Перекрестная ссылка
[001] По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки США № 62/740100, поданной 2 октября 2018, 62/741849, поданной 5 октября 2018; и 62/746805, поданной 17 октября 2018, которые в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки.
Предпосылки к созданию изобретения
1. Область изобретения
[002] Настоящее изобретение относится к композициям, устройствам, наборам и способам для выявления и идентификации видов ленточных червей у млекопитающих. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителам и композициям антител, к устройствам, наборам и способам для выявления присутствия или отсутствия ленточных червей определеннвх видов в образце, взятом у млекопитающего, и для определения различий между антигенами ленточных червей.
2. Описание уровня техники
[003] Инфекции, вызываемые паразитическими червями, очень распространены у животных, и если их не диагностировать и не лечить, то это может приводить к серьезным заболеваниям или гибели животных. Современные способы диагностики инфекций, вызываемых паразитическими червями, включают, главным образом, исследование образцов фекалий под микроскопом, либо непосредственно в мазках фекалий, либо после концентрирования яиц и паразитов путем флотации в плотных средах или седиментации. Несмотря на широкое применение такого способа, этот способ имеет существенные недостатки. Такие способы исследования под микроскопом требуют много времени и специального оборудования. Кроме того, точность результатов этих способов в высокой степени зависит от квалификации и опыта специалиста. Так, например, присутствие ленточных червей определяют путем поиска яиц или проглоттид, но они экскретируются с определенными промежутками и в небольших количествах. Поэтому не удивительно, что инфекция, вызываемая ленточными червями, часто не диагностируется рутинными методами анализа фекалий.
[004] Работа с фекалиями является неприятной и опасной. Санитарно-гигиенические процедуры для обработки фекалий являются довольно неудобными и часто очень сложными. Такие процедуры могут включать взвешивание, центрифугирование и хранение и являются довольно трудными, если только они не проводятся в клинической лаборатории, снабженной подходящими приборами, защитным оборудованием и опытным персоналом. Следовательно, для проведения анализа фекалий необходимо любое сокращение числа стадий, и желательно любое уменьшение контакта между квалифицированным специалистом, проводящим анализ, и тестируемым материалом. В клинических лабораториях, для выявления различных вирусов, бактерий и негельминтных паразитов и организмов в фекалиях применяют методы иммуноанализа. Однако, потребность в разработке простого способа иммуноанализа для выявления инфекции, вызываемой паразитическими червями, в фекалиях, в цельной крови или в сыворотке, остается актуальной.
Сущность изобретения
[005] В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к выделенному антителу, которое может специфически связываться с копроантигеном ленточных червей, таким как копроантиген Taenia, например, копроантиген Taenia pisiformis, или копроантиген Taenia Taeniaeformis, или копроантиген Dipylidium caninum. Антитело может быть детектируемо помечено или присоединено к твердому носителю.
[006] В одном варианте осуществления изобретения, выделенное антитело специфически связывается с копроантигеном Taenia pisiformis. Антитело не вструпает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: ленточного червя Taenia taeniaeformis, ленточного червя Dipylidium, анкилостомы (например, Ancylostoma), круглых червей (Toxocara), трихоцефала (например, Trichuris), Giardia и парвовируса, где ленточный червь Dipylidium представляет собой Dipylidium caninum; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
[007] В другом варианте осуществления изобретения, выделенное антитело специфически связывается с копроантигеном Taenia taeniaeformis. Антитело не вструпает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: ленточного червя Taenia pisiformis, ленточного червя Dipylidium, анкилостомы (например, Ancylostoma), круглых червей (Toxocara), трихоцефала (например, Trichuris), Giardia и парвовируса, где ленточный червь Dipylidium представляет собой Dipylidium caninum; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
[008] В других вариантах осуществления изобретения, выделенное антитело специфически связывается с копроантигеном Dipylidium caninum. Антитело не вструпает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: ленточного червя Taenia, ленточного червя Dipylidium, анкилостомы (например, Ancylostoma), круглых червей (Toxocara), трихоцефала (например, Trichuris) Giardia и парвовируса, где ленточный червь Taenia представляет собой Taenia pisiformis или Taenia taeniaeformis; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
[009] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к иммунокомплексу, содержащему копроантиген ленточных червей и одно или более антител, специфически связанных с копроантигеном ленточных червей. В одном варианте осуществления изобретения, копроантиген ленточных червей может представлять собой копроантиген, происходящий от Taenia pisiformis, Taenia taeniaeformis, Taenia crassiceps или Dipylidium caninum. В другом варианте осуществления изобретения, антитело получают путем иммунизации с использованием целого экстракта ленточных червей, продукта E/S ленточных червей, промывки, полученной от ленточных червей или растворимого вещества TCA ленточных червей. В другом варианте осуществления изобретения, антитело специфически связывается с копроантигеном ленточных червей в образце, таком как образец фекалий, полученный от млекопитающего, инфицированного ленточными червями. В некоторых вариантах осуществления изобретения, млекопитающее дополнительно инфицировано одним или более червями, такими как круглые черви, трихоцефалы и анкилостомы, и антитело специфически не связывается с любым антигеном, происходящим от одного или более червей, таких как круглые черви, трихоцефалы или анкилостомы, которые могут присутствовать в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может быть детектируемо помеченно или связано с твердым носителем.
[010] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к иммунокомплексу, содержащему копроантиген ленточных червей, антитело, специфически связанное с копроантигеном ленточных червей, и лектин, связанный с копроантигеном ленточных червей. Лектин может специфически связываться с углеводом одного конкретного типа или может связываться с двумя или более углеводами на копроантигене ленточных червей.
[011] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к устройству для специфического связывания и выделения гельминтных антигенов из образца, например, копроантигенов из образца фекалий, где такое устройство содержит твердый носитель, где указанный твердый носитель имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из (а) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или копроантигеном третьего ленточного червя; (b) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или копроантигеном третьего ленточного червя; и (с) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя. Такое устройство может представлять собой, например, но не ограничивается ими, устройство для ELISA, такое как устройство для иммунноанализа с боковым потоком или микротитрационный планшет. Образцы, которые могут быть протестированы на присутствие ленточных червей с помощью такого устройства, включают, но не ограничиваются ими, фекалии, слизистую оболочку пищеварительного тракта, мочу, цельную кровь, сыворотку, молоко молочной железы и интактную ткань, такую как, например, ткань молочной железы, тонкого кишечника, печени, сердца, легких, пищевода, головного мозга, мышц и глаз. Кроме того, устройство может также включать, но не обязательно, один или более реагентов для обнаружения одной или более групп, состоящих из: одного или более паразитических гельминтов; паразитов, не являющ;, одного или более простейших и одной или более бактерий. В некоторых вариантах осуществления изобретения, твердый носитель также имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, выбранных из: (i) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном круглых червей, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, анкилостомы, ленточного червя, Giardia и парвовируса; (ii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном трихоцефала, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из круглых червей, анкилостомы, ленточных червей, Giardia и парвовируса; (iii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном анкилостомы, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, круглых червей, ленточных червей, Giardia и парвовируса; (iv) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном Giardia, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена парвовируса; и (v) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном парвовируса, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена Giardia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma, круглые черви представляют собой Toxocara, а трихоцефал представляет собой Trichuris. В других вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma caninum или Ancylosloma tubaeforme; круглые черви представляют собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia; а парвовирус представляет собой кошачий или собачий парвовирус.
[012] В некоторых вариантах осуществления изобретения, твердый носитель имеет иммобилизованные на нем два или более антител, три или более антител, четыре или более антител, пять или более антител, шесть или более антител, семь или более антител или восемь или более антител для прохождения мультиплексной реакции.
[013] В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к устройству для обнаружения присутствия или отсутствия одного или более копроантигенов ленточных червей в образце фекалий; где указанное устройство содержит твердый носитель, лектин и одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из (а) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; (b) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (с) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя, где твердый носитель имеет иммобилизованные на нем один или более лектинов или одно или более антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лектин иммобилизован на твердом носителе. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела иммобилизованы на твердом носителе. В других вариантах осуществления изобретения, устройство также содержит антигены ленточных червей одного или более видов, где антигены ленточных червей одного или более видов специфически связаны с антителами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первый ленточный червь представляет собой Taenia pisiformis, второй ленточный червь представляет собой Taenia taeniaeformis и/или третий ленточный червь представляет собой Dipylidium caninum.
[014] В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия или отсутствия одного или более антигенов гельминтов в образце, например, копроантигенов в образце фекалий, где указанный способ включает: (а) контактирование образца млекопитающего с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из: (i) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя, или с копроантигеном третьего ленточного червя; (ii) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (iii) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя; (b) образование комплексов антитело-копроантиген в присутствии копроантигенов, если они присутствуют в образце; и (с) обнаружение присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются. Копроантигены ленточных червей могут включать копроантигены видов Taenia, например, Taenia pisiformis и Taenia taeniаеformis; и виды Dipylidium, например, Dipylidium caninum. В одном варианте осуществления изобретения, стадия обнаружения присутствия или отсутствия комплексов также включает стадию получения лектина, который связывается по меньшей мере с одним из комплексов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лектин может быть детектируемо помечен или иммобилизован на твердом носителе. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизированы на твердом носителе, а лектин может быть детектируемо меченным. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а лектин может быть иммобилизован на твердом носителе.
[015] В другом варианте осуществления изобретения, способ, перед стадией контактирования образца фекалий млекопитающего по меньшей мере с одним антителом, дополнительно включает стадию контактирования образца фекалий с одним или более лектинами. Один или более лектинов могут быть детектируемо помеченны или иммобилизованы на твердом носителе. Альтернативно, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помеченны или иммобилизованы на твердом носителе. В одном варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизированы на твердом носителе, а один или более лектинов могут быть детектируемо помечены. В другом варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а один или более лектинов могут быть иммобилизованы на твердом носителе.
[016] В одном аспекте изобретения, способ осуществляют для тестирования образца фекалий млекопитающих на копроантиген ленточных червей. Однако, этот способ не ограничивается проведением анализа образца фекалий. Следовательно, помимо фекалий, образец может представлять собой, но не ограничивается ими, например, цельную кровь, сыворотку, молоко молочной железы и интактную ткань, такую как, например, ткань молочной железы, тонкого кишечника, печени, сердца, легких, пищевода, головного мозга, мышц и глаз.
[017] В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу диагностики инфицирования млекопитающего одним или более паразитическими червями, где указанный способ включает стадии: (а) контактирования образца млекопитающего с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из: (i) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя, или с копроантигеном третьего ленточного червя; (ii) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (iii) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя; (b) образования комплексов антитело-копроантиген в присутствии копроантигенов, если они присутствуют в образце; (с) обнаружения присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются; и (d) диагностики у млекопитающего (i) инфицирования первым ленточным червем, если присутствует комплекс «антитело-копроантиген» против первого ленточного червя, (ii) инфицирования вторым ленточным червем, если присутствует комплекс «антитело-копроантиген» против второго ленточного червя, и (iii) инфицирования третьим ленточным червем, если присутствует комплекс «антитело-копроантиген» против третьего ленточного червя. В одном варианте осуществления изобретения выбирают два или более антител, три или более антител, четыре или более антител, пять или более антител, шесть или более антител, семь или более антител или восемь или более антител. В некоторых вариантах осуществления изобретения, стадия обнаружения присутствия или отсутствия комплексов также включает стадию получения одного или более лектинов, которые связываются по меньшей мере с одним из комплексов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лектин может быть детектируемо помечен или иммобилизован на твердом носителе. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизированы на твердом носителе, а лектин может быть детектируемо меченным. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а лектин может быть иммобилизован на твердом носителе.
[018] В другом варианте осуществления изобретения, способ, перед стадией контактирования образца фекалий млекопитающего по меньшей мере с одним антителом, дополнительно включает стадию контактирования образца фекалий с одним или более лектинами. Лектин может быть детектируемо помечен или иммобилизован на твердом носителе. Альтернативно, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены или иммобилизованы на твердом носителе. В одном варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизированы на твердом носителе, и лектин могут быть детектируемо помечен. В другом варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а лектин может быть иммобилизован на твердом носителе.
[019] В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу диагностики и лечения млекопитающего, инфицированного одним или более паразитическими червями, где указанный способ включает стадии: (а) контактирования образца млекопитающего с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из: (i) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; (ii) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (iii) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя; (b) образования комплексов антитело-копроантиген в присутствии копроантигенов, если они присутствуют в образце; (с) обнаружения присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются; и (d) диагностики у млекопитающего (i) инфицирования первым ленточным червем, если присутствует комплекс «антитело-копроантиген» против первого ленточного червя, (ii) инфицирования вторым ленточным червем, если присутствует комплекс «антитело-копроантиген» против второго ленточного червя, и (iii) инфицирования третьим ленточным червем, если присутствует комплекс «антитело-копроантиген» против третьего ленточного червя и (е) введения эффективного количества одного или более терапевтических средств для лечения млекопитающего, инфицированного первым, вторым или третьим ленточным червем или их комбинацией. В одном варианте осуществления изобретения выбирают два или более антител. В других вариантах осуществления изобретения, стадия (е) дополнительно включает введение одного или более дополнительных терапевтических средств для лечения инфекции, вызываемой одним или более паразитическими гельминтами, одним или более паразитами, не являющимися червями, одним или более вирусами, одним или более грибками, одним или более простейшими или одной или более бактериями. В других вариантах осуществления изобретения, стадия (е) дополнительно включает введение одного или более терапевтических средств для ликвидации, отпугивания или уничтожения промежуточного хозяина плоского гельминта-паразита, паразитического гельминта, паразитов, не являющихся червями, вируса, грибка или бактерий. Репрезентативные примеры промежуточных хозяев включают блох и собачьих кровососущих вшей, которые могут переносить яйца ленточных червей.
[020] В других вариантах вышеописанных способов, группа антител стадии (а) дополнительно состоит из: (i) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном круглых червей, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, анкилостомы, ленточного червя, Giardia и парвовируса; (ii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном трихоцефала, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из круглых червей, анкилостомы, ленточных червей, Giardia и парвовируса; (iii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном анкилостомы, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, круглых червей, ленточных червей, Giardia и парвовируса; (iv) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном Giardia, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена парвовируса; и (v) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном парвовируса, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена Giardia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma, круглые черви представляют собой Toxocara, а трихоцефал представляет собой Trichuris. В других вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma caninum или Ancylosloma tubaeforme; круглые черви представляют собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia; а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус. Таким образом, образец фекалий подвергают контактированию с двумя или более антителами, тремя или более антителами, четырьмя или более антителами, пятью или более антителами, шестью или более антителами, семью или более антителами или восьмью или более антителами для обеспечения мультиплексной реакции.
[021] В другом варианте вышеописанных способов, стадия (d) также включает диагностику инфицирования круглыми червями по присутствию комплекса антитело-копроантиген против круглых червей; инфицирования трихоцефалом по присутствию комплекса антитело-копроантиген против трихоцефала; инфицирования анкилостомой по присутствию комплекса антитело-копроантиген против анкилостомы; инфицирования Giardia по присутствию комплекса антитело-копроантиген против Giardia; и инфицирования парвовирусом по присутствию комплекса антитело-копроантиген против парвовируса.
[022] В некоторых вариантах осуществления изобретения, стадия обнаружения присутствия или отсутствия комплексов дополнительно включает стадию получения одного или более лектинов, которые связываются по меньшей мере с одним из комплексов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лектин может быть детектируемо меченным или иммобилизованным на твердом носителе. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизованы на твердом носителе, а лектин может быть детектируемо помечен. В других вариантах осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а лектин может быть иммобилизован на твердом носителе.
[023] Способ может быть также использован для анализа на загрязнение окружающей среды ленточными червями и идентификации их видов. Образцы окружающей среды, которые могут быть протестированы на наличие ленточных червей с помощью устройства, включают, но не ограничиваются ими, почву, разлагающийся материал или фекалии из мест присутствия животных, включая дворы, сады, ящики с песком, игровые площадки. Места проведения анализов могут также включать парки, пляжи, леса, фермы или другие места, загрязненные фекалиями собак, кошек или других млекопитающих-хозяев ленточных червей. Могут быть также протестированы фекалии в ящиках для помета внутри и снаружи.
[024] В еще одном своем аспекте, настоящее изобретение включает набор для осуществления одной или более стадий способа согласно изобретению. Набор может, но необязательно, включать, например, устройство и одну или более композиций согласно изобретению и инструкции по осуществлению способа согласно изобретению. Набор может дополнительно, но необязательно, включать, например, один или более индикаторных реагентов, одно или более соединений для мечения антителами, одно или более антител, один или более реагентов для захвата антигена, один или более ингибиторов и один или более промывочных реагентов, которые используются как часть устройства и/или для осуществления такого способа.
Краткое описание чертежей
[025] На Фиг. 1 показаны определения OD для антитела ADX131 против экстракта червей и экстракта фекалий собак, которые являются отрицательными или положительными по инфицированию ленточными червями в соответствии со способом согласно изобретению, как показано в Примере 1А. Положительный=экстракт фекалий (FEX) собак, инфицированных T. pisiformis; отрицательный=FEX собак, не инфицированных T. pisiformis; экстракт червей=экстракт червей T. pisiformis (WE).
[026] На фиг. 2 показаны определения OD для антитела ADX132 против экстракта червей и экстракта фекалий собак, которые являются отрицательными или положительными по инфицированию ленточными червями в соответствии со способом согласно изобретению, как показано в Примере 1А. Положительный=экстракт фекалий (FEX) собак, инфицированных T. pisiformis; отрицательный=FEX собак, не инфицированных T. pisiformis; экстракт червей=экстракт червей T. pisiformis (WE).
[027] На фиг. 3 показан микротитрационный планшет, в котором проводят ELISA-анализ с использованием экстрактов фекалий собак, инфицированных ленточными червями в соответствии со способом согласно изобретению как показано в Примере 1B. H11 представляет собой негативный контроль. A5, B6, B8, E6 И E10 представляют собой экстракты фекалий пяти собак, положительных по T. pisiformis. Каждая из лунок имеет экстракт фекалий собак, инфицированных анкилостомой Ancylostoma caninum, или собак, инфицированных круглыми червями Toxocara canis, или собак, инфицированных трихоцефалом Trichuris vulpis, или собак, инфицированных D. caninum.
[028] На фиг. 4 показана специфичность «сэндвич»-ELISA на копроантиген, проводимого с использованием антитела ADX131, нанесенного на микротитрационный планшет, и конъюгата ADX132-ПХ, нанесенного после добавления образца, взятого у пациента. Анализ проводили на WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. crassiceps, WE T. taeniaeformis, E/S T. taeniaeformis, а также на FEX собак, положительных по D. caninum, собак, отрицательных по D. caninum, кошек, положительных по D. caninum, кошек, отрицательных по D. caninum, собак, положительных по T. pisiformis, собак, отрицательных по T. pisiformis, группы из трех кошек, положительных по T. taeniaeformis, группы из трех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis, WE анкилостом Ancylostoma caninum, WE круглых червей Toxocara canis и WE трихоцефала Trichuris vulpis, как обсуждается в Примере 1B.
[029] На фиг. 5 показана чувствительность «сэндвич»-ELISA на копроантиген, проводимого с использованием антитела ADX185, нанесенного на микротитрационный планшет, с последующим добавлением образца, взятого у пациента, а затем добавлением конъюгата кроличьего pAb-ПХ против WE T. taeniaeformis. Анализ проводили на FEX 7 кошек, положительных по T. taeniaeformis, и 3 кошек, отрицательных по T. taeniaeformis, как обсуждается в Примере 2B (часть B).
[030] На фиг. 6 показана специфичность «сэндвич»-ELISA на копроантиген, проводимого с использованием антитела ADX184, нанесенного на микротитрационный планшет, и конъюгата ADX193-ПХ, нанесенного после добавления образца, взятого у пациента. ADX193 представляет собой мышиное mAb против E/S T.taeniaeformis, описанное ниже. Анализ проводили на WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. crassiceps, WE T. taeniaeformis, E/S T. taeniaeformis, а также на экстрактах фекалий собак, положительных по D. caninum, собак, отрицательных по D. caninum, кошек, положительных по D. caninum, кошек, отрицательных по D. caninum, собак, положительных по T. pisiformis, собак, отрицательных по Taenia pisiformis, группы из трех кошек, положительных по T. taeniaeformis, и группы из трех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis, как обсуждается в Примере 2B (часть В).
[031] На фиг. 7 показаны результаты ELISA-анализа с использованием ADX184/ADX193-ПХ, проводимого на экстрактах фекалий шести кошек, положительных по T. taeniaeformis; экстрактах фекалий четырех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis; и на одном образце белка E/S T. taeniaeformis, как обсуждается в Примере 2C (часть A).
[032] На фиг. 8 показаны результаты ELISA-анализа на копроантиген с использованием антитела ADX191, нанесенного на микротитрационные планшеты, и ADX194, конъюгированного с ПХ. Оба мышиных mAb использовали в концентрации 3 мкг/мл. Этот ELISA проводили на экстрактах фекалий шести кошек, положительных по T. taeniaeformis; экстрактах фекалий четырех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis; и на одном образце белка E/S T. taeniaeformis, как обсуждается в Примере 2D.
[033] На фиг. 9 показаны результаты ELISA-анализа с использованием кроличьего pAb против WE D. caninum, нанесенного на планшеты, а затем подвергнутого контактированию с FEX при 5 мкг/мл, контактированию с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE D. caninum при 3 мкг/мл, и контактированию с цветовым субстратом. ELISA-анализ с использованием кроличьего pAb против WE D. caninum проводили на экстрактах червей, выделенных из нескольких видов гельминтов: WE D. caninum, WE Taenia pisiformis, WE T. crassiceps, WE анкилостомы Ancylostoma caninum, WE круглых червей Toxocara canis и WE трихоцефала Trichuris vulpis, как обсуждается в Примере 3B (часть А).
[034] На фиг. 10 показаны результаты ELISA-анализа на копроантиген, где мышиное pAb против WE D. caninum наносили на планшеты, а затем подвергали контактированию с FEX, контактированию с конъюгатом мышиного pAb-ПХ против WE D. caninum и контактированию с цветовым субстратом как обсуждается в Примере 3Е (часть А). Анализ проводили на экстрактах фекалий 4 собак, положительных по D. caninum и 3 кошек, положительных по D. caninum; одной кошки, отрицательной по D. caninum и инфицированной Giardia и T. taeniaeformis, одной кошки, отрицательной по D. caninum и инфицированной T. taeniaeformis, и одной кошки, отрицательной по D. caninum и инфицированной Tоxоcara canis и Taenia pisiformis, как обсуждается в Примере 3Е (часть А).
[035] На фиг. 11 показаны результаты первого ELISA-анализа на копроантиген, в котором использовали мышиное mAb ADX226, нанесенное на планшеты, а затем подвергнутое контактированию с FEX, с конъюгатом мышиного mAb ADX251-ПХ, и с цветовым субстратом. Анализ проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum; 5 собак, отрицательных по D. caninum; 3 кошек, положительных по D. caninum и 1 кошки, отрицательной по D. caninum, как обсуждается в примере 3F (часть А).
[036] На фиг. 12 показаны результаты второго ELISA-анализа на копроантиген, в котором использовали мышиное mAb ADX251, нанесенное на планшеты, а затем подвергнутое контактированию с FEX, с конъюгатом мышиного mAb ADX227-ПХ, и с цветовым субстратом. Анализ проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum; 5 собак, отрицательных по D. caninum; 3 кошек, положительных по D. caninum и 1 кошки, отрицательной по D. caninum, как обсуждается в примере 3F (часть А).
