Штамм "ВНИИЗЖ G7" вируса ньюкаслской болезни птиц для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к получению нового штамма вируса ньюкаслской болезни птиц и может быть использовано для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц.

Болезнь Ньюкасла относится к числу наиболее значимых инфекционных заболеваний для птицеводства России и, несмотря на регулярно проводимую профилактическую вакцинацию, вирус болезни Ньюкасла (ВБН) имеет широкое распространение, и по-прежнему представляет угрозу для птицеводства [1].

Болезнь Ньюкасла - (НБ, псевдочума птиц) - высококонтагиозная вирусная инфекция главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом и поражением внутренних органов. Относится к особо опасным инфекциям. Разносится зараженной птицей, с инфицированными предметами.

Вирус болезни Ньюкасла (Avian orthoavulavirus 1) - РНК-содержащий вирус, принадлежит к семейству парамиксовирусов (Paramyxoviridae) роду Orthoavulavirus, [2]. Восприимчивы к патогену около 240 видов птиц, относящихся к 27 отрядам.

В настоящее время в Российской Федерации в промышленных птицеводческих хозяйствах заболевание относится к контролируемым инфекциям. Но, несмотря на регулярно проводимые программы профилактической вакцинации, регистрация новых случаев заболевания в птицеводческих предприятиях и личных подсобных хозяйствах граждан происходит ежегодно.

Возбудитель инфекции распространен во многих странах мира, однако частота возникновения вспышек болезни, количество пораженной птицы имеют существенные различия, зависящие как от климатических, так и от социально-экономических факторов [3].

ВБН имеет весьма обширный круг хозяев. К болезни восприимчивы более 240 видов птиц, принадлежащих к 27 отрядам. Естественным резервуаром ВБН являются дикие птицы, в организме которых заболевание часто протекает бессимптомно [4].

Наибольшую угрозу птицеводству России и странам ближнего зарубежья на протяжении последних лет представляют вирулентные вирусы БН VI и VII генотипов [5].

Сезонные миграции диких птиц способствуют распространению различных вариантов ВБН в отдаленные географические регионы и обеспечивают их долговременное присутствие во многих экосистемах, что определяет важность и необходимость эпизоотологического мониторинга вируса гриппа птиц в естественных условиях. Во время сезонных миграций разнообразные экологические группы диких птиц перемещаются различными путями, придерживаясь благоприятных для их обитания мест.

В период развития промышленного птицеводства болезнь распространилась на обширные территории. Причинами возникновения и распространения БН многие авторы считают миграцию дикой, экзотической птицы, перемещения спортивных голубей, поступление ремонтного молодняка из неблагополучных по заболеваниям птицы регионов. Так же, большое значение в распространении БН играет бесконтрольная реализация птицеводческой продукции, высокая концентрация поголовья на ограниченной территории, нарушение ветеринарно-санитарных правил и технологий выращивания и содержания птиц, использование контаминированных кормов. Важную роль играет свойство вируса длительное время персистировать в организме птиц [3].

Регистрация вспышек вируса БН происходит ежегодно в различных странах. По данным Всемирной организации здравоохранения животных (МЭБ) в мире в 2023 г. зарегистрировано 322 очага ньюкаслской болезни в 18 странах, из них в Российской Федерации зарегистрировано 13 вспышек [6].

Следует также добавить, что наиболее распространенные на сегодняшний день вакцинные штаммы были выделены в середине тридцатых годов прошлого столетия и относятся к классу 2 генотипу II, в то время как наиболее опасные - высокопатогенные штаммы ВБН относятся к классу 2 генотипу VII. Представители данной генетической группы распространились практически по всему миру, включая Южную Америку и Китай [7]. В РФ В 2019 году в 17 очагах НБ был выделен субгенотип VII-L [8]. Проведенный в том же году обширный серомониторинг показал наличие антител к вирусу НБ в 39% образцов у не прививашихся дворовых кур и высокую серопревалентность синантропных птиц [9].

Известны штаммы вируса ньюкаслской болезни птиц, выделенные на территории РФ, используемые для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм «NDV/Mallard/Adigeya/8/2008» вируса ньюкаслской болезни птиц, выделенный от погибшей утки для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса, а также для разработки кандидатных противораковых препаратов на его основе [10].

Известен штамм «NDV/Pigeon/Omsk/13/2008» вируса ньюкаслской болезни птиц, полученный от клинически здорового голубя для приготовления антигенсодержащей сыворотки с целью серодиагностики болезни Ньюкасла [11].

Известен штамм «NDV/Altai/770/2011» вируса болезни Ньюкасла, относится к группе штаммов голубиного парамиксовируса типа 1 (ГПМВ-1) для изучения онколитических свойств и механизмов онколизиса с перспективой создания прототипного противоракового препарата [12].

