СПОСОБ ОЦЕНКИ ОВАРИАЛЬНОЙ АРОМАТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии репродукции, и может быть использовано для оценки овариальной ароматазной активности.

Ароматаза р450 - ферментный комплекс, катализирующий превращение С19-андрогенных стероидов в эстрогены, реализуя биосинтез эстрона из андростендиона и эстрадиола (Э2) из тестостерона. У человека ароматаза р450 обнаружена во многих тканях и органах, таких как гонады, головной мозг, жировая ткань, плацента, печень, кожа, кости, кровеносные сосуды, эндометрий, а также в эндометриоидных гетеротопиях, в тканях лейомиомы, при раке эндометрия и раке молочной железы [Simpson E.R. Biology of aromatase in the mammary gland / E.R. Simpson [et al.] // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. - 2000. - Vol.5, N3. - P.251-258]. В яичниках женщины в репродуктивном периоде ароматаза обнаруживается в антральных, доминантном фолликулах, а также в желтом теле. Главным активатором ароматазной активности является фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), зависящий, в свою очередь, от действия антимюллерова гормона (АМГ). АМГ вырабатывается в яичниках женщины антральными фолликулами и соответствует их числу [Fanchin R. Serum anti-Müllerian hormone is more strongly related to ovarian follicular status than seruminhibin B, estradiol, FSH and LH on day 3 / Fanchin R. [et al.] // Hum. Reprod. - 2003. - Vol.18, N2. - P.323-327].

Ген ароматазы человека локализуется на 15-й хромосоме. В литературе [Shozu M. A new cause of female pseudohermaphroditism: placental aromatase deficiency / Shozu M. [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1991. - Vol.72, N3 - P.560-566] встречаются описания больных с дефектом гена ароматазы р450 CYP19. Клиническая картина дефицита ароматазы у больных женского пола выражается внутриутробной вирилизацией различной степени тяжести, гипергонадотропным гипогонадизмом, недоразвитием вторичных половых признаков, первичной аменореей, бесплодием. Частичный дефект гена ароматазы р450 CYP19 может быть ответственен за недостаточную продукцию эстрадиола доминантным фолликулом и играть роль в патогенезе ановуляции и бесплодия.

Известен способ оценки активности ароматазы по соотношению содержания андрогенов и эстрогенов в крови [Мишарина Е.В. Содержание эстрона, андростендиона и β-эндорфина у женщин с ожирением и гормональной недостаточностью яичников: автореф. дис. … канд. мед. наук. - СПб., 1993]. Этот метод приемлем для косвенной оценки суммарной ароматазной активности.

Суммарная ароматазная активность может быть измерена путем белкового иммуноблоттинга [Lin L. Variable phenotypes associated with aromatase (CYP19) insufficiency in humans / L. Lin [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2007. - V.92. P.982-990]. В процессе определения ароматазной активности используется электрофорез белков крови в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине или по трехмерной структуре нативных белков. Далее белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану, где ароматаза определяется с использованием специфических антител. Этот метод отличает трудоемкость и необходимость специальной аппаратуры.

В онкологической практике активность ароматазы в различных тканях определяют радиометрическим методом, основанным на превращении меченого тритием андростендиона в «тяжелую воду» (3H-H2O) [Ларионов А.А. Конверсия андростендиона в опухолевой и экстрагонадных тканях и ее связь с гормонально-метаболическими факторами у больных раком молочной железы: автореф. дис. … канд. мед. наук. - СПб., 1997]. Недостатком метода является его инвазивность.

