СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ ЛИМФОЦИТОВ НА РАЗВИТИЕ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использовано для определения участия лимфоцитов в дисфункции эндотелия, а также в научно-медицинских целях для оценки межклеточных взаимодействий в развитии дисфункции эндотелия.

Мембран-высвобожденные микрочастицы обладают большим спектром возможных воздействий, включая взаимодействия с клетками крови и сосудистой стенки, влияние на иммунную систему, систему гемостаза.

Известен способ диагностики системного воспалительного ответа организма при критических состояниях (Патент РФ №2328219, А61В 10/00, 10.07.2008), оценивающий нарушения мембран-цитоскелетных взаимоотношений в лимфоцитах по блеббингу, в результате чего рассчитывают индекс блеббинга лимфоцитов и суммарного блеббинга лимфоцитов, по которым диагностируют системный воспалительный ответ организма при критическом состоянии. Недостаток способа заключается в отсутствии оценки межклеточных взаимодействий в развитии дисфункции эндотелия, которая является неотъемлемым звеном системного воспалительного ответа организма.

Патент РФ №2402319, A61K 31/00, 27.10.10 дает подробную характеристику микрочастиц, снижение генерации которых под воздействием лекарственных препаратов приводит к улучшению функции сосудов у телят. Недостатком способа является одностороннее рассмотрение дисфункции эндотелия на фоне генерации микрочастиц без учета межклеточного взаимодействия, что не дает полноценной картины происходящих клеточно-молекулярных процессов при патологии сосудистой стенки.

Патент US 6258553, G01N 33/50, 07.10.2001 включает определение апоптоз-индуцированной активности клеток, в том числе за счет регистрации блеббинга, что позволяет определять антилейкемическую активность субстанций. Недостатком способа является односторонний подход к феномену блеббинга как маркеру апоптоза, в то время как блеббинг является также следствием активации клеток.

В научных и патентных источниках не обнаружено оценки межклеточных взаимодействий при эндотелиальной дисфункции.

Задача заявляемого способа - выявление влияния лимфоцитов на развитие эндотелиальной дисфункции у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что после центрифугирования 2 мл периферической крови пациента на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1077 с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения на 4 см² количества лимфоцитов с определением блеббинга цитоплазматической мембраны, а также осуществляют выделение ультрацентрифугированием из 2 мл периферической крови пациента мембранных микрочастиц с последующим иммуноцитохимическим исследованием на принадлежность к эндотелиальным клеткам, затем рассчитывают коэффициенты содержания лимфоцитов и микрочастиц по следующим критериям: содержание лимфоцитов до 100 клеток в 10 полях зрения соответствует коэффициенту 1, более 100 клеток - коэффициенту 2; содержание микрочастиц эндотелиального происхождения в 10 полях зрения до 50 штук соответствует коэффициенту 1, более 50 штук - коэффициенту 2, далее определяют соотношение указанных коэффициентов: если коэффициенты содержания лимфоцитов в блеббинге и эндотелиальных микрочастиц соотносятся как 1:1, то говорят о выраженной межклеточной коммуникации и задействованности лимфоцитов в формировании дисфункции эндотелия; если соотношение блеббинга и микрочастиц равно 2:1, то говорят о слабом межклеточном взаимодействии и низкой вовлеченности лимфоцитов в формирование дисфункции эндотелия; при соотношении блеббинга и микрочастиц, равном 1:2, говорят о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в генерацию мембранных микрочастиц; при соотношении блеббинга лимфоцитов и эндотелиальных микрочастиц 2:2 говорят о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в ее патогенез.

Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови в объеме 5 мл проводят из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с ризками, содержащую 0,15 мл гепарина; затем тщательно перемешивают кровь с гепарином в пробирке. Допустимо хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5С° в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории проводят повторное ресуспендирование крови в пробирке.

Для выделения лимфоцитарной фракции периферической крови используют градиент плотности фиколл-верографин. Для этого в отдельную пластмассовую пробирку вносят 2 мл фиколл-верографина (Pharmacia hemical, Uppsala, Sweden) плотностью ρ=1077; после чего по стенке пробирки осторожно, медленно дозатором на фиколл-верографин наслаивают 4 мл ресуспендированной крови и центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 минут со скоростью 3000 об/мин.

После центрифугирования на границе раздела фаз пастеровской пипеткой собирают кольцо клеток в отдельную пластмассовую пробирку. Пробирку с выделенным клеточным кольцом центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 минут со скоростью 3000 об/мин. После центрифугирования убирают супернатант, к осадку добавляют 500 мкл PBS (фосфатный буфер) или раствора Хенкса, тщательно ресуспендируют дозатором с большим наконечником.

Перед микроскопированием на предварительно обезжиренное предметное стекло наносят 20 мкл суспензии клеток, на покровное стекло - небольшое количество эмерсионного масла. Микроскопируют в 10 полях зрения (площадь отсмотра 4 см²) с использованием фазово-контрастной насадки; увеличение ×900. В поле зрения микроскопа видны лимфоциты (клетки округлой формы размером 9-10 мкм).

