ШТАММ "ЛП" PARAMYXOVIRUS ПЕРВОГО СЕРОТИПА ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/17 C12N7/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам парамиксовирусов птиц, и может быть использовано для контроля иммуногенной активности вакцин, а также в научных и производственных лабораториях при конструировании вакцин против ньюкаслской болезни.

Штамм "Т-53" вируса ньюкаслской болезни, который используется уже около 50 лет для контроля иммуногенной активности вакцин против ньюкаслской болезни (Смоленский В. И. "Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии" док. дис. М., 1999 г., ТУ 10-19-212-86 - на штамм Ла Сота, ТУ 46-21-567-80 - на штамм "Бор-74 ВГНКИ, ТУ 10-09-4-90 - на инактивированную вакцину, ТУ 9384-010-00008064-97 - на штамм "Н"), в результате многочисленных пассажей снизил свою патогенность для цыплят. Гибель цыплят наступает на 4-5 сутки после заражения, патологические изменения внутренних органов имеют недостаточно четкую картину для этого заболевания, в частности на границе между железистым и мышечным желудком не всегда проявляются кровоизлияния.

Целью предлагаемого изобретения является получение велогенного штамма вируса ньюкаслской болезни (НБ), обладающего стабильной вирулентностью для восприимчивой птицы, пригодного для использования в качестве контрольного при оценке иммуногенной активности вакцин против ньюкаслской болезни.

Цель была достигнута путем выделения изолята вируса, ньюкаслской болезни из патматериала птицы, доставленной из АОЗТ "Птицефабрика Русско-Высоцкая" (Ленинградская обл., Ломоносовский район), который на иммунном фоне вызывал гибель цыплят. Проведено 5 пассажей на развивающихся куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную полость и инкубации при 37^oС в течение 24-36 ч с последующим заражением 45 дневных цыплят и изучением клинических и патологоанатомических характеристик. Изолят депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН (регистрационный номер 2224 от 01.09.2000 г.) как штамм "ЛП" вируса НБ.

Видовая специфичность штамма "ЛП" определена в реакции задержки гемагглютинации со специфическими сыворотками к вирусу ньюкаслской болезни, гриппа птиц (ГП) и синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) по общепринятой методике и твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА) с использованием моноклинальных антител (МАт) к рибонуклеопротеиду (РНП) вирусов НБ и ГП. Установлено, что только специфические сыворотки к вирусу ньюкаслской болезни вызывают задержку гемагглютинации со штаммом "ЛП". В ТФ ИФА реакция положительная (Мат) к РНП вируса НБ. По результатам этих опытов штамм "ЛП" относится к вирусу ньюкаслской болезни семейства Paramyxovirde 1 серотипа (табл. 1).

Инфекционная активность штамма "ЛП" вируса НБ для 10-11-дневных куриных эмбрионов (КЭ) определена путем заражения в аллантоисную полость по 0,1 см³ ЭАЖ с 4 по 9 десятикратными разведениями по 6 КЭ на каждое разведение в двух повторностях. Инкубировали при 37^oС и овоскопировали через каждые 24 часа. Для сравнительной оценки характеристик штамма "ЛП" провели аналогичный опыт со штаммом "Т-53" вируса НБ, который является референс-штаммом и рекомендован в качестве "пробойника".

Патогенность штамма "ЛП" вируса НБ для цыплят определена на бройлерах 15-дневного возраста. Титр материнских антител к вирусу НБ составил 0 - 1/4. Заражали по 5 голов цыплят внутримышечно по 1,0 см³ с 3 по 8-е десятикратное разведение испытуемого изолята. Наблюдение в течение 10 дней. Для сравнительной оценки характеристик изолята провели аналогичный опыт со штаммом "Т-53" вируса НБ. Началом проявления клинических признаков заболевания у цыплят, зараженных изолятом "ЛП", были 3-и сутки, а у цыплят, зараженных штаммом "Т-53", - 4-5-е сутки.

Патологоанатомические изменения у погибших цыплят, зараженных штаммом "ЛП", в отличие от штамма "Т-53" были следующие: кровоизлияния в верхней трети мышечного желудка под кутикулой, более четкие множественные кровоизлияния на слизистой железистого желудка. На границе железистого желудка с мышечным - "геморрагическое кольцо". Слизистая оболочка трахеи отечна, гиперемирована, с точечными кровоизлияниями, в трахее - скопление слизи с кровью. В кишечнике крупные фибринозно-некротические образования. Это свидетельствует о более высокой патогенности штамма "ЛП", чем штамма "Т-53".