Известен способ оценки ароматазной активности в отдельных органах и тканях, в том числе в яичниках женщины, иммуногистохимическим методом [Suzuki Т. Quantitation of P450 aromatase immunoreactivity in human ovary during the menstrual cycle: relationship between the enzyme activity and immunointensity / T. Suzuki [et al.] // J. Histochem. Cytochem. - 1994. - Vol.42, N12. - P.1565-1573]. Способ основан на связывании немаркированных первичных кроличьих поликлональных антител с ароматазой р450 с образованием иммунного комплекса. Далее иммунный комплекс визуализируется при помощи вторичных меченых антител, при этом первичные антитела служат для вторичных антигенами. Иммуногистохимическое исследование проводится на парафиновых срезах. Срезы ткани толщиной 5 мкм помещаются на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина. Количественную оценку результатов иммуногистохимических реакций проводят на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа, цифровой камеры, персонального компьютера, программного обеспечения АСТ-1, версия 2.12 и «Видеотест-Морфология 5.0». Фотосъемку поводят на увеличении 400х (окуляр 10х, объектив 40х), с полным закрытием апертурной диафрагмы, при поднятом консендоре, в режиме Photo, время экспозиции 1/20 с., чувствительность камеры - максимальная, размер изображения 1280×1024 пикселей, графический формат изображения JPEG (normal). Определяется ароматазная активность в гранулезных клетках фолликулов, используя показатель интегральной оптической плотности и количества клеток гранулезы в объекте.

Недостатком данного способа является необходимость инвазивных процедур, чрезвычайная трудоемкость.

Известен способ оценки ароматазной активности путем проведения пробы с летрозолом [Савина В.А. Овариальная ароматаза р450 при синдроме поликистозных яичников / В.А. Савина [и др.] // Медицинский академический журнал.- 2012. - Т. 11, вып. 1. - С 47-53]. В сыворотке крови определяют содержание гормонов ЛГ, ФСГ, Э2, общего тестостерона и свободного тестостерона до и после перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола и по изменению ЛГ и ФСГ, а также коэффициентов Э2/общий тестостерон и Э2/свободный тестостерон через 48 часов оценивают ароматазную активность с помощью балльной системы. Этот способ принят авторами за прототип.

Недостатком способа является обширное дорогостоящее гормональное обследование. В описанном виде метод не дает информации об источнике ароматазной активности. Изменения гонадотропинов в крови являются косвенными показателями снижения Э2 в крови и зависят от интактности или повреждения негативной обратной связи в гипоталамо-гипофизарно-овариальной системе.

Техническим результатом изобретения является получение точных данных об уровне именно овариальной ароматазной активности более простым способом.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки овариальной ароматазной активности путем гормонального исследования сыворотки крови на второй день менструального цикла до перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола и через 48 часов после, согласно изобретению, до приема летрозола определяют уровень эстрадиола и уровень антимюллерова гормона, после приема летрозола - уровень эстрадиола, определяют абсолютное значение изменения уровня эстрадиола и вычисляют коэффициент овариальной ароматазной активности по следующей формуле: К=ΔЭ2/АМГ, где:

ΔЭ2 - абсолютное значение изменения уровня эстрадиола после приема летрозола, пмоль/л;

АМГ - уровень антимюллерова гормона, нг/мл

и оценивают овариальную ароматазную активность, считая, что при K<9,1 - низкая овариальная ароматазная активность, при 9,1<K<27,3 - нормальная, при K>27,3 - высокая.

Проведенные исследования показали, что в предлагаемом способе снижение уровня Э2 в крови через 48 часов после перорального приема 10 мг летрозола позволяет оценить именно овариальную ароматазную активность. Это доказывается результатами исследования, приведенными в табл.1. Как видно из табл.1, у женщин с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ), подтвержденным при лапароскопии (n=30, средний возраст 29±0,4 года), через 3 месяца применения агонистов гонатропин-рилизинг гормона, реакция Э2 на пероральный прием 10 мг летрозола практически отсутствует. Тогда как у здоровых женщин репродуктивного возраста с сохраненным овуляторным циклом (n=15, средний возраст 27±0,4 года), подтвержденным ультразвуковым исследованием органов малого таза и уровнем прогестерона в крови на 20-21 день менструального цикла, под влиянием перорального приема 10 мг летрозола на 2-й день менструального цикла происходит достоверное (р<0,05) снижение Э2 в крови на 42,6±7,9 пмоль/л (табл.1).