Известны штаммы (D26 и Beaudette С) вируса болезни Ньюкасла, которые используются для создания диагностических сывороток [13].

Известен штамм вируса болезни Ньюкасла B1 [14], используемый также для создания диагностических сывороток.

Вышеприведенные штаммы относятся к классу 2, генотипу II.

Известен холодоадаптированный штамм "Н" ГКВ 2348 и штамм ВБН-Х-32/19 вируса болезни ньюкасла, используемый в качестве индуктора интерферона [15].

Представленные выше изобретения на штаммы относятся к медицинской вирусологии.

Имеется несколько штаммов для приготовления живых вакцин для специфической профилактики ньюкаслской болезни (НБ), такие как "Ла-Сота", "B1", "Бор-74 ВГНКИ" или «V-4», "ГАМ-61" [16, 17]. Штаммы "Ла-Сота", "Бор-74 ВГНКИ", "В1" в дозе 1-5×10⁶ЕД₅₀/см³ при интраназальном введении вызывают образование вирусспецифических антител (≥3 log₂) и защищают не менее 80% птицы от заболевания. Однако указанные штаммы размножаются только в куриных эмбрионах и для этой цели используют СПФ-эмбрионы.

Производимая в РФ вакцина из мезогенного штамма "Н" хорошо зарекомендовала себя в условиях эпизоотической нестабильности и неблагополучия, однако ее применение ограничено в связи с остаточной вирулентностью для цыплят младших возрастных групп.

Штамм «ГАМ-61» был получен путем аттенуации вирулентного вируса НБ перемежающимися пассажами на первичной культуре клеток почки теленка и куриных эмбрионах и является штаммом максимально "поздней" селекции. Вирус размножался в первичных (куриных, утиных, перепелиных фибробластах, почке эмбрионов, тестикулах КРС) и перевиваемых линиях (Hela, Hep-1, СПЭВ). При этом уровень гемагглютинации находился в диапазоне 2-4 log₂, инфекционный титр составлял 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцинный штамм «Ла-Сота», относящийся к II генотипу вируса НБ. Однако этот штамм имеет ряд недостатков. Штамм был выделен в 1946 году и антигенно отличается от ныне существующих вариантов, а одним из важнейших факторов выбора эффективного штамма для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики, является антигенное соответствие между гемагглютинином вакцинного и штаммом, циркулирующим в полевых условиях. Установлено, что наследуемая вариация структуры эпитопа гемагглютинин-нейраминидазы произошла в течение 6 лет у 22 из 56 изолятов вируса НБ [18]. Таким образом антигенная удаленность вакцинных и полевых штаммов могут быть одной из главных причин снижения эффективности вакцин против НБ применяемых на практике. Кроме этого известно, что иммунные сыворотки, полученные после вакцинации птиц антигеном штамма «Ла-Сота», тестируемые в РТГА с гомо- и гетерологичными антигенами (штаммов генотипа VII) демонстрировали значительные различия [19].

Техническая проблема заключается в расширении арсенала актуальных штаммов вируса болезни Ньюкасла, циркулирующих на территории РФ, обладающих инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих иммуногенные свойства, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса.

Указанная проблема решена путем получения штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни, который может использоваться для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц.

Вирусный изолят «NDV/by/chicken/612/2021», послуживший источником для получения штамма, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2021 г. из проб патологического материала, полученного от павших в результате вспышки НБ цыплят-бройлеров птицефабрики Республики Беларусь.

В результате проведения научно-исследовательской работы путем пассирования выделенного вируса на СПФ-эмбрионах кур методом предельных разведений из гомогената внутренних органов кур был получен штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц.

Штамм «ВНИИЗЖ G7» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №436-деп / 22-70 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц.

Для получения штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали развивающиеся эмбрионы кур категории СПФ. В результате проведения заражения куриных эмбрионов вирусной суспезией, приготовленной из биологического материала, был получен штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни, имеющий стабильные биотехнологическими свойства и пригодный для использования при проведении лабораторных исследований и изготовлении диагностических препаратов и препаратов специфической профилактики данного заболевания. Штамм адаптирован к репродукции в 9-11-суточных эмбрионах кур, что позволяет в промышленных масштабах получать вирусный материал штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни с титрами инфекционной активности не ниже 6,0 lg ЭИД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью в РГА не ниже1:16.

Идентификация и филогенетическое родство штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни

Проводили генетическую идентификацию полученного вируса и сравнительный анализ последовательности кДНК. Использовали обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Для идентификации и филогенетического анализа осуществляли нуклеотидное секвенирование.