По морфологии цитоплазматической мембраны дифференцируют следующие виды лимфоцитов: 1) интактные клетки (с визуально неизмененной плазматической мембраной; круглой, ровной поверхностью); 2) клетки в состоянии блеббинга (выпячивание цитоплазматической мембраны клетки).

Параллельно проводят выделение мембранных микрочастиц из периферической крови. После повторного ресуспендирования крови в пробирке осуществляют ультрацентрифугирование при Rcf 11000, 5°С, 2 минуты; затем собирают супернатант в отдельный эппендорф и центрифугируют при Rcf 13000, 5°С, 45 минут; убирают супернатант; к осадку добавляют 50 мкл первичных антител к антигенам эндотелиальных клеток CD62E (Sigma Aldrich) в разведении 1:100 в 1% сыворотке (FGS в PBS), инкубируют при 37°С в течение 1 часа, затем добавляют в эппендорф до 1 мл PBS и центрифугируют при Rcf 13000, 5°С, 45 минут, супернатант убирают и к осадку добавляют 10 мкл вторичных-PI меченых антител (Sigma Aldrich), инкубируют при 37°С в течение 30 минут, затем добавляют в эппендорф до 1 мл PBS и центрифугируют при Rcf 13000, 5°С, 45 минут, супернатант убирают и к осадку добавляют 50 мкл PBS, ресуспендируют и 20 мкл суспензии наносят на предметное стекло (площадь отсмотра 4 см), микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа, увеличение ×900 в 10 полях зрения.

После этого рассчитывают коэффициенты содержания лимфоцитов и микрочастиц по следующим критериям: содержание лимфоцитов в блеббинге до 100 клеток в 10 полях зрения соответствует коэффициенту 1, более 100 клеток - коэффициенту 2; содержание мембранных микрочастиц эндотелиального происхождения в 10 полях зрения до 50 шт соответствует коэффициенту 1, более 50 шт - коэффициенту 2; при этом нормальное количество лимфоцитов в блеббинге в 10 поля зрения до 40-50 клеток.

Затем определяют соотношение лимфоцитов в состоянии блеббинга и без к количеству эндотелиальных мембранных микрочастиц; если коэффициенты содержания лимфоцитов к блеббинге и эндотелиальных микрочастиц соотносятся как 1:1, то говорят о выраженной межклеточной коммуникации и задействованности лимфоцитов в формировании дисфункции эндотелия, если соотношение блеббинга и микрочастиц равно 2:1, то говорят о слабом межклеточном взаимодействии и низкой вовлеченности лимфоцитов в формирование дисфункции эндотелия: при соотношении блеббинга и микрочастиц, равном 1:2, говорят о выраженной дисфункции эндотелия, при соотношении блеббинга лимфоцитов и эндотелиальных микрочастиц 2:2 говорят о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в ее патогенез.

Для подтверждения эндотелиальной дисфункции оценивают количественное содержание лимфоцитов в блеббинге и эндотелиальных микрочастиц: при низком содержании лимфоцитов в блеббинге (30 и менее штук на 4 см) и одновременно низком содержании эндотелиальных микрочастиц (20 и менее штук на 4 см) говорят об отсутствии эндотелиальной дисфункции.

Исследование проведено in vitro на модели клеток HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) и у 359 пациентов, страдающих гипертонической болезнью (ГБ, 80 человек), гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца (ГБ+ИБС, 94 человека), гипертонической болезнью и острым нарушением мозгового кровообращения (ГБ+ОНМК, 110 человек), рефрактерной гипертонией (РАГ. 15 человек), нейроциркуляторной дистонией (НЦД, 20 человек), а также у здоровых волонтеров без сердечно-сосудистой патологии (40 человек).

Клиническое обследование было осуществлено с использованием инструментальной диагностики эндотелиальной дисфункции: ультразвуковое исследование диаметра плечевой артерии «манжеточная проба» по способу Celermajer et al (Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery. A report of the international brachial artery reactivity task force. / M.C.Corretti [et al.] // J. of the American College of Cardiology. 2002. - V.39. N.2. - P.257-265). Кроме того, было осуществлено определение эндотелиальной дисфункции клеточно-гуморальными способами: по содержанию циркулирующих эндотелиоцитов (Dignat-George F., Sampol J., Lip G., Blarm A.D. Circulating endothelial cells: realities and promises in vascular disorders. // Pathophysiol. Haemost Thromb. - 2004. - N.33 - P.495-499); sPECAM-1 в плазме крови (Scalia R., Lefer A.M. In vivo regulation of PECAM-1 activity during acute endothelial dysfunction in the rat mesenteric microvasculature. // J. Leukoc. Biol. - 1998. - N.64. - P.163-169).

Результаты исследования представлены в таблице 1: эндотелий-зависимая вазодилатация, определенная методом «манжеточной пробы», была на одном уровне у пациентов с НЦД и здоровых волонтеров контрольной группы (13,9-15,8%), в то время как у пациентов с гипертонической болезнью в сочетании и без осложнений на уровне 6,0-7,1% (р<0,01 по сравнению с контрольной группой).

