль/л до 2,5 нмоль/л (38,8%), абсолютный прирост тестостерона составил 0,7 нмоль/л. Содержание свободного тестостерона увеличилось с 9,5 пмоль/л до 11,6 пмоль/л (22,1%), абсолютное повышение свободного тестостерона равнялось 2,1 пмоль/л. Содержание ФСГ в крови увеличилось с 9,8 МЕ/л до 17,7 МЕ/л (80,6%), абсолютный прирост составил 7,9 МЕ/л. Уровень ЛГ в крови повысился с 3,4 МЕ/л до 9,5 МЕ/л (179,4%), абсолютное повышение составило 6,1 МЕ/л. Отношение эстрадиол/общий тестостерон на 3-й день пробы равнялся 37,4, отношение эстрадиол/свободный тестостерон - 8,1.

Таблица 7 Гормоны Уровень гормонов в крови (M±m) Абсолютная разница % от исходного 1-й день пробы 3-й день пробы ФСГ, МЕ/л 9,8 17,7 7,9 80,6 ЛГ, МЕ/л 3,4 9,5 6,1 179,4 Эстрад иол, пмоль/л 115,4 93,5 -21,9 -18,9 Тестостерон, нмоль/л 1,8 2,5 0,7 38,8 Свободный тестостерон, пмоль/л 9,5 11,6 2,1 22,1 Отношение эстрадиола к общему тестостерону 64,1 37,4 - - Отношение эстрадиола к свободному тестостерону 12,1 8,1 - -

Для оценки ароматазной активности больной Г. по предлагаемому способу произведен подсчет баллов (табл.8).

Таблица 8 Гормоны Динамика уровня гормонов в крови через 48 часов Баллы ФСГ, МЕ/л Повышается более чем на 5,5 МЕ/л 3 Повышается в пределах от 49,3% до 100,6% от исходного уровня 2 ЛГ, МЕ/л Повышается более чем на 5,2 МЕ/л 3 Повышается в пределах от 88,4% до 205,4% от исходного уровня 2 Отношение эстрадиола к общему тестостерону Не превышает 53,6 3 Отношение эстрадиола к свободному тестостерону Не превышает 11,8 3

Сумма баллов равна 16. Таким образом, результаты пробы у больной Г. указывают на повышенную ароматазную активность. Это не позволяет связать развитие нормогонадотропной ановуляции у данной больной с дефицитом ароматазы р450.

Во всех случаях результаты оценки ароматазной активности предлагаемым способом были подтверждены иммуногистохимическими исследованиями.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью (95%) оценивать интенсивность ароматазной активности неинвазивным путем, прост в исполнении и может использоваться в научно-исследовательской практике, в гинекологической практике для диагностики частичного ферментативного дефицита ароматазы р450, ответственного за нарушение синтеза эстрадиола доминантным фолликулом и играющего роль в патогенезе ановуляторного бесплодия, Диагностика высокой ароматазной активности может иметь существенное значение для решения вопроса о лечебном применении ингибиторов ароматазы при эстрогензависимых заболеваниях (эндометриоз, миома матки, рак тела матки, опухоли молочной железы).

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии репродукции, и может быть использовано для оценки ароматазной активности. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови определяют содержание гормонов ЛГ, ФСГ, эстрадиола, общего тестостерона и свободного тестостерона до и через 48 часов после перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы р450 летрозола и по изменению ЛГ и ФСГ, а также отношений эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон оценивают ароматазную активность в баллах, которые присваивают определенным образом и считают, что от 0 до 7 баллов оценивают сниженную ароматазную активность, от 8 до 14 баллов -нормальную; от 15 баллов и более - повышенную. Способ обеспечивает высокую точность оценки при простоте исполнения. 8 табл., 3 пр.

Способ оценки ароматазной активности, заключающийся в том, что в сыворотке крови определяют содержание лютеонизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов, эстрадиола, общего тестостерона и свободного тестостерона до и через 48 часов после перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола и по изменению ЛГ и ФСГ, а также отношений эстрадиол/общий тестостерон и эстрадиол/свободный тестостерон оценивают ароматазную активность в баллах, баллы присваивают следующим образом:
ФСГ не повышается - 0 баллов,
повышается менее чем на 2,8 МЕ/л - 1 балл,
повышается менее чем на 49,3% от исходного уровня - 1 балл,
повышается от 2,8 МЕ/л до 5,5 МЕ/л - 2 балла,
повышается от 49,3% до 100,6% от исходного уровня - 2 балла,
повышается более чем на 5,5 МЕ/л - 3 балла,
повышается более чем на 100,6% от исходного уровня - 3 балла;
ЛГ не повышается - 0 баллов,
повышается менее чем на 2,4 МЕ/л - 1 балл,
повышается менее чем на 88,4% от исходного уровня - 1 балл,
повышается от 2,4 МЕ/л до 5,2 МЕ/л - 2 балла,
повышается от 88,4% до 205,4% от исходного уровня - 2 балла,
повышается более чем на 5,2 МЕ/л - 3 балла,
повышается более чем на 205,4% от исходного уровня - 3 балла;
эстрадиол/общий тестостерон не снижается - 0 баллов,
эстрадиол/общий тестостерон >88,2 пмоль/л/нмоль/л - 1 балл,
53,6 пмоль/л/нмоль/л ≤ эстрадиол/общий тестостерон ≤88,2 пмоль/л/нмоль/л - 2 балла,
эстрадиол/общий тестостерон <53,6 пмоль/л/нмоль/л - 3 балла;
эстрадиол/свободный тестостерон не снижается - 0 баллов,
эстрадиол/свободный тестостерон >47,8 пмоль/л/пмоль/л - 1 балл,
11,8 пмоль/л/пмоль/л ≤ эстрадиол/свободный тестостерон ≤47,8 пмоль/л/пмоль/л - 2 балла,
эстрадиол/свободный тестостерон <11,8 пмоль/л/пмоль/л - 3 балла, при этом от 0 до 7 баллов оценивают сниженную ароматазную активность, от 8 до 14 баллов - нормальную; от 15 баллов и более - повышенную.