[037] На фиг. 13 показаны результаты третьего ELISA-анализа на копроантиген, в котором использовали мышиное mAb ADX251, нанесенное на планшеты, а затем подвергнутое контактированию с FEX, с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом. Анализ проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum; 5 собак, отрицательных по D. caninum; 3 кошек, положительных по D. caninum и 1 кошки, отрицательной по D. caninum, как обсуждается в примере 3F (часть А).
[038] На фиг. 14 показаны результаты первой серии ELISA-анализов на копроантиген, где мышиные mAb ADX224, ADX225, ADX226 и ADX227 против WE D. caninum были отдельно нанесены на планшеты, а затем подвергнуты контактированию с FEX, с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом, как обсуждается в Примере 3G (часть А).
[039] На фиг. 15 показаны результаты второй серии ELISA-анализов на копроантиген, где мышиные mAb ADX226 и ADX227 против WE D. caninum были отдельно нанесены на планшеты, а затем подвергнуты контактированию с FEX, с конъюгатом мышиного mAb ADX227-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом, как обсуждается в Примере 3G (часть А).
[040] На фиг. 16 показаны результаты анализа на гликозилирование копроантигена, связанного с мышиным mAb ADX226 против WE D. caninum, путем оценки способности 21 различного лектина связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированным лектином I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA), как обсуждается в примере 3Н (часть 1).
[041] На фиг. 17 показаны результаты анализа на гликозилирование копроантигена, связанного с кроличьим pAb против WE D. caninum, путем оценки способности 21 различного лектина связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированным лектином I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA), как обсуждается в Примере 3Н (часть 2).
[042] На фиг. 18 показаны результаты анализа на гликозилирование копроантигена(ов), связанного(ых) с кроличьим pAb против WE D. caninum и ADX187 (с мышиным mAb против WE D. caninum) путем оценки способности 21 различного лектина связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированным лектином I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA), как обсуждается в Примере 3Н (часть 3).
[043] На фиг. 19 показаны микротитрационные планшеты, в которых проводили серии ELISA-анализов на T. pisiformis, T. taeniaeformis, D. caninum, анкилостомы, круглые черви, трихоцефал и Giardia с использованием экстрактов фекалий ряда инфицированных собак и кошек, как обсуждается в Примере 4. В ELISA-анализах тестировали экстракты фекалий, взятых из нижеследующих источников: собак, положительных по T. pisiformis (Фиг. 19, столбец 1), кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 19, столбец 2), собак, инфицированных D. caninum (фиг. 19, столбец 3), кошек, инфицированных D. caninum (Фиг. 19, столбец 4), собак, инфицированных анкилостомой A. caninum, (фиг. 19, столбец 5), кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme (Фиг. 19, столбец 6), собак, инфицированных круглыми червями T. canis (фиг. 19, столбец 7), кошек, инфицированных круглыми червями T. cati (фиг. 19, столбец 8), собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis (фиг. 19, столбец 9), кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis (фиг. 19, столбец 10), собак, инфицированных Giardia (фиг. 19, столбец 11), кошек, инфицированных Giardia (фиг. 19, столбец 12), и двух кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, столбцы 13 и 14). На фиг. 19, в столбцах 1-12 представлено изображение одного микротитрационного планшета, а в столбцах 13 и 14 представлено изображение другого отдельного микротитрационного планшета.
[044] На фиг. 20 показаны микротитрационные планшеты, в которых проводили серии ELISA-анализов для обнаружения двух или трех видов ленточных червей рода Taenia, например, T. pisiformis, T. taeniaeformis и рода Dipylidium, например, D. caninum, с использованием экстрактов фекалий, взятых у ряда инфицированных собак и кошек, как обсуждается в Примере 5. Были проведены ELISA-анализы экстрактов фекалий из следующих источников: четырех собак, положительных по T. pisiformis (фиг. 20, столбцы 1, 4, 7 и 10), четырех кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 20, столбцы 2, 5, 8 и 11), двух собак, инфицированных D. caninum (фиг. 20, столбцы 3 и 6), двух кошек, инфицированных D. caninum (фиг. 20, столбцы 9 и 12). На фиг. 20, в столбцах 1-12 представлено изображение одного микротитрационного планшета.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
I. Введение
[045] Настоящее изобретение, в основном, относится к способам, устройствам и наборам для обнаружения и идентификации видов ленточных червей в образце фекалий, взятом у млекопитающего. Настоящее изобретение относится к копроантигенам ленточных червей множества видов, включая Taenia pisiformis, Taenia taeniaeformis и Dipylidium сaninum. В частности, настоящее изобретение относится к способам, устройствам и наборам для обнаружения инфицирования ленточными червями и идентификации двух или более видов ленточных червей.
[046] Настоящее изобретение представляет превосходную альтернативу существующим методам исследования под микроскопом. Действительно, настоящее изобретение относится к устройствам, к наборам и к способам обнаружения присутствия или отсутствия ленточных червей в образце млекопитающего, и эти устройства, наборы и способы: (1) являются простыми для применения и дают достаточно надежные результаты; (2) позволяют подтвердить отсутствие или присутствие конкретных видов ленточных червей у млекопитающего, независимо от того, инфицировано ли это млекопитающее ленточными червями одного или более видов и/или другими паразитическими гельминтами, такими как анкилостомы, круглые черви, трихоцефалы и/или аскариды, (3) позволяют обнаруживать ленточных червей еще до появления яиц и проглоттид в фекалиях инфицированного хозяина; и (4) позволяют отличать ленточных червей различных видов, а также гельминтов-паразитов, таких как круглые черви, трихоцефалы и анкилостомы.
[047] Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии свойств композиций, специфичных к инфекциям, вызываемым ленточными червями. В частности, было установлено, что антитела, индуцированные против специфических полипептидов ленточных червей (или вырабатываемые против экстракта целых ленточных червей, продукта E/S ленточных червей, промывки, полученной от ленточных червей, или растворимого вещества TCA ленточных червей), могут быть использованы для захвата, обнаружения и идентификации антигенов ленточных червей различных видов у млекопитающего. Обнаружение того факта, что ленточные черви каждого вида могут быть специфически выявлены, было неожиданным, поскольку предполагалось, что ленточные черви представляют собой родственные цестоды, и антитело, вырабатываемое против белка, выделенного у ленточного червя любого вида, будет перекрестно взаимодействовать с одним или более ленточными червями других видов, с антигенами хозяев или с другими компонентами хозяина.
[048] Кроме того, было установлено, что это антитело может быть использовано для захвата и обнаружения антигенов ленточного червя у млекопитающего еще до того, как яйца и проглоттиды будут видны в фекалиях. Такая возможность обнаруживать ленточных червей вскоре после инфицирования и до появления каких-либо яиц в фекалиях инфицированного млекопитающего является крайне неожиданной, так как яйца и проглоттиды обычно не появляются в фекалиях инфекционного хозяина вплоть до нескольких недель после инфицирования хозяина.
[049] Таким образом, настоящее изобретение включает способы, устройства и наборы, в которых используются антитела и/или их фрагменты для специфического захвата, обнаружения и идентификации различий между антигенами различных видов ленточных червей у млекопитающего. Возможность с помощью настоящего изобретения определять и диагностировать конкретные виды ленточных червей, даже если присутствуют один или более других видов ленточных червей или червей других типов, предоставляет лицу, осуществляющему уход за млекопитающим, оптимальный выбор курса лечения по уничтожению ленточных червей, а также других червей, таких как круглые черви, трихоцефалы и/или анкилостомы, у млекопитающего. Кроме того, в некоторых случаях, настоящее изобретение позволяет обнаруживать ленточных червей перед появлением яиц и проглоттид в фекалиях, что дает возможность лицу, ухаживающему за животными, начать такое лечение до появления серьезного заболевания у млекопитающего. Лечение, проводимое до появления яиц и проглоттид в фекалиях также позволит значительно снизить или устранить вероятность распространения заражения на других животных или людей.
II. Определение и использование терминов
[050] Термин «композиции согласно изобретению» относится ко всем нуклеиновым кислотам, полипептидам, гликопротеинам, углеводам, гликолипидам, антителам и к смесям, которые включают одну или более из этих нуклеиновых кислот, полипептидов, гликопротеинов, углеводов, гликолипидов и антител и одно или более других соединений, которые могут быть использованы для выявления присутствия или отсутствия ленточных червей в образце, взятом у млекопитающего, путем проведения способа согласно изобретению, который подробно, косвенно или каким-либо иным образом раскрыт в настоящем описании.
[051] «Образец, взятый у млекопитающего», у которого могут быть обнаружены ленточные черви согласно изобретению, включает все компоненты живого организма и их экстракты, такие как любая жидкость, твердое вещество, клетка или ткань, которые могут иметь антиген ленточного червя. Следовательно, примеры образцов включают, но не ограничиваются ими, фекалии, молоко, цельную кровь и ее части, включая сыворотку, а также, например, экстракты тканей, включая ткань молочной железы, кишечника, печени, сердца, легкого, пищевода, головного мозга, мышцы и глаз. Образец может быть взят непосредственно у млекопитающего, либо он может быть взят у любого индивидуума, который контактировал с млекопитающими. Так, например, образец может представлять собой свежие или гниющие фекалии млекопитающего. В качестве другого примера, образец может включать почву, грязь, песок, растительный материал или любой другой материал, который может быть смешан с компонентами организма, которые могут присутствовать у млекопитающего, такие как фекалии. Так, например, образец может быть взят из источника окружающей среды, включая почву, разлагающийся материал или фекалии в лесах, на фермах или в местах содержания животныхх, включая ящики для помета, дворы, сады, ящики с песком, игровые площадки, парки и пляжи. Независимо от происхождения или содержания образца, этот образец иногда называется в данном описании как «образец», «образец, взятый у млекопитающего», «тестируемый образец» или «образец, подвергаемый тестрованию».
[052] Используемый здесь термин «нуклеиновая кислота» является синонимом терминам «ген», «ДНК», «кДНК», «EST», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеиновая кислота», «РНК» и «мРНК». Нуклеиновая кислота может присутствовать в двухцепочечной форме или в одноцепочечной форме. Кроме того, нуклеиновая кислота либо является выделенной по своей природе, например, выделенной из целого ленточного червя или его части, либо она может быть искусственно синтезирована в рекомбинантном организме-хозяине или любыми другими искусственными методами, известными специалистам в данной области, такими как метод на основе ПЦР, осуществляемый путем создания трансгенного организма, который синтезирует нуклеиновую кислоту, с применением устройства для синтеза ДНК или, например, любым другим молекулярным методом.
[053] Используемые здесь термины «полипептид», «пептид» и «белок» являются синонимами, которые используются в настоящем описании для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Полипептид, пептид и белок согласно изобретению могут быть выделеными по своей природе, например, выделенными из целого ленточного червя или его части, либо они могут быть искусственно синтезированы в рекомбинантном организме-хозяине или любыми другими искусственными методами, известными специалистам в данной области. Полипептид, пептид и белок согласно изобретению могут быть гликозилированным.
[054] Термин «антитело» или «антитело согласно изобретению» означает любое антитело, которое способно специфически связываться с одним или более антигенами конкретного червя, но не связываться с антигенами других червей. Так, например, антитела к ленточному червю одного вида могут специфически связываться с антигенами ленточных червей других видов, но не с любыми антигенами ленточных червей различных видов. Антитела согласно изобретению могут быть направлены против одного или более иммуногенных полипептидов, гликопротеинов, углеводов или гликолипидов согласно изобретению. Если это не оговорено особо, то следует отметить, что антитело согласно изобретению может включать смесь двух или более антител различных типов. Так, например, антитело может представлять собой смесь антител двух типов, где одно антитело из двух типов специфически связывается с одним конкретным антигеном, а другое антитело из этих двух типов специфически связывается с некоторыми другими антигенами.
[055] Используемый здесь термин «первое антитело» означает одно или более антител, способных специфически связываться с копроантигеном ленточного червя первого вида, но не с копроантигеном ленточного червя второго вида или с копроантигеном ленточного червя третьго вида.
[056] Используемый здесь термин «второе антитело» означает одно или более антител, способных специфически связываться с копроантигеном ленточного червя второго вида, но не с копроантигеном ленточного червя первого вида или с копроантигеном ленточного червя третьго вида.
[057] Используемый здесь термин «третье антитело» означает одно или более антител, способных специфически связываться с копроантигеном ленточного червя третьего вида, но не с копроантигеном ленточного червя первого вида или с копроантигеном ленточного червя второго вида.
[058] «Иммуногенный полипептид согласно изобретению» и, проще говоря, «полипептид согласно изобретению» представляет собой иммуноген, против которого могут вырабатываться антитела согласно изобретению. Все «полипептиды согласно изобретению» являются иммуногенными, а поэтому они могут быть использованы для индуцирования иммунного ответа у животного-хозяина для продуцирования антител согласно изобретению. Если это не оговорено особо, то следует отметить, что полипептид согласно изобретению может представлять собой один компонент смешанной композиции из множества компонентов.
[059] «Иммуноген» представляет собой любой агент, такой как иммуногенный экстракт, полипептид, гликопротеин, углевод или гликолипид согласно изобретению, который, например, способен вызывать иммунный ответ у животного, подвергаемого воздействию этого агента.
[060] Используемый здесь термин «ленточный червь» означает плоские паразитические гельминты, такие как кишечные ленточные черви, которые включают червей рода Taenia и Dipylidium. Таким образом, используемый здесь термин «ленточный червь» не относится ко всему классу цестод, а скорее он относится к подклассу эуцестод, включая отряд pseudophyllidea. Репрезентативные примеры ленточных червей включают Taenia pisiformis, Taenia taeniaeformis, Taenia crassiceps, Dipylidium caninum, Diphyllorobothrium mansonogide, Diphyllorobothrium latum и Spirometra erinaceieuropaei.
[061] «Копроантиген ленточных червей» или «копроантиген, происходящий от ленточных червей», представляет собой любой продукт ленточных червей, который присутствует в фекалиях млекопитающего, инфицированого ленточными червями, и который может специфически связываться с одним или более антителами согласно изобретению. Так, например, копроантиген ленточных червей может представлять собой, но не ограничивается ими, один или более полипептидов согласно изобретению.
[062] Используемый здесь термин «круглые черви» относится к гельминтам, таким как кишечные круглые черви отряда аскарид, которые включают род Toxocara, Toxascaris, Baylisascaris, Ascaridia, Parascaris, Ascaris, Anisakis и Pseudoterranova. Следовательно, примерами таких круглых червей являются Toxocara canis, Toxocara cati и Toxascaris leonina. Таким образом, используемый здесь термин «круглые черви» не относится ко всему виду нематод. Поэтому, круглые черви не включает какой-либо член рода Ancylostoma, Uncinaria, Necator, Trichuris, Wuchereria, Brugia или Dirofilaria.
[063] «Копроантиген круглых червей» или «копроантиген, происходящий от круглых червей», представляет собой любой продукт круглых червей, который присутствует в фекалиях млекопитающего, инфицированого круглыми червями, и который может специфически связываться с одним или более антителами согласно изобретению. Так, например, копроантиген круглых червей может представлять собой, но не ограничивается ими, новую С-концевую изоформу 7 кДа DIV6728, которая представляет собой экскреторный/секреторный белок T. canis, который присутствует в фекалиях T. canis-инфицированных собак уже через 38 дней после того, как собаки были впервые инфицированы T. canis. Таким образом, «копроантиген круглых червей» может представлять собой новую С-концевую изоформу 7 кДа DIV6728 (которая называется здесь как «Сopro6728»), которая была обнаружена в фекалиях собак, как ообсуждается в патенте США No. 7951547.
[064] Используемый здесь термин «трихоцефал» относится к гельминтам, таким как кишечные трихоцефалы рода Trichuris и Trichocephalus. Следовательно, примерами трихоцефалов являются Trichuris vulpis, Trichuris campanula, Trichuris serrata, Trichuris felis, Trichuris suis, Trichuris trichiura, Trichuris discolor и Trichocephalus trichiuris. Кроме того, используемый здесь термин «трихоцефал» не относится ко всему виду нематод. Так, например, трихоцефал не включает какой-либо член рода Ancylostoma, Uncinaria, Necator, Toxocara, Toxascaris, Ascaris, Wuchereria, Brugia или Dirofilaria.
[065] «Копроантиген трихоцефала» или «копроантиген, происходящий от трихоцефала» представляет собой любой продукт трихоцефала, который присутствует в фекалиях млекопитающего, инфицированого трихоцефалом, и который может специфически связываться с одним или более антителами согласно изобретению. Так, например, копроантиген трихоцефала может представлять собой, но не ограничивается ими, «DIV6901» или «DIV6902», а в дальнейшем, данное конкретное антитело будет называться «анти-DIV6901 антителом» или «анти-DIV6902 антителом», как обсуждается в патенте США № 7951547.
[066] Используемый здесь термин «анкилостома» относится к гельминтам, таким как кишечная анкилостома рода Ancylostoma, Necator и Uncinaria. Примерами анкилостомы являются Ancylostoma caninum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenal, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma tubaeforme и Ancylostoma pluridentatum, Necator americanus и Uncinaria stenocephala. Кроме того, используемый здесь термин «анкилостома» не относится ко всему виду нематод. Так, например, термин «анкилостома» не включает любой член рода Trichuris, Trichocephalus Toxocara, Toxascaris, Ascaris, Wuchereria, Brugia или Dirofilaria.
[067] «Копроантиген анкилостомы» или «копроантиген, происходящий от анкилостомы» представляет собой любой продукт анкилостомы, который присутствует в фекалиях млекопитающего, инфицированого анкилостомой, и который может специфически связываться с одним или более антителами согласно изобретению. Так, например, копроантиген анкилостомы может представлять собой, но не ограничивается ими, новую N-концевую изоформу 28 кДа ASP5, которая представляет собой экскреторный/секреторный белок Ancylostoma, присутствующий в фекалиях собак, инфицированных анкилостомой, уже через 9 дней после того, как собаки были впервые инфицированы анкилостомой. Таким образом, «копроантиген анкилостомы» может представлять собой новую N-концевую изоформу 28 кДа ASP5 (которая называется здесь как «СoproASP5»), которая была обнаружена в фекалиях собак, как ообсуждается в патенте США No. 7951547.
[068] Используемый здесь термин «Giardia» относится к простейшим рода Giardia. Следовательно, примерами рода Giardia являются Giardia lamblia, также известная как Giardia intercinalis.
[069] «Копроантиген Giardia» или «копроантиген, происходящий от Giardia» представляет собой любой продукт Giardia, который присутствует в фекалиях млекопитающего, инфицированого Giardia, и который может специфически связываться с одним или более антителами согласно изобретению.
[070] «Лектины» представляют собой белки, которые распознают специфические моносахаридные или олигосахаридные структуры (углеводы) и связываются с ними. Лектин обычно содержит два или более сайтов связывания с углеводными звеньями. Специфичность связывания некоторых лектинов с углеводами определяют по аминокислотным остаткам, которые связываются с углеводом. Сила связывания лектинов с углеводами может увеличиваться с увеличением числа молекулярных взаимодействий Константа диссоциации для связывания лектинов с углеводами составляет приблизительно Kd=10-5-10-7. Лектины могут быть помечены метками любого типа, известными специалистам в данной области, включая, например, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку, метку коллоидного металла, радиоизотопную метку и биолюминесцентную метку.
[071] В некоторых вариантах осуществления изобретения, используемыми лектинами являются лектины, которые специфически связываются с копроантигеном ленточных червей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, лектины, которые специфически связываются с О-гликозилированными белками, являются подходящими для применения в настоящем изобретении. Такие лектины включают, например, лектин ECL (Erythina cristagalli), GSL I (лектин I Griffonia Simplicifolia), GSL II (лектин II Griffonia Simplicifolia), якалин, лектин LCA (Lens culinaris), RCA 123 (Ricinus Communis), и лектин PSA (лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris), WGA (агглютинин зародыша пшеницы) и sWGA (сукцинилированный агглютинин зародыша пшеницы). Лектины являются коммерчески доступными и поставляются, например, от Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA.
[072] Могут быть использованы лектины, которые специфически связываются с углеводами на антигенах ленточных червей человека, собак, кошек, лошадей, коров, овец или обезьян.
[073] Термин «специфичный к», «специфически связывается» и «стабильно связывается» означает, что конкретная композиция согласно изобретению, такая как, например, антитело, полипептид или олигонуклеотид согласно изобретению распознает один или более других агентов и связывается с этими агентами с большей аффинностью, чем по меньшей мере с одним другим агентом. В одном из примеров, антитело согласно изобретению считается «специфичным к антигенам ленточных червей», «специфически связывающимся» и «стабильно связывающимся» с этими антигенами, если такое антитело распознает антигены круглых червей и связывается с этими антигенами с большей аффинностью, чем с любымы другими антигенами паразитических червей, не являющихся ленточными червями. Такая специфичность связывания может быть протестирована с применением методики, хорошо известной специалистам в данной области, например с помощью ELISA или радиоиммуноанализа (РИА). На основе информации о специфичности связывания конкретной композиции согласно изобретению, способ согласно изобретению может быть осуществлен в условиях, позволяющих этой композиции связываться (а, следовательно, и детектировать такое связывание) с конкретным агентом или агентами, но не связываться в значительной степени с другими агентами при сохранении тех же условий. В одном из примеров, способ согласно изобретению может быть осуществлен в условиях, позволяющих антителу согласно изобретению связываться (а, следовательно, и позволяющих детектировать такое связывание) с одним или более антигенами ленточных червей различных видов, присутствующих в конкретном образце, но не связываться в значительной степени с любым антигеном ленточных червей других видов и/или других паразитических гельминтов, которые могут присутствовать в этом образце, что тем самым позволяет дифференцировать виды ленточных червей и круглых червей, трихоцефалов и анкилостом.
[074] «Обнаружение ленточных червей» означает обнаружение одного или более продуктов, специфичных для ленточных червей, включая, например, один или более полипептидов, антител и нуклеиновых кислот согласно изобретению или один или более антигенов ленточных червей. Присутствие одного или более таких продуктов ленточных червей в образце млекопитающего указывает на то, что это млекопитающее инфицировано ленточным червем, независимо от того, присутствует ли в этом образце также какой-либо целый организм ленточного червя или его яйцо. И наоборот, отсутствие одного или более таких продуктов ленточных червей в образце млекопитающего указывает на то, что это млекопитающее не инфицировано ленточным червем.
[075] Термин «лечение» означает введение терапевтического средства пациенту любым подходящим способом введения для снижения числа или уничтожения паразитических червей (гельминтов) или других внутренних паразитов из организма путем снижения их числа, отпугивания или уничтожения, и/или уменьшения уровня или ликвидации заражения промежуточными хозяевами, такими как насекомые, например, блохи, которые могут переносить инфекцию, вызываемую паразитическими червями или другими внутренними паразитами без значительных повреждений у пациента.