Инфекционный титр штамма "ЛП" вируса НБ для цыплят 15-дневного возраста составляет 7,0 lg ЛД 50/см³.

Инфекционные титры штамма "ЛП" для КЭ составили 9,50 lg ЭЛД 50/см³, 9,75 lg ЭИЛ 50/см³, а штамма "Т-53" - 8,75 lg ЭЛД 50/см³, 9,0 lg ЭИД 50/см³. В РГA гемагглютинирующий титр штамма "ЛП" 1/512-1/1024, а штамма "Т-53" - 1/256-1/512. Штамм "ЛП" относится к велогенным штаммам вируса ньюкаслской болезни.

Контроль стерильности штамма "ЛП" проверяли на бактериальных средах МПА, МПБ, Сабуро и тиогликолевом агаре. Рост бактериальной и грибковой микрофлоры при наблюдении в течение 10 дней отсутствовал (табл. 2).

Маркерные характеристики
Морфологические признаки
При электронноскопическом исследовании вирионы штамма "ЛП" имеют сферическую и филаментозную формы с пепломерами по всей поверхности мембраны. Размер вирионов 80-120 нм.

Культуральные признаки
Вирус хорошо размножается в 9-10-дневных куриных эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость. Биологическая активность через 24-36 ч инкубации при 37^oС достигает титра 8,0-8,5 lg ЭЛД 50/см³.

Вирулентные свойства
Индекс интрацеребральной патогенности составляет 1,9.

Индекс внутривенной патогенности составляет 1,4.

Величина среднего времени гибели куриных эмбрионов, вызванная минимальной летальной дозой, составляет 30-40 ч.

Антигенные свойства
Видовая специфичность штамма "ЛП" определена в реакции задержки гемагглютинации со специфическими сыворотками к вирусу ньюкаслской болезни, ГП и ССЯ-76 по общепринятой методике и твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА) с использованием моноклональных антител (МАт) к рибонуклеопротеиду (РНП) вирусов НБ и ГП. Установлено, что штамп "ЛП" антигенно родственен парамиксовирусу первой антигенной подгруппы (ПМВ-1).

Внутримышечное введение вируса цыплятам в дозе 10000 ЭЛД 50/см³ вызывает их гибель на 3-4 сутки с признаками, характерными для ньюкаслской болезни.

Иммуногенность
Штамм "ЛП" относится к велогенным вирусам первого серотипа Paramyxovirus.

Серологические свойства
Штамм "ЛП" вируса НБ обладает способностью агглютинировать эритроциты птиц, животных и человека. Гемагглютинирующий титр 1/512-1/1024. Элюция вируса с эритроцитов наступает через 60-80 мин.

Тропизм
Выраженным тропизмом штамм не обладает. Преимущественно вирус размножается в клетках головного мозга, селезенке и трахее.

Безвредность
Штамм "ЛП" вируса НБ патогенен для кур всех возрастных групп.

Стандартные условия выращивания
Вирус размножается в развивающихся куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную полость и инкубации при 37^oС в течение 24-36 ч. Лиофилизируется в смеси с пептоно-лактозным стабилизатором в соотношении 1/1 и хранится при температуре минус 40^oС.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам парамиксовирусов птиц, и может быть использовано для контроля иммуногенной активности вакцин, а также в научных и производственных лабораториях при конструировании вакцин против ньюкаслской болезни. Штамм получен путем выделения изолята вируса ньюкаслской болезни из патматериала птицы, доставленной из птицефабрики. Штамм "ЛП" депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН. Штамм "ЛП" в качестве контрольного при оценке иммуногенной активности вакцин против ньюкаслской болезни обладает более высокой инфекционной активностью (7,0 lg ЛД 50/ см³, 9,5 lg ЭЛД 50/см³) с более выраженными патологоанатомическими изменениями: кровоизлияния в верхней трети мышечного желудка под кутикулой; более четкие множественные кровоизлияния на слизистой железистого желудка; на границе железистого желудка с мышечным "геморрагическое кольцо"; слизистая оболочка трахеи отечна, гиперемирована с точечными кровоизлияниями, в трахее скопление слизи с кровью; в кишечнике - крупные фибринозно-некротические образования. 2 табл.

Штамм "ЛП" Paramyxovirus первого серотипа 2227, депонированный в Коллекции штаммов микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, для контроля иммуногенной активности вакцин против ньюкаслской болезни птиц.