ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭЗА Российский патент 2013 года по МПК A61K38/06 A61K33/24 A61P7/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к бионеорганической химии и медицине, а именно к области получения лекарственных препаратов, и может быть использовано в бионеорганической химии, фармакологии, медицине и ветеринарии.

Предшествующий уровень техники

Тотальная гемодепрессия той или иной степени выраженности имеет место практически в ста процентах случаев при проведении химиотерапии в онкологии, антибиотикотерапии хронических гнойных заболеваний в хирургии, при гемодиализе, в случае массовых поражений при природных и техногенных катастрофах. Лекарственные средства для лечения гемодепрессии: препараты на основе эритропоэтина и колониистимулирующих факторов, тромбопоэтины, - являются высокомолекулярными продуктами биотехнологического синтеза пептидной природы. Одним из недостатков этих лекарственных средств являются опасные для здоровья побочные эффекты, включая негативное влияние на эндогенную продукцию собственных стимуляторов гемопоэза, необходимость лечения ими преимущественно в условиях стационара, низкотемпературное хранение, практически неприемлемое для средств неприкосновенного запаса. Производство стимуляторов эритропоэза (эритропоэтины), лейкопоэза (нейпоген), тромбопоэза требует сложных технологических приемов. Эритропоэтины, нейпоген, тромбопоэтины не пригодны для создания средств неприкосновенного запаса на случай массовых поражений при природных и техногенных катастрофах.

Поэтому существует необходимость в разработке стимулятора кроветворения с терапевтической эффективностью не ниже, чем у средств селективной стимуляции гемопоэза: эритропоэтина, колониистимулирующих факторов, тромбопоэтина, - обеспечивающих возможность использования в качестве средства неприкосновенного запаса на случай чрезвычайных ситуаций с большим количеством раненых и пораженных, нуждающихся в гемостимуляторах.

Сущность изобретения

Задачей данного изобретения являлось создание средства для стимулирования гемопоэза всех кровяных ростков, не оказывающего негативного влияния на эндогенную продукцию собственного гемопоэза, и также физиологически сложившееся взаимодействие эндогенных стимуляторов гемопоэза и кровяных ростков. Такое средство предпочтительно должно иметь длительный срок хранения.

Данная задача решается тем, что предложена комбинация бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевой соли и координационных соединений, образованных палладием, медью и (γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицином (средство по изобретению).

Целесообразно, когда в такой комбинации мольное соотношение бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевой соли: палладия: меди находится в диапазоне 100-10000: 1-10: 1-10, например 1000: 1: 1.

В такой комбинации в качестве источника палладия может быть взят цис-диаминодихлорпалладий, а в качестве источника меди - медь двухлористая.

Предложенная комбинация может быть получена путем окисления литиевой соли -(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина с применением цис-диаминодихлорпалладия и меди двухлористой.

Такая комбинация может применяться в терапии, в частности в качестве стимулятора гемопоэза.

Предложена также фармацевтическая композиция, содержащая указанную комбинацию в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые эксципиенты.

Такая композиция обладает активностью стимулятора гемопоэза.

Предложен также способ стимулирования гемопоэза, при котором нуждающемуся в этом пациенту вводят комбинацию или фармацевтическую композицию по изобретению.

Подробное описание изобретения

Предложенная комбинация способна стимулировать все кровяные ростки, не оказывает негативного влияния на эндогенную продукцию собственных стимуляторов гемопоэза, а также физиологически сложившееся взаимодействие эндогенных стимуляторов гемопоэза и кровяных ростков. Указанную комбинацию можно длительно хранить при комнатной температуре.

Глутатион, гамма-глутаминил-цистеинил-глицин, представляет собой трипептид, образованный остатками трех аминокислот: глутаминовой кислоты, цистеина и глицина.

Глутатион содержится во всех живых организмах и имеет важное значение для окислительно-восстановительных реакций в связи со способностью сульфгидрильной группы (SH-) цистеина вступать в обратимую реакцию:

Восстановленный глутатион (GSH) в данном описании обозначен как (γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицин. Окисленная форма глутатиона (GSSG) обозначена как бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицин.

Если не указано иное, под глутатионом в данном описании подразумевается восстановленный глутатион.