Выравнивание и редактирование нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программного обеспечения ClustalW и BioEdit (версия 7.0.5.3.). Филогенетический анализ осуществляли методом наибольшего правдоподобия (Maximum Likelihood) при использовании модели HKY. Проверка устойчивости филогении проводилась методом «бутстреп» (500 повторностей). Для моделирования различий скоростей эволюции сайтов использовали дискретное гамма-распределение. Анализ проводили с помощью программы MEGA X (версия 10.2.6). Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей гена слияния F (нуклеотиды 1-1662 ОРС), (фиг. 1).

Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц относится к семейству Paramyxoviridae, роду Orthoavulavirus, вида Avian orthoavulavirus 1 и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей ньюкаслской болезни птиц. Размер вириона БН колеблется в пределах 120-300 нм. Основная форма для вирионов - сферическая, со встречающимися нитевидными формами. Геном ВБН представлен одноцепочечной минус РНК, состоящей из 15,186, 15,192 или 15,198 нуклеотидных оснований. РНК содержит шесть генов, отделенных друг от друга консервативными некодирующими участками «start» и «end» контролирующими процесс транскрипции. У представителей родов семейства Paramyxoviridae порядок генов универсален, а количество их различно, в пределах от 6 до 10.

Вирионы семейства Paramyxoviridae имеют двухслойную липидную оболочку, в состав которой входит часть плазматической мембраны клетки хозяина. В оболочке располагаются гликопротеиновые «шипы», с помощью которых происходит проникновение и выход вириона из клетки. «Шипы» состоят из вирусных белков: белок слияния (F) и гемагглютинин-нейраминидаза - белок прикрепления (HN) белок слияния (F) представляет собой тример и содержит две цепи F1 и F2, соединенные дисульфидными мостиками. Поверхностные вирусные гемагглютинин-нейраминидаза (HN) и белок слияния F играют основную роль в процессах соединения мембран клетки и вириона и его проникновения в инфицируемую клетку.

Высокопатогенные штаммы характеризуются многоосновным аминокислотным мотивом сайта расщепления белка F (в позициях 112-(K/R)-R-(Q/K)-(R/K)-R-116) на С-конце субъединицы F2, а также фенилаланином на N-конце субъединицы F1 (позиция 117). Такая последовательность сайта обеспечивает эффективность расщепления клеточными протеазами в различных системах органов и обеспечивает вирулентность штамма.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни принадлежит к субгенотипу VII.1.1. Инокуляция в организм птицы штамма ««ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови в титре от 8,00до 8,3 log₂.

Гемагглютинирующая активность штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц в РГА не ниже 1:16. Титр специфической сыворотки составил 6 log₂.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц чувствителен к детергентам, формальдегиду, этанолу, миродез базик, хлорамину Б, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовым облучении и при рН ниже 5,0.

Биотехнологические свойства

Оптимальными условиями культивирования штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц являются следующие:

- система культивирования - развивающиеся эмбрионы кур в возрасте 9-11 сут.;

- метод заражения - инокуляция при помощи шприца в аллантоисную полость;

- продолжительность культивирования вируса составляет 48-96 ч.

При культивировании вирус штамма «ВНИИЗЖ G7» накапливается в титре не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение не менее 5 пассажей (срок наблюдения).

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА). Так, через 28 сут. после однократной иммунизации цыплят инактивированной цельной вакциной из штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц в прививном объеме 0,5 см³/гол средний титр антител по группе к НА, обеспечивающим реакцию торможения гемагглютинации, составляет 6,7±0,3 log₂.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.

Вирулентность - низкая. Вызывает гибель трех из 10 зараженных цыплят в дозе 7,9 lg ЭИД₅₀.

Контагиозность - контагиозен. Не иммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.

Стабильность - штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц обладает стабильным фенотипом при культивировании в куриных эмбрионах в течение 5 пассажей.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами - штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Условия хранения

При хранении штамма при температуре минус (45,0±5,0)°С допустимая длительность хранения без освежения 6 лет.

Генно- и хемотаксономические характеристики

Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц относится к отряду Mononegavirales, семейству Paramyxoviridae, подсемейству Avulavirinae, роду Orthoavulavirus, виду Avian orthoavulavirus 1. Геном представлен одноцепочечной не фрагментированной РНК отрицательной полярности длиной 15192 нуклеотидов. Геном вируса кодирует шесть структурных белков - нуклеопротеин (NP) (ОРС - 122…1591 н.), фосфопротеин (P) (ОРС - 1893…3080 н.), матриксный белок (M) (ОРС - 3296…4390 н.), белок слияния (F) (ОРС - 4550…6211 н.), гемагглютинин-нейраминидазу (HN) (ОРС - 6418…8133 н.) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (L) (ОРС - 8387…15001 н.) [20, 23].