Таблица 1 Результаты исследования эндотелиальной дисфункции   ГБ ГБ+ИБС ГБ+ОНМК НЦД Здоровые волонтеры характеристика           эндотелий-зависимая вазодилатация (%) 6,0±2,1
*** 7,1±3,4
** 6,5±1,2
*** 13,9±0,6 15,8±1,7 циркулирующие эндотелиоциты (шт/мл) 11,6±1,5
*** 31,9±8,4
*** 54,1±5,9
*** 4,9±1,5 2,4±1,6 sPECAM-1 нг/мл 3,5±0,03
** 6,8±0,05
*** 11,5±0,5
*** 0,28±0,02 0,23±0,03 лимфоциты в состоянии блеббинга (шт на 4 см²) 51,6±4,8
*** 78,7±3,3
*** 182,7±18,3
*** 10,5±5,3 5,2±3,3 эндотелиальные микрочастицы (шт на 4 см²) 155,9±5,3
*** 100,1±7,6
*** 248,9±15,6
*** 60,1±13,2
** 15,4±4,7 Здесь: ГБ - гипертоническая болезнь; ГБ+ИБС - гипертоническая болезнь и ишемическая болезнь сердца; ГБ+ОНМК - гипертоническая болезнь и острое нарушение мозгового кровообращения; НЦД - нейроциркуляторная дистония. *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 - достоверно по отношению к контролю (здоровые волонтеры).

Концентрация sPECAM (молекула межклеточной адгезии, опосредующая лимфоцитарно-эндотелиальное взаимодействие) в плазме крови коррелировала со степенью тяжести сердечно-сосудистой патологии с коэффициентом r=0,93, р<0,01. Количество циркулирующих эндотелиоцитов (апоптотические слущенные эндотелиоциты) в крови обладает корреляционной связью высокой силы с выраженностью сердечно-сосудистой патологии (r=0,97; р<0,001).

Определение циркулирующих эндотелиальных микрочастиц выявило прямую корреляционную связь со степенью тяжести сердечно-сосудистой патологии и эндотелиальной дисфункцией, определенной «манжеточной пробой» и по содержанию клеточно-гуморальных маркеров, r=0,85 (р<0,01).

Блеббинг лимфоцитов - как отражение межклеточного взаимодействия в реализации эндотелиальной дисфункции, был значимо выше при всех состояниях, связанных с гипертонической болезнью. Выявлено, что степень вовлеченности лимфоцитов в межклеточные коммуникации при развитии дисфункции эндотелия у разных пациентов с одной и то же патологией варьирует, однако отмечаются тенденции к преобладанию высокого вовлечения лимфоцитов в эндотелиальную дисфункцию и генерацию мембранных эндотелиальных частиц у пациентов в остром периоде инсульта, прогрессировании ишемической болезни сердца. При этом у пациентов с гипертонической болезнью на фоне повышенной генерации эндотелиальных микрочастиц отмечается нормальное содержание лимфоцитов с незначительным количеством лимфоцитов в состоянии блеббинга, что указывает на низкую вовлеченность лимфоцитов в процесс дисфункции эндотелия. При рефрактерной гипертонии на фоне выраженной дисфункции эндотелия и незначительного количества лимфоцитов в состоянии блеббинга при повышенном содержании лимфоцитов в крови происходит процесс самогенерации мембранных микрочастиц лимфоцитами, за счет которых в том числе формируется устойчивость к действию лекарственных препаратов, так как они связывают рецепторы клеток; при нейроциркуляторной дистонии на фоне повышенного содержания эндотелиальных микрочастиц и незначимого содержания лимфоцитов в состоянии блеббинга, а также общего их количества возможно развитие дисфункции эндотелия в большей степени за счет других факторов, нежели иммунных синапсов с лимфоцитами. У пациентов контрольной группы, как правило, было низкое содержание эндотелиальных микрочастиц (15,4±4,7) и лимфоцитов в состоянии блеббинга (в среднем 5,2±3,3), однако у отдельных пациентов лимфоцитов в состоянии блеббинга было около 20 при низком содержании эндотелиальных микрочастиц, что свидетельствует о незначимых причинах для развития эндотелиальной дисфункции, а блеббинг лимфоцитов может быть объяснен существованием других стимулов, что требует расширения диагностического поиска заболеваний у этих пациентов.

Для определения значимости межклеточной коммуникации лимфоцитов и эндотелиоцитов в развитии дисфункции эндотелия, а также возможности определения по предлагаемым маркерам (блеббинг лимфоцитов, эндотелиальные микрочастицы) выраженности дисфункции эндотелия нами была осуществлена терапия пациентов исследуемых групп миокардиальным цитопротектором (Предуктал MB, Сервье, Франция). Известно, что Предуктал MB является цитопротектором с широким спектром действия, способным влиять на клеточный метаболизм, воздействовать на внутриклеточные сигнальные пути, приводить к закрытию митохондриальной поры и тем самым снижать концентрацию внутриклеточного кальция, стабилизировать мембраны, что в конечном итоге улучшает функцию эндотелия (Protective effects of trimetazidine against vascular endothelial cell injury induced by oxidation. // S.He [et al.] // J. of Geriatric Cardiology. - 2008. - V.5, N.4. - P.248-251.).