Глутатион способен образовывать соли с катионами. GSSGLi₂ обозначает дилитиевую соль глутатиона.

Комбинация по изобретению содержит d-металлы. Источниками el-металлов, палладия и меди могут служить их различные соли, которые при растворении в воде приводят к образованию комплексных соединений. В частности, при внесении в водный раствор простых солей меди(II), таких как CuCl₂ или СuВr₂, происходит их аквотация, сопровождающаяся последующим гидролизом и образованием в растворе олигоядерных аквагидроксокомплексов меди(II). Палладий также может быть добавлен в виде его подходящих солей, в частности цис-диаминодихлорпалладия.

Реакция получения средства по изобретению GSSGLi₂/Pd/Cu=1000/1/1 соответствует уравнению:

При каталитическом окислении тиолов RSH одной из наиболее важных функций палладия является образование координационных соединений - продуктов присоединения к иону палладия тиолат-ионов RS^-, с последующим их окислением и разрушением координационного полиэдра.

Экспериментальные исследования каталитических систем с применением медно-палладиевых катализаторов показывает их значительно большую каталитическую эффективность по сравнению с биядерными тиолатмостиковыми соединениями палладия(II). В отличие от водных растворов окисленного глутатиона GSSG, содержащих тиолатные комплексы меди , водные растворы, содержащие Pd-Cu катализаторы, по данным ¹H ЯМР, ИК спектроскопии и ВЭЖХ устойчивы к процессам разложения.

Исследования показывают, что в Pd-Cu катализаторах соотношения Pd:Cu оптимально лежат в пределах от 1:0.2 до 1:2.

Для процессов мягкого селективного окисления GSH до GSSG можно сделать вывод о том, что биядерные тиолатмостиковые комплексы палладия(II) выполняют основную функцию катализаторов окисления, а тиолатные комплексы меди(I) следует отнести к химическим сайтам, меняющим их каталитическую активность или, говоря иначе, управляющим их каталитической активностью.

Таким образом, сочетание функциональных биядерных палладиевых координационных соединений, например формулы , с бидентатномостиковой координацией глутатиона с управляющим сайтом типа , образующимся из солей меди СиХ₂ (где Х=Сl^- или Вr^-), превращающихся в среде тиолов в соответствующие тиолатные производные комплексов меди(I), показывает один из наиболее эффективных подходов к управлению активностью каталитических систем на основе комплексов палладия и .

Образование комплексного соединения, включающего Cu, Pd и GSH в сопоставимых количествах, обеспечивает биологический эффект предложенной комбинации.

Для получения фармацевтических композиций по изобретению используют фармацевтически приемлемые эксципиенты. В частности, это неорганические или органические носители. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут быть использованы, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза и т.п. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для регулирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты и другие необходимые компоненты.

В общем, все продукты и способы по изобретению альтернативно могут включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих компонентов и стадий, раскрытых в данном описании или известных специалисту из уровня техники, и такие продукты или способы по изобретению могут дополнительно или альтернативно исключать какой-либо компонент, или стадию, или объект, который использован в продукте или способе, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения.

Конкретные примеры осуществления изобретения

Пример 1. Получение средства по изобретению бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: цис-диаминодихлорпалладий: медь двухлористая (GSSGLi₂/Cu=1000/1/1)

Для проведения реакции 330 г (1,074 моль) восстановленного глутатиона суспендируют в 3100 мл воды. К полученной суспензии при постоянном перемешивании добавляют 39,67 г (0,537 моль) карбоната лития. После окончания выделения углекислого газа реакционную массу охлаждают и добавляют 0,1135 г (0,537 ммоль) цис-диаминодихлорпалладия и 0,0915 г (0,537 ммоль) хлорида меди 2-водного. К полученному раствору при постоянном перемешивании добавляют 304,5 г 6% р-ра (0,537 моль) перекиси водорода, контролируя температуру, значения которой не должны превышать 15°С. После добавления перекиси полученный раствор выдерживают при комнатной температуре 1,5 часа, фильтруют через фильтр 0,22µ и лиофилизируют. Выход бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: цис-диаминодихлорпалладий: медь двухлористая (в соотношении 1000:1:1) составляет 99%.