Классификация штаммов и изолятов ВНБ основана на полной последовательности гена слияния F [24, 25]. При проведении филогенетического анализа нуклеотидной последовательности гена F было установлено, что исследуемый штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц принадлежит к субгенотипу VII.1.1 по классификации Dimitrov et al. (2019) [24] или субгенотипу VII-L по классификации Diel et al. (2012) [25]. Вирусы данного субгенотипа получили широкое распространение на территории стран Ближнего Востока, а также Китая и Индонезии.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении:

фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое положение штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ньюкаслской болезни. Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей гена F.

Показано, что исследуемый штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни принадлежит к субгенотипу VII.1.1 (VII-L).

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID №1: представляет последовательность нуклеотидов гена F штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни;

SEQ ID №2: представляет последовательность аминокислот гена F штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни.

Исследования основывались на определении первичной структуры гена F испытуемого образца штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами и изолятами вируса ньюкаслской болезни. В результате секвенирования была определена полная нуклеотидная (1662 н.о.) и аминокислотная (553 а.о.) последовательности гена F штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение вирусной суспензии штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц

Для культивирования производственного штамма «ВНИИЗЖ G7» использовали развивающиеся СПФ-эмбрионы кур 9-11-суточной инкубации. Перед использованием эмбрионы подвергали овоскопии для подтверждения их кондиционности. Положение и границу пуги обозначали карандашом на поверхности скорлупы.

Ампулу с лиофилизированной вирусной суспензией штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц вскрывали и ресуспендировали, добавляли физиологический раствор до первоначального объема препарата перед лиофилизацией, при этом сублимат полностью растворяется. Далее вирусный материал разбавляли стерильным физиологическим раствором (рН 7,2-7,6). Величину разбавления определяли таким образом, чтобы в 0,1 см³ вирусной суспензии содержалось от 2,0 до 5,0 lg ЭИД₅₀ вируса.

Скорлупу эмбриона обрабатывали дезинфицирующим раствором. В скорлупе в области пуги на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делали отверстие диаметром около 1 мм. Через отверстие в естественной воздушной камере эмбриона в аллантоисную полость с помощью шприца вводили вирусную суспензию штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц в объеме 0,1 см³. После этого отверстие в скорлупе заливали стерильным парафином.

Зараженные КЭ помещали в термостат при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности 50-70%. На лотке с зараженными КЭ делали надпись с указанием штамма вируса, даты и времени заражения. Просмотр зараженных КЭ производили с помощью овоскопа ежедневно в течение 4 дней. Все эмбрионы, погибшие до 24 ч инкубации, выбраковывают. Для изготовления посевного материала использовали только живые эмбрионы 24-96-часовой инкубации.

По окончании инкубации живые КЭ помещали в холодильную камеру (4°С) на 18 ч. Перед вскрытием КЭ выдерживали 3 ч при комнатной температуре до испарения конденсата (влаги) на скорлупе.

Сбор посевного материала проводили асептически. Скорлупу над воздушной камерой дезинфицировали 70% спиртом с последующим фламбированием. Вскрывали скорлупу, затем стерильным глазным пинцетом снимали подскорлупную оболочку и отсасывали стерильной пипеткой аллантоисную жидкость в стерильные пронумерованные флаконы объемом 100 см³. Из вируссодержащей жидкости каждого флакона делали высевы на бактериальные среды для проверки на отсутствие контаминации микрофлорой и определяли гемагглютинирующий титр.

Отсутствие контаминации бактериями и грибами проводят по ГОСТ 28085 [25]. Контаминация антигена из штамма «ВНИИЗЖ G7» посторонними бактериями и грибами отсутствовала.

Проверку контаминации посевного материала микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XV, том II, с. 2997-3008 (ОФС.1.7.2.0031). Рост микоплазм на средах отсутствовал.

Испытания на контаминацию вирусами проводили методом ПЦР с применением тест-систем (коммерческих наборов и методик).