На рисунке 1 отображена динамика содержания мембран-высвобожденных микрочастиц различного клеточного генеза на 1 и 30 сутки наблюдения на фоне получения базисной сердечно-сосудистой терапии и Предуктала MB: по вертикали - среднее количество тромбоцитарных, эндотелиоцитарных и лимфоцитарных микрочастиц в штуках в 10 полях зрения, по горизонтали группы пациентов с гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца ( ГБ+ИБС), нейроциркуляторной дистонией ( НЦД) и контрольная группа относительно здоровых людей ( контроль); по горизонтали - время наблюдения. Как видно из рисунка, содержание микрочастиц различного клеточного происхождения уменьшается на фоне назначения Предуктала MB. что было статистически достоверно по отношению к контролю: р<0,05; статистически достоверно по отношению к результатам до назначения Предуктала MB: р<0,01.

На рисунке 2 отображено содержание слущенных эндотелиоцитов, лимфоцитов в состоянии блеббинга, мембран-высвобожденных микрочастиц в изучаемых группах пациентов с сердечно-сосудистой патологией в зависимости от приема базисной сердечно-сосудистой терапии; где горизонтали - количество эндотелиальных клеток в штуках, лимфоцитов в состоянии блеббинга в процентах по отношению ко всем лимфоцитам периферической крови и эндотелиальных микрочастиц в штуках в 10 полях зрения на 1 и 30 сутки наблюдения; по вертикали - группы пациентов с НЦД - нейроциркуляторная дистония; ГБ+ИБС - гипертоническая болезнь и ишемическая болезнь сердца на фоне получения Предуктала MB, а также в контрольной группе: А - больные, получавшие в течение 6 месяцев до исследования базисную сердечно-сосудистую терапию, и В - не получавшие. Как видно из рисунка, данные изучаемых параметров выше у пациентов, не получавших до назначения Предуктала базисной сердечно-сосудистой терапии; на 30 сутки назначения Предуктала в группе пациентов, получавших до исследования базисную сердечно-сосудистую терапию, динамика снижения маркеров дисфункции эндотелия выраженнее. Статистически достоверно по отношению к контролю: # - р<0,05; ## - р<0,01. Статистически достоверно по отношению к результатам до назначения Предуктала MB: * - р<0,05; ** - р<0,01.

Полученные нами результаты показывают, что определение количества лимфоцитов в блеббинге и содержания эндотелиальных микрочастиц отображает процессы, происходящие в эндотелии сосудов, в том числе лимфоцитарно-эндотелиальное взаимодействие. Улучшение состояния эндотелия сопровождается снижением лимфоцитов в состоянии блеббинга и количества циркулирующих эндотелиальных микрочастиц (табл.2).

Таблица 2 Взаимосвязь улучшения функции эндотелия и снижения количества лимфоцитов в состоянии блеббинга и эндотелиальных мембранных микрочастиц параметр гипертоническая болезнь (110 человек) РАГ (15 человек) Контрольная группа
(30 человек) до приема Предуктала
(60) после приема Предуктала
(60) до приема Предуктала
(15) после приема Предуктала
(15) апоптотические эндотелиоциты клеток/мл 11,6±1,5
*** 2,3±0,8 23,2±2,2
*** 9,6±2,09
** 2,4±1,6 эндотелиальные микрочастицы (шт на 4 см) 155,9±5,3
*** 56,2±9,2
* 290,2±24,4
*** 89,9±15,3
*** 15,4±4,7 sPECAM (нг/мл) 3,5±0,03
** 2,8±0,8
* 7,9±2,2
** 6,8±0,9
* 0,23±0,03 лимфоциты в состоянии блеббинга (шт на 4 см²) 51,6±4,8
*** 16,2±5,63
*** 194,5±64,8
** 28,8±4,9
*** 5,2±3,3 манжеточная проба D 3,72±0,6
* 4,32±0,03
* 4,1±0,9
* 4,3±0,01
* 4,9±0,4 %РГ 6,0±2,1
*** 8,4±0,3
** 8,5±1,7
** 9,4±0,07
** 15,8±1,7 %НГ 9,4±6,7
*** 18,38±0,1 11,9±1,3
*** 15,1±0,2
* 20,3±1,12 Здесь: D - диаметр плечевой артерии, %РГ - вазодилатация на реактивную гиперемию; %НГ - вазодилатация на нитроглицерин; *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 - достоверно по отношению к контролю (здоровые волонтеры).