III. Антитела согласно изобретению
[076] Настоящее изобретение дополнительно включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые вырабатываются против всех или части одного или более полипептидов согласно изобретению, и которые специфически связываются с ними, а также включает композиции, которые содержат указанные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. При контактировании с образцом, взятым у млекопитающего, эти антитела и антигенсвязывающие фрагменты способны специфически связываться с конкретным антигеном гельминтов. Так, например, иммуноглобулиновые антитела и антигенсвязывающие фрагменты ленточных червей способны специфически связываться с антигенами ленточных червей, присутствующими в образце, но не способны специфически связываться с любым антигеном других червей, таких как круглые черви, анкилостомы или трихоцефалы, которые могут присутствовать в образце. Антитела согласно изобретению являются подходящими для их использования только для захвата одного или более антигенов ленточных червей, только для детекции одного или более антигенов ленточных червей или, более предпочтительно, для захвата и детекции одного или более антигенов ленточных червей.
[077] Антитела согласно изобретению могут принадлежать к любому классу антител, включая, например, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, и могут быть получены любым из множества методов, известных специалисту в данной области. (См. например, публикации Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68(1992); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); и Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Howard and Kaser, eds., CRC Press (2006), каждая из которых в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки).
[078] В одном из способов, полипептид согласно изобретению вводят животному-хозяину, такому как, например, кролики, мыши, крысы, морские свинки, козы, свиньи, коровы, овцы, ослы, собаки, кошки, куры или лошади. Усиленный иммунный ответ может быть индуцирован у животного-хозяина посредством связывания полипептида с носителем и/или посредством воздействия на хозяина адъюванта, однако следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением не требуется, чтобы полипептид был связан с носителем, или чтобы хозяин был подвергнут воздействию адъюванта. Примером носителя, который может быть использован для этой цели, является альбумин бычьей сыворотки, бычий тироглобулин и соевый ингибитор трипсина. Примеры адъювантов включают полный или неполный адъювант Фрейнда и адъювант MDL-TDM. Независимо от того, связан ли полипептид с таким носителем, или подвергается ли хозяин воздействию адъюванта, может быть проведена, но необязательно, бустер-иммунизация с последующим забором крови у животного-хозяина один или более раз. Поликлональные антитела (pAb), которые специфически связываются с полипептидом, могут затем быть очищены из антисыворотки, полученной из крови или из участков кровотечения. Такая очистка может быть достигнута, например, с применением методов аффинной хроматографии, которые включают связывание полипептида с твердым носителем. Такие методы аффинной хроматографии хорошо известны специалистам в данной области.
[079] В нескольких вариантах осуществления изобретения, антитело против ленточных червей согласно изобретению представляет собой антитело, которое вырабатывается у кроликов путем иммунизации животного-хозяина экстрактом целого ленточного червя, продуктом E/S ленточного червя, промывкой от ленточного червя или растворимым веществом TCA, как описано ниже.
[080] Следует также отметить, что антитела согласно изобретению могут представлять собой, но необязательно, поликлональные или моноклональные антитела (mAb), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела и их фрагменты. Моноклональные антитела, которые являются специфичными к представляющему интерес полипептиду, могут быть получены и очищены, например, путем продуцирования клеточных линий, которые генерируют антитела, обладающие желаемой специфичностью к представляющему интерес полипептиду. Клеточные линии этого типа могут быть получены из клеток конкретного типа (например, клеток селезенки), которые выделяют у животного-хозяина, уже иммунизованного полипептидом, как описано ранее. В этом случае, такие клетки могут быть затем иммортализованы, например, посредством их слияния с миеломными клетками с применением любого из множества методов слияния, известных специалисту в данной области. В одном из репрезентативных методов, клетки иммунизированного животного-хозяина совместно инкубируют с их партнером по слиянию, например, с миеломными клетками, в присутствии детергента в течение короткого периода времени перед посевом на среду, которая поддерживает рост гибридных клеток (но не партнера по слиянию с миеломой). Такой выбор может быть осуществлен, например, с использованием гипоксантина, аминоптерина и тимидина (HAT). Если гибридные клетки образуются во время отбора, а, возможно, через одну или две недели после начала процедуры отбора, то гибридные моноколонии (и их супернатанты) тестируют на их способность связываться с полипептидом или полипептидами, против которых было иммунизовано животное-хозяин. Гибридные колонии, имеющие наиболее оптимальную специфичность связывания, являются наилучшими кандидатами, из которых могут быть выделены моноклональные антитела. Эти моноклональные антитела, могут быть, например, выделены непосредственно из супернатанта (то есть, из среды), в котором эти колонии выращивают, с применением любого из множества методов, известных специалисту в данной области.
[081] Антитела согласно изобретению также могут представлять собой одноцепочечное антитело (scFv) или антигенсвязывающий фрагмент антитела. Антигенсвязывающие фрагменты антител представляют собой часть интактного антитела, содержащего антигенсвязывающий сайт или вариабельную область интактного антитела, где указанная часть не содержит константных доменов тяжелой цепи Fc-области интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab-, Fab'-, Fab'-SH-, F(ab')2- и Fv-фрагменты. Помимо продуцирования и очистки из клеток животных или млекопитающих, антитела, фрагменты антител или остовы, не являющиеся антителом, могут быть выбраны на основе различных технологий in vitro, включая фаговое представление, рибосомное представление или бактериальное представление.
[082] Антитела, включая вторые антитела, могут быть помечены метками любого типа, известными специалистам в данной области, включая, например, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, радиоактивную метку, ферментную метку, метку коллоидного металла, радиоизотопную метку и биолюминесцентную метку. В различных вариантах осуществления изобретения, одно или более антител согласно изобретению метят ферментом, коллоидной частицей, радионуклидом или флуорофором. Конкретная метка может представлять собой, например, окрашенную латексную частицу, зольный краситель или зольное золото, конъюгированное с антителом.
IV. Способы, устройства и наборы согласно изобретению
А. Устройства и наборы согласно изобретению
[083] В одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к обнаружению присутствия или отсутствия одного или более антигенов ленточных червей в образце, где указанное устройство содержит твердый носитель, где твердый носитель имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из: (а) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или копроантигеном третьего ленточного червя; (b) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (с) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя, и необязательно (d) одного или более типов копроантигена Giardia, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала и/или копроантигена анкилостомы, где один или более типов копроантигенов круглых червей, копроантигенов трихоцефала и копроантигенов анкилостомы специфически связываются с антителами. См. патент США No. 7951547, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки. Устройство сконструировано так, чтобы оно способствовало специфическому связыванию и отделению копроантигенов ленточных червей от любого антигена Giardia, круглых червей, трихоцефала и анкилостом в образце, взятом у млекопитающего.
[084] В одном аспекте изобретения, устройство включает твердый носитель, где одно или более антител согласно изобретению иммобилизованы на твердом носителе. Твердый носитель может представлять собой, но не ограничивается ими, внутреннюю нижнюю поверхность лунки микротитрационного планшета, микрочастицу, каналы устройства для микрофлюидизации, кассету, мембрану или подложку, которые включены, например, как часть устройства с боковым потоком. Репрезентативный микротитрационный планшет представляет собой 96-луночный планшет Immulon 1B (который является коммерчески доступным и поставляется от Thermo Scientific, Milford, MA), однако, следует отметить, что для специалиста в данной области очевидно, что для иммобилизации антител может быть использован широкий ряд других микротитрационных планшетов, которые не являются 96-луночным планшетом Immulon 1B, и эти планшеты могут оказаться подходящими для иммобилизации твердого носителя согласно изобретению.
[085] Репрезентативным устройством с боковым потоком является устройство с боковым потоком, описанное в аатенте США No. 5726010, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки. Устройство для осуществления анализа с боковым потоком может представлять собой устройство SNAP®, которое является коммерчески доступным и поставляется от IDEXX Laboratories, Inc. Westbrook, ME. Однако, специалисту в данной области очевидно, что для иммобилизации антитела может быть использован широкий ряд других устройств с боковым потоком, которые не являются устройствами SNAP® или устройствами, описанными в патенте США No. 5726010, и которые обеспечивают иммобилизацию на них антитела, а поэтому эти устройства могут оказаться подходящими для их использования в качестве устройства согласно изобретению. Эти устройства могут включать, например, устройства с боковым потоком, в которых применяется технология на основе коллоидного золота.
[086] Антитела, используемые в устройстве согласно изобретению, могут быть иммобилизованы на твердом носителе любым известным способом, включая, например, ковалентное или нековалентное, прямое или опосредованное связывание антител с твердым носителем. Следовательно, хотя эти антитела могут быть присоединены к твердому носителю посредством физической адсорбции (то есть, без использования химических линкеров), однако, очевидно, что эти антитела могут быть иммобилизованы на твердом носителе любым методом химического связывания (то есть, с использованием химических линкеров), хорошо известным специалисту в данной области.
[087] В некоторых вариантах осуществления изобретения, (а) первое антитело может вырабатываться против экстракта целого ленточного червя первого вида, продукта E/S ленточного червя первого вида, промывки от ленточного червя первого вида или растворимого вещества TCA ленточного червя первого вида; (b) второе антитело может вырабатываться против экстракта целого ленточного червя второго вида, продукта E/S ленточного червя второго вида, промывки от ленточного червя второго вида или растворимого вещества TCA ленточного червя второго вида; или (с) третье антитело может вырабатываться против экстракта целого ленточного червя третьего вида, продукта E/S ленточного червя третьего вида, промывки от ленточного червя первого вида или растворимого вещества TCA ленточного червя третьего вида.
[088] В некоторых вариантах осуществления изобретения, твердый носитель также имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, выбранных из: антитела, способного специфически связываться с копроантигеном круглых червей, но не с копроантигеном трихоцефала или анкилостомы; антитела, способного специфически связываться с копроантигеном трихоцефала, но не с копроантигеном круглых червей или анкилостомы; антитела, способного специфически связываться с копроантигеном анкилостомы, но не с копроантигеном трихоцефала или круглых червей; антитела, способного специфически связываться с копроантигеном Giardia, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из: копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена парвовируса; и антитела, способного специфически связываться с копроантигеном парвовируса, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена Giardia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma, круглые черви представляют собой Toxocara, а трихоцефал представляет собой Trichuris. В других вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma caninum или Ancylosloma tubaeforme; круглые черви представляют собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia; а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
[089] Следует также отметить, что твердый носитель может представлять собой любой материал, подходящий для иммобилизации антител согласно изобретению. Так, например, твердый носитель может представлять собой сферы, частицы, трубки, лунки, зонды, индикаторные полоски, наконечники пипеток, предметные стекла, волокна, мембраны, бумагу, натуральные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы, стекло, полипропилен, полиэтилен, полистирол, декстран, найлон, амилазы, пластики, магнетит или любой другой подходящий материал, хорошо известный специалисту в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения, твердый носитель может содержать множество частиц, микрочастиц, чипов или сфер. Множество частиц, микрочастиц, чипов или сфер может быть прикреплено к устройству или может быть свободно связано с устройством. Множество частиц, микрочастиц, чипов или сфер может присутствовать на поверхности устройства или внутри устройства. Множество частиц, микрочастиц или сфер может быть стационарным на устройстве или внутри устройства, либо они могут перемещаться внутри устройства или проходить через него.
[090] Устройство может включать, но необязательно, один или более меченных реагентов для захвата антигена, которые могут быть смешаны с образцом млекопитающего перед его введением в устройство согласно изобретению. При включении меченного реагента для захвата антигена, этот меченный реагент для захвата антигена может быть, а может и не быть осажден или осушен на твердой поверхности устройства. Термин «реагент для захвата антигена» означает любое соединение, которое является специфичным к представляющему интерес антигену или к представляющим интерес антигенам. Меченный реагент для захвата антигена, независимо от того добавляют ли его в образец млекопитающего или предварительно осаждают на устройстве, может представлять собой, например, меченное антитело, специфичное к антигену круглых червей, включая, но не ограничиваясь ими, антитела настоящего изобретения.
[091] Устройство может также, но необязательно, включать жидкий реагент, который обеспечивает транспорт (например, в случае, если устройство представляет собой, например, устройство SNAP®), или как-либо иначе облегчает удаление (например, если устройство включает микротитрационный планшет) несвязанного вещества (например, непрореагировавших частей образца млекопитающего, таких как, например, непрореагировавшие части экстракта фекалий и несвязанный реагент для захвата антигена) из зоны реакции (твердая фаза). Жидкий реагент может представлять собой промывочный реагент и может служить только для удаления несвязанного вещества из зоны реакции, или он может включать детектирующий реагент и может служить для удаления несвязанного материала и для облегчения детекции антигена. Так, например, в случае реагента для захвата антигена, конъюгированного с ферментом, этот детектирующий реагент включает субстрат, который продуцирует детектируемый сигнал после взаимодействия с конъюгатом фермент-антитело в зоне реакции (твердая фаза). Альтернативно, в случае меченного реагента для захвата антигена, конъюгированного с радиоактивной, флуоресцентной или светопоглощающей молекулой, этот жидкий реагент действует просто как промывочный раствор, облегчающий детектирование образования комплекса в зоне реакции посредством вымывания несвязанного меченного реагента.
[092] Жидкий реагент может также включать ограниченное количество «ингибитора», то есть, вещества, которое блокирует продуцирование детектируемого конечного продукта. Ограниченное количество определяется как количество ингибитора, достаточное для блокирования продуцирования конечного продукта до тех пор, пока большая часть или весь избыток несвязанного материала не будут удалены из второй области, так как в этот момент образуется детектируемый конечный продукт.
[093] Устройство согласно изобретению может также включать различные связывающие реагенты, иммобилизованные на участках, и отличающающиеся от реагента или реагентов для захвата антигена. Так, например, иммунореагент (антитело, антиген или полипептид), который распознает видоспецифическую (например, специфичную к круглым червям) часть меченного антитела или реагента для захвата антигена или ферментной части реагента, меченного ферментом, может быть включен в качестве позитивного контроля для оценки жизнеспособности реагентов в устройстве. Так, например, позитивный контроль может представлять собой антитело против пероксидазы хрена, которое продуцируется, например, у коз или мышей. Кроме того, реагент, например, антитело, выделенное из неиммунного члена вида, от которого происходит часть антитела комплекса антиген-антитело, может быть включен в качестве негативного контроля для оценки специфичности образования иммунокомплекса (то есть, комплекса антиген-антитело).
[094] Это устройство согласно изобретению, помимо того, что оно предназначено для специфического связывания и выделения копроантигенов ленточных червей в образце млекопитающего, может быть, но необязательно, сконструировано так, чтобы оно обеспечивало возможность проведения одного или более других диагностических тестов. Так, например, твердый носитель может также включать реагенты для обнаружения одного или более гельминтов, таких как круглые черви, трихоцефалы, аскариды и анкилостомы, одного или более паразитов, не являющихся червями, одного или более вирусов (таких как парвовирус), одного или более грибков, одного или более простейших (таких как Giardia) или одной или более бактерий. Реагенты для обнаружения одного или более паразитов, не являющихся червями, одного или более вирусов, одного или более грибков, одного или более простейших или одной или более бактерий могут представлять собой, например, одно или более антител или один или более антигенов, распознаваемых антителами, специфичными к одному или более паразитам, не являющихся червями, одному или более вирусам, одному или более грибкам, одному или более простейшим или к одной или более бактериям.
[095] В одном варианте осуществления изобретения, устройство согласно изобретению представляет собой микротитрационны планшет, который включает множество лунок, где каждая лунка содержит твердый носитель, имеющий одно или более антител согласно изобретению, иммобилизованных на этом носителе.
[096] Микротитрационный планшет может быть использован в комбинации со способом согласно изобретению для выявления присутствия или отсутствия одного или более гельминтных копроантигенов в образце. Так, например, инфицирование ленточными червями может быть диагностировано у млекопитающего путем обнаружения одного или более антигенов ленточных червей с использованием антитела, иммобилизованного на твердом носителе. В одном варианте осуществления изобретения, антигены, которые являются детектируемыми, представляют собой копроантигены. «Копроантигены» представляют собой любой продукт или любые продукты желудочно-кишечных паразитов, таких как ленточные черви, которые присутствуют в образце фекалий хозяина определенного вида (например, собак или кошек), и которые могут специфически связываться с антителами. Таким образом, копроантигены могут представлять собой целые черви, яйца червей, фрагменты червей или продукты, секретируемые, экскретированные или выделяемые червями или их комбинации.
[097] Помимо микротитрационного планшета существует большое количество других альтернативных подходов для параллельного осуществления множественных иммуноанализов (то есть, мультиплексных иммуноанализов), известных специалистам в данной области. Обычно, мультиплексные иммуноанализы могут быть осуществлены в одном сосуде, в композиции или в устройстве, где компоненты множественных иммуноанализов находятся в диспергированном состоянии. Эти технологии могут быть основаны на массивах, микромассивах и/или микросферах или микрочастицах. В массивах или микромассивах, реагенты для захвата обычно наносят в виде пятен или каким-либо иным образом осаждают в дискретных областях одного устройства, такого как мембрана. В способах на основе сфер, реагенты для захвата для каждого анализа присоединяют к сферам, где сферы для каждого анализа отличаются от сфер для других анализов. Идентификация может быть проведена по цвету светового излучения, по физическому положению, штриховому коду или т.п. См. например, Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I. & Fairclough, L. C. (2015), ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Prot. Clin. Appl., 9: 406-422. doi:10.1002/prca.201400130).
[098] Множество таких мультиплексных платформ является коммерчески доступныым. В качестве примеров могут служить Luminex® (см., например, патент США No. 7523637); πCode™ MicroDiscs (Plexbio, см., например, заявку на патент США No. US2014/0274778); магнитные сферы со штриховыми кодами и способы и устройства для проведения мультиплексных анализов (например, Applied BioCode, Inc., Santa Fe Springs, CA, USA); магнитные чипы со штриховыми кодами (например, Applied BioCode, Inc.; например, патент США No. 8232092); тест-полоски в методе микрофлюидизации (например, LumiraDx®, патент США No. 9919313); и технологии на основе рассеяния света, такие как LightDeck® (mBio®, патент США No. 9739714). Дополнительные технологии мультиплексного иммуноанализа включают MULTI-ARRAY (Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD, USA), мультиплексную систему Bio-Plex® (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), технологии Access 2 (Beckman Coulter, Atlanta, GA); и ProcartaPlex® и ProQuantum® (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) (см. Fu Q, Zhu J, Van Eyk JE. Comparison of multiplex immunoassay platforms. Clin Chem. 2010 Feb;56(2):314-8. doi:10.1373/clinchem.2009.135087).
[099] В другом аспекте изобретения, устройство для определения присутствия или отсутствия одного или более копроантигенов ленточных червей в образце фекалий содержит твердый носитель, один или более лектинов и одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из: (а) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; (b) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (с) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя. В одном варианте осуществления изобретения, твердый носитель имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, два или более антител, три или более антител, четыре или более антител, пять или более антител, шесть или более антител, семь или более антител или восемь или более антител. Меченный лектин может связываться с углеводами на копроантигене ленточного червя, захваченном иммобилизованными антителами для детекции. В другом варианте осуществления изобретения, лектин может быть иммобилизован на твердом носителе. Иммобилизованный лектин может захватывать копроантиген ленточного червя, если он присутствует, и полученный комплекс может быть обнаружен с использованием одного или более меченных антител. В другом варианте осуществления изобретения, устройство дополнительно включает антиген ленточных червей одного или более видов, где антиген ленточных червей одного или более видов специфически связывается с антителами.
[0100] Кроме того, настоящее изобретение также включает наборы для анализа (например, промышленные изделия) для обнаружения и идентификации различных видов ленточных червей в образце млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления изобретения, наборы для анализа позволяют дополнительно обнаруживать и различить коинфекцию, вызываемую гельминтами, такими как круглые черви, трихоцефалы и/или анкилостомы в образце млекопитающего. Следовательно, набор может включать одно или более устройств и/или композиций согласно изобретению. Так, например, набор может включать антитела против ленточных червей и средства для определения связывания антител с антигенами ленточных червей и средства для определения связывания антител с антигенами ленточных червей. В одном конкретном примере, такой набор включает устройство, имеющее иммобилизованное антитело против ленточных червей одного или более различных видов, один или более реагентов для захвата антигена (например, неиммобилизованный меченный реагент для захвата антигена и иммобилизованный реагент для захвата антигена) и промывочный реагент, а также детектирующий реагент и реагенты, используемые в качестве позитивного и негативного контроля, если это желательно или необходимо. В такие тест-наборы могут быть включены и другие компоненты, такие как буферы, контроли и т.п., известные специалистам в данной области. Относительные количества различных реагентов могут варьироваться для обеспечения концентраций в растворе реагентов, которые, по существу, оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты могут поставляться в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, которые при растворении дают раствор реагента, имеющий соответствующие концентрации для объединения с образцом. Набор согласно изобретению может дополнительно включать инструкции по проведению одного или более способов согласно изобретению, включая инструкции по применению любого устройства и/или композиции согласно изобретению, которые включены в набор.
B. Способы согласно изобретению
[0101] Настоящее изобретение дополнительно включает способы применения одного или более устройств, наборов и/или композиций согласно изобретению для выявления присутствия или отсутствия одного или более антигенов ленточных червей в образце. Таким образом, эти способы могут быть проведены для выявления присутствия или отсутствия одного или более видов ленточных червей в образце, таком как, например, образец фекалий, который получают от млекопитающего, включая, но не ограничиваясь имм, собак, кошек, свиней, коров или человека. Кроме того, эти способы могут быть проведены для обнаружения одного или более гельминтов, таких как круглые черви, трихоцефалы, анкилостомы и аскариды, паразитов, не являющихся червями, таких как Giardia, и вирусов, таких как парвовирус в образце.
[0102] В способах согласно изобретению, обнаружение одного или более видов ленточного червя может быть осуществлено путем определения присутствия или отсутствия одного или более антигенов ленточных червей. Если образец, тестируемый на копроантигены ленточных червей, представляет собой фекалии, то растворимая часть фекалий может быть собрана в соответствии с любым протоколом, известным специалистам в данной области. Так, например, в дополнение к конкретному протоколу, описанному в приведенном здесь разделе «Примеры», растворимые части образца обычно могут быть собраны посредством фильтрации, экстракции, центрифугирования или простого смешивания с последующим гравиметрическим осаждением. Специалисту в данной области известно, что существует множество способов экстракции и приготовления нефекальных образцов, взятых у млекопитающего. Так, например, образец может представлять собой физиологическую жидкость, которая естественным образом выделяется или как-либо иначе высвобождается млекопитающими, или которую искусственно получают от млекопитающего. Такая искусственная экстракция может быть осуществлена путем доения млекопитающего или путем шприцевой инъекции в организм млекопитающего и взятия жидкости в шприц. После получения жидкости, она может быть, но необязательно, фракционирована (например, сыворотка может быть фракционирована из цельной крови, а затем использована в качестве образца). В качестве другого примера, образец может быть получен посредством взятия мазка у млекопитающего, например, из ротовой полости млекопитающего. В еще одном примере, срезы ткани могут быть получены путем биопсии.
[0103] Способы включают контактирование образца млекопитающего с одним или более антителами, специфичными к копроантигенам ленточных червей, в условиях, способствующих образованию комплекса антиген/антитело, то есть иммунокомплекса. То есть, антитело специфически связывается с копроантигеном, присутствующим в образце. Специалист в данной области знаком с анализами и условиями, которые могут быть использованы для детекции такого связывания комплекса антиген/антитело. Так, например, комплекс антиген/антитело может быть детектирован с использованием второго антитела, которое связывается с комплексом антиген/антитело. Образование комплекса между антигеном и антителами в образце может быть детектировано с применением любого подходящего способа, известного специалистам в данной области.