По соответствующим методикам ПЦР исследовали антиген из штамма «ВНИИЗЖ G7» на присутствие геномов, следующих возможных контаминантов:

- вируса инфекционного бронхита кур согласно «Методическим рекомендациям по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [26];

- вируса инфекционной бурсальной болезни согласно «Методическим рекомендациям по выявлению генома вируса инфекционной бурсальной болезни кур с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [27];

- вируса инфекционного энцефаломиелита согласно «Методическим рекомендациям по выявлению РНК вируса инфекционного энцефаломиелита кур методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [28];

- вируса синдрома снижения яйценоскости-76 согласно «Методическим рекомендациям по выявлению ДНК вируса синдрома снижения яйценоскости методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [29];

- вируса реовирусной инфекции кур согласно «Методическим рекомендациям по выявлению РНК реовируса кур методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [30];

- вируса инфекционного ларинготрахеита птиц согласно «Методическим рекомендациям по выявлению генома вируса инфекционного ларинготрахеита птиц с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [31];

- вируса инфекционной анемии цыплят согласно «Методическим рекомендациям по индикации вируса инфекционной анемии цыплят с использованием полимеразной цепной реакции» [32];

- вируса оспы птиц согласно «Методическим рекомендациям по выявлению ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [33];

- вируса лейкоза птиц согласно «Методическим указаниям по выявлению генома вируса лейкоза птиц подтипа J с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [34];

- вируса гриппа А птиц согласно «Методическим рекомендациям по выявлению РНК вируса гриппа птиц типа А методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени» [35];

- вируса болезни Марека согласно «Методическим рекомендациям по выявлению ДНК вируса болезни Марека трех серотипов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в формате мультиплекс» [36];

- вируса ринотрахеита индеек (метапневмовируса птиц) согласно «Методическим указаниям по выявлению генома метапневмовирусов птиц подтипов А и В с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» [37].

Все выше перечисленные реакции имели отрицательные результаты, что подтверждает отсутствие в составе производственного штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса НБ геномов других вирусов.

Определяли нуклеотидную последовательность фрагмента гена F₀ вируса НБ в ПЦР в соответствии с «Методикой выявления генома и штаммовой дифференциации вируса ньюкаслской болезни с использованием ПЦР и прямого секвенирования» [38].

В результате исследований установлено, что полученный штамм «ВНИИЗЖ G7» не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами, а нуклеотидная последовательность фрагмента гена F₀ соответствовала последовательности гена F₀ производственного штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса НБ.

В результате исследований установлено, что полученный штамм «ВНИИЗЖ G7» не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами.

В результате испытаний с применением методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) было установлено, что штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса НБ птиц не контаминирован вирусами гриппа (А) птиц, инфекционного бронхита кур (ИБК), инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), реовирусом птиц, ССЯ-76, инфекционной анемии цыплят, инфекционного энцефаломиелита кур, оспы и лейкоза кур и содержит в своем составе только геном вируса болезни ньюкасла.

Пример 2. Определение инфекционной активности штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц

Определение инфекционной активности штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц проводили на развивающихся СПФ-эмбрионах кур.

Лиофилизированный вирусный материал штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц в количестве трех флаконов ресуспендировали: в каждый флакон добавляли физиологический раствор до первоначального объема материала перед лиофилизацией, образовывая суспензию и объединяли содержимое флаконов, получая среднюю пробу.

Готовили последовательные десятикратные разведения вируссодержащего материала на физиологическом растворе до 10^-10 включительно.

Каждым разведением (с 10^-5 до 10^-10) антигена по 0,1 см³ заражали по 4 эмбриона в аллантоисную полость. Не менее 4 эмбрионов оставляли в качестве контроля.

Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 72 ч при температуре (37,5±0,5)°С и относительной влажности 50-70%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили с интервалом 6 ч.

Гибель эмбрионов в течение первых 24 ч считали неспецифичной. Через 72 ч инкубации все эмбрионы охлаждали при температуре 4-8°С в течение 12-18 ч и вскрывали.

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу над воздушным пространством дезинфицировали 70% раствором спирта и фламбировали. В стерильном боксе ножницами срезали верхнюю часть скорлупы по окружности пуги и вскрывали оболочки эмбриона. Аллантоисную жидкость из полости эмбриона отбирали пипеткой и собирали в стеклянные пробирки от каждого эмбриона отдельно и контролировали на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гемагглютинации (РГА), которую ставили на стекле путем смешивания одной капли аллантоисной жидкости с одной каплей 5% взвеси эритроцитов петуха.

Титр вируса рассчитывали по методу Спирмена-Кербера. Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц составила 7,5±0,35 lg ЭИД₅₀/см³.

Пример 3. Определение гемагглютинирующей активности штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц

Гемагглютинирующую активность штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц определяли в реакции гемагглютинации (РГА) микрометодом в объеме 0,025-0,02 см³.

Для постановки РГА готовили двукратные разведения вирусной суспензии на физиологическом растворе в объеме 0,025 см³. Каждое разведение готовили отдельной пипеткой.