Исследование in vitro проведено в 5 сетах на пассаже 5-7 клеток HUVEC (Lonza, USA). Вкратце: в культуральный флакон, содержащий 1х10⁶ клеток HUVEC, в ЕВМ (endothelial basal medium) с добавками (включая 2% бычью сыворотку) добавляли 2×10⁵ лимфоцитов от здоровых волонтеров и в другой культуральный флакон - 2×10⁵ лимфоцитов от пациентов с гипертонической болезнью. Сокультивирование проводили при нормальных условиях (21% O₂, 37°С) в течение 24 часов. Затем осуществляли сбор питательной среды в отдельную пробирку, подвергали ее центрифугированию дважды: 1) 3000 rpm, 10 мин - для осаждения лимфоцитов; 2) 340g, 10 мин - для осаждения эндотелиальных клеток. Полученный супернатант центрифугировали при 13000g, 45 минут. Полученный осадок отмывали в 500 мкл PBS (фосфатно-солевой буфер) центрифугированием при 13000g, 45 минут. После этого к осадку микрочастиц добавляли антитела CD31 (Miltenyi Biotec GmbH, Germany) по протоколу фирмы-производителя. Получены следующие результаты: в культуре интактных клеток HUVEC (без инкубации с лимфоцитами) количество эндотелиальных микрочастиц составило 98000±15000 шт/мкл; в культуре клеток HUVEC ко-инкубированных с лимфоцитами от здоровых волонтеров количество эндотелиальных микрочастиц было 150000±3000 шт/мкл (р<0,05 по сравнению с интактными HUVEC); в культуре клеток HUVEC ко-инкубированных с лимфоцитами от пациентов с гипертонической болезнью количество эндотелиальных микрочастиц было 450000±10000 (р<0,001 по сравнению с интактными HUVEC). Нами было также определено, что количество апоптотических эндотелиоцитов в культуре интактных HUVEC составило: 2,5±0.5%; в культуре с лимфоцитами от здоровых волонтеров - 3,7±0,1% (р<0,05); в культуре с лимфоцитами от пациентов с гипертонической болезнью - 40,2±8,4% (р<0,001). Развитие эндотелиальной дисфункции было подтверждено определением содержания в питательной среде методом ИФА эндотелина-1: интактные HUVEC - 5,5±0,1 пг/мл; HUVEC + лимфоциты от здоровых волонтеров - 15,9±0,3 пг/мл (р<0,001 по сравнению с интактными HUVEC); HUVEC + лимфоциты от пациентов с гипертонической болезнью - 57,9±1,26 пг/мл (р<0,001 по сравнению с интактными HUVEC). Полученные результаты позволили сделать заключение об участии лимфоцитов в развитии эндотелиальной дисфункции и стимуляции образования эндотелиальных мембранных микрочастиц.

На рисунке 3 схематично представлен механизм участия лимфоцитов в формировании эндотелиальных мембран-высвобожденных микрочастиц. Активация внутриклеточных сигнальных систем, опосредованных митоген-активированными протеинкиназами, повышением уровня внутриклеточного кальция и свободных радикалов, приводит к разобщению белков цитоскелета, экстернализации фосфатидилсерина, запуску процесса рафтинга липидных доминов (рисунок 3: А, В; 1,2,3). Динамическое движение цитоплазматической мембраны способствует сближению рецепторных локусов преимущественно одного типа к одному полюсу клетки, образуется рецепторный кластер на мембране (рисунок 3: С), под микроскопом проявляется выпячиванием наружной цитоплазматической мембраны на одном полюсе клетки; лимфоцит с усиленным рецепторным полюсом взаимодействует с эндотелиоцитами, приводя их гиперактивации, при этом получая обратный ответ от эндотелиоцита, лимфоцит способен отшнуровывать мембранные микрочастицы (0,1-1,0 мкм), представляющие собой пузырьки с биологически активными веществами, окруженные мембранной лимфоцита и несущей его рецепторы (рисунок 3: D). Микрочастицы в свою очередь могут взаимодействовать с рецепторами эндотелиальных клеток и значимо их блокировать (рисунок 3: Е), так как их количество превышает во много раз количество лимфоцитов, а также могут проникать через межэндотелиальные щели, формируя асептическое воспаление и вызывая атерогенез (рисунок 3: G, Н). Гиперактивированные эндотелиоциты подвергаются тем же изменениям, что и мембрана лимфоцитов; эндотелиоциты включаются в процесс самогенерации активных мембранных микрочастиц, которые могут контактировать с этим же или другими эндотелиоцитами, клетками крови, например лимфоцитами, активируя их и насыщая антигенной информацией о эндотелиоците, а также проникать через межэндотелиальные щели и вовлекаться в процесс асептического воспаления и образования атеросклеротической бляшки (рисунок 3: F, G, Н, 4). Гиперактивация эндотелиоцитов и постоянная стимуляция со стороны лимфоцитов и микрочастиц приводит к запуску запрограммированной клеточной гибели, в результате которой происходит слущивание эндотелиоцита.

На рисунке 4 представлена микрофотография эндотелиальных микрочастиц PI-меченых: на темном фоне видны красные микрочастицы диаметром 0,1-1,0 мкм при увеличении микроскопа х900.

Изучение влияния лимфоцитов на развитие дисфункции эндотелия было также проведено у 30 пациентов с гипертонической болезнью II стадии ранее не получавших регулярной сердечно-сосудистой терапии до начала и через 60 дней после назначения регулярного приема ингибитора АПФ, β-адреноблокатора и диуретика, а также у 90 пациентов с разной стадией гипертонической болезни (по критериям ВОЗ).