Пример 2. Влияние средства по изобретению на состояние кроветворения при циклофосфан-индуцированной гемодепрессии.

Средство по изобретению представляет соединение катионов лития и анионов дисульфида глутатиона в сочетании с комплексами биоэлемента меди и палладия. Образующие продукт химического синтеза соединения характеризует широкий спектр биологической активности, включая стимуляцию кроветворения (миело- и лимфопоэз).

Цель исследования. Определение способности средства по изобретению стимулировать гемопоэз.

Приготовление растворов исследуемых соединений для проведения исследования.

Синтезированное вещество хранили при 4°С; непосредственно перед началом эксперимента вещество растворяли в физиологическом растворе. Раствор стерилизовали пропусканием через фильтры 0,22 мкм Millex-GS (Millipore) в стерильном ламинарном боксе.

Раствор средства по изобретению маркировали V-002.

В качестве средств сравнения использовали стимулятор эритропоэза эпокрин, стимулятор миелопоэза лейкомакс, рекомендованные средства лечения токсической лейкопении пентоксил и метилурацил.

Модели исследования

Исследование было проведено на белых рандомбредных крысах-самцах массой 140-160 г. Стимуляцию гемопоэза исследовали на моделях радиационной, токсической и травматической гемодепрессии.

Модель радиационной панцитопении

Для облучения крыс ионизирующим излучением использовали гамма-установку ИГУР-1. Поглощенная доза гамма-излучения на каждое животное составляла 3.5 Гр, при мощности дозы 1,4 Гр/мин.

Животных подвергали облучению гамма-квантами на установке ИГУР-1. Поглощенная доза составляла 2,3 Гр (ЛД30/45), при мощности дозы 1,4 Гр/мин.

Модель циклофосфановой миелосупрессии

Циклофосфан вводился однократно под кожу спины в дозе 100 мг/кг (растворитель - вода для инъекций).

Модель свинцовой анемии

Половозрелым крысам-самцам массой 170-180 г ежедневно на протяжении 7 дней подкожно вводится раствор уксуснокислого свинца (ацетата свинца) в дозе 50 мг/кг. Через 10 дней гемоглобин и эритроциты снижаются в среднем на 70-80% от исходного уровня. Препараты начинают вводить с 11-го дня от начала эксперимента.

Модель бензольной лейкопении

Половозрелым крысам-самцам массой 170-180 г ежедневно на протяжении 7 дней подкожно вводится бензол в дозах 0,1 мг/кг. Через 8 дней количество лейкоцитов снижается в 2-2,5 раза, а гранулоцитов - в 10 раз по сравнению с исходным уровнем. Препараты начинают вводить с 9-го дня от начала эксперимента.

Модель посттравматической анемии (синдром длительного сдавления)

Нанесение компрессионной травмы. В целях нанесения компрессионной травмы мягкие ткани задних конечностей белых крыс и мышей подвергали сдавлению с помощью тисков специальной конструкции. Сдавление продолжалось 2,5-3 ч. У белых мышей перед постановкой основного эксперимента определяли время сдавления, при котором гибель мышей в последующие после нанесения травмы 3 сут достигала примерно 50%; это время находилось в пределах 2,5-3 ч. Для крыс время компрессии, необходимое для развития анемии, но не вызывающее гибели животных, составило 3 ч.

Средство по изобретению (V-002) вводили внутримышечно (бедро) один раз в день в течение 10 дней в дозе 10 мг/кг. Животные были разбиты на следующие группы: интактные животные (однократно подкожно физраствор), контрольная группа (животные, подвергнутые воздействию, но не получавшие лечения), опытные группы (животные подвергнутые, воздействию, получавшие лечение средством по изобретению или препарат сравнения). Каждая группа включала 10 животных.

Гематологические исследования проводили унифицированными стандартными методами.

Результаты

Описание результатов исследований, доказывающих эффективность предлагаемой разработки на экспериментальных моделях

Результаты экспериментальных исследований представлены в таблицах 1-6.

