Способ сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалёза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis Российский патент 2020 года по МПК A01K67/33 G01N33/48 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а более конкретно - к паразитологии (=гельминтологии) к «Способу сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis» и предназначенный для использования при гельминтологических лабораторных или/и полевых исследованиях чистых сборов зрелых яиц от живых, половозрелых самок Trichuris (=Trichocephalus) ovis, от спонтанно зараженных возбудителем трихоцефалеза домашних или/и диких жвачных, который необходим при терапии и профилактики трихоцефалеза домашних или/и диких жвачных, скрининге препаратов (антигельминтиков) и проведения генетических исследований - ДНК.

Трихоцефалез это заболевание домашних и диких жвачных, которое регистрируется во многих странах мира и в Российской Федерации. [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9] Болезнь протекает зачастую в хронической форме у взрослых домашних жвачных, но может протекать и в острой форме, особенно у молодняка, что может стать причиной гибели последних, если несвоевременно ставится диагноз и не проводятся лечебные и профилактические мероприятия. [4, 5] Гибель домашних и диких жвачных может наносить зоопаркам, циркам, заповедникам, охотничьим и фермерским хозяйствам огромные экономические убытки. Поэтому разработка различных способов, которые дают возможность исследователям более детально изучать эпизоотологию, биологию и видовой состав возбудителей трихоцефалеза жвачных, позволит разработать более эффективные меры борьбы и профилактики этой болезни.

Известны способы сбора яиц гельминтов от домашних жвачных [Котельников Г.А. - 1, в том числе и от цирковых животных: В.Е. Пасечник и др., - 5] с помощью методов копроовоскопии (флотации, седиментации, комбинированные), однако они имеют следующий существенный недостаток:

При этих способах неизвестен вид возбудителя инвазии, так как по литературным данным у домашних и диких жвачных Российской Федерации могут паразитировать 11 видов трихоцефал возбудителей трихоцефалеза: Trichuris ovis Abildgaard, 1795; Т. globulosa Linstow, 1901; Т. skrjabini Baskakov, 1924; Т. tarandi Puschmenkov, 1939; T. longispiculus Artjuch 1948; T. dzeirani Artjuch, 1948; T. lani Artjuch, 1948; T. capreoli Artjuch, 1948; T. baskakovi Mizkewitch, 1959; T. massino Mizkewitch, 1959; T.schumakovitschi Savinkova, 1967). Следовательно, получить сборы яиц методами копроовоскопии от определенного вида трихоцефал (в нашем случае вид Trichuris ovis) невозможно.

Можно воспользоваться известным «Способом прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал Trichocephalus ovis, Trichocephalus skrjabini, Trichocephalus capreoli от жвачных животных» [Пасечник В.Е. - 6] Этот способ эффективен при постановке прижизненного диагноза, то есть уточнения вида возбудителя болезни: Trichuris ovis, Т. skrjabini, Т. capreoli и др., если у нас нет возможности исследовать павших больных жвачных непосредственно на вскрытии.

Однако при необходимости сбора зрелых яиц от оределенного вида самок власоглава (в нашем случае от вида: Trichuris (=Trichocephalus) ovis) этот способ, к сожалению непригоден так как при этом способе яйца трихоцефал (=трихурисов) просветляют в смеси 98,5%-ного раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1.

Следовательно, яйца трихоцефал любого вида (в нашем случае вид: Trichuris ovis) будут непригодны для культивирования до инвазионной стадии, после применения этого способа.

Известен «Способ прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis» [Пасечник В.Е. - 6], который имеет недостатки:

Trichuris vulpis является паразитом типичным для домашних и диких хищных [Пасечник В.Е. - 2, 4, 5, 7], a Trichuris ovis типичным гельминтом для домашних и диких жвачных. [2, 3, 4, 5, 6, 9] Поэтому и условия в лабораторной среде (применяемый раствор, температурный режим и время экспозиции) для этих самок власоглава будут резко отличаться:

другие недостатки: необходимость использования пробирок, что значительно затрудняет посевы яиц Trichuris ovis, для культивирования до инвазионной стадии и удлиняет рабочее время экспериментаторов;

применение официнального изотонического раствора (0,9%) хлорида натрия для сбора яиц от самок паразитарного зооноза хищных Trichuris vulpis, однако применение в предлагаемом нами способе этого раствора к самкам Trichuris ovis паразита жвачных нецелесообразно, так как количество яиц при указанном выше известном способе сбора яиц, значительно уступает предлагаемому способу;