Выявлено, что отсутствие регулярной терапии сопровождается выраженным снижением эндотелий-зависимой вазодилатации по данным манжеточной пробы (в 3,2 раза меньше по сравнению со здоровыми волонтерами, р<0,001), тогда как получение регулярной сердечно-сосудистой терапии в течение 2 месяцев приводит к увеличению эндотелий-зависимой вазодилатации у тех же пациентов по сравнению с исходными данными в 2,4 раза (р<0,001) (табл.3). Лабораторное исследование показало, что среднестатистически пациенты с гипертонической болезнью II стадии имеют соотношение лимфоцитов в состоянии блеббинга и эндотелиальных микрочастиц 1:2, что говорит о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в генерацию мембранных микрочастиц. Регулярная сердечно-сосудистая терапия тех же пациентов в течение 2 месяцев привела к статистически значимому снижению блеббинга лимфоцитов в 1,6 раз (р<0,01 по сравнению с исходными данными), количества эндотелиальных мембранных микрочастиц в 1,4 раза (р<0,05 по сравнению с исходными данными), что соответствовало соотношению 1:2. Выявленная лабораторная динамика содержания лимфоцитов в состоянии блеббинга и эндотелиальных микрочастиц с выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченностью лимфоцитов в генерацию мембранных микрочастиц подтверждается изменением концентрации в плазме крови эндотелина-1: у не леченых пациентов с гипертонической болезнью концентрация эндотелина-1 выше, чем у здоровых волонтеров в 7,7 раз (р<0,001), у тех же пациентов после приема середечно-сосудистой терапии в течение 2 месяцев концентрация эндотелина-1 превышает таковую у здоровых волонтеров в 5,3 раза (р<0,001). Коэффициент корреляции концентрации эндотелина-1 в плазме крови с результатами «манжеточной пробы» составляет r=0,85 (р=0,0238); с количеством циркулирующих мембранных микрочастиц r=0,82 (р=0,0341); с количеством циркулирующих эндотелиальных клеток r=0,86 (р=0,0238).

Таблица 3. Эндотелиальная дисфункция, количество лимфоцитов в состоянии блеббинга и эндотелиальных мембранных микрочастиц у пациентов с гипертонической болезнью II стадии до и на фоне регулярной сердечно-сосудистой терапии Изучаемый признак Гипертоническая болезнь II стадии здоровые волонтеры (30 чел) до назначения регулярной сердечно-сосудистой терапии (30 чел) на фоне регулярной сердечно-сосудистой терапии в течение 60 дней (те же пациенты, 30 чел) эндотелий-зависимая вазодилатация (манжеточная проба, %) 4,9±0,2
*** 6,7±0,7
*** 15,8±1,7 эндотелин-1 (пг/мл) 8,5±0,4
*** 5,8±0,9
*** 1,1±0,6 блеббинг лимфоцитов (шт) 91,2±12,9
*** 56,1±3,3
*** 5,2±3,3 эндотелиальные микрочастицы (шт) 193,3±8,2
*** 135,9±5,3
*** 15,4±4,7 *** - р<0,001 по сравнению со здоровыми волонтерами.

Зависимость между эндотелиальной дисфункцией и вовлеченностью лимфоцитов в генерацию эндотелиальных мембранных микрочастиц была также установлена у пациентов с разной стадией гипертонической болезни по критериям ВОЗ (табл.4.). Эндотелий-зависимая вазодилатация у пациентов с I стадией гипертонической болезни была снижена по отношению к здоровым волонтерам на 3,9% (р<0,05), у пациентов со II стадией - на 7,5% (р<0,001); у пациентов с III стадией гипертонической болезни - на 8,7% (р<0,001). У этих же пациентов концентрация эндотелина-1 в крови была выше по отношению к здоровым волонтерам: I стадия - на 3,7 пг/мл (р<0,01); II стадия - на 5,7 пг/мл (р<0,001); III стадия - на 7,8 пг/мл (р<0,001).

Таблица 4. Эндотелиальная дисфункция, количество лимфоцитов в состоянии блеббинга и эндотелиальных мембранных микрочастиц у пациентов с разной стадией гипертонической болезни изучаемый признак Гипертоническая болезнь здоровые волонтеры (30 чел) I стадии (30 чел) II стадии (30 чел) III стадии (30 чел) эндотелий-зависимая вазодилатация (манжеточная проба, %) 11,9±0,8
* 8,3±1,6
*** 7,1±3,4
*** 15,8±1,7 эндотелии-1 (пг/мл) 4,8±0,5
** 6,8±0,9
*** 8,9±0,2
*** 1,1±0,6 блеббинг лимфоцитов (шт) 39,2±4,6
* ** 56,1±3,3
*** 125,5±4,5
*** 5,2±3,3 эндотелиальные микрочастицы (шт) 78,3±8,8
** 135,9±5,3
*** 210,9±7,4
*** 15,4±4,7 *<0,05; **<0,01; ***<0,001 - достоверно по отношению к здоровым волонтерам.

