ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ СЕРОДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА В РТГА Российский патент 2013 года по МПК C12N7/00 A61K39/17 G01N33/569 

Изобретение относится к штаммам вируса болезни Ньюкасла для приготовления антигенсодержащей сыворотки с целью серодиагностики болезни Ньюкасла в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использовано в ветеринарии, вирусологии и биотехнологии.

Болезнь Ньюкасла является одним из серьезнейших заболеваний птиц, способным вызывать крупные падежи, причиняя огромный вред сельскому хозяйству и нанося серьезный экономический ущерб. Болезнь Ньюкасла - это вирусное заболевание, которое вызывается вирусом болезни Ньюкасла (далее ВБН).

Вирус болезни Ньюкасла или парамиксовирус птиц 1 (Alexander, D.J. (1997) / Newcastle disease and other avian Paramyxoviridae infections // B.W. Calneck (Ed.), Diseases of Poultry 10th edn (p.541-569) // Ames, IA: Iowa State University Press.) имеет большое экономическое значение, так как может вызывать крупные падежи домашней птицы, нанося огромный экономический ущерб.

ВБН имеет весьма обширный круг хозяев: он поражает огромное количество различных видов птиц (Alexander, D.J. (2000) / Newcastle disease in ostriches (Struthio camelus) // Avian Pathology, 29, 95-100). Вирус передается перназальным или пероральным путем. Заболевание, вызываемое ВБН, протекает с разной интенсивностью и обладает разной способностью к передаче. Основываясь на тяжести протекания болезни, выделяют три патотипа ВБН:

лептогенная ветвь вызывает весьма умеренное плохо детектируемое респираторное заболевание,

мезогенная ветвь проявляется в нервных и респираторных расстройствах, вызывая умеренную смертность,

велогенная ветвь вызывает тяжелые кишечные или неврологические повреждения, приводя к высокой смертности (до 100% цыплят) (Alexander, D.J. (1997) / Newcastle disease and other avian Paramyxoviridae infections // B.W. Calneck (Ed.), Diseases of Poultry 10th edn (p.541-569) // Ames, IA: Iowa State University Press.). В зависимости от того какая из систем органов повреждается, велогенная ветвь делится на висцеротропную и нейриотропную.

Вспышки болезни Ньюкасла регулярно регистрируются по всему миру, например в Австралии (Westbury, H. (2001). Newcastle disease virus: an evolving pathogen // Avian Pathology, 30, 5-11), Корее (Youn Jeong Lee, Haan Woo Sungi, Jim Gu Choil, Jae Hong Kirn and Chang Seon Song (2004) / Molecular epidemiology of Newcastle disease viruses isolated in South Korea using sequencing of the fusion protein cleavage site region and phylogenetic relationships // Avion Pathology 33(5), 482-491) и Калифорнии (Janice С.Pedersen, Dennis A. Senne, Peter R. Woolcock, Hailu Kinde, Daniel J. King, Mark G. Wise, Brundaban Panigrahy, and Bruce S. Seal (2004) / Phylogenetic Relationships among Virulent Newcastle Disease Virus Isolates from the 2002-2003 Outbreak in California and Other Recent Outbreaks in North America // Journal of Clinical Microbiology, 45(5), 2329-2334), вызвавшие крупные падежи домашней птицы.

В настоящее время систематический мониторинг ВБН на территории РФ отсутствует. Считается, что для защиты от этого инфекционного возбудителя вполне достаточно вакцинации птиц на птицефабриках и крупных птицефермах. В небольших частных хозяйствах птицы зачастую не вакцинируются вовсе, что повышает опасность возникновения эпизоотий при передаче вирулентного штамма от диких птиц домашним.