Таблица 1 Группы женщин Уровень Э2 в крови (пмоль/л) и границы доверительного интервала ΔЭ2 1-й день пробы 3-й день пробы Здоровые женщины (n=15) 144,9±7,9 102,3±4,2 42,6±7,9 (127,9-161,7) (93,5-111,2) 25,5-59,6 Больные НГЭ (n=30) 104,5±5,7 96,2±3,6 8,3±2,5 (92,7-116,3) (88,8-103,5) 3,2-13,4

Поскольку овариальная ароматазная активность зависит не только от количества фермента ароматазы, но и от числа антральных фолликулов, то для более точного представления об овариальной ароматазной активности использован коэффициент К (коэффициент овариальной ароматазной активности), показывающий отношение абсолютного значения изменения уровня Э2 в крови в ответ на прием 10 мг ингибитора ароматазы летрозола к уровню АМГ, отражающему количество антральных фолликулов в яичниках женщины.

Коэффициент К был рассчитан у 15 здоровых женщин репродуктивного возраста (средний возраст составил 27±0,4 года) с сохраненным овуляторным циклом, подтвержденным ультразвуковым исследованием органов малого таза и уровнем прогестерона в крови на 20-21 день менструального цикла. Среднее значение овариальной ароматазной активности (M±m) и границы доверительного интервала (при p=0,05) у здоровых женщин (n=15) представлены в табл.2.

Таблица 2 К Среднее значение (M±m) Границы доверительного интервала (при p=0,05) 18,2±4,2 9,1-27,3

Таким образом, о низкой овариальной ароматазной активности судят при показателе коэффициента К менее 9,1, о нормальной овариальной ароматазной активности при показателе коэффициента К от 9,1 до 27,3, о высокой овариальной ароматазной активности судят при значении К более 27,3.

Способ осуществляют следующим образом.

В 9 часов утра на 2-ой день менструального цикла из локтевой вены больной забирают 10 мл крови для гормонального исследования. Затем больная принимает 10 мг ингибитора ароматазы летрозола per os. Через 48 часов проводят повторное взятие крови. Иммуноферментным методом в первой порции крови определяют уровни АМГ и Э2, во второй - только уровень Э2. Об овариальной ароматазной активности судят по коэффициенту K=ΔЭ2/АМГ, с последующей его оценкой: при K<9,1 - низкая овариальная ароматазная активность, при 9,1<K<27,3 - нормальная, при K>27,3 - высокая.

Сущность способа иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Л.Т.С. 25 лет с хронической нормогонадотропной ановуляцией и бесплодием. Проведено исследование по предлагаемому способу. В табл.3 представлены реакция на летрозол, уровень АМГ в крови и значение К больной Л.Т.С.

Таблица 3 Гормоны Уровень гормонов в крови (M±m) ΔЭ2 1-й день пробы 3-й день пробы Эстрадиол, пмоль/л 116,5 91,9 24,6 АМГ, нг/мл 19,9 - - К - 1,24 -

В ответ на прием летрозола у данной больной произошло снижение уровня Э2 в крови с 116,5 пмоль/л до 91,9 пмоль/л, абсолютное значение снижения Э2 составило 24,6 пмоль/л, K=1,24, что указывает на низкую овариальная ароматазную активность.

Заключительный диагноз: частичный дефицит ароматазы, нормогонадотропная ановуляция, первичное бесплодие.

Пример 2. Больная А.В.С., 27 лет, с неклассической формой врожденной гиперплазии коры надпочечников, нормогонадотропной недостаточностью яичников, ановуляцией, опсоменореей, гирсутизмом I. Проведено исследование по предлагаемому способу. В табл.4 представлены результаты исследования: реакция на летрозол, уровень АМГ в крови и значение К больной А.В.С.