[0104] Кроме того, для достижения этой цели, относительное количество комплексов антитело-антиген, которые образуются в одной конкретной реакции, может быть измерено по отношению к комплексам, полученным в любой другой реакции любым способом, известным специалистам в данной области. Если было определено, что тестируемый образец имеет специфические комплексы антиген-антитело против ленточных червей, то исходя из образованных специфических комплексов можно сделать вывод, что у млекопитающего-хозяина присутствует конкретный ленточный червь и определить его вид (например, Taenia pisiformis и Dipylidium caninum). Если это подтверждается, то можно сделать вывод, что млекопитающее, у которого был взят тестируемый образец, имеет инфекцию, вызываемую кишечными ленточными червями. Выводы о том, что у млекопитающего, подвергающегося тестированию, имеется инфекция, вызываемая кишечными ленточными червями, могут быть сделаны врачом-клиницистом или медицинским персоналом диагностического центра или персоналом, осуществляющим уход за млекопитающим, таким как, например, ветеринар. Если лицо, осуществляющее уход за млекопитающим, определяет (или получает информацию иным образом), что у млекопитающего имеется инфекция, вызываемая ленточными червями, и что у него присутствует ленточный червь конкретного вида, то лицо, осуществляющее уход за млекопитающим, может затем провести этому млекопитающему курс лечения, который оптимально предназначен для избавления млекопитающего от конкретной инфекции ленточными червями, а не инфекции, вызываемой паразитическими червями в целом. Кроме того, настоящее изобретение может быть использовано для подтверждения того, что любое животное, которое получило лечение от конкретной инфекции ленточными червями, было избавлено от такой инфекции. Лицо, которое осуществляет уход за млекопитающим, и которому известно, что образец включает ленточных червей и круглых червей, но не анкилостом, может, например, использовать эту информацию для лечения млекопитающего, у которого был взят образец специально для определения ленточных червей, путем введения такому млекопитающему лекарственного средства, которое является оптимально эффективным против ленточных червей, и второго лекарственного средства, которое является оптимально эффективным против круглых червей. При отсутствии такой информации, лицо, осуществляющее уход за млекопитающим, может, например, каким-либо иным образом лечить млекопитающего лекарственным средством, которое оптимально эффективно только против ленточных червей и только против круглых червей, или против других червей, не являющихся ленточными червями и круглыми червями (в таких случаях млекопитающее может иметь риск получения субоптимального лечения). Кроме того, людям, которые могут контактировать с зараженным животным или с его экскрементами, можно порекомендовать соблюдать меры предосторожности от паразита или паразитов. В этой связи, важно точно и с высокой специфичностью определить виды червей, которые могут вызывать серьезное заболевание (например, заболевание, вызываемое мигрирующими личинками) у человека.
[0105] Пациент, страдающий от инфекций, вызываемых кишечными паразитами, может пройти курс лечения некоторыми лекарственными средствами, которые, как известно, уничтожают паразитов у пациента. Таким образом, пациент, в кале которого было обнаружено содержание копроантигена кишечного паразита, может быть подвергнут лечению подходящим терапевтическим средством в целях снижения числа или уничтожения кишечных паразитов.
[0106] Пациенты, страдающие инфекциями, вызываемыми кишечными паразитическими червями, такими как ленточные черви, анкилостомы, трихоцефалы и/или круглые черви, могут быть подвергнуты лечению антигельминтными лекарственными средствами, также известными как противогельминтные средства (или антигельминты). Такие противогельминтные средства широко известны специалистам в данной области. Противогельминтные средства для уничтожения ленточных червей включают, но не ограничиваются ими, празиквантел, нитазоксанид, альбендазол, эпсипрантел, фенбендазол или их комбинации. Противогельминтные средства могут быть введены различными подходящими способами, включая пероральное введение, парентеральное введение, такое как подкожное, внутривенное, внутримышечное или внутрибрюшинное, или местное (кожное) введение, например, нанесение непосредственно на обнаженную поверхность кожи пациента при лечении и/или профилактике заражения кишечными паразитами.
[0107] Giardia представляет собой микроскопический паразит, который вызывает диарею, известную как гиардиоз. Giardia, включая Giardia intestinalis, Giardia lamblia и Giardia duodenalis, присутствуют на поверхностях или в почве, в пищевых продуктах или в воде, загрязненных фекалиями инфицированных людей или животных. Копроантиген Giardia может быть обнаружен с помощью ряда коммерчески доступных тестов, включая быстрый тест на собачьи Giardia VetScan® (Abaxis, Union City, USA), быстрый тест на антиген CPV-CCV-Giardia Anigen® (BioNote, Seoul, Korea), тест на Giardia SNAP® (IDEXX, Westbrook, ME, USA) и ELISA-анализ на антиген Giardia (IDEXX), анализ на микропланшете на Giardia/криптоспоридии ProSpecT® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и тест на Giardia Witness® (Zoetis, Parsippany, NJ, USA). (Barbecho JM, Bowman DD, Liotta JL. Comparative performance of reference laboratory tests and in-clinic tests for Giardia in canine feces. Parasit Vectors. 2018 Aug 1;11(1):444. doi: 10.1186/s13071-018-2990-6. PMID: 30068364; PMCID: PMC6090814).
[0108] Терапевтические средства для лечения инфекций Giardia широко известны специалистам в данной области. Инфекции Giardia могут быть подвергнуты лечению одним или более из нескольких лекарственных средств, включая фенбендазол, албендазол, метронидазол, тинидазол, нитазоксанид, паромомицин, хинакрин и фуразолидон, фебентел, памоат пирантела, празиквантел или их комбинации. Эти лекарственные средства могут быть введены различными подходящими способами, включая пероральное введение, парентеральное введение, такое как подкожное, внутривенное, внутримышечное или внутрибрюшинное, или местное (кожное) введение, например, нанесение непосредственно на обнаженную поверхность кожи пациента при лечении и/или профилактике Giardia.
[0109] Промежуточные хозяева могут быть вовлечены в передачу одного или более червей или паразитов, не являющихся червями, грибков, вирусов и бактерий, пациенту, и, таким образом, успешное терапевтическое лечение включает стратегию борьбы с повторным заражением или его профилактики. Так, например, поскольку инфекции, вызываемые ленточными червями, могут передаваться промежуточными хозяевами, такими как блохи и кровососущие собачьи вши, то успешное терапевтическое лечение в случае такой инфекции включает стратегию борьбы с любым промежуточным хозяином (например, блохами), которыйе могут присутствовать у пациента. Таким образом, борьба с промежуточными хозяевами, такими как блохи, способствует профилактике повторного заражения пациента ленточными червями. Терапевтические средства для лечения или борьбы с инфекцииями, вызываемыми блохами, хорошо известны специалистам в данной области и включают селамектин, фипронил, имидаклоприд, индоксакарб, пиретрин, перметрин, флуметрин, спиносад, нитенпирам, афоксоланер, флураланер, саралан, нитенпирам, метопрен, пирипроксифен и луфенурон или их комбинации. Средства для борьбы с блохами могут быть введены различными подходящими способами, включая пероральное введение, парентеральное введение, такое как подкожное, внутривенное, внутримышечное или внутрибрюшинное, или местное (кожное) введение, например, нанесение непосредственно на обнаженную поверхность кожи пациента. Репрезентативные подходящие формы для борьбы с блохами включают спреи, порошки, воротники, композиции для ухода за полостью рта или препараты для местного применения.
[0110] Стадии способа согласно изобретению могут включать нанесение образца млекопитающего на устройство согласно изобретению, которое включает: (а) первое антитело, способное специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; (b) второе антитело, способное специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и (с) третье антитело, способное специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя, с получением комплексов антитело-копроантиген в присутствии копроантигенов, если они образуются в образце; и детектирование присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются.
[0111] В некоторых вариантах осуществления изобретения, устройство может дополнительно включать одно или более антител, выбранных из: антитела, способного специфически связываться с копроантигеном круглых червей, но не с копроантигеном трихоцефала или анкилостомы; антитела, способного специфически связываться с копроантигеном трихоцефала, но не с копроантигеном круглых червей или анкилостомы; антитела, способного специфически связываться с копроантигеном анкилостомы, но не с копроантигеном трихоцефала или круглых червей; антитела, способного специфически связываться с копроантигеном Giardia, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена парвовируса; и антитела, способного специфически связываться с копроантигеном парвовируса, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена Giardia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma, круглые черви представляют собой Toxocara, а трихоцефал представляет собой Trichuris. В других вариантах осуществления изобретения, анкилостомы представляют собой Ancylostoma caninum или Ancylosloma tubaeforme; круглые черви представляют собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia; а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
[0112] В одном варианте осуществления изобретения, стадия обнаружения присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются, дополнительно включает стадию получения одного или более лектинов, которые связываются по меньшей мере с одним из комплексов. Лектин может быть детектируемо меченным или иммобилизованным на твердом носителе. Альтернативно, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены или иммобилизованы на твердом носителе. В одном варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизированы на твердом носителе, а лектин может быть детектируемо меченным. В другом варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а лектин может быть иммобилизован на твердом носителе.
[0113] В другом варианте осуществления изобретения, стадия контактирования образца фекалий млекопитающего с одним или более антителами дополнительно включает стадию контактирования образца фекалий с одним или более лектинами. Лектин может быть детектируемо меченным или иммобилизованным на твердом носителе. Альтернативно, первое, второе и третье антитела могут быть помечены или иммобилизованы на твердом носителе. В одном варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть иммобилизированы на твердом носителе, а лектин может быть детектируемо меченным. В другом варианте осуществления изобретения, первое, второе и третье антитела могут быть детектируемо помечены, а лектин может быть иммобилизован на твердом носителе.
[0114] Антитела и лектины могут быть непосредственно или опосредованно присоединены к твердому носителю или подложке, таким как лунка микротитрационного планшета, антитело-иммобилизирующая часть устройства SNAP®, магнитная сфера, немагнитная сфера, колонка, матрица, мембрана, волокнистый материал, состоящий из синтетического или натурального волокна (например, стекло или материалы на основе целлюлозы или термопластических полимеров, такие как полиэтилен, полипропилен или сложный полиэфир), структура из спеченного стекла, состоящая из материалов в виде крупных частиц (например, стекло или различные термопластические полимеры), или пленка из сформованной мембраны, состоящая из нитроцеллюлозы, найлона, полисульфона или т.п. (обычно синтетическая по своей природе). Все эти материалы подложки могут быть использованы в подходящих формах, таких как пленки, листы или пластины, либо они могут быть нанесены на соответствующие инертные носители или прикреплены к этим носителям или ламинированы с этими носителями, такими как бумага, стекло, пластиковые пленки или ткани. Подходящие способы иммобилизации антител, пептидов и лектинов на твердых фазах включают ионные, гидрофобные, ковалентные взаимодействия и т.п.
[0115] Однако, способы согласно изобретению не требуют применения твердых фаз или субстратов. Специалистам в данной области известно, что существует ряд способов, с применением которых может быть проведен способ согласно изобретению для обнаружения присутствия или отсутствия круглых червей без использования твердых фаз или подложек. Так, например, могут быть проведены способы иммунопреципитации, которые не требуют использования твердых фаз или подложек.
[0116] В некоторых вариантах осуществления изобретения, комплекс антиген/антитело детектируют, если индикаторный реагент, такой как конъюгат фермента, который связан с антителом, катализирует детектируемую реакцию. Индикаторный реагент, включающий, но необязательно, сигнал-генерирующее соединение, может быть нанесен на комплекс антиген/антитело в условиях, которые позволяют получить детектируемый комплекс антиген/антитело/индикатор. Антитело может быть, но необязательно, помечено индикаторным реагентом перед образованием комплекса антиген/антитело.
[0117] Образование комплекса антиген/антитело или комплекса антиген/антитело/индикатор в некоторых из способов согласно изобретению может быть специфически детектировано, например, радиометрическим, ферментативным, хемилюминесцентным, колориметрическим, нефелометрическим, флуориметрическим, фотометрическим, гранулометрическим методом, методом с применением поверхностного плазмонного резонанса или методами осаждения. Детектирование комплекса антиген/антитело может быть также осуществлено путем добавления второго антитела, которое связано с индикаторным реагентом, включающим сигнал-генерирующее соединение. Индикаторные реагенты, включающие сигнал-генерирующие соединения (метки), связанные с комплексом полипептид/антител, могут быть детектированы с применением вышеописанных способов и могут включать хромогенные агенты, катализаторы, такие как конъюгаты ферментов, флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин и родамин, хемилюминесцентные соединения, такие как диоксетаны, акридины, фенантридины, рутений и люминол, радиоактивные элементы, прямые визуальные метки, а также кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п. Примеры конъюгатов ферментов включают щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена, бета-галактозидазу и т.п. Выбор конкретной метки не играет решающей роли, но он может формировать сигнал либо сам по себе, либо в сочетании с одним или более дополнительными веществами.
[0118] Способы согласно изобретению включают, но не ограничиваются ими, способы на основе конкурентного связывания, непосредственные реакции или сэндвич-анализы, включая, но не ограничиваясь ими, ELISA, RIA, иммуноФлуоресцентные анализы (IFA), гемагглютинацию (HA), иммуноанализ с поляризацией флуоресценции (FPIA) и анализы на микротитрационных планшетах (то есть, любой анализ, осуществляемый в одной или более лунках микротитрационного планшета). Один анализ согласно изобретению включает анализ на связывание с помощью реверсивного потока на хроматографической колонке, который может быть осуществлен, например, с использованием устройства SNAP®. См. патент США No. 5726010.
[0119] В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ согласно изобретению облегчает проведение сэндвич-анализов или анализов на конкурентное специфическое связывание. В сэндвич-анализе, реагенты для захвата антигена иммобилизуют в зоне реакции. Эти реагенты для захвата антигена могут специфически связываться с антигенами в образце, тестируемом на ленточного червя. После связывания антигена образца, комплекс «реагент для захвата антигена/антиген» детектируют любым подходящим способом. Так, например, комплекс может быть подвергнут взаимодействию с меченными специфически связывающимися реагентами (например, с конъюгатом фермент-антитело) и с детектируемым антигеном (например, после взаимодействия с субстратом).
[0120] В других вариантах способа согласно изобретению проводят анализ на конкурентное связывание. В анализе на конкурентное связывание, реагенты для захвата антигена иммобилизуют в зоне реакции и одновременно подвергают контактированию с антигеном образца и меченным антигеном (например, с конъюгатом антиген-фермент). Количество метки, детектируемой в зоне реакции, обратно пропорционально количеству антигена в образце.
[0121] В некоторых вариантах способа, антитела, специфичные к копроантигенам ленточных червей, присоединяют к твердой фазе или к подложке. К подложке добавляют образец, который может включать антиген ленточных червей. Затем добавляют антитела, которые специфически связываются с антигенами ленточных червей. Антитела могут быть одинаковыми антителами, используемыми в твердой фазе, либо они могут происходить от различных источников или видов. Кроме того, эти антитела могут быть связаны с индикаторным реагентом, таким как конъюгат фермента. Стадии промывки могут быть осуществлены перед каждым добавлением. Затем может быть добавлен хромофор или субстрат фермента для проявления окраски. Цветная реакция может быть прекращена, и окраска может быть количественно определена, например, на спектрофотометре, и/или визуально оценена на глаз.
[0122] В других вариантах этого способа, антитела, специфичные к копроантигенам ленточных червей, присоединяют к твердой фазе или к подложке. К подложке добавляют образец, который может включать антиген ленточных червей. Затем добавляют вторые антитела против других видов, которые специфически связываются с копроантигенами. Эти вторые антитела, в отличие от антител на твержой фазе, происходят от других видов. После этого добавляют третьи антитела против других видов, которые специфически связываются со вторыми антителами и специфически не связываются с антителами на твердой фазе. Третьи антитела могут включать индикаторный реагент, такой как конъюгат фермента. Стадии промывки могут быть осуществлены перед каждым добавлением. Затем может быть добавлен хромофор или субстрат фермента для проявления окраски. Цветная реакция может быть прекращена, и окраска может быть количественно определена, например, на спектрофотометре, и/или визуально оценена на глаз.
[0123] В конкретном примере, способ согласно изобретению осуществляют с использованием устройства, которое представляет собой устройство для анализа с боковым потоком, путем добавления полученного образца млекопитающего к проточной матрице устройства в первой области (в зоне нанесения образца). Полученный образец переносят в канал с потоком жидкости под действием капилляров во вторую область проточной матрицы, где присутствует метка в виде крупных частиц, способных к связыванию и образованию первого комплекса с антигеном в образце. Метка в виде крупных частиц может представлять собой, например, цветную латексную частицу, зольный краситель или зольное золото, конъюгированное с антителом, специфичным к антигену круглых червей. Первый комплекс переносят в третью область проточной матрицы, где антитело, которое специфически связывается с антигеном круглых червей, иммобилизуется в определенном месте. Второй комплекс образуется между иммобилизованным антителом и первым комплексом. Метка в виде крупных частиц, которая является частью второго комплекса, может быть непосредственно оценена на глаз.
[0124] Каждое специфическое антитело червей может представлять собой иммобилизованный реагент для захвата антигена в зоне реакции (твердая фаза). Второй реагент для захвата антигена, то есть, второе специфическое антитело против ленточных червей, которое было конъюгировано с меткой, может быть либо добавлено к образцу перед его добавлением в устройство, либо второй реагент для захвата антигена может быть введен в устройство. Так, например, меченный реагент для захвата антигена может быть осажден и осушен на пути прохождения жидкости, который обеспечивает такое прохождения жидкости между зоной нанесения образца и твердой фазой. Контактирование меченного реагента для захвата антигена с тестируемым образцом может приводить к растворению меченного реагента для захвата антигена.
[0125] В одном варианте способа согласно изобретению, специфический копроантиген червей детектируют с помощью ELISA. Конкретные примеры способа проведения ELISA согласно изобретению описаны здесь в разделе «Примеры». Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные способы проведения ELISA, однако, следует отметить, что специалисту в данной области известны альтернативные, дополнительные или другие стадии ELISA, которые могут быть проведены без отклонения от основной цели, достигнутой с применением данного способа согласно изобретению.
[0126] В другом варианте осуществления изобретения, копроантиген ленточных червей детектируют с использованием устройства с боковым потоком, такого как, например, устройство SNAP®.
[0127] Кроме того, способы согласно изобретению для обнаружения заражения ленточными червями могут быть объединены с другими диагностическими анализами для выявления присутствия других организмов или состояний. Так, например, анализы согласно изобретению могут быть проведены в комбинации с реагентами, которые обнаруживают один или более гельминтов, фекальных паразитов, не являющихся червями, один или более вирусов, один или более грибков, один или более простейших, одну или более бактерий, один или более паразитов в крови или в скрытой крови или их комбинации. При наличии двух или более уникальных сайтов связывания в одном устройстве для анализа (таких как, например, два уникальных пятна на устройстве для анализа SNAP®), настоящее изобретение позволяет обнаруживать два или более организмов в одном образце. В одном варианте осуществления изобретения имеются три уникальных пятна для обнаружения бывших или присутствующих инфекций или заражений тремя организмами (пятна представляют либо реагенты, связывающиеся с антигеном или антителом) в одном образце (то есть, где один и тот же отдельно взятый образец был подвергнут воздействию трех реагентов для захвата на одном устройстве). В еще одном варианте осуществления изобретения имеются четыре уникальных пятна для обнаружения бывших или присутствующих инфекций или заражений четырьмя организмами (пятна представляют реагенты, связывающиеся с антигеном или с антителом) в одном образце (то есть, где один и тот же отдельно взятый образец был подвергнут воздействию четырех реагентов для захвата на одном устройстве). Однако, следует отметить, что одно и то же устройство может включать более четырех уникальных пятен и/или позволяет обнаруживать более чем четыре организма.
[0128] Реагенты для обнаружения одного или более гельминтов, паразитов, не являющихся червями, одного или более вирусов, одного или более грибков, одного или более простейших, или одной или более бактерий, могут представлять собой, например, одно или более антител или один или более антигенов, распознаваемых антителами, специфичными к одному или более гельминтам, паразитам, не являющимся червями, к одному или более вирусам, к одному или более грибкам или к одной или более бактериям. В некоторых вариантах осуществления изобретения, реагенты могут включать одно или более антител или один или более антигенов, распознаваемых антителами, специфичными к одному или более гельминтным паразитам (например, к круглым червям, к трихоцефалам, к анкилостомам и аскаридам), к паразитам, не являющимся червями, к одному или более вирусам (например, к парвовирусам, таким как собачий парвовирус или кошачий парвовирус), к одному или более грибкам, к одному или более простейшим (например, Giardia, таким как Giardia lamblia) или к одной или более бактериям.
[0129] Способ может также включать, но необязательно, использование одной или более нуклеиновых кислот ленточных червей, включая, но не ограничиваясь ими, нуклеиновые кислоты согласно изобретению для определения присутствия или отсутствия одного или более видов ленточных червей в образце, взятом у млекопитающего. Такое применение этих нуклеиновых кислот для определения присутствия гельминтов может быть осуществлено до, во время или после применения любых других аспектов данного способа, включая обнаружение одного или более видов ленточных червей под действием антитела. Таким образом, в одном аспекте изобретения, после того, как один или более видов ленточных червей обнаруживаются или не обнаруживаются в конкретном образце, и после того, как млекопитающее, у которого был взят образец, диагностируется как инфицированное или не инфицированное ленточными червями, этот образец (или позже полученный образец от диагностированного млекопитающего) может быть протестирован на наличие или отсутствие любой одной или более нуклеиновых кислот, включая любую одну или более нуклеиновых кислот согласно изобретению. Любое отсутствие конкретного гельминта у конкретного млекопитающего с использованием одной или более нуклеиновых кислот (после того, как гельминт был обнаружен при использовании одного или более антител), должно рассматриваться как вероятность того, что антитела обнаруживали гельминтный корпоантиген еще до появления детектируемой гельминтной нуклеиновой кислоты в образце. В таком случае, лицо, осуществляющее уход за млекопитающим, может проигнорировать тот факт, что нуклеиновая кислота не смогла обнаружить гельминт, и провести лечение млекопитающего, а в частности, гельминтной инфекции, исходя из того, что антитела действительно обнаруживают гельминт. В другом аспекте изобретения, нуклеиновые кислоты используют для определения присутствия или отсутствия гельминтов у конкретного млекопитающего, а затем наличие или отсутствие гельминтов дополнительно оценивают с использованием антител согласно изобретению. Обнаружение одной или более гельминтных нуклеиновых кислот может быть осуществлено с применением любых методов детекции нуклеиновой кислоты, известных специалисту в данной области. Так, например, такое обнаружение может быть осуществлено путем проведения метода на основе ПЦР, такого как, но не ограничивающегося им, например, метод на основе ПЦР в реальном времени. Примеры методов на основе ПЦР, описаны, например, в руководствах PCR Protocols (Methods in Molecular Biology), 2nd ed., Bartlett and Stirling, eds., Humana Press (2003); и Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), каждое которых в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0130] Настоящее изобретение конкретно описано со ссылкой на нижеследующие Примеры; однако, они не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
Пример А
[0131] Если это не оговорено особо, то для получения данных, описанных в одном или более из приведенных ниже Примеров 1-5, были использованы материалы и методы, описанные ниже.