Таблица 1 Общий анализ крови самцов крыс с радиационной цитопенией на 3 сут после гамма-облучения (3,5 Гр) Исследуемые показатели Биологический контроль Контроль облучения Лейкомакс + облучение V-002 + облучение Гемоглобин, г/л 15.2±0.16 13.0±0.2 12.9±0.22 12.5±0.25 Эритроциты, 10¹²/л 6.7±0.16 6.2±0.19 6.2±0.23 5.8±0.15 СОЭ, мм/ч 2.5±0.85 2±0.37 3.3±0.80 3.2±0.54 Тромбоциты, 10⁹л 368±21.5 370±35.3 387±17.4 502±36.4** Ретикулоциты, % 1.8±0.2 0.08±0.005* 0.3±0.1** 0,5±0,1** Лейкоциты, 10⁹/л 9.2±0.35 0.58±0.026* 1.38±0.11* 1.49±0.11* Палочкоядерные 0.3±0.1 0 2.5±0.3 0 нейтрофилы, %         Сегментоядерные 16±2.5(1472) 18.7±2.4(108)* 42±1.6(580) ** 38±1.6(566) ** нейтрофилы, %         Эозинофилы, % 2±0.3 0 0 0 Моноциты, % 5.7±0.5 11.6±0.6 10.3±0.5 10.6±0.6 Лимфоциты, % 75.5±1.4(6945) 71±1.8(411)* 45±1.6(621) 51.3±0.(764)** - в скобках - абсолютное количество клеток; - * - р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем; - ** - р 0,05 - по сравнению с облученным контролем.

Таблица 2 Общий анализ крови самцов крыс с радиационной цитопенией на 10 сут после гамма-облучения (3,5 Гр) Исследуемые показатели Биологический контроль Контроль облучения Лейкомакс + облучение V-002 + облучение Гемоглобин, г/л 15.2±0.16 13.8±0.56 13.2±0.68 13.9±0.31 Эритроциты, 10¹²/л 6.7±0.16 6.0±0.25 6.2±0.18 6.1±0.08 СОЭ, мм/ч 2.5±0.85 1.8±0.31 3.2±0.80 2.0±0.37 Тромбоциты, 10³/л 368±21.5 167±19.3* 126±10.0* 228±13.8** Ретикулоциты, % 1.8±0.2 1.0±0.1 1,5±0.2 1,33±0.2 Лейкоциты, 10⁹/л 9.2±0.35 2.5±0.15* 3,41±0,09* 4,88±0.18** Палочкоядерные 0.3±0.1 0 2±0.3 2±0.2 нейтрофилы, %         Сегментоядерные 16±2.5(1472) 32±1.9(800) * 50.4±0.6(1719)** 63.3±1.6(3456) нейтрофилы, %       ** Эозинофилы, % 2±0.3 1.7±0.3 1.7±0.2 0.3±0.1 Моноциты, % 5.7±0.5 8.7±0.4 5.3±0.5 5.7±0.4 Лимфоциты, % 75.5±1.4(6945) 57.7±1.1(1443)* 41±0.9(1398)* 22.6±0.8(877) * - в скобках - абсолютное количество клеток - * - р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем - ** - р 0,05 - по сравнению с облученным контролем

Таблица 3 Общий анализ крови самцов крыс с радиационной цитопенией на 15 сут после гамма-облучения (3,5 Гр) Исследуемые показатели Биологический контроль Контроль облучения Лейкомакс + облучение V-002 + облучение Гемоглобин, (г/л) 15.2±0.16 13.3±0.68 11.6±0.63 12.5±0.52 Эритроциты, 10¹²/л 6.7±0.16 5.7±0.17 5.7±0.26 5.2±0.12 СОЭ, мм/ч 2.5±0.85 2.3±0.61 2.7±0.49 4.8±0.70 Тромбоциты, 10³/л 368±21.5 273±56.9 290±38.3 498±72.9** Ретикулоциты, % 1.8±0.2 1.2±0.2 1.7±0,3 2±0.2 Лейкоциты, 10⁹/л 9.2±0.35 2.9±0.04 3.6±0.22 5.6±0.19** Палочкоядерные 0.3±0.1 0 0 0.7±0.3 нейтрофилы, %         Сегментоядерные 16±2.5(1472) 14.3±1.6(415) 20.3±2.4(731) 26±2.2(1456) нейтрофилы, %         Эозинофилы, % 2±0.3 0 0.6±0.2 0 Моноциты, % 5.7±0.5 12.3±0.6 6.2±0.8 9.0±0.7 Лимфоциты, % 75.5±1.4 73.4±1.8(2129) 72.5±1.4(2610) 64.3±0.9(3600) - в скобках - абсолютное количество клеток        