Как видно из таблицы 4, у пациентов с разной стадией гипертонической болезни, которым соответствовала разная степень выраженности дисфункции эндотелия, что было определено по уровню эндотелина-1 в крови и инструментальным исследованием диаметра плечевой артерии «Манжеточная проба», выявлено разное содержание лимфоцитов в состоянии блеббинга и эндотелиальных микрочастиц в крови. Так, у пациентов с 1 стадией коэффициент соотношения составил 1:1, что говорит о выраженной межклеточной коммуникации и задействованности лимфоцитов в формировании дисфункции эндотелия; у пациентов со II и III стадией гипертонической болезни коэффициент соотношения был равен 2:2, что говорит о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в ее патогенез. При этом у пациентов с III стадией гипертонической болезни по ВОЗ отмечается наибольшее содержание в крови лимфоцитов в состоянии блеббинга и циркулирующих эндотелиальных микрочастиц.

Пример 1.

Мужчина, 34 года, страдает НЦД по смешанному типу в течение 10 лет.

По данным электрокардиографии, эхокардиографии, тредмил-теста отклонений от нормы не выявлено.

На момент осмотра давление 140/85 мм рт.ст., ЧСС 58 в минуту.

Развернутый анализ крови, биохимический анализ крови - без изменений.

Тест УЗИ на эндотелиальную дисфункцию «Манжеточная проба» определил ее наличие.

Лабораторно установлено, что у пациента 30 лимфоцитов на 4 см² исследуемого образца крови, из них в состоянии блеббинга 10 (коэффициент 1); мембранных эндотелиальных микрочастиц 180 на 4 см² исследуемого образца крови (коэффициент 2), что говорит о соотношении 1:2 и отсутствии вовлеченности лимфоцитов в процесс генерации дисфункции эндотелия.

Пример 2.

Женщина, 58 лет, страдает гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца, последнее время жаловалась на участившиеся боли в эпигастрии, возникающие независимо от приема пищи, усиливающиеся на полный желудок. Наблюдалась у гастроэнтеролога без видимого эффекта от терапии.

По данным ЭКГ: предсердная экстрасистолия, гипертрофия левого желудочка.

Холтеровское мониторирование: миграция водителя ритма по предсердиям в ночное время, редкая предсердная и желудочковая экстрасистолия по типу бигемении, эпизод депрессии сегмента ST в нижних отведениях в дневное время.

УЗИ сонных артерий: атеросклеротическое поражение сонных артерий.

На момент осмотра АД 130/80 мм рт.ст. ЧСС 68 в минуту.

Развернутый анализ крови без изменений.

В биохимическом анализе крови: дислипидемия за счет преобладания липопротеидов низкой плотности и липопротеидов очень низкой плотности, остальные показатели в норме.

Лабораторно: лимфоцитов в состоянии блеббинга 220 на 4 см² (коэффициент 2), эндотелиальных микрочастиц 248 на 4 см² (коэффициент 2), что соответствует 2:2 и говорит о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в ее патогенез.

Через 25 дней у пациентки развился инфаркт миокарда задней стенки левого желудочка.

Пример 3.

Пациентка, 40 лет, страдает в течение последних 5 лет рефрактерной гипертонией, резистентной к лекарственным средствам, последнее время постоянно принимает ингибиторы АПФ, бета-адреноблокаторы и клофелин без значимого эффекта.

На момент осмотра АД 210/120 мм рт.ст., ЧСС 90 в минуту.

Лабораторно-иструментальные методы не показали возможность симптоматической гипертонии.

Развернутый анализ крови: СОЭ 200 мм/ч, остальные показатели в норме. Биохимический анализ крови - без изменений. Общий анализ мочи: преобладание оксалатов.

Лабораторно: лимфоцитов 150 на 4 см², из них в блеббинге 40 лимфоцитов (коэффициент 1), эндотелиальных микрочастиц 370 на 4 см² (коэффициент 2), это соответствует 1:2 с повышенным содержанием лимфоцитов, это говорит о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в генерацию мембранных микрочастиц. Учитывая высокое содержание лимфоцитов и микрочастиц, пациентке показана гемосорбция.

Пример 4.

Пациент 35 лет, обратился с жалобами на дискомфорт в перикардиальной области при подъеме тяжестей (работа грузчика), периодически боли в затылочной области головы, других жалоб не предъявлял. За артериальным давлением не следил, ранее к терапевту не обращался.

По развернутому анализу крови и биохимическому анализу крови отклонений не выявлено. Инструментальные методы исследования (ЭхоКГ, ЭКГ, Холтеровское мониторирование, УЗИ сосудов с ЦДК) патологии не выявили.

Лабораторно: лимфоцитов 100 на 4 см², из них в блеббинге 10 лимфоцитов (коэффициент 1), эндотелиальных микрочастиц 7 на 4 см² (коэффициент 1), это соответствует согласно формуле 1:1 и говорит о выраженной межклеточной коммуникации и задействованности лимфоцитов в формировании дисфункции эндотелия. Уточняющим критерием в данном случае является низкое содержание как лимфоцитов в блеббинге (30 и менее шт на 4 см²), так и микрочастиц (20 и менее шт на 4 см²), регистрируемое при отсутствии эндотелиальной дисфункции. Заключение: на момент обследования у пациента эндотелиальная дисфункция не регистрируется.

Пример 5.