[0132] Приготовление экстрактов червей Taenia pisiformis и Dipylidium caninum. Экстракты червей Taenia pisiformis и Dipylidium caninum были закуплены у Antibody systems, Inc. Нurst, Texas, USA. Экстракты червей центрифугировали при 10000× g в течение 30 минут при 4°C. Cупернатант собирали, диализовали в PBS, рН 7,0 (c отсечкой молекулярной массы мембраны 12-14 кДа, часть 132678, Spectrum, Repligen, Waltham MA, USA) и концентрацию белка определяли с помощью анализа Брэдфорда.
[0133] Приготовление экстрактов червей Taenia taeniaeformis. Taenia taeniaeformis получали из лаборатории Отделения ветеринарии Университета Росса в Сэнт-Китс. Все целые черви были промыты несколько раз холодным PBS, рН 7,0, для удаления любых фекальных материалов и слизи из хозяина при комнатной температуре, и гомогенизировали при 4°C с помощью устройства для измельчения тканей до тех пор, пока заметные куски ткани не распадались на кусочки, не видимые невооруженным глазом. Гомогенизированные материалы переносили в 50 мл-пробирку Falcon, и измельчитель промывали 2-3 раза холодным PBS, pH 7,0. Гомогенизированных ленточных червей вместе с промывками в измельчителе центрифугировали при 10000× g в течение 30 минут при 4°C, и супернатанты собирали перед диализом в PBS, рН 7,0 (с отсечкой молекулярной массы мембраны 12-14 кДа, часть 132678, Spectrum, Repligen, Waltham MA, USA). Концентрацию белка определяли с помощью анализа Брэдфорда.
[0134] Приготовление растворимой фракции TCA Dipylidium caninum. Этот антиген получали путем разрушения червей в водном буферном растворе (фосфатном буфере, рН 7,2), с последующим центрифугированием для удаления нерастворимых веществ и компонентов в виде крупных частиц, добавлением по каплям 30% трихлоруксусной кислоты (ТСА) до конечной концентрации 15%, перемешиванием в течение еще 15 минут при 18-27°С после добавления всей TCA, хранением на лабораторном столике в течение еще 45 минут при температуре 18-27°С в состоянии покоя, центрифугированием для удаления нерастворимых компонентов, диализом против водного буферного раствора (0,01М фосфатного буфера, РН 7,2) с помощью диализной трубки Spectrapor ®, MWCO: 6-8 К, и лиофилизацией на лиофилизаторе.
[0135] Приготовление промывки червей. Замороженные исходные образцы червей промывали 4 раза в буфере PBS при рН 7,2. Буферные растворы от первых 3 стадий промывки отбрасывали. Буферный раствор в четвертой стадии промывки центрифугировали при 10000× g в течение 20 минут и супернатант собирали. Супернатант концентрировали на концентраторе iCON (MWCO: 20 мл/9К; Thermo Scientific). Полученный концентрат был назван «промывкой червей» (WW).
[0136] Приготовление продукта E/S. Экскретированные/секретированные продукты (Е/S) собирали путем выдерживания живых червей в колбе Т-150 со средой для культивирования тканей (ЕMЕМ с D-глюкозой, гентамицином и фунгизоном, рН 7,2-7,3) в инкубаторе при 37°C с 5% CO2 в течение двух недель. Вкратце, живых ленточных червей промывали несколько раз нагретой средой для удаления любых остатков фекалий, а затем помещали в колбу для культивирования ткани Т-150, содержащую 100 мл нагретой среды (EMEM). Жизнеспособность ленточных червей проверяли ежедневно, и среду заменяли три раза в день. Использованную среду объединяли и концентрировали на концентраторе Icon (MWCO: 9К; Thermo Scientific), а затем полученный концентрированный продукт E/S использовали для получения антител.
[0137] Получение поликлональных антител (pAb). Поликлональные антитела были продуцированы у кроликов, не содержащих специфических патогенов (SPF), в SDIX, LLC (Windham, Maine, USA). Иммуногены представляют собой экстракты целых червей (Dipylidium caninum и Taenia pisiformis от Antibody Systems Inc. Hurst, Tex.; T. taeniaeformis от IDEXX Laboratories, Inc) или продукт E/S (IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine). Вкратце, кроликов подвергали контрольному заражению путем подкожного введения одного и того же иммуногена в различных адъювантах четыре раза в течение 50 дней. По окончании процедуры иммунизации собирали сыворотку.
[0138] Получение моноклонального антитела (mAb). Мышиные моноклональные антитела получали в соответствии со стандартными процедурами, если это не оговорено особо. Вкратце, 3-5 мышей Balb/c иммунизировали иммуногеном, и после завершения схемы иммунизации, клетки селезенки собирали. Клетки селезенки подвергали слиянию с миеломными клетками. Через несколько раундов скрининга и отбора с помощью среды HAT, изотипирования и субклонирования получали специфические клеточные линии гибридомы, секретирующие нужное mAb.
[0139] Очистка и выделение антител. Поликлональное кроличье антитело и мышиное моноклональное антитело очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с G-белком-сефарозой 4 Fast Flow (Thermo Fisher Scientific) с использованием системы очистки АКТА. Вкратце, сыворотку кролика или TCF (конечную культуральную жидкость) разводили промывочным буфером и загружали на колонку с G-белком. Колонку тщательно промывали промывочным буфером перед тем, как антитело элюировалось с колонки. Элюированное антитело нейтрализовали 1М Трис-буфером, рН 8,0, затем диализовали в 10 мМ PBS, рН 7,2 и хранили при -20°С для последующего использования.
[0140] Приготовление экстракта фекалий. Образцы свежих, неконсервированных фекалий собак или кошек (1 грамм) суспендировали в 4 мл раствора разбавителя (раствор разбавителя представляет собой: 0,05М основания Трис; 1 мМ EDTA; 0,45% Kathon; 16 мг/мл сульфата гентамицина; 0,05% Твина-20; 40% фетальной бычьей сыворотки; 10% кроличьей сыворотки; и 5% мышиной сыворотки). Суспензию центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 минут с получением первого супернатанта. Первый супернатант центрифугировали при 10000× g в течение 10 минут с получением второго супернатанта, который называется здесь «экстрактом фекалий».
[0141] ELISA-анализы. Очищенные поликлональные Ab или моноклональные Ab (100 мкл/лунку и 3 мкг/мл) иммобилизовали путем физической адсорбции на 96-луночных планшетах Immulon 1B в течение ночи при 4°C. Затем планшеты блокировали 1% BSA в 0,1М Трис рН 7,0 при 4°C в течение ночи с последующей сушкой при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли приблизительно 100 мл экстракта фекалий и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем лунки промывали пять раз раствором PBS-Твина-20 в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. В отдельном реакционном сосуде, свободное кроличье pAb (другое антитело, в случае mAb против той же самой используемой мишени) метили пероксидазой хрена (ПХ) с использованием перекрестно-сшивающего линкера, а именно, сукцинимидил-4-[N-малеимидометил] циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) для получения конъюгата, и 3 мкг/мл этого конъюгата добавляли в каждую лунку, имеющую иммобилизованные pAb или mAb. После 30-минутного периода инкубирования при комнатной температуре, несвязанный конъюгат удаляли из лунок путем промывки с использованием раствора PBS-Твина-20 в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. Затем 50 мкл субстрата пероксидазы TMBLUE™ (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME) добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. После прекращения каждой ферментативной реакции путем добавления 0,1% додецилсульфата натрия (ДСН) после 10-минутного периода инкубирования измеряли оптическую плотность (OD) в каждой лунке 96-луночного планшета при А650 с применением стандартных спектрофотометрических методов на планшет-ридере для ELISA для вычисления «величины OD650» (или просто величины OD) для каждой лунки. В этом формате, значение OD, полученное для любой конкретной лунки 96-луночного планшета, прямо пропорционально количеству специфически связанного антигена, присутствующего в лунке. Значения OD 0,1 или ниже рассматривали как отрицательные результаты, а другие значения OD рассматривали как положительные результаты, если это не указано особо в Примерах.
[0142] Характеризация углеводов/гликозилирования с помощью ELISA на углеводы с использованием якалина-биотина. Планшет immulon 1B, покрытый мышиным mAb IgM ADX226, использовали для ELISA-анализа на углеводы. В каждую лунку добавляли приблизительно 100 мкл экстракта фекалий и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем лунки промывали пять раз раствором PBS-Твина-20 в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. Затем, в каждую лунку добавляли якалин-биотин (0,25 мкг/мл), а затем инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Несвязанный якалин-биотин (Vector Laboratories, 30 Ingold Road, Burlingame, CA) удаляли из лунок путем промывки с использованием раствора PBS-Твина-20 в соответствии со стандартными методами, известными специалистам в данной области. Конъюгат стрептавидин-ПХ (Vector Laboratories, 30 Ingold Road, Burlingame, CA) добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Несвязанный конъюгат стрептавидин-ПХ снова промывали с использованием раствора PBS-Твина-20. Затем 50 мкл субстрата пероксидазы TMBLUE™ (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME) добавляли в каждую лунку после инкубирования в течение 30 минут с конъюгатом стрептавидин-ПХ и планшеты инкубировали в течение 1 минуты при комнатной температуре. После прекращения каждой ферментативной реакции путем добавления 0,1% додецилсульфата натрия (ДСН) после 1-минутного периода инкубирования измеряли оптическую плотность (OD) в каждой лунке 96-луночного планшета при А650 как проиллюстрировано выше в разделе, где описан ELISA-анализ фекалий.
Пример 1А
[0143] Вырабатывание и скрининг мышиных моноклональных антител против Taenia pisiformis. Мышиные mAb (моноклональные антитела) индуцировали путем иммунизации мышей экстрактом червей (WE) T. pisiformis (далее называемым экстрактом T. pisiformis или экстрактом из T. pisiformis), и получали гибридомы. Гибридомы-кандидаты скринировали на способность секретируемых mAb связываться с иммуногеном (то есть, с экстрактом T. pisiformis), нанесенным на микротитрационные планшеты в ELISA-анализе на захват. Исходя из этого скрининга, сто (100) гибридом (то есть, 100 mAb), которые были позитивными в этом скрининге (то есть, были способны связываться с экстрактом T. pisiformis), отбирали для дальнейшего анализа. Затем 100 кандидатов mAb снова скринировали на их способность функционировать в ELISA-анализе на копроантиген с помощью скрининг-анализа на захват. Микротитрационные планшеты покрывали кроличьим поликлональным антителом, которое было продуцировано посредством стандартной иммунизации кроликов экстрактом T. pisiformis. Затем добавляли FEX (экстракт фекалий), полученный из образцов фекалий собак. Образцы фекалий были получены от собак, которые, как известно, были инфицированы T. pisiformis, и эти образцы были получены из IDEXX Reference Laboratories. В каждую лунку добавляли один из 100 супернатантов-кандидатов mAb, а затем козье антитело против мышиных IgG конъюгировали с меткой. В этом анализе особенно тщательно оценивали пять mAb (02D09, 03H02, 07C02, ADX131 и ADX13), а затем они были отобраны для дальнейшего анализа.
[0144] Пять mAb дополнительно скринировали на их способность функционировать при спаривании друг с другом в сэндвич-анализе. Для этой цели, каждое из пяти mAb наносили на лунки микротитрационных планшетов и инкубировали с FEX (Taenia Pisiformis-позитивными образцами: n=10; T. pisiformis-негативными образцами: n=10) с последующим добавлением одного из пяти mAb, конъюгированного с меткой, или мышиного pAb против WE Taenia pisiformis. Пять mAb хорошо функционировали в комбинации по меньшей мере с одним из других mAb, а поэтому они были отобраны для дальнейшего исследования. Из пяти mAb, которые хорошо функционировали, были выбраны два антитела (ADX131 и ADX132) для дальнейших исследований, поскольку они давали низкий фон и мощный сигнал при спаривании друг с другом в ELISA на копроантиген.
[0145] Каждое из ADX131 и ADX132 спаривалось с ПХ-конъюгатами 02D09, 03H02, 07C02, ADX131 и ADX132 в другом ELISA-анализе. В качестве позитивного контроля использовали дополнительное спаривание с кроличьим pAb против WE T. pisiformis. ADX131 и ADX132 отдельно наносили на лунки микротитрационных планшетов, а затем инкубировали с FEX собак, инфицированных T. pisiformis; собак, не инфицированных T. pisiformis или с экстрактом червей T. pisiformis; и с конъюгатами и субстратом ПХ. В каждой из пяти пар антител, ADX131 давало сильный сигнал при инкубировании с FEX инфицированных собак и с экстрактом червей. В четырех из пяти пар антител, ADX131 давало отрицательный результат (то есть, сигнал ниже порогового значения) при инкубировании с FEX неинфицированных собак, за исключением спаривания с 03H02, которое давало сигнал, немного превышающий выбранное пороговое значение 0,1 OD (фиг. 1). Во всех пяти парах антител, ADX132 давало сильный сигнал при инкубировании с FEX инфицированных собак и с экстрактом червей. Во всех пяти парах антител, ADX132 давало низкий фоновый сигнал при инкубировании с FEX неинфицированных собак (фиг. 2).
Пример 1В
[0146] ELISA-анализ на специфичность к копроантигену Taenia pisiformis и оценка чувствительности такого анализа. Для оценки специфичности анализа проводили ELISA-анализ на копроантиген T. pisiformis (с использованием ADX131, нанесенного на планшет, и конъюгата ADX132-ПХ), в котором осуществляли тестирование FEX собак, инфицированных анкилостомой Ancylostoma caninum (n=44), круглыми червями Taxocara canis (n=9), трихоцефалом Trichuris vulpis (n=36), D. caninum (n=44) или Taenia pisiformis (n=5). Результат (см. фиг. 3) показал, что все 5 образцов Т. pisiformis были позитивными в этом анализе, а все остальные были негативными. ELISA-анализ на копроантиген T. pisiformis не выявил перекрестного взаимодействия с анкилостомой Ancylostoma caninum, круглыми червями Taxocara canis, трихоцефалом Trichuris vulpis или D. caninum. Таким образом, ELISA-анализ на копроантиген T. pisiformis имел 100% чувствительность и специфичность в этом эксперименте. Для оценки специфичности анализа был проведен сэндвич-ELISA на копроантиген с использованием ADX131, нанесенного на микротитрационный планшет, и конъюгата ADX132-ПХ, нанесенного после добавления образца, взятого у пациента. Анализ проводили на WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. crassiceps, WE T. taeniaeformis, E/S T. taeniaeformis, а также на FEX собак, положительных по D. caninum; собак, отрицательных по D. caninum; кошек, положительных по D. caninum; кошек, отрицательных по D. caninum; собак, положительных по T. pisiformis; собак, отрицательных по T. pisiformis; группы из трех кошек, положительных по T. taeniaeformis; и группы из трех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis. Вышеупомянутые WE использовали в концентрации 1 мкг/мл белка. Анализ дополнительно проводили на нескольких образцах WE при 2 мкг/мл белка и/или 10 мкг/мл белка. Образцы WE, имеющие эти более высокие концентрации, представляют собой WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. crassiceps, WE анкилостом Ancylostoma caninum, WE круглых червей Toxocara canis и WE трихоцефала Trichuris vulpis. Среди этих образцов, анализ был положительным только на WE T. pisiformis и у собак, положительных по T. pisiformis (фиг. 4). Таким образом, ELISA-анализ на ADPX131/ADX132-ПХ был в высокой степени специфичным в этом эксперименте.
[0147] Для оценки специфичности ELISA-анализа на копроантиген T. pisiformis (с использованием ADX131, нанесенного на планшет, и конъюгата ADX132-ПХ) проводили анализ на FЕX 822 образцов, взятых у собак. Из этих образцов, 1 образец был подтвержден как образец, положительный по T. Pisiformis, с помощью микроскопии (то есть, проглоттиды наблюдались под микроскопом), а 821 образец был подтвержден как образец, отрицательный по T. pisiformis, с помощью микроскопии. Результаты показали, что из 821 образца, которые давали отрицательный результат при микроскопии, 818 образцов были отрицательными в ELISA-анализе на копроантиген Taenia pisiformis, а 3 образца были положительными. Образец, который давал положительный результат при микроскопии, был положительным в ELISA-анализе на копроантиген T. pisiformis. Таким образом, специфичность ELISA-анализа на копроантиген T. pisiformis составляла 99,7% в этом эксперименте.
Пример 1C
[0148] Характеризация антигена: гликозилирование антигенов, связанных с mAb ADX131 против T. pisiformis. Для того, чтобы определить, является ли копроантиген, связанный с mAb ADX131, гликозилированным, было протестировано 21 различных лектинов на их способность связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированным лектином I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA). Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, FEX собак, положительных по T. pisiformis, добавляли в планшеты, покрытые ADX131. После промывки добавляли конъюгаты лектин:биотин, а затем стрептавидин-ПХ и цветовой субстрат. В этом тесте, следующие лектины, такие как WGA, сукцинилированный WGA, PSA, GSLII И LCA, давали мощный сигнал и низкий фон, что указывает на то, что они связывались с копроантигеном T. pisiformis.
[0149] Характеризация антигена: гликозилирование антигенов, связанных с mAb ADX132 против T. pisiformis. Для того, чтобы определить, является ли копроантиген, связанный с mAb ADX132, гликозилированным, была протестирована способность ADX132 связываться с продуктами FEX, связанными с 21 различными лектинами с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированным лектином I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA). Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, лунки микротитрационных планшетов покрывали одним из лектинов и добавляли FEX собак, положительных по T. pisiformis, а затем добавляли конъюгат ADX132-ПХ и цветовой субстрат. В этом тесте использовали лектины WGA, UEA И GSLII, связанные с копроантигеном.
[0150] Данные по связыванию лектина показали, что копроантиген T. pisiformis, связанный с ADX131/ADX132, является гликозилированным. Данные по связыванию лектина также показали, что копроантиген ADX131/132 содержит следующие молекулы: невосстановленный GlcNac; восстановленный GlcNac; фукозу; GSL II; и маннозу.
Пример 2А
[0151] Получение кроличьих поликлональных антител против T. taeniaeformis. Экстракты червей (WE), продукт E/S и промывку червей (WW) T. taeniaeformis получали как описано выше. Кроликов иммунизировали WE T. taeniaeformis, E/S T. taeniaeformis или WW T. taeniaeformis как описано выше для продуцирования поликлональных антител, а именно, кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis, кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis и кроличьих pAb против WW T. taeniaeformis.
А. Начальная оценка с помощью ELISA-анализа, проводимого с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis и кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis
[0152] Для начальной оценки, проводимой с помощью ELISA-анализов на копроантиген, проводимых с использованием кроличьего pAb против WE T. taeniaeformis и кроличьего pAb против E/S T. taeniaeformis, тестировали экстракты кошачьих фекалий семи кошек, положительных по T. taeniaeformis, и шести кошек, отрицательных по T. taeniaeformis.
[0153] ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis: В этом ELISA-анализе, кроличье pAb против WE T. taeniaeformis наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE T. taeniaeformis и с цветовым субстратом. В этом анализе, все семь образцов, положительных по T. taeniaeformis, рассматривались как позитивные, а все шесть образцов, отрицательных по T. taeniaeformis, рассматривались как негативные. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность и специфичность ELISA-анализа, проводимого с использованием конъюгатов кроличьих pAb WE T. taeniaeformis, составляла 100%.
[0154] ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis: В этом ELISA-анализе, кроличье pAb против E/S T. taeniaeformis наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом кроличьего pAb против E/S T. taeniaeformis и с цветовым субстратом. В этом анализе, все семь образцов, положительных по T. taeniaeformis, рассматривались как позитивные, а все шесть образцов, отрицательных по T. taeniaeformis, рассматривались как негативные. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность и специфичность ELISA-анализа, проводимого с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis, составляла 100%.
В. Эффективность ELISA-анализа, проводимого с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis, на образцах фекалий собак и кошек
[0155] Эффективность ELISA-анализа на копроантиген, проводимого с использованием кроличьего pAb против WE T. taeniaeformis (как описано в разделе А) дополнительно оценивали на экстрактах фекалий собак и кошек. Набор собачьих образцов включал экстракты фекалий 31 собаки, положительных по T. taeniaeformis, и 74 собак, отрицательных по T. taeniaeformis. Набор кошачьих образцов включал экстракты фекалий 13 кошек, положительных по T. taeniaeformis, и 39 кошек, отрицательных по T. taeniaeformis.
[0156] Для собак, из 31 положительного образца, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 8 образцах. Из 74 отрицательных собачьих образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 6 образцах. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 25,8%, а специфичность составляла 91,9%.
[0157] Для кошек, из 13 положительных образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал в 12 образцах. Из 39 отрицательных образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WE T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 4 образцах. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 92,3%, а специфичность составляла 89,7%.
C. Эффективность ELISA-анализа, проводимого с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis, на образцах фекалий собак и кошек
[0158] Эффективность ELISA-анализа на копроантиген, проводимого с использованием кроличьего pAb против E/S T. taeniaeformis (как описано в разделе А), дополнительно оценивали на экстрактах фекалий собак и кошек. Набор собачьих образцов включал экстракты фекалий 31 собаки, положительных по T. taeniaeformis, и 74 собак, отрицательных по T. taeniaeformis. Набор кошачьих образцов включал экстракты фекалий 13 кошек, положительных по T. taeniaeformis, и 39 кошек, отрицательных по T. taeniaeformis.
[0159] Для собак, из 31 положительного образца, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 4 образцах. Из 74 отрицательных собачьих образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 1 образце. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 12,9%, а специфичность составляла 98,6%.
[0160] Для кошек, из 13 положительных образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал в 12 образцах. Из 39 отрицательных образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против E/S T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 3 образцах. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 92,3%, и специфичность составляла 92,3%.
D. Эффективность ELISA-анализа, проводимого с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WW T. taeniaeformis, на образцах фекалий собак и кошек
[0161] Эффективность ELISA-анализа на копроантиген, проводимого с использованием кроличьего pAb против WW T. taeniaeformis, оценивали на экстрактах фекалий собак и кошек. Набор собачьих образцов включал экстракты фекалий 31 собаки, положительных по T. taeniaeformis, и 74 собак, отрицательных по T. taeniaeformis. Набор кошачьих образцов включал экстракты фекалий 13 кошек, положительных по T. taeniaeformis, и 39 кошек, отрицательных по T. taeniaeformis.
[0162] Для собак, из 31 положительного образца, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WW T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 16 образцах. Из 74 отрицательных собачьих образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WW T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 3 образцах. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 51,6%, а специфичность составляла 98,6%.
[0163] Для кошек, из 13 положительных образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WW T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал в 12 образцах. Из 39 отрицательных образцов, ELISA-анализ, проводимый с использованием конъюгатов кроличьих pAb против WW T. taeniaeformis, давал позитивный сигнал только в 3 образцах. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 92,3%, а специфичность составляла 95,9%.
Пример 2В
[0164] Получение мышиных поликлональных и моноклональных антител против WE T. taeniaeformis и E/S T. taeniaeformis. Экстракт червей (WE) T. taeniaeformis и продукт E/S T. taeniaeformis получали как описано выше. Мышей иммунизировали WE T. taeniaeformis или E/S T. taeniaeformis, как описано выше для продуцирования мышиных поликлональных антител, а именно, мышиного pAb против WE T. taeniaeformis и мышиного pAb против E/S T. taeniaeformis. Эти поликлональные антитела специфически связываются с их соответствующими иммуногенами, если эти иммуногены были нанесены на микротитрационные планшеты.