Таблица 4 Анализ костного мозга самцов крыс с радиационной цитопенией на 3 сут после гамма-облучения (3,5 Гр) Исследуемые показатели Биологический контроль Контроль облучения Лейкомакс + облучение V-002 + облучение Кол-во ЯСК в голени 10⁶ 10.0±0.49 0.7±0.08 2.6±0.64** 2.7±0.75** Эритробласты, % 0.8±0.05 0.4±0.02 0.5±0.02 0.5±0.02 Пронормоциты, % 0.6±0.02 0.5±0.03 0.5±0.02 0.4±0.05 Базофильные 7.3±0.03 6.2±0.13 5.8±0.19 5.7±0.21 нормоциты, %         Полихроматофильные 8.4±0.04 8.3±0.07 8.3±0.09 8.5±0.09 нормоциты, %         Оксифильные 5.7±0.3 8.5±0.11 8.9±0.1 9.0±0.08 нормоциты, %         Число митозов красной 0.5±0.02 0.2±0.06 0.1±0.03 0.15±0.03 крови, %         Миелобласты, % 2.4±0.2 1.1±0.09 1.4±0.06 1.6±0.07** Промиелоциты, % 4.3±0.21 2.1±0.05 2.4±0.04 2.5±0.06 Миелоциты, % 0.2±0.02 6.0±0.13 6.2±0.07 6.1±0.04 Метамиелоциты, % 7.2±1.01 7.4±0.13 7.5±0.13 7.5±0.07 Палочкоядерные 11.8±0.04 8.3±0.08 9.6±0.22 9.3±0.21 нейтрофилы, %         Сегментоядерные 21.5±1.3 33.8±0.49 31.9±0.23 32.6±0.6 нейтрофилы, %         Эозинофилы, % 7.5±0.03 5.4±0.1 5.7±0.14 5.8±0.6 Число митозов белой 0.5±0.01 0.1±0.04 0.2±0.06 0.3±0.05** крови, %         Лимфоциты, % 8.2±0.08 7.6±0.18 7.2±0.1 7.1±0.06 Плазматические клетки, 1.5±0.01 1.0±0.07 1.1±0.03 1.0±0.03 %         Моноциты,% 0.9±0.2 1.1±0.14 1.1±0.04 1.2±0.04 Ретикулоциты, % 2.5±0.2 0.4±0.06 0.4±0.05 0.4±0.03 Мегакариобласты и 0.4±0.01 0.6±0.04 0.8±0.07** 0.8±0.05** мегакариоциты, %         Недифференцированные 0.5±0.02 0.8±0.09 0.6±0.04 0.5±0.02 бласты, %        

