СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ СОСУДИСТОЙ ТЕРАПИИ ПО ВЫРАЖЕННОСТИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 A61P9/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, неврологии, терапии, лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки эффективности сосудистой терапии по содержанию аннексин-V позитивных и негативных эндотелиальных клеток в крови.

Дозировка и выбор лекарственного препарата чаще всего назначаются врачом из собственных клинических наблюдений, опираясь на клиническое мышление, а так же согласуясь с регрессом предъявляемых жалоб и симптомов. При этом не всегда выбранная доза и лекарственный препарат оказывают достаточный эффект на восстановление морфологических и функциональных свойств клеток сосудистой стенки. В связи с этим поиск доступных и быстрых методов оценки влияния препаратов на эндотелиоциты сосудов является актуальной задачей современной медицины.

Известен способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца путем исследования сыворотки крови (патент РФ №2402016, G01N 33/48, 20.10.2010), в котором до и после лечения определяют в сыворотке крови общий холестерин и липопротеиды. Преимущество способа - в оценке вероятных событий перекисного окисления липидов и формировании атеросклеротических бляшек.

Недостаток способа - отсутствие оценки эффекта терапии на состояние сосудистой стенки, так как в нормальных условиях эндотелий не пропускает липидные фракции, достаточные для формирования атеросклеротических бляшек.

Известен способ диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом (патент РФ №2331880, G01N 33/48, 20.08.2008), заключающийся в измерении количества циркулирующих эндотелиоцитов в периферической крови из расчета на 100 лимфоцитов. За нормальное значение принимается 1-3 эндотелиоцита на 100 лимфоцитов. Забор крови в динамике позволяет оценить эффективность выбранной терапии и дозы лечения.

Недостатком этого способа является отсутствие определения антигенного потенциала циркулирующих эндотелиоцитов.

Известен способ снижения эндотелиоцитемии у больных артериальной гипертонией с нарушением толерантности к глюкозе (патент РФ №2398574, A61K 31/175 10.09.2010), базирующийся на оценке эффективности приема метформина 500 мг 2 раза в день и лизиноприла 10 мг 1 раз утром в течение 1 месяца путем определения количества циркулирующих эндотелиоцитов методом ультрацентрифугирования и подсчета в камере Горяева, за нормальное значение принимают 1-2 эндотелиоцита в 1 мкл. Преимуществом способа является его относительная простота исполнения.

Недостатком данного способа является отсутствие дифференциальной диагностики патогенетической значимости циркулирующих эндотелиоцитов, так как содержание аннексии негативных эндотелиоцитов, например, может быть следствием физиологической дисфункции эндотелия или причиной травматического повреждения инъекционной иглой во время забора крови.

Задачей предлагаемого способа является обоснованный выбор лекарственных препаратов и их доз, эффективно улучшающих состояние стенки сосудов у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что у пациентов до назначения лекарственных препаратов и в динамике терапии проводят забор периферической венозной крови, ультрацентрифугированием выделяют эндотелиоциты, проводят их инкубацию с FITC-меченным аннексином-V; затем подсчитывают эндотелиоциты с помощью иммерсионного микроскопа в 10 полях зрения и при преобладании количества аннексин-V негативных эндотелиоцитов над аннексин-V позитивными эндотелиоцитами говорят о низкой задействованности эндотелия сосудов в патологическом процессе или об эффективной сосудистой терапии, при преобладании аннексин-V позитивных эндотелиоцитов над аннексин-V негативными эндотелиоцитами говорят о высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс или о неэффективной сосудистой терапии: в норме средне статистически количество циркулирующих эндотелиоцитов 1-3, аннексин-V позитивных - 0; при эндотелиальной дисфункции 1 степени циркулирующих эндотелиоцитов 4-6, из которых 1-3 аннексии-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 2 степени циркулирующих 7-12, из которых 4-6 аннексии-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 3 степени циркулирующих эндотелиоцитов 13-18, из которых аннексии-V позитивные 7-10; при эндотелиальной дисфункции 4 степени циркулирующих эндотелиоцитов 19-25, аннексин-V позитивные 12-24, при критической эндотелиальной дисфункции с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений циркулирующих эндотелиоцитов более 25, все аннексин-V позитивные.

Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови в объеме 2 мл проводят из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с ризками, содержащую 0,015 мл гепарина; затем тщательно перемешивают кровь с гепарином в пробирке. Допустимо хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5C° в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории проводят повторное ресуспендирование крови в пробирке; выделение циркулирующих эндотелиальных клеток осуществляют ультрацентрифугированием при +4°C в течение 20 минут при скорости 395 g, собирают супернатант, к которому добавляют 0,2 мл ADP (1 мг/мл раствора), суспендируют в течение 10 минут до полного смешивания, центрифугируют при +4°C в течение 20 минут на скорости 395 g, собирают супернатант и центрифугируют при +4°C в течение 20 минут при 2100 g, к полученному осадку добавляют 0,1 мл 0,9% NaCl, тщательно ресуспендируют и наносят на предметное стекло 15 мкл суспензии, добавляют 20 цл связывающего буфера и 3 цл Аннексина V-FITC (Annexin-V detection Kit), инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут во влажной камере, затем покрывают покровным стеклом и с помощью иммерсионного микроскопа проводят детекцию аннексии-V позитивных и аннексин-V негативных эндотелиальных клеток в 10 полях зрения при увеличении ×900.

При преобладании количества аннексин-V негативных эндотелиоцитов (нет зеленого свечения мембраны) над аннексин-V позитивными (зеленое свечение мембраны) эндотелиоцитами говорят о низкой задействованности эндотелия сосудов в патологическом процессе или об эффективной сосудистой терапии, при преобладании аннексин-V позитивных эндотелиоцитов над аннексин-V негативными эндотелиоцитами говорят о высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс или о неэффективной сосудистой терапии, по количеству циркулирующих эндотелиоцитов и способности к связыванию аннексина-V судят о степени выраженности эндотелиальной дисфункции: в норме количество циркулирующих эндотелиоцитов 1-3, аннексин-V позитивных - 0; при эндотелиальной дисфункции 1 степени циркулирующих эндотелиоцитов 4-6, из которых 1-3 аннексин-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 2 степени циркулирующих 7-12, из которых 4-6 аннексин-V позитивные; при эндотелиалной дисфункции 3 степени циркулирующих эндотелиоцитов 13-18, из которых аннексии-V позитивные 7-10; при эндотелиальной дисфункции 4 степени циркулирующих эндотелиоцитов 19-25, аннексин-V позитивные 12-24, при критической эндотелиальной дисфункции с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений циркулирующих эндотелиоцитов более 25, все аннексин-V позитивные.

По результатам анализа циркулирующих эндотелиальных клеток проводят подбор лекарственной терапии и доз, направленных на снижение количества циркулирующих эндотелиоцитов, их антигенного и протромбогенного потенциала.

Нами обследованы пациенты обоего пола в возрасте 40-65 лет, страдающие гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца (54 человека) и гипертонической болезнью (30 человек), получавшие ПРЕДУКТАЛ MB к базисной сердечно-сосудистой терапии и 60 человек с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу на фоне гипертонической болезни, получавшие ЭНАЛАПРИЛ или ПЕРИНДОПРИЛ в дополнение к базисной неврологической терапии.

Результаты по динамике содержания циркулирующих аннексин-V позитивных эндотелиоцитов представлены на рисунке 1, где по вертикали - количество циркулирующих эндотелиоцитов в периферической крови в штуках у пациентов с гипертонической болезнью без терапии ПРЕДУКТАЛОМ ( ГБ), гипертонической болезнью и терапией ПРЕДУКТАЛОМ (ГБ предуктал), гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца без терапии ПРЕДУКТАЛОМ ( ГБ+ИБС), гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца на фоне терапии ПРЕДУКТАЛОМ ( ГБ+ИБС предуктал); по горизонтали - 1, 30, 60 день наблюдения и забора периферической крови. Как видно из рисунка, пациенты с гипертонической болезнью и ИБС имели изначально до назначения ПРЕДУКТАЛА большее количество циркулирующих эндотелиальных клеток, в обеих группах количество аннексин-V позитивных эндотелиоцитов снизилось на фоне ПРЕДУКТАЛА выраженное, чем без него.

На рисунке 2 представлены два метода лекарственной терапии ЭНАЛАПРИЛОМ (или ПЕРИНДОПРИЛОМ в соответствующих ЭНАЛАПРИЛУ дозах) пациентов с острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК) на фоне гипертонической болезни: «ударная доза» и «титрование», где по вертикали - доза ЭНАЛАПРИЛА; по горизонтали - степень выраженности дисфункции эндотелия в порядке уменьшения от 4 до 0. Способ терапии: титрование, ударная. Как видно из рисунка, при применении ударной дозы добиться снижения степени эндотелиальной дисфункции оказалось быстрее, что имеет значимый эффект в предупреждении прогрессирования дисфункции эндотелия.

Пример 1

Женщина, 36 лет, поступила в клинику с диагнозом - Острое нарушение мозгового кровообращения в правой средней мозговой артерии с легким гемипарезом слева, гипертоническая болезнь III, риск 4.

Жалобы на момент осмотра: головная боль в затылочной области, возникающая в утренние и вечерние часы, мушки перед глазами, легкий дискомфорт в перикардиальной области так же в преимущественно в утренние и вечерние часы, слабость в левой ноге и левой руке, парестезии.