Наиболее распространенными на сегодняшний день вакцинами против ВБН являются аттенуированные и инактивированные вакцины, такие как Hitchner, Bl, La Sota и Clone-30 (Bell, I.G., Nicholls, P.J., Norman, C., Ideris, A. & Cross, G.M. (1991) / The resistance of meat chickens vaccinated by aerosol with live V4 Newcastle disease virus vaccine in the field to challenge with a velogenic Newcastle disease virus // Australian Veterinary Journal, 68, 97-101). Тем не менее ВБН способен выживать и реплицироваться даже в вакцинированном животном, имеющем антитела (Parede, L. & Young, P.L. (1990) / The pathogenesis of velogenic Newcastle disease virus infection of chickens of different ages and different levels of immunity // Avion Diseases, 34, 803-808). Следует также добавить, что наиболее распространенные на сегодняшний день вакцинные штаммы были выделены в середине тридцатых годов прошлого столетия и относятся к классу 2 генотипу 2, в то время как наиболее опасные - высокопатогенные штаммы ВБН относятся к классу 2 генотипу 7. Этот генотип широко распространен в азиатских странах и может быть занесен на территорию НСО дикими перелетными птицами. Нашим коллективом на территории РФ были выделены генотипы 4, 5, 6 и 7 класса 2, а также ВБН класса 1. В том числе на территории НСО были выделены генотипы 5 и 6 класса 2, среди которых имелись штаммы азиатского происхождения. Таким образом, имеются все предпосылки для заноса на территорию НСО вирулентных штаммов ВБН из азиатских стран.

Важную роль в борьбе с болезни Ньюкасла играет своевременная диагностика, позволяющая выявлять очаги инфекции и предотвращать распространение из них возбудителя. Предварительный диагноз на БН ставят на основе эпизоотологических, клинических и патоморфологических данных. Однако значительная вариабельность симптоматики и патоморфологических поражений у инфицированной вирусом БН птицы диктует необходимость подтверждения первичного диагноза изоляцией и идентификацией возбудителя, а также установления у заболевшей птицы сероконверсии к последнему. Точная диагностика вируса требует комбинирования различных методов, таких как анализ клинических симптомов (в том числе и гистологический анализ), выделение и наработка вирусного материала и серологический анализ. Детекция ВБН может быть осуществлена с помощью in situ гибридизации (Brown, C.C., King, D.J. & Seal, B.S. (1999) / Comparison of pathology-based techniques for detection of viscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens // Journal of Comparative Pathology, 120, 383-389). Также весьма широко распространенным методом детекции ВБН является реакция торможения гемагглютинации (Alexander, D.J. (1989) / Newcastle disease // H.G.Purchase, L.H.Arp, C.H.Domermuth & J.E.Pearson (Ed.), A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avion Pathogens 3rd edn (p.114-120) // Kennett Square, PA: American Association of Avian Pathologists).

Серологическая диагностика выполнима даже в условиях лабораторий птицефабрик. Для выявления специфических антител к вирусу болезни Ньюкасла наиболее часто применяют РТГА и ИФА. Однократное получение положительных результатов этих тестов позволяет судить лишь о наличии у птицы специфических антител, которые могли появиться как в результате заболевания, так и после вакцинации (Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИИТиБП, 1998). Если исследование проводят в отдаленный после вакцинации период, то рост титра антител в сыворотке крови, взятой от той же птицы через 14 дней, свидетельствует о циркуляции в стаде вируса БН.

Известны штаммы (D26 и Beaudette С) вируса болезни Ньюкасла, которые используются для создания диагностических сывороток (патент США №6719979, МПК А61К 39/295, опубл. 13.04.2004).

Известен другой штамм вируса болезни Ньюкасла B1 (Wehmann et al., Rapid identification of Newcastle disease vims vaccine strains B-1 by restriction site analysis of their matrix gene. Vaccine, 1997, p.1430-1433, vol. 15, № 12/13), используемый также для создания диагностических сывороток.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм вируса болезни Ньюкасла La Sota (Goldhaft, Tevis M., "Guest Editorial Historical Note on the Origin of the LaSota Strain of Newcastle Disease Virus," Oct. 1, 1979, Avian Diseases, vol. 24, № 2, p.297-301).

Вышеприведенные штаммы относятся к классу 2, генотипу 2.