Таблица 5 Анализ костного мозга самцов крыс с радиационной цитопенией на 10 сут после гамма-облучения (3,5 Гр) Исследуемые показатели Биологический контроль Контроль облучения Лейкомакс + облучение V-002 + облучение Кол-во ЯСК в голени, 10⁶ 10.0±0.49 0.9±0.08 4.2±0.46** 6.6±0.47** Эритробласты, % 0.8±0.05 0.6±0.03 0.6±0.03 0.6±0.02 Пронормоциты, % 0.6±0.02 0.5±0.03 0.5±0.02 0.6±0.04 Базофильные нормоциты, 7.3±0.03 7.1±0.14 7.2±0.09 7.0±0.06 %         Полихроматофильные 8.4±0.04 8.4±0.1 8.6±0.11 8.6±0.13 нормоциты, %         Оксифильные нормоциты, 5.7±0.3 7.3±0.08 8.9±0.09 8.9±0.06 %         Число митозов красной 0.5±0.02 0.3±0.01 0.3±0.006 0.3±0.05 крови, %         Миелобласты, % 2.4±0.2 1.6±0.07 2.5±0.04** 2.6±0.04** Промиелоциты, % 4.3±0.21 2.0±0.06 3.1±0.03** 3.2±0.06** Миелоциты, % 0.2±0.02 5.2±0.11 6.4±0.07** 6.6±0.07** Метамиелоциты, % 7.2±1.01 8.2±0.13 7.3+0.1 7.5±0.09 Палочкоядерные 11.8±0.04 11.1±0.33 9.5±0.2 9.8±0.3 нейтрофилы, %         Сегментоядерные 21.5±1.3 30.1±0.64 25.9±0.56 25.7±0.4 нейтрофилы, %         Эозинофилы, % 7.5±0.03 4.5±0.3 5.7±0.16 5.6±0.15 Число митозов белой 0.5±0.01 0.2±0.09 0.31±0.04 0.38±0.07 крови, %         Лимфоциты, % 8.2±0.08 7.9±0.19 8.2±0.09 7.9±0.16 Плазматические клетки, 1.5±0.01 1.3±0.05 1.3±0.08 1.2±0.03 %         Моноциты,% 0.9±0.2 1.6±0.08 1.5±0.08 1.4±0.1 Ретикулоциты, % 2.5±0.2 1.4±0.05 1.4±0.08 1.9±0.04** Мегакариобласты и 0.4±0.01 1.4±0.02 0.5±0.02 0,7±0.03** мегакариоциты, %         Недифференцированные 0.5±0.02 0.6±0.02 0.8±0.03** 0.8±0.03** бласты, %        

Таблица 6 Анализ костного мозга самцов крыс с радиационной цитопенией на 15 сут после гамма-облучения (3,5 Гр) Исследуемые показатели Биологический контроль Контроль облучения Лейкомакс + облучение +V-002 + облучение Кол-во ЯСК в голени 10⁶ 10.0±0.49 1.0±0.1 6.2±1.4** 7.6±1.03** Эритробласты, % 0.8±0.05 0.7±0.01 0.8±0.03 0.8±0.02 Пронормоциты, % 0.6±0.02 0.5±0.03 0.6±0.02 0.7±0.03 Базофильные 7.3±0.03 7.2±0.2 7.4±0.03 7.2±0.05 нормоциты, %         Полихроматофильные 8.4±0.04 8.5±0.1 8.4±0.05 8.5±0.15 нормоциты, %         Оксифильные 5.7±0.3 7.0±0.06 8.8±0.04** 8.8±0.09** нормоциты, %         Число митозов красной 0.5±0.02 0.4±0.06 0.4±0.04 0.4±0.01 крови, %         Миелобласты, % 2.4±0.2 2.3±0.07 3.0±0.04** 3.0±0.05** Промиелоциты, % 4.3±0.21 4.2±0.05 4.5±0.05 4.6±0.14 Миелоциты, % 0.2±0.02 6.3±0.12 6.9±0.03** 7.0±0.12** Метамиелоциты, % 7.2±1.01 8.5±0.14 8.1±0.02 8.2±0.17 Палочкоядерные 11.8±0.04 12.4±0.2 11.9±0.11 12.4±0.16 нейтрофилы, %         Сегментоядерные 21.5±1.3 21.3±0.7 19.5±0.19 18.8±0.78 нейтрофилы, %         Эозинофилы, % 7.5±0.03 6.0±0.18 5.1±0.09 5.3±0.07 Число митозов белой 0.5±0.01 0.3±0.07 0.4±0.04 0.4±0.01 крови, %         Лимфоциты, % 8.2±0.08 8.3±0.12 8.1±0.03 7.8±0.16 Плазматические клетки, 1.5±0.01 1.3±0.13 1.3±0.03 1.4±0.05 %         Моноциты, % 0.9±0.2 1.7±0.13 1.4±0.02 1.7±0.08 Ретикулоциты, % 2.5±0.2 2.1±0.18 2.5±0.03 2.5±0.11 Мегакариобласты и 0.4±0.01 0.5±0.03 0.6±0.05* 0.9±0.06** мегакариоциты, %         Недифференцированные 0.5±0.02 1.0±0.06 0.8±0.04 0.8±0.04 бласты, %        