температурный режим при этом известном способе сбора яиц от самок власоглава хищных Trichuris vulpis, значительно выше (t=37,5° - 39°С), что влияет существенно на количество получаемых яиц по предлагаемому нами способу от самок Trichuris ovis, власоглава жвачных, так как при t>30°С в разы уменьшается количество яиц выделяемые живой, половозрелой самкой Trichuris ovis, что неприемлемо, так как очень часто для заражения экспериментальных животных необходимы тысячи яиц;

Известен способ сбора яиц [В.Е. Пасечник - 2, 4] для лабораторных исследований, при котором исследователи для сбора яиц от гельминтов проводят секционирование половых органов самок: вагины, вульвы, матки.

Этот способ имеет следующие недостатки:

1) полученный материал (яйца паразитов) очень сильно загрязнен остатками тканей паразита, что в процессе опыта вызывает развитие бактериальной микрофлоры и гниение (=разрушение) яиц гельминтов;

2) извлечение яиц из матки паразита (указанным выше способом) дополнительно загрязняет материал большим количеством незрелых яиц.

3) при этом способе сбора яиц получение до 100% зрелых яиц невозможно, так как основная масса зрелых яиц находится в дистальной, что в матке паразита яйца созревают неравномерно) и кроме того в процессе опытов исследователям нужны для культивирования до инвазионной стадии с целью изучения в лабораторных экспериментах биологии и эпизоотологии паразитов сборы в количествах иногда исчисляющие тысячи зрелых яиц.

Очевидно, что исследователю по этой причине получить в большом количестве чистые сборы до 100% зрелые яйца от Trichuris (=Trichocephalus) ovis, для проведения экспериментов в лабораторных или/и полевых условиях, крайне сложно и практически невозможно.

Исходя из недостатков указанных выше известных способов сбора яиц от гельминтов, мы при разработке нашего «Способа сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis» использовали известный физиологический раствор Tyrode М. (по Свиридову С.В., 2007) [8]: состав раствора (г/л дистиллированной воды): NaCl - 8.00, KCl - 0.20, CaCl₂ - 0.20, MgCl₂ - 0.10, NaH₂PO₄ - 0.05, NaHCO₃ - 1.00, глюкоза - 1.00

- применяется в качестве кровезаменителя в гуманитарной медицине, который позволил получить хорошие результаты по сбору яиц от Trichuris (=Trichocephalus) ovis.

Целью изобретения является использование впервые разработанного нами «Способа сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis», для получения естественным способом до 100% зрелых яиц от живых, половозрелых самок

Trichuris ovis и предназначенного для проведения экспериментов в лабораторных или/и полевых условиях при изучении терапии и профилактики трихоцефалеза жвачных, скрининга препаратов (антигельминтиков) и генетических исследований ДНК.

Поставленная цель достигается тем, что при проведении сбора яиц от возбудителей трихоцефалеза, применяют разработанный нами впервые «Способ сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis», заключающийся в том, что из материала толстой кишки спонтанно зараженных домашних и диких жвачных животных при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии животных [по К.И. Скрябину - 9] отбирают 250 и более живых половозрелых самок Trichocephalus ovis после предварительной отмывки в изотоническом (0,9%) растворе хлорида натрия, помещают по 5 самок в отдельные бактериологические чашки с физиологическим раствором Tyrode экспонируют при t=25°C в течение 3 ч в условиях термостата, после чего получают чистый сбор зрелых яиц Trichocephalus ovis, выделенных живыми самками.

Экспериментатор получает чистый сбор из до 100% зрелых яиц от самок Trichuris (=Trichocephalus) ovis возбудителя трихоцефалеза жвачных.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом: известным способом сбора яиц путем секционирования (=разрушения) половых женских органов паразитов, показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что:

проводят раздельный (=индивидуальный) только что извлеченных из вскрытых органов жвачных сбор живых, половозрелых самок Trichuris (=Trichocephalus) ovis, в каждую бактериологическую чашку с раствором Tyrode и экспонируют их при t=25°С в течение 3 часов в условиях термостата.

После этой экспозиции экспериментаторы получают с эффективностью до 100% чистый сбор зрелых яиц гельминтов выделившихся естественным путем из половых органов (вульвы, вагины, матки) самок, так как они вынуждены выделять в раствор Tyrode и следовательно в бактериологические чашки - до 100% зрелые, чистые яйца Trichuris (=Trichocephalus) ovis.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях, и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия».