Однако по причине антигенной дивергенции с наиболее опасными современными генетическими линиями (класс 2, генотип 7) точная диагностика и достоверная интерпретация результатов при использовании диагностических препаратов на основе сывороток, приготовленных с использованием штаммов B1 и LaSota и других вышеприведенных аналогов, затруднена.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание отечественного штамма вируса болезни Ньюкастла (ВБН), антигенно адекватного современным высокопатогенным штаммам ВБН, на основе которого создана антигенсодержащая сыворотка для более точной диагностики ВБН в РТГА.

Указанный технический результат достигается получением нового штамма вируса болезни Ньюкасла NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 для приготовления антигенсодержащей сыворотки с целью серодиагностики болезни Ньюкасла в РТГА.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 является типичным представителем вируса болезни Ньюкасла род Avulavirus, семейство Paromyxoviridae. Заявляемый штамм выделен от погибшей утки при вспышке на территории республики Адыгея. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-513.

Источник получения. Из патологического материала, полученного от застреленного клинически здорового голубя (селезенка, легкое, тонкий кишечник, головной мозг), был выделен изолят вируса болезни Ньюкасла, который получил название NDV/Pigeon/Omsk/13/2008. Вирус был выделен на РКЭ на первом пассаже. Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами петуха, но не агглютинировал эритроциты лошади: показатели гемагглютинирующей активности составляли 1:64-1:128 ГАЕ/0,2 мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 5,2 lg ЭИД50/мл.

Идентификация вируса. Первичная идентификация изолированного вируса гриппа А осуществлялась методом ОТ-ПЦР с детекцией результатов в закрытой пробирке в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфичных к консервативным участкам М-гена вируса болезни Ньюкасла, согласно (Miller PJ, Decanini EL, Afonso CL. / Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges / Infect Genet Evol. 2010 Jan;10(1):26-35. Epub 2009 Sep 30).

Генетический и филогенетический анализ: Экстракцию РНК из суспензии вирусов проводили с использованием набора реагентов «Рибосорб» (ФГУН ЦНИИЭ), реакцию обратной транскрипции проводили с концевого, универсального праймера Random dN6 с помощью фермента М-MuLV обратной транскриптазы (ФГУН ЦНИИЭ). Для секвенирования был выбран участок генома вируса болезни Ньюкасла, содержащий С-концевой сегмент М-гена, N-концевой сегмент F-гена и межгенную область. По нуклеотидной последовательности данного участка можно воссоздать аминокислотную последовательность сайта протеолитического расщепления белка слияния, которая является основным маркером патогенности для вируса болезни Ньюкасла. Для секвенирования были использованы праймеры, разработанные на базе SEPRL (Kim LM, King DJ, Curry PE, Suarez DL, Swayne DE, Stallknecht DE, Siemens RD, Pedersen JC, Senne DA, Winker K, Afonso CL. / Phylogenetic diversity among low-virulence newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates // J Virol. 2007 Nov; 81(22): 12641-53. Epub 2007 Sep 12).

ПЦР проводили на приборах «DNA-Engine» (Bio Rad, США) с использованием реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом “cycle sequence” с набором ABI PRISM Big Dye™ v.1.1 (Applied Biosystems, USA) согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM™ Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнялось с использованием блока программ DNASTAR по алгоритму Clustal.

Филогенетический анализ проводился с помощью программы MEGA 3.1 методом Neighbor Joining по алгоритму Kimura 2-parameter с выполнением Bootstrap Test of Phylogeny (1000 повторов) [Kumar S.].

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности генов показал принадлежность штамма NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 к классу 2, генотипу 6. Штамм наиболее близок к штаммам, ранее описанным в Юго-Восточной Азии.

Культуральные свойства. Штамм NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 при культивировании на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сутки (температура культивирования 37°С в атмосфере 5% CO₂).

Патогенность для человека. Штаммы вируса болезни Ньюкасла не являются патогенными для человека.

Патогенность для птицы. Штамм NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 относится к умереннопатогенным вариантам вируса болезни Ньюкасла.