Для постановки РГА использовали 72-луночный плексиглазовый планшет. В один ряд лунок вносили 0,025 см³ физиологического раствора. В первую лунку наливали 0,025 см³ посевного материала (получали разведение 1:2). Новой пипеткой тщательно перемешивали жидкость в этой лунке и затем 0,025 см³ переносили в следующую лунку для получения разведения вируса 1:4. Последующие разведения готовили таким же образом.

Аналогично готовили двукратные разведения штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц до 1:1024-1:4096. Из последней лунки после перемешивания удаляли 0,025 см³ содержимого. После этого к полученным разведениям штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц добавляли 0,025 см³ 1% -ной взвеси эритроцитов.

Затем планшет встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 30-45 мин. После этого учитывали реакцию по форме и величине осадка эритроцитов.

При образовании большого осадка в виде «зонтика» реакцию оценивали на 3 креста (+++), менее интенсивную реакцию - на 2 креста (++), а слабо выраженную на 1 крест (+).

За титр гемагглютининов или за одну гемагглютинирующую единицу (ГАЕ) принимали наибольшее разведение вируса, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов на 3 или 2 креста.

При постановке РГА обязательно ставили контроль на наличие неспецифической агглютинации эритроцитов. Для этого к 0,025 см³ физиологического раствора добавляли 0,025 см³ 1%-ной суспензии эритроцитов.

Таким образом, гемагглютинирующий титр лиофилизированного штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц не ниже 1:16.

Пример 4. Определение стабильности фенотипа штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц

Оценку стабильности фенотипа штамма оценивали при проведении пяти последовательных пассажей исходного штамма в системе культивирования - развивающихся куриных эмбрионах категории СПФ.

При каждом пассаже определяли согласно методике, описанной в примере 2, титр вируса. Фенотип штамма считают стабильным, если после каждого пассажа инфекционная активность вируса составляет не менее 6,0 lg ЭИД₅₀/см³.

В результате исследований, штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц оставался стабильным, т.е. титр инфекционной активности вируса составлял 7,5±0,35 lg ЭИД₅₀/см³.

Пример 5. Получение антигена из штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц

В экстраэмбриональную жидкость эмбрионов кур, инфицированных вирусом ньюкаслской болезни штаммом «ВНИИЗЖ G7», согласно примеру 1, добавляли навеску тиомерсала из расчета 1 г на 4 л жидкости, и подготовленный водный раствор инактиванта аминоэтилэтиленимина с pH 8,2-8,3, из расчета его концентрации в суспензии 0,25%. Инактивацию вируса проводили при температуре 37°С в течение 24 ч. Полученный в результате инактивации антиген исследовали на стерильность и полноту инактивации.

Пример 6. Получение гипериммунной сыворотки против антигена вируса ньюкаслской болезни птиц штамма «ВНИИЗЖ G7»

Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц использовали для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств вируса ньюкаслской болезни.

Был изготовлен экспериментальный образец инактивированной вакцины из штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц. Вакцина была изготовлена из экстраэмбриональной жидкости эмбрионов кур, инфицированных вирусом ньюкаслской болезни штаммом «ВНИИЗЖ G7», согласно примеру 1, инактивированной димером аминоэтилэтиленимина, с добавлением тиомерсала в качестве консерванта, согласно примеру 5, и масляного адъюванта, в соотношении 30:70. Лекарственная форма - эмульсия для инъекции.

Птице в количестве 10 голов вводили внутримышечно и подкожно, однократно, при помощи шприцев-автоматов, образец вакцины в прививном объеме 0,5 см³.

До вакцинации и через 14, 28 сут. после прививки отбирали кровь и определяли величину титров антител против вируса ньюкаслской болезни, используя наборы производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Было установлено, что на 28т сут. после прививки в организме птицы вырабатывается напряженный специфический иммунитет к вирусу ньюкаслской болезни штамма «ВНИИЗЖ G7». Так, средний титр антител к вирусу НБ из штамма «ВНИИЗЖ G7» титр антител у привитых подкожно и внутримышечно птиц из составлял 8,0-8,3 log₂, до вакцинации антител к 7 генотипу вируса НБ обнаружено не было.

Таким образом, получена гипериммунная сыворотка к антигену штамма «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц генотипа 7 с активностью 8,9 log₂.

Также показано, что используя штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц была изготовлена вакцина, при введении которой у 80% иммунизированной птицы выявлен титр антител к вирусу НБ не менее 5,0 log₂ в РТГА.