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример 1. При исследовании на мясокомбинатах, убойных пунктах в России (Московской области), Республике Молдова - толстого кишечника и особенно слепой кишки от спонтанно зараженных трихоцефалами домашних жвачных (крупный рогатый скот, овец), были собраны живые, половозрелые 500 самок Trichuris (=Trichocephalus) ovis, которые были использованы для получения сборов яиц по двум способам:.

1-й (опыт) по предлагаемому «Способу сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis», заключающийся в отборе только живых, половозрелых 250 и более самок Trichuris ovis после гельминтологических исследований толстого кишечника на вскрытии от спонтанно зараженных возбудителем трихоцефалеза жвачных с предварительной отмывкой живых, половозрелых самок Trichuris ovis от субстрата в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия и помещении по 5 самок в каждую бактериологическую чашку с физиологическим раствором Tyrode и экспозицией их при t=25°С в течение 3 часов в условиях термостата.

и 2-м (контроль) известным «Способом сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis» [по В.Е. Пасечнику -], который заключается в отборе 250 живых, половозрелых самок Trichuris ovis, после гельминтологических исследований толстого кишечника на вскрытии от спонтанно зараженных возбудителем трихоцефалеза жвачных без предварительной отмывкой живых, половозрелых самок Trichuris ovis от субстрата в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия в отдельные пробирки с официнальным изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия (solutio Natrii chlorati isotonica), и экспозицией пробирок при t=37,5°-39°С в течение 5 часов в условиях термостата.

Через 5 часов были сравнены результаты эффективности этих двух способов сбора яиц от самок возбудителя трихоцефалеза жвачных: Trichuris (=Trichocephalus) ovis. В результате, было выяснено, что:

по известному способу (контроль) то есть без предварительной отмывкой живых, половозрелых самок Trichuris ovis от субстрата в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия и помещении их в пробирки с изотоническим раствором (0,9%) хлорида натрия (solution Natrii chlorati isotonica) и экспозицией пробирок с самками Trichuris ovis при t=37,5°C-39°С в течение 5 часов в условиях термостата, количество яиц выделенных 250 самками в раствор:

при t=37,5°-39°С составило 759 яиц при экспозиции 5 часов в условиях термостата.

А по предлагаемому способу (1-й опыт) отобранные 250 живых, половозрелых самок Trichuris ovis с предварительной отмывкой их от субстрата в изотоническом растворе (0,9%) растворе хлорида натрия в раствор Tyrode и помещенных по 5 живых, половозрелых самок Trichuris ovis в каждую бактериологическую чашку и экспозицией в термостате при t=25°C в течение 3-х и 5-и часов:

при t=25°С составило 2957 яиц в течение 3-х часов и 3530 яиц в течение 5 часов.

Анализируя результаты сравнительных способов известного (2-й контроль) и предлагаемого (1-й опыт), отчетливо видно, что разработанный способ сбора яиц при отработанных параметрах:

предварительная отмывка живых, половозрелых самок Trichuris ovis от субстрата в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия;

сбора живых, половозрелых самок Trichuris ovis, не в пробирки, а в бактериологические чашки - что позволяет сохранить большее количество зрелых яиц и непосредственно в бактериологических чашках проводить культивирование яиц Т. ovis до инвазионной стадии;

соблюдение температурного режима (не при t=37°-39°С, а при t=25°С);

и применение другого раствора (не официнального изотонического раствора (0,9%) хлорида натрия, а физиологического раствора Tyrode);

и времени экспозиции (не в течение 5 часов, а в течение 3-х часов) имеет явное преимущество перед известным способом, что и было подтверждено экспериментально.

Следовательно, данный пример убедительно показывает преимущество предлагаемого «Способа сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных: Trichuris (=Trichocephalus) ovis».

Пример 2. При исследовании на мясокомбинатах, убойных пунктах России (Московской области), Республике Молдова - толстого кишечника и особенно слепой кишки от спонтанно зараженных трихоцефалами домашних жвачных (овец и крупный рогатый скот), были собраны 500 живых, половозрелых самок Trichuris (=Trichocephalus) ovis.