Патогенность для млекопитающих. Штамм не проявляет патогенности для млекопитающих.

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 2 лет при хранении на -70°С.

Для культивирования штамма в культуре клеток используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Пример 1. Ретроспективная серодиагностика сывороток диких перелетных птиц.

Проведено скрининговое исследование сывороток крови от диких птиц с использованием различных антигенов:

1. Антиген предлагаемого штамма NDV/ Pigeon/Omsk /13/2008.

2. Антиген на основе штамма La Sota.

Было исследовано 120 образцов сывороток крови диких птиц. В таблице представлены результаты сравнительного исследования сывороток в РТГА с антигенами различных штаммов. Положительными считали сыворотки с титром ≥32.

При использовании антигена для диагностики вируса болезни Ньюкасла на основе штамма La Sota положительными оказались 47% сывороток, а на основе антигена предлагаемого штамма NDV/ Pigeon/Omsk /13/2008 - 100% (см. таблицу).

Таблица Значения обратных титров положительных сывороток крови диких птиц на наличие антител к вирусу болезни Ньюкасла в РТГЛА Сыворотка Антиген NDV/ Pigeon/Omsk /13/2008 Антиген La Sota 1. ≥2048 128 2. 1024 64 3. 512 64 4. 128 <16 5. 256 <16 6. 256 <16 7. 512 64 8. 256 32 9. 256 <16 10. 512 16 11. 128 32 12. 1024 16 13. 512 32 14. 256 32 15. 512 <16 16. 512 16 17. 512 32 18. 256 16 19. 256 <16

Поликлональные сыворотки от диких птиц проявляют большее сродство к антигену предлагаемого штамма, что позволяет с большей достоверностью детектировать наличие антител. Таким образом, антиген NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 позволяет выявлять 100% сывороток, содержащих антитела к современным вариантам ВБН. Антиген на основе штамма ла сота, который ранее циркулировал и относится.

Уникальные биологические свойства предлагаемого штамма обеспечивают технологическое преимущество по сравнению с другими, поскольку позволяют нарабатывать антиген высокого качества в большом количестве. Следует добавить, что предлагаемый штамм NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 может быть использован совместно с другими известными для более детального исследования антигенных характеристик вновь выделяемых штаммов ВБН и серодиагностики сывороток крови животных.

Пример 2. Оценка уровня популяционного иммунитета домашних птиц на птицеферме после вакцинации.

Для оценки уровня популяционного иммунитета была собрана репрезентативная случайная выборка сывороток крови у кур (n=150).

Была проведена реакция торможения гемагглютинации с антигеном предлагаемого штамма NDV/Pigeon/Omsk /13/2008. Реакцию проводили в U-образных иммунологических планшетах с 5% суспензией эритроцитов петуха.

В результате все сыворотки имели титр в РТГА 1/160-1/320 с антигеном предлагаемого штамма. Этот титр является диагностическим (Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИИТиБП, 1998). Таким образом, по результатам РТГА с антигеном предлагаемого штамма уровень популяционного иммунитета составил 100%. Это позволяет заключить, что вакцинация позволяет сформировать популяционный иммунитет у промышленного поголовья кур к современному «дикому» штамму NDV/Pigeon/Omsk/13/2008. При возможном заносе в подобное стадо домашней птицы дикого штамма вакцинация позволит с большой вероятностью защитить поголовье. При этом подобное заключение было сделано в исследованиях с использованием антигена на основе предлагаемого штамма NDV/Pigeon/Omsk /13/2008.

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса болезни Ньюкасла. Охарактеризованный штамм NDV/Pigeon/Omsk/13/2008 получен от клинически здорового голубя и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-513. Представленный штамм может быть использован для приготовления антигенсодержащей сыворотки с целью серодиагностики болезни Ньюкасла. 1 табл., 2 пр.

Штамм вируса болезни Ньюкасла для использования при диагностике болезни Ньюкасла в РТГА, депонированный в коллекции культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером № V-513.