Таким образом, заявляемый штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц необходим для создания диагностических препаратов и средств специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц»:

1. Alexander D.J. Newcastle disease in the European Union 2000 to 2009 // Avian Pathol. 2011. Vol. 40(6). P. 547-558.

2. Newcastle disease virus: Current status and our understanding / Ketan Ganar, Moushumee Das, Sugandha Sinha [et al.] // Virus Res. - 2014. - Vol. 184 - P. 71-81.

3. Коротецкий И.С., Богоявленский А.П. и др. Молекулярно-генетическая характеристика велогенных изолятов вируса Болезни Ньюкасла, выделенных на территории Российской Федерации, Украины, Казахстана и Киргизии // Вопросы вирусологии. 2010. Т. 55. №4. С. 15-17.

4. Identification of Newcastle disease virus subgenotype VII.2 in wild birds in Turkey /Nuri Turan, Cemal Ozsemir, Aysun Yilmaz [et al.] // Appl Environ Microbiol. - 2020 - Vol. 16. - P. 277

5. Чвала И.А. Выявление вируса ньюкаслской болезни в популяциях птиц в России // Ветеринария. 2015. №1. С. 15-18.

6. https://fsvps.gov.ru/files/neblagopoluchnye-strany-mira-po-bolezni-njukasla-v-2023-g/ (дата обращения 29.01.2024 г).

7. Lomniczi B., Wehmann E., Herczeg J., Ballagi-Pordany A., Kaleta E.F., Werner O. et al. Newcastle disease outbreaks in recent years in western Europe were caused by an old (VI) and a novel genotype (VII). Archives of Virology. 1998;143:49-64. URL: https://link.springer.com/article/10.1007/s007050050267?utm_source=getftr&utm_medium=getftr&utm_campaign=getftr_pilot (дата обращения: 23.10.2023).

8. Фролов С.В., Мороз Н.В., Чвала И.А., Ирза В.Н. Эффективность вакцин против ньюкаслской болезни производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» в отношении актуальных вирусов VII генотипа. Ветеринария сегодня. 2021; 1(1): 44-51. URL: https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/543 (дата обращения: 23.10.2023).

9. Волкова М.А., Чвала И.А., Осипова О.С., Кулагина М.А., Андрейчук Д.Б. Серологический мониторинг гриппа птиц и ньюкаслской болезни в Российской Федерации в 2019 году. Ветеринария сегодня. 2020; (2): 76-82. URL: https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/471 (дата обращения: 23.10.2023).

10. Патент РФ №2010146025, МПК А61К 39/17, 2012 г.

11. Патент РФ №2010146027, МПК А61К 39/17, 2012 г.

12. Юрченко К.С. Изучение противоопухолевого потенциала диких штаммов вируса болезни ньюкасла на опухолевых клетках человека и на модели экспериментального онкогенеза in vivo // дис … канд. биол. наук. СПб. 2019 г.

13. Патент US №6719979, МПК А61К 39/295, 2004 г.

14. Wehmann et al. Rapid identification of Newcastle disease vims vaccine strains B-1 by restriction site analysis of their matrix gene. Vaccine, 1997, p. 1430-1433, vol. 15, №12/13.

15. Муллагулова М.Н. Получение вариантов вируса болезни Ньюкасла со сниженной вирулентностью для клеток-продуцентов интерферона // Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 2000 г.

16. Сюрин В.И. и др. Вирусные болезни животных, 1998, М., ВНИИТИБП, с. 214-232.

17. Смоленский В.И. Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии, дисс. докт. вет. наук, 1999 г.

18. Sun-Hee Cho, Hyuk-Joon Kwon, Tae-Eun Kim, Jae-Hong Kim, Han-Sang Yoo, Sun-Joong Kim. Variation of a newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase linear epitope. Journal of Clinical Microbiology. 2008; 46: 1541-1544. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2292945/ (дата обращения: 23.10.2023).

19. Jingjing Liu, Jie Zhu, Haixu Xu, Juan Li, Zenglei Hu, Shunlin Hu, et al. Effects of the HN Antigenic Difference between the Vaccine Strain and the Challenge Strain of Newcastle Disease Virus on Virus Shedding and Transmission. Viruses. 2017; 9(8): 225. URL: https://www.mdpi.com/1999-4915/9/8/225/htm#table_body_display_viruses-09-00225-t002 (дата обращения: 23.10.2023).

20. Newcastle disease virus: Current status and our understanding / K. Ganar, M. Das, S. Sinha [et al.] // Virus Res. - Vol. 184. - 2014. - p. 71-81 https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.02.016.

21. Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications / A. Czeglédi, D. Ujvári, E. Somogui [et al.] // Virus Res. - Vol. 120 (1-2). - 2006. - p. 36-48 https://doi.org/10.1016/j.virusres.2005.11.009.