Собранные 500 живых и половозрелых Trichuris ovis, были использованы для получения сборов яиц по двум способам:

1-й (опыт) по заявляемому способу сбора яиц (еще живые и половозрелые 250 самок Trichuris ovis, предварительно отмытые от субстрата в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия с последующим помещением по 5 самок в каждую бактериологическую чашку с физиологическим раствором Tyrode и экспозицией их при t=25°C в течение 3 часов в условиях термостата, где они произвольно откладывают яйца в пробирки с физиологическим раствором Tyrode.

и 2-м (контроль) известным способом сбора яиц путем вскрытия вульвы, вагины, матки 250 самок Trichuris ovis.

В последующем по 2500 яиц выбранных произвольно (=подряд) Trichuris ovis полученных предлагаемым нами способом (1-й опыт) и известным способом путем разрушения половых органов самок гельминтов (2-й контроль) культивировали в термостате при t=30°С и просматривали под микроскопом, чтобы сравнить предлагаемый способ сбора яиц (1-й - опыт) и известный способ - путем вскрытия половых органов самок: матки, вагины, вульвы (2-й - контроль).

В результате выяснилось, что в сборе яиц по известному способу (2-й - контроль) развилось только 66% (1650 яиц), а остальные яйца начали загнивать, а при предлагаемом способе (1-й - опыт) сбора, яйца до 100% случаев были живыми и развивались без наличия секундарной микрофлоры.

Таким образом, результаты культивирования яиц собранные по разработанному и предлагаемому нами способу (1-й - опыт) подтвердили данные, полученные при использовании предлагаемого «Способа сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis», которые были выявлены нами впервые.

Использование предлагаемого «Способа сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных: Trichuris (=Trichocephalus) ovis», обеспечивает по сравнению с существующими способами сбора яиц: копроовоскопии, сбора яиц путем секционирования (=разрушения) половых органов самок гельминтов (вульвы, вагины, матки) следующие преимущества:

известен вид трихоцефал: Trichuris ovis (в отличие от известных способов сбора яиц: копроовоскопии седиментации, флотации, комбинированного, когда неизвестен вид трихоцефал у домашних и диких жвачных в Российской Федерации по литератрным данным могут паразитировать 11 видов трихоцефал: Т. ovis; Т. globulosa; Т. skrjabini et al., следовательно известные прижизненные способы сбора яиц (флотации, седиментации, комбинированного) непригодны для сбора яиц Т. ovis;

сокращает время и снижает трудоемкость исследований за счет исключения необходимости проведения вскрытия половых органов самок: вульвы, вагины, матки Trichuris ovis (в отличие от способа сбора яиц путем вскрытия половых органов самок гельминтов);

исключает загрязненность полученного сбора яиц обрывками частиц тканей половых органов самок (вульвы, вагины, матки) от Trichuris ovis (в отличие от способа сбора яиц путем вскрытия половых органов самок гельминтов);

исключает загнивание и развитие секундарной бактериальной инфекции в культуре полученной предлагаемым нами способа эффективного и чистого сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза жвачных: Trichuris ovis (в отличие от способа сбора яиц путем вскрытия половых органов самок паразита);

сбор живых, половозрелых самок Trichuris ovis, не в пробирки, а в бактериологические чашки позволяет:

а) сохранить большее количество зрелых яиц,

б) и непосредственно проводить культивирование и наблюдение за культурой яиц Trichuris ovis (в отличие от известного способа сбора яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis, при котором используют пробирки, а не бактериологические чашки, что значительно затрудняет посевы яиц Trichuris (=Trichocephalus) ovis, для культивирования до инвазионной стадии и удлиняет рабочее время экспериментатора[7]);

соблюдение более эффективного температурного режима (не при t=37° 39°С, а при t=25°С), позволяет получить намного большее количество зрелых яиц (в отличие от известного способа сбора яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis [7]);

применение другого раствора: не официнального изотонического раствора (0,9%) хлорида натрия, а физиологического раствора Tyrode имеет явное преимущество в отличие от известного способа сбора [7] яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=TrichocephaIus) vulpis, что и было подтверждено нами экспериментально;

время экспозиции (не в течение 5 часов, а в течение 3-х часов) позволило получить достаточно большое количество зрелых яиц необходимых для проведения экспериментов, так как при экспозиции свыше 5 часов самки Trichuris ovis начинают откладывать в довольно большом количестве неоплодотворенные яйца из матки самок власоглавов, а это существенно влияет на возможность проведения качественных экспериментов, что и является еще одним преимуществом и отличеем предлагаемого нами способа сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichoceohalus) ovis, от известного способа сбора [7] яиц (in viro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis (это тоже было подтверждено экспериментально);