По КТ головного мозга подтвержден инсульт по ишемическому типу. АД 150/110 мм рт.ст. В анализе крови: лейкоцитоз (13×10¹²) преимущественного за счет зрелых форм, СОЭ 20 мм/ч в эритрограмме отклонений нет, тромбоциты в норме. По биохимическому анализу крови: фибриноген 6,0 мг/л, С-РБ 14, остальные показатели в пределах нормы. В общем анализе моче - без отклонений. По карте гемостаза: преобладание активированных тромбоцитов. ЭКГ: выявила признаки гипертрофии левого желудочка.

Лабораторно выявлено, что циркулирующих эндотелиоцитов 14, из которых аннексии-V позитивных 10. Это соответствует 3 степени эндотелиальной дисфункции и говорит о высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс.

Пациентке была назначена стандартная неврологическая терапия, включающая кавинтон, пирацетам, эмоксипин, аспирин. Кроме того, к терапии было добавлено назначение ЭНАЛАПРИЛА 10 мг 1 таблетка 2 раза в день.

Через 5 дней терапии были повторно взяты анализы крови на исследование. В анализе крови: лейкоцитоз уменьшился (10×10) преимущественного за счет зрелых форм, СОЭ 20 мм/ч, в эритрограмме отклонений нет, тромбоциты в норме. По биохимическому анализу крови: фибриноген 5,4 мг/л, С-РБ 14, остальные показатели в пределах нормы. В общем анализе мочи - без отклонений. По карте гемостаза: преобладание активированных тромбоцитов. ЭКГ: без изменений по сравнению с предыдущей.

Лабораторно выявлено, что циркулирующих эндотелиоцитов 10, из которых аннексии-V позитивных 6. Это соответствует 3 степени эндотелиальной дисфункции и говорит о высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс, однако назначенная терапия оказывает корригирующий эффект на сосудистую стенку.

Пациентка продолжала предъявлять жалобы на головную боль в затылочной области, слабость в левой руке и ноге. АД 150/100 мм рт.ст.

Было решено увеличить дозу ЭНАЛАПРИЛА: до 20 мг×2 р/д.

Через 5 дней терапии отмечен регресс жалоб на головные боли, АД 140/90 мм рт.ст., в анализе крови нормализация лейкограммы, СОЭ 18 мм/ч, фибриноген 4,2 мг/л, С-РБ-7 мг/л, циркулирующих эндотелиоцитов 8, из которых 6 аннексин-V позитивные, что свидетельствует о 2 степени эндотелиальной дисфункции и высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс. АД 125/75 мм рт.ст. Пациентка отметила исчезновение парестезии. Слабость в конечностях сохранялась.

Учитывая, нормализацию параметров АД, регресс жалоб, но сохраняющуюся высокую степень вовлеченности эндотелия в патопроцесс было решено добавить к проводимой терапии МИЛДРОНАТ по 5 мл внутривенно капельно на физиологическом растворе (100 мл). Курс 5 капельниц.

Через следующих 5 дней пациентка отметила улучшение в удержании предметов левой рукой, отсутствие подволачивания левой ноги при ходьбе, головные боли не беспокоили, дискомфорт за грудиной не отмечала, настроение улучшилось. АД 120/70 мм рт.ст. В анализе крови лишь сохранялось повышенное СОЭ 17 мм/ч. Остальные показатели пришли в норму.

Лабораторно: циркулирующих эндотелиоцитов 5, из которых 1 аннексии-V позитивный, что соответствует эндотелиальной дисфункции 1 степени с низкой вовлеченностью эндотелия в патопроцесс.

Было решено продолжить базисную и дополнительную терапию, переведя пациентку на прием таблетированных препаратов: ЭНАЛАПРИЛ 20 мг×2 р/д и МИЛДРОНАТ 250 мг×2 р/д.

Перед выпиской: жалоб не предъявляет, АД 120/70 мм рт.ст. Анализы крови и мочи без отклонений.

Лабораторно: циркулирующих эндотелиоцитов 4, аннексин-V позитивных нет. Это свидетельствует об эффективности подобранной терапии, на фоне которой произошло восстановление функции эндотелия и снижение его антигенных и протромботических свойств.

Пациентке было рекомендовано продолжить прием препаратов в течение месяца с последующим обращением в поликлинику.

Пример 2

Мужчина 40 лет обратился с жалобами на дискомфорт за грудиной при ходьбе на 300 метров, подъеме на 2 этаж, утомляемость при привычных физических нагрузках. Артериальное давление 130/80 мм рт.ст., ЧСС 96 в минуту.

Пациент ранее медикаментозной терапии не получал.

Биохимический и развернутый анализ крови отклонений от нормы не выявили.