А. Получение мшиного mAb против WE T. taeniaeformis
[0165] Гибридомы получали от мышей, иммунизованных WE Т. taeniaeformis, как описано выше. Из полученных гибридом, секретирующих мышиное моноклональное антитело (мышиное mAb), отбирали два мышиных mAb против WE Т. taeniaeformis, таких как ADX184 (IgG) и ADX185 (IgM), поскольку они давали мощный сигнал и низкий фон в ELISA-анализах.
B. Эффективность ELISA-анализа нп копроантиген, проводимого с использованием мышиных mAb против WE Т. taeniaeformis
[0166] Для оценки чувствительности был проведен сэндвич-ELISA-анализ на копроантиген с использованием ADX185, нанесенного на микротитрационный планшет, с последующим добавлением образца, взятого у пациента, а затем с добавлением конъюгата кроличьего pAb-ПХ против WE Т. taeniaeformis. Анализ проводили на FEX, полученных от 7 кошек, положительных по T. taeniaeformis, и 3 кошек, отрицательных по T. taeniaeformis. Как показано на фиг. 5, анализ выявил копроантиген в 7 из 7 позитивных образцов и ни в одном из 3 негативных образцов. Таким образом, в этом эксперименте, чувствительность ELISA-анализа, проводимого с использованием ADX185/кроличьего pAb-ПХ против WE Т. taeniaeformis составляла 100%.
[0167] Для оценки специфичности был проведен сэндвич-ELISA на копроантиген с использованием ADX184, нанесенного на микротитрационный планшет, и конъюгата ADX193-ПХ, нанесенного после добавления образца, взятого у пациента.
ADX193 представляет собой мышиное mAb против E/S T. taeniaeformis, описанное ниже. Анализ проводили на WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. crassiceps, WE T. taeniaeformis, E/S T. taeniaeformis, а также на экстрактах фекалий собак, положительных по D. caninum; собак, отрицательных по D. caninum; кошек, положительных по D. caninum; кошек, отрицательных по D. caninum; собак, положительных по T. pisiformis; собак, отрицательных по T. pisiformis; группы из трех кошек, положительных по T. taeniaeformis, и группы из трех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis. Вышеупомянутые WE использовали в концентрации 1 мкг/мл белка. Анализ дополнительно проводили на нескольких образцах WE при 10 мкг/мл белка и 2 мкг/мл белка. Образцы WE, имеющие эти более высокие концентрации, представляют собой WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. taeniaeformis, WE T. crassiceps, WE анкилостомы Ancylostoma caninum, WE круглых червей Toxocara canis и WE трихоцефала Trichuris vulpis. Среди этих образцов, как показано на фиг. 6, анализ был положительным только на WE Т. taeniaeformis (при 10 мкг/мл) и для группы кошек, положительных по T. taeniaeformis. Таким образом, ELISA-анализ на ADX184/ADX193-ПХ был в высокой степени специфичным в этом эксперименте.
C. Получение и скрининг мышиного mAb против E/S T. taeniaeformis
[0168] Гибридомы получали от мышей, иммунизованных E/S T. taeniaeformis, как описано выше. Из полученных гибридом, секретирующих мышиное моноклональное антитело (мышиное mAb), было отобраны пять ыышиных mAb против E/S T. taeniaeformis: ADX190, ADX191, ADX192, ADX193, ADX194. Эти пять мышиных mAb дополнительно оценивали на их эффективность в ELISA-анализе, если каждое из них было спарено с конъюгатом мышиного pAb-ПХ против E/S. Было проведено пять анализов на E/S T. taeniaeformis, то есть, анализов экстрактов фекалий семи кошек, положительных по T. taeniaeformis, и трех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis. В каждом из пяти анализов были детектированы все 7 позитивных кошачьих образцов. Каждый из них был также негативным для трех негативных кошачьих образцов, хотя ADX193 и ADX194 имели более высокий фон в одном из трех негативных кошачьих образцов.
Пример 2C
Эффективность ELISA, проводимого с использованием ADX184 с ADX193-ПХ
[0169] ELISA проводили с использованием ADX184, нанесенного на микротитрационные планшеты, и ADX193, конъюгированного с ПХ. Оба мышиных mAb использовали в концентрации 5 мкг/мл.
[0170] ELISA-анализ, проводимый с использованием ADX 184/ADX193-ПХ, осуществляли на экстрактах фекалий шести кошек, положительных по T. taeniaeformis, экстрактах фекалий четырех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis, и на одном образце белка E/S T. taeniaeformis. Как показано на фиг. 7, этот анализ выявил копроантиген во всех шести позитивных экстрактах фекалий и в образце E/S, но не обнаруживал копроантиген в любом из четырех негативных экстрактов фекалий.
[0171] ELISA-анализ, проводимый с использованием ADX 184/ADX193-ПХ, осуществляли на экстрактах фекалий 68 кошек, положительных по T. taeniaeformis, и 108 кошек, отрицательных по T. taeniaeformis, которые были положительными по D. caninum. Анализ давал позитивный сигнал в 55 из 68 образцов, позитивных по T. taeniaeformis (чувствительность 80,9%) и позитивный сигнал в 1 из 108 образцов, негативных по T. taeniaeformis (специфичность 99,1%; перекрестная реактивность с D. caninum, 0,9%).
Пример 2D
Эффективность ELISA, проводимого с использованием ADX191 с ADX194-ПХ
[0172] ELISA-анализ на копроантиген проводили с использованием ADX191, нанесенного на микротитрационные планшеты, и ADX194, конъюгированного с ПХ. Оба мышиных mAb использовали в концентрации 3 мкг/мл. ELISA-анализ проводили на экстрактах фекалий шести кошек, положительных по T. taeniaeformis, на экстрактах фекалий четырех кошек, отрицательных по T. taeniaeformis и на одном образце белка E/S T. taeniaeformis. Как показано на фиг. 8, этот анализ выявил копроантиген во всех шести позитивных экстрактах фекалий и в образце E/S, но не обнаруживал копроантиген в любом из четырех негативных экстрактов фекалий.
Пример 3А
A. Получение кроличьего pAb против растворимой фракции TCA Dipylidium caninum (кроличьего pAb против TCA D. caninum )
[0173] Фракцию TCA червей D. caninum получали как описано выше и использовали для иммунизации двух кроликов. Антисыворотку от одного из этих кроликов отбирали для дальнейшего анализа.
B. Оценка с помощью ELISA-анализа, проводимого с использованием кроличьего pAb против TCA D. caninum, на образцах, взятых у собак и кошек.
[0174] В этом ELISA-анализе на копроантиген, кроличье pAb против TCA D. caninum наносили на планшеты, подвеергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против TCA D. caninum и с цветовым субстратом как описано выше.
[0175] Для собак: ELISA-анализ, проводимый с использованием кроличьего pAb против TCA D. caninum, осуществляли на экстрактах фекалий 58 собак, положительных по D. caninum, и этот ELISA-анализ давал позитивный сигнал в 57 из 58 образцов. Этот анализ также проводили на экстрактах фекалий 27 собак, отрицательных по D. caninum; и этот ELISA давал позитивный сигнал в 8 из 27 образцов. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность анализа составляла 98,3%, а специфичность 70,4%.
[0176] Для кошек: ELISA-анализ, проводимый с использованием кроличьего pAb против TCA D. caninum, осуществляли на экстрактах фекалий 31 кошки, положительных по D. caninum, и этот ELISA-анализ давал позитивный сигнал в 28 из 31 образца. Этот анализ также проводили на экстрактах фекалий 13 кошек, отрицательных по D. caninum; и этот ELISA давал позитивный сигнал в 5 из 13 образцов. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность анализа составляла 90,3%, а специфичность 61,5%.
Пример 3В
A. Получение кроличьего pAb против фракции WE D. caninum (кроличьего pAb против WE D. caninum )
[0177] WE получали из червей D. caninum (Antibody Systems) как описано выше и использовали для иммунизации двух кроликов. Антисыворотку одного из этих кроликов отбирали для дальнейшего анализа.
В. Оценка, проводимая с помощью ELISA-анализа с использованием кроличьего pAb против WE D. caninum
[0178] В этом ELISA-анализе, кроличье pAb против WE D. caninum наносили на планшеты, подвеергали контактированию с FEX, при 5 мкг/мл, а затем с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE D. caninum при 3 мкг/мл и с цветовым субстратом как описано выше. Этот ELISA-анализ, проводимый с использованием кроличьего pAb против WE D. caninum, осуществляли на экстрактах червей, выделенных из гельминтов нескольких видов: WE D. caninum, WE T. pisiformis, WE T. crassiceps, WE анкилостом Ancylostoma caninum, WE круглых червей Toxocara canis и WE трихоцефала Trichuris vulpis. Как показано на фиг. 9, только WE D. caninum давал позитивный сигнал в этом ELISA-анализе, что указывает на специфичность такого анализа в этом эксперименте.
[0179] Эффективность ELISA-анализа, проводимого с использованием кроличьего pAb против WE D. caninum, оценивали в дополнительном эксперименте следующим образом. Анализ проводили на экстрактах фекалий 44 собак, положительных по D. caninum, и 48 собак, отрицательных по D. caninum. Этот анализ давал позитивный сигнал в 16 из 44 позитивных образцов, но не в одном из негативных образцов. Следовательно в этом эксперименте, чувствительность составляла 36,4%, а специфичность 100%.
Пример 3C
А. Получение кроличьего pAb против E/S D. caninum (кроличьего pAb против E/S D. caninum)
[0180] E/S получали из червей D. caninum у собак как описано выше и использовали для иммунизации двух кроликов. Антисыворотку одного из этих кроликов отбирали для дальнейшего анализа.
В. Оценка, проводимая с помощью ELISA-анализа с использованием кроличьего pAb против E/S D. caninum
[0181] В этом ELISA-анализе на копроантиген, кроличье pAb против E/S D. caninum наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против E/S D. caninum и с цветовым субстратом как описано выше.
[0182] Анализ проводили на экстрактах фекалий 7 собак, положительных по D. caninum. Этот анализ давал позитивный сигнал в 4 из 7 позитивных образцов. Этот анализ давал позитивный сигнал у 1 из четырех собак, отрицательных по D. caninum. Следовательно, в этом эксперименте, чувствительность составляла 57,1%, а специфичность 75%.
Пример 3D
A. Получение кроличьего mAb против WE D. caninum (кроличьего mAb против WE D. caninum)
[0183] WE получали из целых червей D. caninum собак как описано выше. Кроликов иммунизовали WE Dipylidium caninum в соответствии со стандартной процедурой иммунизации (SDIX, Windham, Maine, USA). После введения бустер-дозы по меньшей мере через 3 недели после первой иммунизации, пробу крови кролика использовали для продуцирования моноклональных антител (ImmunoPrecise Antibodies, Ltd. (IPA), Victoria, British Columbia, Canada). В-клетки кролика собирали, и супернатанты В-клеточной культуры оценивали на 96-луночных планшетах, покрытых WE D. caninum, и зондировали вторым антителом против кроличьих IgG. Приблизительно 50 мл супернатантов В-клеток из позитивных лунок тестировали на специфическое связывание во втором скрининге (IDEXX) с различными экстрактами фекалий. B-клетки наилучших 32 кандидатов этого второго скрининга хранили в буфере для лизиса в целях клонирования. Из этих 32 кандидатов выделяли РНК, и вариабельные области тяжелой и легкой (каппа) цепей крольчьего антитела клонировали в отдельные экспрессионные векторы млекопитающих (IPA). Супернатанты культур тканей, собранные из клеток млекопитающих, трансфецированных векторами тяжелой и легкой цепей антитела, были оценены снова для различных экстрактов фекалий. Наилучшие пять клонов рекомбинантных конструкций ДНК, кодирующих кроличье mAb, секвенировали (IPA). Два из этих пяти клонов кроличьих mAb, а именно, RDX13 и RDX12, были отобраны для дальнейшего анализа.
В. Оценка с помощью ELISA-анализа, проводимого с использованием кроличьего mAb против WE D. caninum, на образцах, взятых у собак и кошек.
[0184] В этой серии ELISA-анализов на копроантиген, мышиное mAb ADX226 наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатами RDX13-ПХ и/или RDX12-ПХ и с цветовым субстратом как описано выше.
[0185] В первом эксперименте, конъюгаты RDX13-ПХ и RDX12-ПХ смешивали и проводили анализ на экстрактах фекалий 38 собак, положительных по D. caninum, 28 собак, отрицательных по D. caninum, 20 кошек, положительных по D. caninum и 7 кошек, отрицательных по D. caninum. Этот анализ давал позитивный сигнал у 28 из 38 собак с положительным результатом, у 2 из 28 собак с отрицательным результатом, у 18 из 20 кошек с положительным результатом и ни у одной кошки из 7 кошек с отрицательным результатом. Таким образом, в этом эксперименте, анализ имеет чувствительность 73,7% и специфичность 92,9% для собачьих образцов и чувствительность 90,0% и специфичность 100% для кошачьих образцов.
[0186] Во втором, третьем и четвертом экспериментах, конъюгаты RDX13-ПХ и RDX12-ПХ использовали как отдельно, так и в смеси, и анализ проводили на экстрактах фекалий 37 собак, положительных по D. caninum, 28 собак, отрицательных по D. caninum, 21 кошки, положительных по D. caninum, и 7 кошек, отрицательных по D. caninum.
[0187] Во втором эксперименте, где RDX13-ПХ использовали отдельно, анализ дал позитивный сигнал у 20 из 37 собак с положительным результатом, у 1 из 28 собак с отрицательным результатом, у 15 из 21 кошки с положительным результатом и ни у одной кошки из 7 кошек с отрицательным результатом. Таким образом, в этом эксперименте, анализ имеет чувствительность 54,1% и специфичность 96,4% для собачьих образцов и чувствительность 71,4% и специфичность 100% для кошачьих образцов.
[0188] В третьем эксперименте, где RDX12-ПХ использовали отдельно, анализ дал позитивный сигнал у 13 из 37 собак с положительным результатом, у 1 из 28 собак с отрицательным результатом, у 16 из 21 кошки с положительным результатом и ни у одной кошки из 7 кошек с отрицательным результатом. Таким образом, в этом эксперименте, анализ имеет чувствительность 35,1% и специфичность 96,4% для собачьих образцов и чувствительность 76,2% и специфичность 100% для кошачьих образцов.
[0189] В четвертом эксперименте, где конъюгаты RDX13-ПХ и RDX12-ПХ смешивали, анализ давал позитивный сигнал у 22 из 37 собак с положительным результатом, у 1 из 28 собак с отрицательным результатом, у 19 из 21 кошки с положительным результатом и ни у одной кошки из 7 кошек с отрицательным результатом. Таким образом, в этом эксперименте, анализ имеет чувствительность 59,5% и специфичность 96,4% для собачьих образцов и чувствительность 90,5% и специфичность 100% для кошачьих образцов.
Пример 3Е
A. Получение мышиного pAb против WE D. caninum (мышиного pAb против WE D. caninum)
[0190] WE приготавливали из червей D. caninum собак как описано выше, и использовали для иммунизации мышей. Полученную антисыворотку, то есть, мышиное pAb против WE D. caninum, использовали в ELISA-эксперименте, описанном ниже.
B. Оценка, проводимая с помощью ELISA-анализа с использованием мышиного pAb против WE D. caninum на образцах, взятых у собак и кошек
[0191] В этом ELISA-анализе на копроантиген, мышиное pAb против WE D. caninum наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом мышиного pAb-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом как описано выше.
[0192] Этот анализ проводили на экстрактах фекалий четырех собак, положительных по D. caninum, и 3 кошек, положительных по D. caninum; одной кошки, отрицательной по D. caninum и инфицированной Giardia и T. taeniaeformis; одной кошки, отрицательной по D. caninum и инфицированной T. taeniaeformis; и одной собаки, инфицированной Toxocara и Taenia pisiformis. Как показано на фиг. 10, анализ дал положительный сигнал у 4 из 4 собак с положительным результатом, ни у одной собаки с отрицательным результатом, у 3 из 3 кошек с положительным результатом и ни у одной кошки из 2 кошек с отрицательным результатом. Следовательно, в этом эксперименте, анализ показал высокую степень специфичности и чувствительности.
Пример 3F
A. Получение мышиного mAb против растворимой фракции TCA D. caninum (мышиного mAb против TCA D. caninum )
[0193] Растворимую фракцию TCA получали из червей D. caninum от собак как описано выше, и использовали для иммунизации мышей (MBS). Селезенку иммунизованной мыши использовали для получения мышиного mAb, ADX251, которое использовали в следующих ELISA-экспериментах.
B. Оценка, проводимая с помощью ELISA-анализов с использованием мышиного mAb против TCA D. caninum на образцах, взятых у собак и кошек
[0194] В первой конфигурации ELISA на копроантиген, мышиное mAb ADX226 наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом мышиного mAb ADX251-ПХ и с цветовым субстратом.
[0195] Анализ проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum, 5 собак, отрицательных по D. caninum, 3 кошек, положительных по D. caninum и 1 кошки, отрицательной по D. caninum. Как показано на фиг. 11, анализ давал позитивный сигнал у 3 из 3 собак с положительным результатом, ни у одной собаки из пяти собак с отрицательным результатом, у 3 из 3 кошек с положительным результатом и ни у одной кошки с отрицательным результатом. Следовательно, в этом эксперименте, анализ показал высокую степень специфичности и чувствительности.
[0196] Во второй конфигурации ELISA на копроантиген, мышиное mAb ADX251 наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом мышиного mAb ADX227-ПХ и с цветовым субстратом. Анализ проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum; 5 собак, отрицательных по D. caninum; 3 кошек, положительных по D. caninum, и 1 кошки, отрицательной по D. caninum. Как показано на фиг. 12, анализ давал позитивный сигнал у 3 из 3 собак с положительным результатом, ни у одной собаки из пяти собак с отрицательным результатом, у 3 из 3 кошек с положительным результатом и ни у одной кошки с отрицательным результатом. Следовательно, в этом эксперименте, анализ показал высокую степень специфичности и чувствительности.
[0197] В третьей конфигурации ELISA на копроантиген, мышиное mAb ADX251 наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом. Анализ проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum; 5 собак, отрицательных по D. caninum; 3 кошек, положительных по D. caninum; и 1 кошки, отрицательной по D. caninum. Как показано на фиг. 13, анализ давал позитивный сигнал у 3 из 3 собак с положительным результатом, ни у одной собаки из пяти собак с отрицательным результатом, у 3 из 3 кошек с положительным результатом и ни у одной кошки с отрицательным результатом. Следовательно, в этом эксперименте, анализ показал высокую степень специфичности и чувствительности.
Пример 3G
A. Получение мышиного mAb против WE D. caninum (мышиного mAb против WE D. caninum)
[0198] WE D. caninum получали из червей D. caninum от собак как описано выше, и использовали для иммунизации мышей. От этих мышей были получены четыре моноклональных антитела (ADX224, ADX225, ADX226 и ADX227) как описано выше, и эти антитела были отобраны для последуюшего анализа.
B. Оценка, проводимая с помощью ELISA-анализов с использованием мышиного mAb против WE D. caninum на образцах, взятых у собак и кошек
[0199] ELISA-анализы в нижеследующих конфигурациях проводили на экстрактах фекалий 3 собак, положительных по D. caninum, 4 собак, отрицательных по D. caninum, 3 кошек, положительных по D. caninum, и 1 кошки, отрицательной по D. caninum.
[0200] В первой серии конфигураций ELISA на копроантиген, мышиные mAb против WE D. caninum отдельно наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатом кроличьего pAb-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом. Результаты представлены на фиг. 14. Таким образом, анализ, проводимый с использованием ADX224 на планшете, выявил копроантиген в 5 из шести позитивных образцов и его отсутствие во всех негативных образцах. Анализ, проводимый с использованием ADX225 на планшете, выявил копроантиген в 6 из шести позитивных образцов и его отсутствие во всех негативных образцах. Анализ, проводимый с использованием ADX226 на планшете, выявил копроантиген в 6 из шести позитивных образцов и его отсутствие во всех негативных образцах. Анализ, проводимый с использованием ADX227 на планшете, выявил копроантиген в шести из шести позитивных образцов и его отсутствие во всех негативных образцах.
[0201] Во второй серии конфигураций ELISA на копроантиген, каждое из четырех мышиных mAb против WE D. caninum отдельно наносили на планшеты, подвергали контактированию с FEX, а затем с конъюгатами мышиного mAb-ПХ против WE D. caninum и с цветовым субстратом. Результаты представлены на фиг. 15. Из этих тестируемых комбинаций было выбрано две пары. Анализ, проводимый с использованием ADX226 на планшете и ADX227-ПХ, выявил копроантиген в шести из шести позитивных образцов и его отсутствие во всех негативных образцах, а анализ, проводимый с использованием ADX227 на планшете и ADX227-ПХ, выявил копроантиген в шести из шести позитивных образцов и его отсутствие во всех негативных образцах. Такое успешное спаривание ADX227 с самим собой позволяет предположить, что копроантиген, детектируемый ADX227, содержит повторяющийся эпитоп.
Пример 3Н
А. Характеризация антигена: Гликозилирование антигенов, связанных с антителом ADX226 против D. caninum.
[0202] Для того, чтобы определить, является ли копроантиген, связанный с мышиным mAb ADX226 против WE D. caninum, гликозилированным, была протестирована способность 21 различных лектинов связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированными лектинами I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA). Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, ADX226 наносили на планшеты Immulon lb. В планшеты добавляли FEX собак, положительных или отрицательных по D. caninum. После промывки добавляли конъюгаты лектин:биотин, а затем стрептавидин-ПХ и цветовой субстрат. Результаты показаны на фиг. 16. В этом анализе нижеследующие лектины PSA, LCA, якалин, ECL, GSL1, RCA123 и WGA специфически и сильно связывались с ADX226 против копроантигена. Эти данные связывания с лектином показали, что копроантиген D. caninum, связанный с ADX226, является гликозилированным.
B. Характеризация антигена: гликозилирование антигенов, связанных с кроличьим pAb против WE D. caninum.
[0203] Для того, чтобы определить, является ли копроантиген, связанный с кроличьим pAb против WE D. caninum, гликозилированным, была протестирована способность 21 различных лектинов связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированными лектинами I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA). Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, кроличье pAb против WE D. caninum наносили на планшеты Immulon lb. В планшеты добавляли FEX собак, положительных или отрицательных по D. caninum. После промывки добавляли конъюгаты лектин:биотин, а затем стрептавидин-ПХ и цветовой субстрат. В этом анализе, нижеследующие лектины якалин, WGA, сукцинилированный WGA, GSL II связывались с кроличьим pAb против копроантигена WE D. caninum. Результаты показаны на фиг. 17. Эти данные связывания с лектином показали, что копроантиген D. caninum, связанный с кроличьим pAb против WE D. caninum, является гликозилированным. Эти данные также показали, что сэндвич-анализ, проводимый с использованием антитела-лектина, может быть применен для обнаружения копроантигена D. caninum.