Пациент, 38 лет, обратился по поводу головных болей в затылочной области (особенно после физических нагрузок), «мушек» перед глазами, снижения зрения, вялости и апатии. Ухудшение состояния стал отмечать в течение последнего года. Ранее занимался силовыми видами спорта (перерыв около 5 лет). Со слов больного, ранее сердечно-сосудистыми заболеваниями не страдал, за медицинской помощью не обращался.

При осмотре выявлена гиперемия лица, артериальное давление 160/100 мм рт.ст., ЧСС 110 в минуту. Разницы артериального давления на руках нет.

Пациент не курит, аллергический и наследственный анамнез не отягощен.

Манжеточная проба: снижение эндотелий-зависимой вазодилатации: 5,1%.

Лабораторно: эндотелии-1 - 8,1 пг/мл; количество лимфоцитов в состоянии блеббинга 105; количество эндотелиальных микрочастиц - 187. Указанное соотношение составляет 2:2 и говорит о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в ее патогенез.

Пациенту была назначена терапия, состоящая из Эналаприл 10 мг 2 раза в день, Бисопролол 5 мг 1 раз в день, Индапамид 2,5 мг 1 раз в день. Через 2 месяца от начала терапии: эндотелий-зависимая вазодилатация 7,5%, эндотелии-1 - 6,7 пг/мл; количество лимфоцитов в состоянии блеббинга 53; количество эндотелиальных микрочастиц 138. Это соответствует соотношению 1:2 и говорит о выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в генерацию мембранных микрочастиц. Заключение: на фоне сохраняющейся выраженной дисфункции эндотелия и вовлеченности лимфоцитов в процесс ее формирования отмечена динамика к снижению тяжести гипертонической болезни по сравнению с исходными данными. Самочувствие пациента удовлетворительное, головные боли не беспокоят, артериальное давление 130/85 мм рт.ст. Назначенная сердечно-сосудистая терапия продолжена.

Использование заявляемого способа позволяет оценить вовлеченность лимфоцитов по средствам иммунных синапсов и генерации микрочастиц эндотелиального происхождения в развитие дисфункции эндотелия, а также выраженность дисфункции эндотелия, на основании чего можно прогнозировать риск развития сосудистых осложнений и оптимизировать лечение сердечно-цереброваскулярных патологий.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения влияния лимфоцитов на развитие дисфункции эндотелия. Для этого проводят забор периферической венозной крови у пациента в объеме 5 мл, центрифугирование 2 мл на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1077. С помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения на 4 см² количества лимфоцитов с определением блеббинга цитоплазматической мембраны. Рассчитывают коэффициенты содержания лимфоцитов и микрочастиц по следующим критериям: содержание лимфоцитов до 100 клеток в 10 полях зрения соответствует коэффициенту 1, более 100 клеток - коэффициенту 2; содержание микрочастиц эндотелиального происхождения в 10 полях зрения до 50 штук соответствует коэффициенту 1, более 50 штук - коэффициенту 2. Далее определяют соотношение указанных коэффициентов: если коэффициенты содержания лимфоцитов в блеббинге и эндотелиальных микрочастиц соотносятся как 1:1, то говорят о задействованности лимфоцитов в формировании дисфункции эндотелия; если соотношение блеббинга и микрочастиц равно 2:1, то говорят о низкой вовлеченности лимфоцитов в формирование дисфункции эндотелия; при соотношении блеббинга и микрочастиц, равном 1:2 или 2:2, говорят о выраженной дисфункции эндотелия. Изобретение позволяет оценить выраженность дисфункции эндотелия, на основании чего можно прогнозировать риск развития сосудистых осложнений и оптимизировать лечение сердечно-цереброваскулярных патологий. 4 ил., 4 табл., 5 пр.

Способ определения влияния лимфоцитов на развитие дисфункции эндотелия, включающий забор периферической венозной крови у пациента в объеме 5 мл, центрифугирование 2 мл на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1077, отличающийся тем, что с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения на 4 см² количества лимфоцитов с определением блеббинга цитоплазматической мембраны, а также осуществляют выделение ультрацентрифугированием из 2 мл периферической крови пациента мембранных микрочастиц с последующим иммуноцитохимическим исследованием на принадлежность к эндотелиальным клеткам; затем рассчитывают коэффициенты содержания лимфоцитов и микрочастиц по следующим критериям: содержание лимфоцитов до 100 клеток в 10 полях зрения соответствует коэффициенту 1, более 100 клеток - коэффициенту 2; содержание микрочастиц эндотелиального происхождения в 10 полях зрения до 50 штук соответствует коэффициенту 1, более 50 штук - коэффициенту 2, далее определяют соотношение указанных коэффициентов: если коэффициенты содержания лимфоцитов в блеббинге и эндотелиальных микрочастиц соотносятся как 1:1, то говорят о задействованности лимфоцитов в формировании дисфункции эндотелия; если соотношение блеббинга и микрочастиц равно 2:1, то говорят о низкой вовлеченности лимфоцитов в формирование дисфункции эндотелия; при соотношении блеббинга и микрочастиц, равном 1:2 или 2:2, говорят о выраженной дисфункции эндотелия.