23. Updated unified phylogenetic classification system and revised nomenclature for Newcastle disease virus / K. Dimitrov, C. Abolnik, C. Afonso [et al.] // Infect. Genet. Evol. - 2019; 74; https://doi.org/10.1016/j.meegid.2019.103917.

24. Diel, D.G., da Silva, L.H., Liu, H., Wang, Z., Miller, P.J., Afonso, C.L., 2012a. Genetic diversity of avian paramyxovirus type1: proposal for a unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes. Infect. Genet. Evol. 12, 1770-1779. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2012.07.012.

25. ГОСТ 28085-2013. Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Методы контроля стерильности.

26. Методические рекомендации по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, А.В. Андриясов, И.А. Чвала // ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017.

27. Методические рекомендации по выявлению генома вируса инфекционной бурсальной болезни с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, И.А. Чвала // ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017.

28. Методические рекомендации по выявлению РНК вируса энцефаломиелита кур методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Д.Б. Андрейчук, О.С. Осипова, А.Н. Колотилов, И.А. Чвала // ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017.

29. Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса синдрома снижения яйценоскости - 76 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Н.Г. Зиняков, Т.И. Ерошина, И.А. Чвала // ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017.

30. Методические рекомендации по выявлению РНК реовируса кур методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Н.Г. Зиняков, Д.Б. Андрейчук, А.В. Андриясов, И.А. Чвала // ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017.

31. Методические рекомендации по выявлению генома вируса инфекционного ларинготрахеита птиц с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Л.О. Щербакова, Т.И. Ерошина, В.Ю. Кулаков, И.А. Чвала // ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017.

32. Методические рекомендации по выявлению генома вируса инфекционной анемии цыплят с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [Текст]: утв. 01.12.2017 / 52-17, Л.О. Щербакова, З.Б. Никонова, Т.И. Ерошина, И.А. Чвала; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: [б. и.], 2017. - 12 с. - Б. ц.

33. Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [Текст]: утв. ФГБУ «ВНИИЗЖ» 31.05.2017 / 46-17, Н.П. Елаткин, А.Н. Ушакова, Д.Б. Андрейчук, И.А. Чвала ; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: [б. и.], 2017. - 15 с. - Б. ц.

34. Методические рекомендации по выявлению генома вируса лейкоза птиц подтипа J с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [Текст]: утв. 01.12.2017 / 53-17, Л.О. Щербакова, М.И. Шульпин, С.П. Лазарева, И.А. Чвала ; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: [б. и.], 2017. - 15 с. - Б. ц.

35. Методические рекомендации по выявлению РНК вируса гриппа птиц типа А методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени [Текст]: методический материал / 45-16, А.В. Андриясов, Д.Б. Андрейчук, И.А. Чвала ; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: [б. и.], 2016. - 13 с.

36. Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса болезни Марека трех серотипов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в формате мультиплекс [Текст]: утв. 01.12.2017 / 57-17, Д.Б. Андрейчук, Т.И. Ерошина, А.А. Козлов, И.А. Чвала; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: [б. и.], 2017. - 13 с. - Б. ц.

37. Методические рекомендации по выявлению генома метапневмовируса птиц подтипа А и В с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени [Текст]: утв. 01.12.2017 / 59-17, З.Б. Никонова, Н.Г. Зиняков, С.Н. Колосов, И.А. Чвала; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: [б. и.], 2017. - 17 с. - Б. ц.

38. Методика выявления генома и штаммовой дифференциации вируса ньюкаслской болезни с использованием ПЦР и прямого секвенирования [Текст]: методический материал / 35-03, Л.О. Щербакова, И.П. Пчелкина, В.В. Дрыгин, С.К. Старов; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир: [б. и.], 2003. - 10 с. - Б. ц.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен штамм вируса ньюкаслской болезни птиц сферы Riboviria, царства Orthornavirae, типа Negarnaviricota, подтипа Haploviricotina, класса Monjiviricetes, отряда Mononegavirales, семейства Paramyxoviridae, подсемейства Avulavirinae, рода Orthoavulavirus, вида Avian orthoavulavirus 1, депонированный в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №436-деп/22-70 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм репродуцируется в 11-суточных куриных эмбрионах СПФ-кур, где достигает инфекционного титра не менее 6,0 lg ЭИД₅₀/см³. Штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни, вызываемой вирусами, относящимися к генотипу VII-L. 1 ил., 6 пр.

Штамм «ВНИИЗЖ G7» вируса ньюкаслской болезни птиц семейства Paramyxoviridae рода Orthoavulavirus вида Avian orthoavulavirus 1, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №436 – деп / 22-70 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ньюкаслской болезни птиц.