С. Характеризация антигена: гликозилирование антигенов, связанных с антителами против D. caninum, а именно, с кроличьим pAb против WE D. caninum и ADX187
[0204] Был проведен анализ в аналогичной конфигурации для того, чтобы определить, является(ются) ли копроантиген(ы), связанный(ые) с кроличьим pAb против WE D. caninum, и ADX187 (мышиное mAb против WE D. caninum), гликозилированным(и), и в этом анализе была протестирована способность 21 различных лектинов связываться с копроантигеном с использованием коммерчески доступного набора (наборов с биотинилированными лектинами I, II и III от Vector Laboratories, Burlingame, CA). В этой конфигурации, 21 различных биотинилированных лектинов наносили на планшеты Immulon lb. В планшеты добавляли FEX собак, положительных или отрицательных по D. caninum. После промывки добавляли конъюгаты кроличьего pAb-ПХ или ADX187-ПХ против WE D. caninum, а затем стрептавидин-ПХ и цветовой субстрат. Результаты показаны на фиг. 18. В этом анализе, нижеследующие лектины: якалин, WGA и сукцинилированный WGA связывались с кроличьим pAb против копроантигена WE D. caninum. Та же самая серия лектинов: якалин, WGA и сукцинилированный WGA связывалась с ADX187 против копроантигена. Эти данные связывания с лектином подтверждают, что копроантиген(ы) D. caninum (s), связанный(е) с кроличьим pAb и ADX187 против WE D. caninum, является(ются) гликозилированным(и). Эти данные также показали, что сэндвич-анализ, проводимый с использованием антитела-лектина, может быть применен для обнаружения копроантигена D. caninum.
[0205] Дальнейшее тестирование на O-гликозилирование копроантигена, распознаваемого ADX226
В этом эксперименте, ADX226 наносили на микротитрационные планшеты, а затем добавляли FEX, якалин-биотин, стрептавидин-ПХ и, наконец, субстрат ПХ. FEX приготавливали из экстрактов фекалий 20 собак, положительных по D. caninum, 24 собак, отрицательных по D. caninum, 12 кошек, положительных по D. caninum, и 3 кошек, отрицательных по D. caninum. Анализ давал позитивный сигнал у 18 из 20 собак с положительным результатом (чувствительность 95%), ни у одной из 24 собак с отрицательным результатом (100% специфичность), у 11 из 12 кошек с положительным результатом (чувствительность 91,7%) и ни у одной из 3 кошек с отрицательным результатом (100% специфичность). Эти данные показали, что копроантиген, связанный с ADX226, является О-гликозилированным, и что сэндвич-иммуноанализ, проводимый с использованием антитела и лектина, может быть осуществлен для обнаружения копроантигена ленточных червей.
Пример 4
[0206] Ряд сэндвич-ELISA-анализов фекалий проводили в микротитрационных планшетах, по существу, как описано выше в разделе «Пример А» для подтверждения специфичности ELISA-анализов на детектирование ленточных червей T. pisiformis, ленточных червей T. taeniaeformis, ленточных червей D. caninum, анкилостомы Ancylostoma caninum (A. caninum), анкилостомы Ancylostoma tubaeforme (A. tubaeforme), круглых червей Toxocare canis (T. сanis), круглых червей Toxocara cati (T. cati), трихоцефала Trichuris vulpis (T. vulgaris), трихоцефала Trichuris felis (T. felis) и простейших Giardia Lamblia (Giardia).
[0207] В ELISA-анализах тестировали экстракты фекалий из следующих источников: собак, положительных по T. pisiformis (Фиг. 19, столбец 1), кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 19, столбец 2), собак, инфицированных D. caninum (фиг. 19, столбец 3), кошек, инфицированных D. caninum (Фиг. 19, столбец 4), собак, инфицированных анкилостомой A. caninum, (фиг. 19, столбец 5), кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme (Фиг. 19, столбец 6), собак, инфицированных круглыми червями T. canis, (фиг. 19, столбец 7), кошек, инфицированных круглыми червями T. cati (фиг. 19, столбец 8), собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis (фиг. 19, столбец 9), кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis (фиг. 19, столбец 10), собак, инфицированных Giardia (фиг. 19, столбец 11), кошек, инфицированных Giardia (фиг. 19, столбец 12), и двух кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, столбцы 13 и 14). На фиг. 19, в столбцах 1-12, представлено изображение одного микротитрационного планшета, а в столбцах 13 и 14 представлено изображение другого отдельного микротитрационного планшета.
[0208] ELISA-анализ на копроантиген ленточных червей T. pisiformis (фиг. 19, ряд А). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для выявления копроантигена T. pisiformis. Вкратце, mAb ADX131 наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом mAb ADX132-ПХ с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. ADX131 наносили в концентрации 3 мкг/мл. ADX132-ПХ использовали в концентрации 3 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген T. pisiformis дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. pisiformis. Однако, этот ELISA-анализ на T. pisiformis не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: кошек, инфицированных ленточными червями T. taeniaeformis; собак, инфицированных D. caninum; кошек, инфицированных D. caninum; собак, инфицированных анкилостомой A. caninum; кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme; собак, инфицированных круглыми червями T. canis; кошек, инфицированных круглыми червями T. cati; собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis; кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis; собак, инфицированных Giardia; кошек, инфицированных Giardia; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд А). Таким образом, этот ELISA-анализ на T. pisiformis специфически обнаруживал копроантиген T. pisiformis, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. taeniaeformis, ленточных червей D. caninum, анкилостомы A. caninum, круглых червей T. сanis, круглых червей T. cati, трихоцефала T. vulpis, трихоцефала T. felis, простейших Giardia Lamblia и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на Т. pisiformis был в высокой степени видоспецифическим. Этот ELISA-анализ на Т. pisiformis является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования или заражения T. pisiformis. Этот ELISA-анализ на Т. pisiformis может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию T. pisiformis от инфекции ленточными червями T. taeniaeformis, ленточными червями D. caninum, анкилостомой A. caninum, анкилостомой A. tubaeforme, круглыми червями T. сanis, круглыми червями T. cati, трихоцефалом T. vulpis, трихоцефалом T. felis, простейшими Giardia Lamblia, собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0209] ELISA-анализ на копроантиген ленточных червей T. taeniaeformis (фиг. 19, ряд В). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для выявления копроантигена Taenia taeniaeformis. Вкратце, mAb ADX184 наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом мышиного mAb ADX193-ПХ с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. ADX184 наносили в концентрации 5 мкг/мл. ADX193-ПХ использовали в концентрации 3 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген T. taeniaeformis дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. taeniaeformis. Однако, этот ELISA-анализ на T. taeniaeformis не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: кошек, инфицированных ленточными червями Taenia pisiformis; собак, инфицированных D. caninum; кошек, инфицированных D. caninum; собак, инфицированных анкилостомой A. caninum; кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme; собак, инфицированных круглыми червями T. canis; кошек, инфицированных круглыми червями T. cati; собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis; кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis; собак, инфицированных Giardia; кошек, инфицированных Giardia; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд В). Таким образом, этот ELISA-анализ на T. taeniaeformis специфически обнаруживал копроантиген T. taeniaeformis, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. pisiformi, ленточных червей D. caninum, анкилостомы A. caninum, анкилостомы A. tubaeforme, круглых червей T. сanis, круглых червей T. cati, трихоцефала T. vulpis, трихоцефала T. felis, простейших Giardia Lamblia и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на T. taeniaeformis был в высокой степени видоспецифическим. Этот ELISA-анализ на T. taeniaeformis является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования или заражения T. taeniaeformis. Этот ELISA-анализ на T. taeniaeformis может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию T. taeniaeformis от инфекции ленточными червями T. pisiformis, ленточными червями D. caninum, анкилостомой A. caninum, анкилостомой A. tubaeforme, круглыми червями T. сanis, круглыми червями T. cati, трихоцефалом T. vulpis, трихоцефалом T. felis, простейшими Giardia Lamblia, собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0210] ELISA-анализ на копроантиген ленточных червей D. caninum (фиг. 19, ряд C). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для выявления копроантигена D. caninum. Вкратце, mAb ADX226 наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом мышиного mAb RDX5-ПХ с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. ADX226 наносили в концентрации 3 мкг/мл. RDX5-ПХ использовали в концентрации 3 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген D. caninum дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных D. caninum, и кошек, инфицированных D. caninum. Однако, этот ELISA-анализ на D. caninum не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: собак, инфицированных ленточными червями T. pisiformis; кошек, инфицированных T. taeniaeformis, собак, инфицированных анкилостомой A. caninum; кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme; собак, инфицированных круглыми червями T. canis; кошек, инфицированных круглыми червями T. cati; собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis; кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis; собак, инфицированных Giardia; кошек, инфицированных Giardia; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд С). Таким образом, этот ELISA-анализ на D. caninum специфически обнаруживал копроантиген D. caninum, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. taeniaeformis; ленточных червей T. pisiformi, анкилостомы A. caninum, анкилостомы A. tubaeforme; круглых червей T. сanis; круглых червей T. cati; трихоцефала T. vulpis; трихоцефала T. felis; простейших Giardia Lamblia и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на D. caninum был в высокой степени видоспецифическим и является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования или заражения D. caninum. Этот ELISA-анализ на D. caninum может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию D. caninum от инфекции ленточными червями T. pisiformis, ленточными червями T. taeniaeformis, анкилостомой A. caninum, анкилостомой A. tubaeforme, круглыми червями T. сanis, круглыми червями T. cati, трихоцефалом T. vulpis, трихоцефалом T. felis, простейшими Giardia Lamblia; собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0211] ELISA-анализ на копроантиген анкилостомы Ancylostoma (фиг. 19, ряд D). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для выявления копроантигена A. caninum. Вкратце, кроличье поликлональное антитело против ASP5-l наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом мышиного mAb-ПХ против ASP5-l с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы как обсуждается в патенте США № 7951547, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки. Кроличье поликлональное антитело наносили в концентрации 5 мкг/мл. Мышиное mAb использовали в концентрации 4 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген Ancylostoma дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных D. caninum, и кошек, инфицированных A. tubaeforme. Однако, этот ELISA-анализ на Ancylostoma не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: собак, инфицированных ленточными червями T. pisiformis; кошек, инфицированных ленточными червями T. taeniaeformis; собак, инфицированных ленточными червями D. caninum; кошек, инфицированных ленточными червями D. caninum, собак, инфицированных круглыми червями T. canis; кошек, инфицированных круглыми червями T. cati;, собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis; кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis; собак, инфицированных Giardia; кошек, инфицированных Giardia; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд D). Следовательно, этот ELISA-анализ на Ancylostoma специфически обнаруживал копроантиген A. caninum и A. tubaeforme, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. taeniaeformis; ленточных червей T. pisiformi, ленточных червей D. caninum; круглых червей T. сanis; круглых червей T. cati; трихоцефала T. vulpis; трихоцефала T. felis; простейших Giardia Lamblia и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на Ancylostoma был в высокой степени специфическим и является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования или заражения анкилостомой A. caninum и A. tubaeforme. Кроме того, этот ELISA-анализ на Ancylostoma может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию анкилостомой A. caninum или A. tubaeforme от инфекции ленточными червями T. pisiformis, ленточными червями T. taeniaeformis, ленточными червями D. caninum; круглыми червями T. сanis, круглыми червями T. cati, трихоцефалом T. vulpis, трихоцефалом T. felis, простейшими Giardia Lamblia; собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0212] ELISA-анализ на копроантиген круглых червей Toxocara (фиг. 19, ряд Е). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для выявления копроантигена T. canis и T. cati. Вкратце, мышиное mAb против белка DIV6728C Т. canis наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом ПХ и другого мышиного mAb против белка DIV6728C Т. canis с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы как обсуждается в патенте США № 7951547, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки. ADX5 наносили в концентрации 6 мкг/мл. ADX10-ПХ использовали в концентрации 5 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген Toxocara дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. canis, и кошек, инфицированных T. cati. Однако, этот ELISA-анализ на Toxocara не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: собак, инфицированных ленточными червями T. pisiformis; кошек, инфицированных T. taeniaeformis; собак, инфицированных ленточными червями D. caninum; кошек, инфицированных ленточными червями D. caninum, собак, инфицированных анкилостомой A. caninum; кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme; собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis; кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis; собак, инфицированных Giardia; кошек, инфицированных Giardia; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд Е). Таким образом, этот ELISA-анализ на Toxocara специфически обнаруживал копроантиген Toxocara, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. taeniaeformis; ленточных червей T. pisiformis, ленточных червей D. caninum; анкилостомы A. caninum; анкилостомы A. tubaeforme; трихоцефала T. vulpis; трихоцефала T. felis; простейших Giardia Lamblia и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на Toxocara был в высокой степени специфическим и является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования или заражения T. canis и T. cati. Этот ELISA-анализ на круглые черви Toxocara может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию круглыми червями T. canis или T. cati от инфекции ленточными червями T. pisiformis, ленточными червями T. taeniaeformis, ленточными червями D. caninum; анкилостомой A. caninum; анкилостомой A. tubaeforme; трихоцефалом T. vulpis, трихоцефалом T. felis, простейшими Giardia Lamblia; собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0213] ELISA-анализ на копроантиген трихоцефала Trichuris (фиг. 19, ряд F).
[0214] Был проведен сэндвич-ELISA-анализ на копроантиген для выявления копроантигена T. vulpis. Вкратце, мышиное mAb против белка DIV6901 (ADX6) T. vulpis наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом ПХ и другого мышиного mAb против белка DIV6901 (ADX14) T. vulpis с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы как обсуждается в патенте США № 7951547, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки. ADX6 наносили в концентрации 3 мкг/мл. ADX10-ПХ использовали в концентрации 3 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген Trichuris дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. vulpis, и кошек, инфицированных T. felis. Однако, этот ELISA-анализ на Trichuris не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: собак, инфицированных ленточными червями T. pisiformis; кошек, инфицированных T. taeniaeformis; собак, инфицированных ленточными червями D. caninum; кошек, инфицированных ленточными червями D. caninum, собак, инфицированных анкилостомой A. caninum; кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme; собак, инфицированных круглыми червями T. canis; кошек, инфицированных круглыми червями T. cati; собак, инфицированных Giardia; кошек, инфицированных Giardia; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд F). Таким образом, этот ELISA-анализ на Trichuris специфически обнаруживал копроантиген T. vulpis и T. felis, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. taeniaeformis; ленточных червей T. pisiformis, ленточных червей D. caninum; анкилостомы A. caninum; анкилостомы A. tubaeforme; круглых червей T. canis; круглых червей T. cati; простейших Giardia Lamblia и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на Trichuris был в высокой степени специфическим и является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования или заражения T. vulpis и T. felis. Этот ELISA-анализ на трихоцефал Trichuris может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию трихоцефалом T. vulpis или T. felis от инфекции ленточными червями T. pisiformis, ленточными червями T. taeniaeformis, ленточными червями D. caninum; анкилостомой A. caninum; анкилостомой A. tubaeforme; круглыми червями T. canis; круглыми червями T. cati; простейшими Giardia Lamblia; собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0215] ELISA на копроантиген Giardia (Фиг. 19, ряд G). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для обнаружения копроантигена Giardia lamblia с использованием пары антител, которая специфически детектирует растворимый антиген (SNAP® Giardia Test, IDEXX Laboratories, Inc. Westbrook, ME, USA) (Olson ME, Leonard NJ, Strout J. Prevalence and Diagnosis of Giardia Infection In dogs and cats Using a coryal antigen test and fail mass. Can Vet J. 2010 Jun; 51 (6): 640-2. PMID: 20808578). Вкратце, кроличье поликлональное антитело против Giardia наносили на микротитрационные планшеты, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатом ПХ и мышиного моноклонального антитела против Giardia с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. Поликлональное антитело наносили в концентрации 3 мкг/мл. mAb-ПХ использовали в концентрации 3 мкг/мл. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген Giardia дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных Giardia, и кошек, инфицированных Giardia. Однако, этот ELISA-анализ на Giardia не обнаруживал копроантиген в FEX любого из следующих животных: собак, инфицированных ленточными червями T. pisiformis; кошек, инфицированных ленточными червями T. taeniaeformis; собак, инфицированных ленточными червями D. caninum; кошек, инфицированных ленточными червями D. caninum, собак, инфицированных анкилостомой A. caninum; кошек, инфицированных анкилостомой A. tubaeforme; собак, инфицированных круглыми червями T. canis; кошек, инфицированных круглыми червями T. cati; собак, инфицированных трихоцефалом T. vulpis; кошек, инфицированных трихоцефалом T. felis; и кошек, инфицированных парвовирусом (фиг. 19, ряд G). Таким образом, этот ELISA-анализ на Giardia специфически обнаруживал копроантиген Giardia lamblia, который не вступает в перекрестную реакцию с любым из нижеследующих копроантигенов: ленточных червей T. taeniaeformis; ленточных червей T. pisiformi, ленточных червей D. caninum; анкилостомы A. caninum; анкилостомы A. tubaeforme; круглых червей T. сanis; круглых червей T. cati; трихоцефала T. vulpis; трихоцефала T. felis; и кошачьего парвовируса. Таким образом, этот ELISA-анализ на Giardia был в высокой степени видоспецифическим и является подходящим для обнаружения или диагностики инфицирования Giardia lamblia. Этот ELISA-анализ на Giardia может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию Giardia lamblia от инфекции ленточными червями T. pisiformis, ленточными червями T. taeniaeformis, ленточными червями D. caninum; анкилостомой A. caninum; анкилостомой A. tubaeforme; круглыми червями T. сanis, круглыми червями T. cati, трихоцефалом T. vulpis, трихоцефалом T. felis; собачьим парвовирусом и кошачьим парвовирусом.
[0216] Статус положительного инфицирования кошек парвовирусом (фиг. 19, столбцы 13 и 14) был подтвержден с помощью анализа на парвовирус SNAP® (M. Abd-Eldaim, M. Beall and M. A. Kennedy. “Detection of feline panleukopenia virus using a commercial ELISA for canine parvovirus” Vet Ther. 2009 Winter; 10(4): E1-6) в соответствии с инструкциями производителей (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, USA). Этот мультиплексный ELISA-анализ фекалий позволяет одновременно осуществлять обнаружение ленточных червей T. pisiformis, ленточных червей T. taeneaeformis, ленточных червей D. caninum, анкилостомы A. caninum; анкилостомы A. tubaeforme; круглых червей T. canis; круглых червей T. cati; трихоцефала T. vulpis, трихоцефала T. felis и простейших Giardia Lamblia.
[0217] Эти данные показали, что способы согласно изобретению могут быть применены для облегчения обнаружения и видоспецифической дифференциации инфекций, вызываемых по меньшей мере восьмью различными кишечными паразитами.
Пример 5
[0218] Был разработан ряд ELISA-анализов фекалий, способных обнаруживать два или три вида ленточных червей рода Taenia, например, T. pisiformis, T. taeniaeformis и рода Dipylidium, например, D. caninum. ELISA проводили в микротитрационных планшетах, по существу, как описано выше в разделе «Пример A».
[0219] В ELISA-анализах были проанализировны экстракты фекалий от нижеследующих источников: четырех собак, положительных по T. pisiformis (фиг. 20, столбцы 1, 4, 7 и 10), четырех кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 20, столбцы 2, 5, 8 и 11), двух собак, инфицированных D. caninum (фиг. 20, столбцы 3 и 6), двух кошек, инфицированных D. caninum (фиг. 20, столбцы 9 и 12). На фиг. 20, столбцы 1-12 представляют изображение одного микротитрационного планшета.
[0220] ELISA-анализ на копроантиген для обнаружения ленточных червей рода Taenia (фиг. 20, ряд А). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для выявления копроантигена у животных, инфицированных ленточными червями Taenia. Вкратце, mAb ADX131 и mAb ADX184 наносили на микротитрационные планшеты в концентрации 3 мкг/мл, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатами mAb ADX132-ПХ и ADX193-ПХ в концентрации 3 мкг/мл каждого, с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. Результаты показали, что этот ELISA-анализ на копроантиген Taenia дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. pisiformis (фиг. 20, ряд А, столбцы 1, 4, 7 и 10), и кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 20, ряд А, столбцы 2, 5, 8 и 11). Однако, этот ELISA-анализ на Taenia не обнаруживал копроантиген в FЕХ у собак, инфицированных ленточными червями D. caninum (фиг. 20, ряд А, столбцы 3 и 6), или кошек, инфицированных D. caninum (фиг. 20, ряд А, столбцы 9 и 12). Следовательно, этот ELISA-анализ на Taenia позволяет специфически обнаруживать копроантиген T. pisiformis и T. taeniaeformis, который перекрестно на реагирует с копроантигеном D. caninum. Этот ELISA-анализ на Taenia является подходящим для выявления или диагностики инфицирования или заражения одним или более ленточными червями Taenia, включая Т. pisiformis и T. taeniaeformis. Этот ELISA-анализ на Taenia может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию одним или более ленточными червями Taenia, включая Т. pisiformis и T. taeniaeformis, от инфекции ленточными червями Dipylidium, включая D. caninum.
[0221] ELISA-анализ на копроантиген для обнаружения ленточных червей Т. pisiformis и D. caninum (фиг. 20, ряд В). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для обнаружения копроантигена у животных, инфицированных ленточными червями Т. pisiformis и D. caninum. Вкратце, mAb ADX131 и mAb ADX226 наносили на микротитрационные планшеты в концентрации 3 мкг/мл, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатами mAb ADX132-ПХ и mAb RDX5-ПХ в концентрации 3 мкг/мл каждого, с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. Результаты показали, что этот ELISA-анализ дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. pisiformis (фиг. 20, ряд D, столбцы 1, 4, 7 и 10), собак, инфицированных ленточными червями D. caninum (фиг. 20, ряд В, столбцы 3 и 5) и кошек, инфицированных D. caninum (фиг. 20, ряд В, столбцы 9 и 12). Однако, этот ELISA-анализ не обнаруживал копроантиген в FЕХ у кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 20, ряд В, столбцы 2, 5, 8 и 11). Следовательно, этот ELISA-анализ позволяет специфически обнаруживать копроантиген T. pisiformis и D. caninum, который перекрестно на реагирует с копроантигеном T. taeniaeformis. Этот ELISA-анализ является подходящим для выявления или диагностики инфицирования или заражения ленточными червями Т. pisiformis и/или D. caninum и может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию ленточными червями T. pisiformis и/или D. caninum от инфекции ленточными червями T. taeniaeformis.
[0222] ELISA-анализ на копроантиген для обнаружения ленточных червей T. taeniaeformis и D. caninum (фиг. 20, ряд С). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для обнаружения копроантигена у животных, инфицированных ленточными червями T. taeniaeformis и D. caninum. Вкратце, mAb ADX184 и mAb ADX226 наносили на микротитрационные планшеты в концентрации 3 мкг/мл, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатами mAb ADX193-ПХ и RDX5-ПХ в концентрации 3 мкг/мл каждого, с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. Результаты показали, что этот ELISA-анализ дает позитивный сигнал для FEX от кошек, инфицированных T. taeniaeformis (фиг. 20, ряд С, столбцы 2, 5, 8 и 11), собак, инфицированных ленточными червями D. caninum (фиг. 20, ряд С, столбцы 3 и 6), и кошек, инфицированных D. caninum (фиг. 20, ряд С, столбцы 9 и 12). Однако, этот ELISA-анализ не обнаруживал копроантиген в FЕХ у собак, инфицированных T. pisiformis (фиг. 20, ряд С, столбцы 1, 4, 7 и 10). Следовательно, этот ELISA-анализ позволяет специфически обнаруживать копроантиген T. taeniaeformis и D. caninum, который перекрестно на реагирует с копроантигеном T. pisiformis. Этот ELISA-анализ является подходящим для выявления или диагностики инфицирования или заражения ленточными червями T. taeniaeformis и/или D. caninum и может быть использован для того, чтобы отличать инфекцию ленточными червями T. taeniaeformis и/или D. caninum от инфекции ленточными червями T. pisiformis.