«Способ сбора яиц in vitro от возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichuris (=Trichocephalus) ovis» легко осуществим в лабораторных условиях;

предлагаемый способ обеспечивает до 100% чистый сбор яиц in vitro, без обрывков частиц тканей половых органов (вульвы, вагины, матки) от живых, половозрелых и идентифицированного до вида самок Trichuris (=Trichocephalus) ovis, из паразитирующих 11 видов трихурисов у жвачных Российской Федерации, возбудителя трихоцефалеза от спонтанно зараженных трихоцефалами жвачных в зоопарках, цирках, и в фермерских хозяйствах, который необходим при терапии и профилактики трихоцефалеза домашних или/и диких жвачных, скрининге препаратов (антигельминтиков) и генетических исследований ДНК.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки:

1. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. //Справочник. - М. - Колос.- 1983. - 208 с.

2. Пасечник В.Е. Перекрестное заражение трихоцефалами приотарных собак и овец в Молдавии. //Бюл. Всесоюзного института гельминтологии. - М. - 1984. - Вып. -37. - С. 57.

3. Пасечник В.Е. К морфологии видов Trichuris (=Trichocephalus) ovis Abildgaard, 1795, Т. skrjabini Baskakov, 1924 //Труды Всероссийского НИИ гельминтологии имени К.И. Скрябина. - М. - 1999. - Изд. Россельхозакадемии. - Том. - 35. - С. 85 - 120.

4. Пасечник В.Е. Дисс. кандидата ветеринарных наук. - М. - Всероссийский НИИ гельминтологии имени К.И. Скрябина (ВИГИС) -2000. - С. 124-125.

5. Пасечник В.Е., Успенский А.В., Микулец Ю.И., Жданова В.Ю. Методические рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с гельминтозами цирковых животных. //М. - Изд. Россельхозакадемии. (РАСХН) - 2008 - 50 с.

6. Пасечник В.Е. Способ прижизненной дифференциальной диагностики трихоцефал Trichocephalus ovis, Trichocephalus skrjabini и Trichocephalus capreoli жвачных животных. //Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации. - М., 2010 - 22. (Патент на изобретение №2396069)

7. Пасечник В.Е. Способ прижизненного сбора оплодотворенных яиц (in vitro) от возбудителя паразитарного зооноза Trichuris (=Trichocephalus) vulpis //Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации. - М. - 2015. - №21 (Патент на изобретение №2557973).

8. Свиридов С.В. Сбалансированные и специальные растворы электролитов // Трудный пациент №8. - Т. 5. - 2007 - С. 37.

9. Скрябин К.И. Метод полных гельминтологических вскрытий позвоночных, включая человека. //Изд. 1-го Московского государственного университета. - М. - 1928. - 45 с.

10. Скрябин К.И., Шихобалова Н.П. и И.В. Орлов. Трихоцефалиды и капиллярииды животных и человека и вызываемые ими заболевания. //Основы нематодологии. Изд. Академии наук СССР. - М. - 1957 -Т. VI. - 587 с.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ сбора яиц in vitro от самок возбудителя трихоцефалеза домашних и диких жвачных Trichocephalus ovis заключается в том, что из материала толстой кишки спонтанно зараженных животных при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии животных после предварительной отмывки в изотоническом растворе 0,9% хлорида натрия отбирают 250 и более живых половозрелых самок Trichocephalus ovis. Помещают по 5 самок в отдельные бактериологические чашки с физиологическим раствором Tyrode. Экспонируют при t=25°C в течение 3 часов в условиях термостата с получением чистого сбора зрелых яиц Trichocephalus ovis. Изобретение позволяет получить качественный материал для исследования. 2 пр.

Способ сбора зрелых яиц in vitro от самок возбудителя трихоцефалеза Trichocephalus ovis, заключающийся в том, что из материала толстой кишки спонтанно зараженных домашних и диких жвачных животных при исследовании гельминтологическими методами на вскрытии животных отбирают 250 и более живых половозрелых самок Trichocephalus ovis после предварительной отмывки в изотоническом 0,9%-ном растворе хлорида натрия, помещают по 5 самок в отдельные бактериологические чашки с физиологическим раствором Tyrode, экспонируют при t=25°C в течение 3 ч в условиях термостата, после чего получают чистый сбор зрелых яиц Trichocephalus ovis, выделенных живыми самками.