Таблица 4 Гормоны Уровень гормонов в крови (M±m) ΔЭ2 1-й день пробы 3-й день пробы Эстрадиол, пмоль/л 121,4 103,7 17,7 АМГ, нг/мл 1,8 - - K - 9,8 -

На 3-й день пробы у данной больной произошло снижение содержания Э2 в крови с 121,4 пмоль/л до 103,7 пмоль/л, абсолютное снижение Э2 равнялось 17,7 пмоль/л, K=9,8. Таким образом, овариальная ароматазная активность не выходила за пределы нормальных колебаний. Это не позволяет связать развитие нормогонадотропной ановуляции у данной больной с дефицитом ароматазы.

Пример 3. Больная А.И.Н., 27 лет, с синдромом поликистозных яичников, нормогонадотропной нормопролактинемической недостаточностью яичников, ановуляцией и бесплодием. Проведено исследование по предлагаемому способу. В табл.5 представлены результаты исследования: реакция на летрозол, уровень АМГ в крови и величина К больной А.И.Н.

Таблица 5 Гормоны Уровень гормонов в крови (M±m) ΔЭ2 1-й день пробы 3-й день пробы Эстрадиол, пмоль/л 206,2 100,3 105,9 АМГ, нг/мл 1,96 - - K - 54,0 -

В ответ на прием летрозола у данной больной произошло снижение уровня Э2 в крови с 206,2 пмоль/л до 100,3 пмоль/л, абсолютное снижение Э2 равнялось 105,9 пмоль/л, K=54,0, что указывает на повышенную овариальная ароматазную активность.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью (95%) оценивать интенсивность овариальной ароматазной активности неинвазивным путем, прост в исполнении и может использоваться в научно-исследовательской практике, в гинекологической практике для диагностики частичного дефицита ароматазы, ответственного за нарушение синтеза эстрадиола фолликулами и играющего роль в патогенезе ановуляторного бесплодия. Диагностика высокой овариальной ароматазной активности может иметь существенное значение для решения вопроса о лечебном применении ингибиторов ароматазы при эстрогензависимых заболеваниях (эндометриоз, миома матки, рак тела матки, опухоли молочной железы).

Изобретение относится к медицине, а именно к способу оценки овариальной ароматазной активности. Сущность способа состоит в том, что проводят гормональное исследование сыворотки крови на второй день менструального цикла до перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола и через 48 часов после; до приема летрозола определяют уровень эстрадиола и уровень антимюллерова гормона, после приема летрозола - уровень эстрадиола. Определяют абсолютное значение снижения уровня эстрадиола после приема летрозола и вычисляют коэффициент овариальной ароматазной активности (K) по формуле. При значении К <9,1 выявляют низкую овариальную ароматазную активность, при 9,1<К<27,3 - нормальную, при К >27,3 - высокую. Использование заявленного способа позволяет с высокой точностью оценивать интенсивность овариальной ароматазной активности неинвазивным путем. 5 табл., 3 пр.

Способ оценки овариальной ароматазной активности путем гормонального исследования сыворотки крови на второй день менструального цикла до перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола и через 48 часов после, отличающийся тем, что до приема летрозола определяют уровень эстрадиола и уровень антимюллерова гормона, после приема летрозола - уровень эстрадиола, определяют абсолютное значение изменения уровня эстрадиола и вычисляют коэффициент овариальной ароматазной активности по следующей формуле:
К=∆Э2/АМГ, где:
∆Э2 - абсолютное значение изменения уровня эстрадиола после приема летрозола, пмоль/л;
АМГ - уровень антимюллерова гормона, нг/мл
и оценивают овариальную ароматазную активность, считая, что при К <9,1 - низкая овариальная ароматазная активность, при 9,1<К<27,3 - нормальная, при К >27,3 - высокая.