[0223] ELISA-анализ на копроантиген для обнаружения ленточных червей T. pisiformis, T. taeniaeformis и D. caninum (фиг. 20, ряд D). Был проведен сэндвич-ELISA-анализ для обнаружения копроантигена у животных, инфицированных ленточными червями T. pisiformis, T. taeniaeformis и D. caninum. Вкратце, mAb ADX131, mAb ADX184 и mAb ADX226 наносили на микротитрационные планшеты в концентрации 3 мкг/мл, инкубировали с экстрактом фекалий, а затем инкубировали с конъюгатами mAb ADX132-ПХ, mAb ADX193-ПХ и RDX5-ПХ в концентрации 3 мкг/мл каждого, с последующим детектированием с использованием субстрата пероксидазы. Результаты показали, что этот ELISA-анализ дает позитивный сигнал для FEX от собак, инфицированных T. pisiformis (фиг. 20, ряд D, столбцы 1, 4, 7 и 10), кошек, инфицированных ленточными червями T. taeniaeformis (фиг. 20, ряд D, столбцы 2, 5, 8 и 11), собак, инфицированных ленточными червями D. caninum (фиг. 20, ряд D, столбцы 3 и 6), и кошек, инфицированных D. caninum (фиг. 20, ряд D, столбцы 9 и 12). Следовательно, этот ELISA-анализ позволяет обнаруживать копроантиген T. pisiformis, T. taeniaeformis и D. caninum. Этот ELISA-анализ является подходящим для выявления или диагностики инфицирования или заражения ленточными червями T. pisiformis, T. taeniaeformis и/или D. caninum. Полученные данные показали, что этот анализ ELISA может быть использован для облегчения обнаружения инфекции, вызываемой ленточными червями Taenia и/или Dipylidium у собак и кошек.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Комплексное противопаразитарное средство для защиты животных | 2022 |
|
RU2782929C1 |
| АМИДОАЦЕТОНИТРИЛЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПЕСТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2010 |
|
RU2546871C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЯЙЦА ПАРАЗИТОВ, И СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ ЯИЦ ПАРАЗИТОВ | 2006 |
|
RU2440818C2 |
| НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК ПРОСТЕЙШИХ И ГЕЛЬМИНТОВ | 2022 |
|
RU2793208C1 |
| ЭНДОПАРАЗИТИЦИДНОЕ СРЕДСТВО | 2006 |
|
RU2417101C2 |
| ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ПАРВОВИРУСА СОБАК | 2008 |
|
RU2519210C2 |
| Способ получения[5(6)-(1Н-азол-1-ил-метил)-бензимидазол]карбаматов | 1989 |
|
SU1706389A3 |
| АТТЕНУИРОВАННЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПАРВОВИРУС, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ СОБАК ОТ ИНФИЦИРОВАНИЯ ПАРВОВИРУСОМ | 2011 |
|
RU2527157C2 |
| Штамм "Арчи" вируса Carnivore protoparvovirus 1 парвовирусного энтерита собак для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики парвовирусного энтерита собак | 2023 |
|
RU2817267C1 |
| Средство для лечения и профилактики нематодозов и цестодозов у мелких домашних животных | 2019 |
|
RU2722272C1 |
Изобретение относится к биотехнологии, в частности раскрыты способы, устройства, наборы и композиции для обнаружения присутствия или отсутствия одного или более копроантигенов ленточных червей в образце. Способы, устройства, наборы и композиции согласно изобретению могут быть использованы для подтверждения присутствия или отсутствия ленточных червей в образце фекалий млекопитающего, а также позволяют отличать различные виды ленточных червей при наличии одной или более инфекций, вызываемых гельминтами (такими как круглые черви, анкилостомы, трихоцефалы и аскариды), Giardia и парвовирусом. Подтверждение наличия или отсутствия ленточного червя у млекопитающего может быть осуществлено, например, в целях выбора оптимального курса лечения млекопитающего и/или для того, чтобы подтвердить уничтожение инфекции у млекопитающего после лечения. 6 н. и 88 з.п. ф-лы, 20 ил., 5 пр.
1. Способ обнаружения присутствия или отсутствия одного или более антигенов плоских гельминтов в образце фекалий, включающий:
(а) контактирование образца фекалий млекопитающего с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из:
(i) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя;
(ii) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и
(iii) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя;
(b) детекцию присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются.
2. Способ диагностики инфицирования млекопитающего одним или более плоскими гельминтными червями, включающий стадии:
(а) контактирования образца фекалий млекопитающего с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из:
(i) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя;
(ii) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и
(iii) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя; и
(b) образования комплексов антитело-копроантиген в присутствии копроантигенов, если они образуются в образце;
(c) детекции присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются; и
(d) диагностики наличия у млекопитающего:
(i) инфекции первым ленточным червем, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против первого ленточного червя;
(ii) инфекции вторым ленточным червем, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против второго ленточного червя; и
(iii) инфекции третьим ленточным червем, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против третьего ленточного червя.
3. Способ диагностики и лечения млекопитающего, инфицированного одним или более плоскими гельминтными червями, включающий стадии:
(а) контактирования образца фекалий млекопитающего с одним или более антителами, выбранными из группы, состоящей из:
(i) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя;
(ii) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и
(iii) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя; и
(b) образования комплексов антитело-копроантиген в присутствии копроантигенов, если они образуются в образце;
(c) детекции присутствия или отсутствия комплексов антитело-копроантиген, если они образуются; и
(d) диагностики наличия у млекопитающего:
(i) инфекции первым ленточным червем, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против первого ленточного червя;
(ii) инфекции вторым ленточным червем, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против второго ленточного червя; и
(iii) инфекции третьим ленточным червем, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против третьего ленточного червя; и
(е) введения эффективного количества одного или более терапевтических средств для лечения млекопитающего, имеющего инфекцию первым ленточным червем, инфекцию вторым ленточным червем или инфекцию третьим ленточным червем или их комбинацию.
4. Способ по п. 3, где стадия (е) дополнительно включает введение одного или более дополнительных терапевтических средств для: (а) лечения инфекции одним или более паразитическими гельминтными червями, одним или более паразитами, не являющимися червями, одним или более вирусами, одним или более грибками, одним или более простейшими или одной или более бактериями.
5. Способ по любому из пп. 3 или 4, где стадия (е) дополнительно включает введение одного или более терапевтических средств для (b) ликвидации, отпугивания или уничтожения промежуточного хозяина паразитических плоских гельминтных червей, паразитических гельминтных червей, паразитов, не являющихся червями, вирусов, грибков, простейших или бактерий.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где образец фекалий получают от млекопитающего, которое является собакой или кошкой.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где первым ленточным червем является Taenia pisiformis.
8. Способ по п. 7, где первое антитело не вступает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: ленточных червей Taenia taeniaeformis, ленточных червей Dipylidium, анкилостомы, круглых червей, трихоцефала, Giardia и парвовируса.
9. Способ по п. 8, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
10. Способ по п. 9, где ленточные черви Dipylidium представляет собой Dipylidium caninum; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где второй ленточный червь представляет собой Taenia taeniaeformis.
12. Способ по п. 11, где второе антитело не вступает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: копроантигена ленточных червей Taenia taeniaeformis, копроантигена ленточных червей Dipylidium, копроантигена анкилостомы, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена Giardia и копроантигена парвовируса.
13. Способ по п. 12, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
14. Способ по п. 13, где ленточные черви Dipylidium представляет собой Dipylidium caninum; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где третий ленточный червь представляет собой Dipylidium caninum.
16. Способ по п. 15, где третье антитело не вступает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: копроантигена ленточных червей Taenia, копроантигена анкилостомы, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена Giardia и копроантигена парвовируса.
17. Способ по п. 16, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
18. Способ по п. 17, где ленточные черви Taenia представляет собой Taenia pisiformis или Taenia taeniaeformis; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
19. Способ по любому из пп. 1-6, где первый ленточный червь и второй ленточный червь принадлежат к виду Taenia.
20. Способ по любому из пп. 1-6, где первый ленточный червь представляет собой Taenia pisiformis, а второй ленточный червь представляет собой Dipylidium caninum.
21. Способ по любому из пп. 1-6, где первый ленточный червь и второй ленточный червь принадлежат к виду Taenia, а третий ленточный червь представляет собой Dipylidium caninum.
22. Способ по любому из пп. 1-6, где первый ленточный червь представляют собой Taenia pisiformis, второй ленточный червь представляет собой Taenia taeniaeformis, а третий ленточный червь представляет собой Dipylidium caninum.
23. Способ по любому из пп. 1-6, где первое, второе и третье антитела специфически не связываются с каким-либо копроантигеном, происходящим по меньшей мере от одного червя, выбранного из группы, состоящей из круглых червей, трихоцефала и анкилостомы.
24. Способ по п. 23, где круглые черви представляют собой Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara vitulorum, Toxascaris leonina, Baylisascaris procyonis, Ascaridia galli, Parascaris equorum, Ascaris suum, Ascaris lumbricoides, Anisakis simplex или Pseudoterranova decipiens.
25. Способ по п. 23, где трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis, Trichuris campanula, Trichuris serrata, Trichuris felis, Trichuris suis, Trichuris trichiura, Trichuris discolor или Trichocephalus trichiuris.
26. Способ по п. 23, где анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenal, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma tubaeforme, Ancylostoma pluridentatum, Necator americanus или Uncinaria stenocephala.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где группа стадии (а) дополнительно состоит из:
(i) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном круглых червей, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, анкилостомы, ленточного червя, Giardia и парвовируса;
(ii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном трихоцефала, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из круглых червей, анкилостомы, ленточных червей, Giardia и парвовируса; и
(iii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном анкилостомы, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, круглых червей, ленточных червей, Giardia и парвовируса;
(iv) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном Giardia, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена парвовируса; и
(v) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном парвовируса, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена Giardia.
28. Способ по п. 27, где анкилостомы представляют собой Ancylostoma, круглые черви представляют собой Toxocara, а трихоцефал представляет Собой Trichuris.
29. Способ по п. 28, где анкилостомы представляют собой Ancylostoma caninum или Ancylosloma tubaeforme; круглые черви представляют собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia; а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
30. Способ по любому из пп. 2-29, где стадия (d) дополнительно включает диагностику:
(iv) инфицирования круглыми червями, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против круглых червей,
(v) инфицирования трихоцефалом, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против трихоцефала;
(vi) инфицирования анкилостомой, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против анкилостомы;
(vii) инфицирования Giardia, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против Giardia; и
(viii) инфицирования парвовирусом, если присутствует комплекс антитело-копроантиген против парвовируса.
31. Способ по любому из пп. 1-30, где образец фекалий подвергают контактированию с двумя или более антителами, тремя или более антителами, четырьмя или более антителами, пятью или более антителами, шестью или более антителами, семью или более антителами или восьмью или более антителами.
32. Способ по любому из пп. 1-31, где стадия детекции присутствия или отсутствия комплексов дополнительно включает стадию получения по меньшей мере одного второго антитела, которое связывается с одним или более комплексами.
33. Способ по п. 32, где второе антитело является меченным или присоединенным к твердому носителю.
34. Способ по любому из пп. 1-32, где одно или более из первого, второго и третьего антител являются меченными.
35. Способ по любому из пп. 1-32, где первое, второе и третье антитела иммобилизованы на твердом носителе.
36. Способ по п. 30, где одно или более антител, способных специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антител, способных специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антител, способных специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антител, способных специфически связываться с копроантигеном Giardia; и антител, способных специфически связываться с копроантигеном парвовируса, являются меченными.
37. Способ по п. 30, где антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia; и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, иммобилизованы на твердом носителе.
38. Способ по любому из пп. 35 или 37, где твердый носитель образует часть устройства для твердофазного иммуноферментного анализа.
39. Способ по п. 38, где устройство для твердофазного иммуноферментного анализа представляет собой устройство для иммуноанализа с боковым потоком.
40. Способ по любому из пп. 1-39, дополнительно включающий стадию контактирования образца с одним или более реагентами для выявления одной или более групп, состоящих из: одного или более паразитических гельминтных червей; одного или более паразитов, не являющихся червями; одного или более вирусов; одного или более грибков; одного или более простейших и одной или более бактерий.
41. Способ по п. 40, где реагенты содержат одно или более антител или один или более антигенов, распознаваемых антителами, специфичными к одному или более паразитическим гельминтным червям; к паразитам, не являющимся червями; к одному или более вирусам; к одному или более грибкам; к одному или более простейшим или к одной или более бактериям.
42. Способ по любому из пп. 40 или 41, где один или более паразитических гельминтных червей включают по меньшей мере один из круглых червей, трихоцефалов, анкилостом и аскарид.
43. Способ по п. 41, где один или более реагентов представляют собой антитело, которое специфически связывается с копроантигеном паразитов Giardia, не являющихся червями.
44. Способ по п. 43, где Giardia представляет собой Giardia lamblia.
45. Способ по п. 44, где антитело не связывается с копроантигеном, происходящим от Т. pisiformis, Taenia taeniaeformis, D. caninum, A. caninum, которыми были инфицированы собаки, A. tubaeforme, T. canis, T. cati, T. vulpis, T. felis и парвовируса.
46. Способ по любому из пп. 1-45, дополнительно включающий стадию определения присутствия или отсутствия нуклеиновой кислоты круглых червей, трихоцефала или анкилостомы.
47. Способ по п. 46, где стадию определения присутствия или отсутствия нуклеиновой кислоты проводят с помощью анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
48. Способ по любому из пп. 1-47, где по меньшей мере один из копроантигенов является гликозилированным.
49. Способ по любому из пп. 1-48, где стадия детекции присутствия или отсутствия комплексов дополнительно включает стадию получения одного или более лектинов, которые связываются по меньшей мере с одним из комплексов.
50. Способ по п. 49, где лектин детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе.
51. Способ по п. 49, где первое, второе, третье антитела; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia, и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе.
52. Способ по любому из пп. 48 или 49, где первое, второе и третье антитела; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia, и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, иммобилизуют на твердом носителе, а лектин подвергают детектируемому мечению.
53. Способ по любому из пп. 48 или 49, где первое, второе и третье антитела; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia, и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, подвергают детектируемому мечению, а лектин иммобилизуют на твердом носителе.
54. Способ по п. 48, где перед стадией контактирования образца фекалий млекопитающего с одним или более антителами, дополнительно проводят стадию контактирования образца фекалий с одним или более лектинами.
55. Способ по п. 54, где один или более лектинов детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе.
56. Способ по п. 54, где первое антитело, второе антитело, третье антитело; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia, и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, детектируемо метят или иммобилизуют на твердом носителе.
57. Способ по п. 54, где первое антитело, второе антитело и третье антитело; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia, и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, иммобилизуют на твердом носителе, а один или более лектинов подвергают детектируемому мечению.
58. Способ по п. 54, где первое антитело, второе антитело и третье антитело; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном круглых червей; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном трихоцефала; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном анкилостомы; антитело, способное специфически связываться с копроантигеном Giardia, и антитело, способное специфически связываться с копроантигеном парвовируса, подвергают детектируемому мечению, а один или более лектинов иммобилизуют на твердом носителе.
59. Устройство для обнаружения присутствия или отсутствия одного или более копроантигенов ленточных червей в образце фекалий, где указанное устройство содержит твердый носитель, который имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из:
(а) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя;
(b) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и
(c) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя.
60. Устройство для обнаружения присутствия или отсутствия одного или более копроантигенов ленточных червей в образце фекалий, где указанное устройство содержит твердую подложку, один или более лектинов и одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из:
(а) первого антитела, способного специфически связываться с копроантигеном первого ленточного червя, но не с копроантигеном второго ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя;
(b) второго антитела, способного специфически связываться с копроантигеном второго ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном третьего ленточного червя; и
(c) третьего антитела, способного специфически связываться с копроантигеном третьего ленточного червя, но не с копроантигеном первого ленточного червя или с копроантигеном второго ленточного червя,
где твердая подложка имеет иммобилизованные на нем один или более лектинов или одно или более антител.
61. Устройство по п. 60, где твердая подложка имеет иммобилизованные на нем два или более антител.
62. Устройство по п. 60, где один или более лектинов иммобилизованы на твердом носителе.
63. Устройство по любому из пп. 59 или 60, дополнительно включающее (d) один или более типов копроантигена Giardia, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала и/или копроантигена анкилостомы, где копроантиген круглых червей, копроантиген трихоцефала и/или копроантиген анкилостом одного или более типов специфически связаны с антителами.
64. Устройство по любому из пп. 59 или 60, где твердый носитель имеет иммобилизованные на нем два или более антител.
65. Устройство по любому из пп. 59-64, дополнительно содержащее антиген ленточных червей одного или более видов, где антиген ленточных червей одного или более видов специфически связан с антителами.
66. Устройство по любому из пп. 59-65, где
(а) первое антитело было индуцировано против экстракта целого червя первого вида, продукта E/S ленточного червя первого вида, промывки ленточного червя первого вида или растворимого продукта TCA ленточного червя первого вида.
(b) второе антитело было индуцировано против экстракта целого червя второго вида, продукта E/S ленточного червя второго вида, промывки ленточного червя первого вида или растворимого продукта TCA ленточного червя второго вида; или
(с) третье антитело было индуцировано против экстракта целого червя третьего вида, продукта E/S ленточного червя третьего вида, промывки ленточного червя первого вида или растворимого продукта TCA ленточного червя третьего вида;
67. Устройство по любому из пп. 59-66, где ленточный червь первого вида представляет собой Taenia pisiformis.
68. Устройство по п. 67, где первое антитело не вступает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: копроантигена ленточных червей Taenia taeniaeformis, копроантигена ленточных червей Dipylidium, копроантигена анкилостомы, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена Giardia и копроантигена парвовируса.
69. Устройство по п. 68, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
70. Устройство по п. 68, где ленточные черви Dipylidium представляют собой Dipylidium caninum; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
71. Устройство по любому из пп. 59-70, где ленточный червь второго вида представляет собой Taenia taeniaeformis.
72. Устройство по п. 71, где второе антитело не вступает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: копроантигена ленточных червей Taenia pisiformis, копроантигена ленточных червей Dipylidium, копроантигена анкилостомы, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена Giardia и копроантигена парвовируса.
73. Устройство по п. 72, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
74. Устройство по п. 72, где ленточные черви Dipylidium представляют собой Dipylidium caninum; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
75. Устройство по любому из пп. 59-74, где ленточный червь третьего вида представляет собой Dipylidium caninum.
76. Устройство по п. 75, где третье антитело не вступает в специфическую перекрестную реакцию с одним или более копроантигенами, выбранными из группы, состоящей из: копроантигена ленточных червей Taenia, копроантигена анкилостомы, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена Giardia и копроантигена парвовируса.
77. Устройство по п. 76, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
78. Устройство по п. 76, где ленточные черви Taenia представляют собой Taenia pisiformis или Taenia taeniaeformis; анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
79. Устройство по любому из пп. 59-66, где ленточные черви первого и второго видов представляют собой Taenia.
80. Устройство по п. 59-66, где ленточные черви первого вида представляют собой Taenia pisiformis, а ленточные черви второго вида представляют собой Taenia taeniaeformis.
81. Устройство по любому из пп. 59-66, где ленточные черви первого и второго видов представляют собой Taenia, а ленточные черви третьего вида представляют собой Dipylidium caninum.
82. Устройство по любому из пп. 59-66, где ленточные черви первого вида представляют собой Taenia pisiformis, ленточные черви второго вида представляют собой Taenia taeniaeformis, а ленточные черви третьего вида представляют собой Dipylidium caninum.
83. Устройство по п. 82, где первое, второе и третье антитела специфически не связываются с каким-либо копроантигеном, происходящим по меньшей мере от одного члена, выбранного из группы, состоящей из: копроантигена анкилостомы, копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена Giardia и копроантигена парвовируса.
84. Устройство по любому из пп. 59-83, где устройство дополнительно включает один или более реагентов для обнаружения одной или более групп, состоящих из: одного или более паразитических гельминтных червей; одного или более паразитов, не являющихся червями; одного или более вирусов; одного или более грибков; одного или более простейших и одной или более бактерий.
85. Устройство по любому из пп. 59-84, где твердый носитель дополнительно имеет иммобилизованные на нем одно или более антител, выбранных из группы, состоящей из:
(i) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном круглых червей, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, анкилостомы, ленточного червя, Giardia и парвовируса;
(ii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном трихоцефала, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из круглых червей, анкилостомы, ленточных червей, Giardia и парвовируса; и
(iii) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном анкилостомы, но не с копроантигеном, происходящим от группы, состоящей из трихоцефала, круглых червей, ленточных червей, Giardia и парвовируса;
(iv) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном Giardia, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена парвовируса; и
(v) антитела, способного специфически связываться с копроантигеном парвовируса, но не с копроантигеном, выбранным из группы, состоящей из копроантигена круглых червей, копроантигена трихоцефала, копроантигена анкилостомы, копроантигена ленточного червя Taenia, копроантигена ленточного червя Dipylidium и копроантигена Giardia.
86. Устройство по п. 85, где твердый носитель содержит два или более антител, три или более антител, четыре или более антител, пять или более антител, шесть или более антител, семь или более антител или восемь или более антител.
87. Устройство по п. 85, где анкилостомой является Ancylostoma, круглыми червями являются Toxocara, а трихоцефалом является Trichuris.
88. Устройство по п. 87, где анкилостома представляет собой Ancylostoma caninum или Ancylostoma tubaeforme; круглый червь представляет собой Toxocara canis или Toxocara cati; трихоцефал представляет собой Trichuris vulpis или Trichuris felis; Giardia представляет собой Giardia lamblia, а парвовирус представляет собой кошачий парвовирус или собачий парвовирус.
89. Устройство по любому из пп. 59-88, где указанное устройство представляет собой устройство для твердофазного иммуноферментного анализа.
90. Устройство по п. 89, где устройство для твердофазного иммуноферментного анализа представляет собой устройство для иммуноанализа с боковым потоком.
91. Устройство по любому из пп. 59-90, где образец берут у собак или кошек.
92. Устройство по любому из пп. 59-91, где по меньшей мере один из копроантигенов является гликозилированным.
93. Набор для обнаружения одного или более копроантигенов плоских гельминтов в образце, взятом у млекопитающего, где указанный набор содержит устройство по п. 59-92 и один или более реагентов, достаточных для обнаружения одного или более копроантигенов.
94. Набор по п. 93, где один или более реагентов выбраны из группы, состоящей из одного или более индикаторных реагентов; одного или более антител для мечения соединений; одного или более антител; одного или более реагентов для захвата антигена; одного или более ингибиторов и одного или более промывочных реагентов.
| Киров Р | |||
| Ф | |||
| Использование экспресс-теста для выявления антигенов D | |||
| Immitis //Вестник Совета молодых ученых Рязанского государственного агротехнологического университета имени ПА Костычева | |||
| Способ получения цианистых соединений | 1924 |
|
SU2018A1 |
| - С | |||
| Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Lloyd S., Soulsby E | |||
| J | |||
| The role of IgA immunoglobulins in the passive transfer of protection to Taenia | |||