Тредмил-тест: стенокардия напряжения II функционального класса, гиперактивный тип реагирования сосудистого тонуса на физические нагрузки.

Лабораторно: циркулирующих эндотелиоцитов 8, из которых 6 аннексин-V позитивные, что свидетельствует о 2 степени эндотелиальной дисфункции и высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс.

Назначено: КОНКОР 5 мг 1 таблетка в день, ПРЕДУКТАЛ MB 0,35 1 таблетка×2 р/д в течение 1 месяца.

Через 1 месяц пациент отмечает отсутствие загрудинных болей, повышение работоспособности.

Лабораторно: циркулирующих эндотелиоцитов 2, аннексин-V позитивных нет. Это свидетельствует об эффективности подобранной терапии, на фоне которой произошло восстановление функции эндотелия и снижение его антигенных и протромботических свойств.

Рекомендовано продолжить постоянный прием КОНКОРА 5 мг 1 таблетка в день и ПРЕДУКТАЛА MB 0,35 1 таблетка×2 р/д в течение 6 месяцев.

Использование заявляемого способа позволяет провести обоснованный выбор лекарственных препаратов и их доз, улучшающих морфологическое и функциональное состояние эндотелиальных клеток сосудов, что снижает риск возникновения и прогрессирования эндотелиальной дисфункции и развития тяжелой сосудистой патологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, неврологии, терапии, лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки эффективности сосудистой терапии по содержанию аннексин-V позитивных и негативных эндотелиальных клеток в крови. Способ заключается в том, что у пациентов до назначения лекарственных препаратов и в динамике терапии проводят забор периферической венозной крови, ультрацентрифугированием выделяют эндотелиоциты, проводят их инкубацию с ПТС-меченным аннексином-V, затем подсчитывают эндотелиоциты с помощью иммерсионного микроскопа в 10 полях зрения и при преобладании количества аннексин-V негативных эндотелиоцитов над аннексин-V позитивными эндотелиоцитами говорят о низкой задействованности эндотелия сосудов в патологическом процессе или об эффективной сосудистой терапии, при преобладании аннексин-V позитивных эндотелиоцитов над аннексин-V негативными эндотелиоцитами говорят о высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс или о неэффективной сосудистой терапии: в норме средне статистически количество циркулирующих эндотелиоцитов 1-3, аннексин-V позитивных - 0; при эндотелиальной дисфункции 1 степени циркулирующих эндотелиоцитов 4-6, из которых 1-3 аннексин-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 2 степени циркулирующих 7-12, из которых 4-6 аннексии-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 3 степени циркулирующих эндотелиоцитов 13-18, из которых аннексии-V позитивные 7-10; при эндотелиальной дисфункции 4 степени циркулирующих эндотелиоцитов 19-25, аннексии-V позитивные 12-24, при критической эндотелиальной дисфункции с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений циркулирующих эндотелиоцитов более 25, все аннексии-V позитивные. Использование заявляемого способа позволяет провести обоснованный выбор лекарственных препаратов и их доз, улучшающих морфологическое и функциональное состояние эндотелиальных клеток сосудов, что снижает риск возникновения и прогрессирования эндотелиальной дисфункции и развития тяжелой сосудистой патологии. 2 пр., 2 ил.

Способ оценки эффективности сосудистой терапии по выраженности эндотелиальной дисфункции, включающий забор периферической венозной крови у пациентов до назначения лекарственных препаратов и в динамике терапии, ультрацентрифугированием выделяют эндотелиоциты, проводят их инкубацию с FITC-меченным аннексином-V, отличающийся тем, что подсчитывают эндотелиоциты с помощью иммерсионного микроскопа в 10 полях зрения и при преобладании количества аннексин-V негативных эндотелиоцитов над аннексин-V позитивными эндотелиоцитами говорят о низкой задействованности эндотелия сосудов в патологическом процессе или об эффективной сосудистой терапии, при преобладании аннексин-V позитивных эндотелиоцитов над аннексин-V негативными эндотелиоцитами говорят о высокой вовлеченности эндотелия в патологический процесс или о неэффективной сосудистой терапии: в норме среднестатистически количество циркулирующих эндотелиоцитов 1-3, аннексин-V позитивных - 0; при эндотелиальной дисфункции 1 степени циркулирующих эндотелиоцитов 4-6, из которых 1-3 аннексин-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 2 степени циркулирующих 7-12, из которых 4-6 аннексин-V позитивные; при эндотелиальной дисфункции 3 степени циркулирующих эндотелиоцитов 13-18, из которых аннексин-V позитивные 7-10; при эндотелиальной дисфункции 4 степени циркулирующих эндотелиоцитов 19-25, аннексин-V позитивные 12-24, при критической эндотелиальной дисфункции с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений циркулирующих эндотелиоцитов более 25, все аннексин-V позитивные.