Проведенные исследования показали, что оба препарата обладают гемостимулирующей активностью и способствуют коррекции постлучевой миелосупрессии. Обращает на себя внимание тот факт, что уже на 3 сутки после облучения экспериментальных животных на фоне введения Лейкомакса и V-002 количество лейкоцитов периферической крови возрастает по сравнению с уровнем облученного контроля в среднем в 3 раза. При этом аналогичная динамика выявлена и в количестве ядросодержащих клеток костного мозга этих животных. Выявлено также увеличение (в среднем в 2 раза) числа митозов белой крови и количества сегментоядерных нейтрофилов. На 10 сутки после радиационного воздействия оба изучаемые препарата в равной степени оказывают стимулирующее действие на миелоидный росток, что проявляется в росте числа лейкоцитов. Однако следует отметить, что количество сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови облученных животных, получавших препараты, возрастает (в абсолютных величинах в 2 - 3 раза. Наибольшей активностью на данный период исследования обладает V-002. Кроме того, применение этого препарата способствует активации мегакариобластов, что нашло свое отражение в предотвращении падения числа тромбоцитов в периферической крови облученных животных (10 сут исследования). К 15-м суткам после радиационного воздействия уровень тромбоцитов не только достигает фоновых значений, но и превышает его в среднем в 1,5 раза. В этот период отмечен существенный рост (почти в 2 раза по сравнению с облученным контролем) количества лейкоцитов в периферической крови в группе животных, получавших V-002, а также увеличение (в среднем в 3 раза) числа сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.

Влияние препарата V-002 на характеристики периферической крови и миелограммы при их введении интактным животным и животным с циклофосфановой цитопенией отражено в таблицах 7 и 8.

Таблица 7 Общий анализ крови самцов крыс с цитопенией на фоне предварительного введения циклофосфана в дозе 100 мг/кг и лечения V-002 Исследуемые показатели Интактные (физраствор) Циклофосфан V-002, 10 мг/кг Циклофосфан + V-002,10 мг/кг 10-й день Гемоглобин, г/дл 12,9±04 11,0±0,4* 14.0±02 12 9±0.4 Гематокрит, г % 47.3±1.0 32.4±0.9* 52,7±1,1 46.7±10 Эритроциты, 10¹² /л 6.2±0.3 3,2±0,4* 6,5±0.3 5.4±03 Цветовой показатель (МСН), пг 17,5±0,3 15,1±0.4* 18,5±0,5 16,2±0,2 СОЭ, мм/ч 5, 5±0.2 7,4±0,3* 5,6±0,2 5,8±0,2 Тромбоциты, 10⁹/л 680±54 420±42* 730±65 703±56 Ретикулоциты, % 2.1±0,3 0* 2.1±0,1 2.0±05 Лейкоциты, 10⁹/л 7,1±02 1,8±03* 7,4±0 3 5.2±0.3* Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.5±0.3 25±07 0 0,6±0.3 Сегментоядерные нейтрофилы, % 12,3±3.0 54,4±57* 15,3±2.9 27,3±2,7 Базофилы, % 0 0 0 0 Лимфоциты, % 79.2±3.5 33,6±2.5* 80,3±3,9 58,0±3,8 Моноциты, % 2,5±0.2 7.9±0,7* 1.8±0.7 3,8±0,5 Эозинофилы, % 2,3±0,3 0 2,1±0,3 2,0±0,5 Плазматические клетки, % 0.5±0.2 0 0 2,9±0,3* Нормоциты, % 0 0 0 1,0±0,4 Полихроматофилы, % 0 1,2±0.5 0 0,7±0,3 15-й день Гемоглобин, г/дл 13.4±0,3 10.4±0.3* 14.1±0.3 13,2±0,3 Гематокрит г % 48.5±0.9 31.3±1.1* 51.1±0.8 48,2±0,6 Эритроциты, 10¹²/л 6.3±0.2 3,3±0,3* 6.2±0.2 5,8±0,3 Цветовой показатель (МСН), Пг 17.6±0.3 14.6±0.4* 18.2±0.4 17,0±0,4 СОЭ, мм/ч 5.4±0.2 7.6±0.3* 5.1±0.3 5,5±0,3 Тромбоциты, 10⁹/л 695±60 340±47* 724±54 724±42 Ретикулоциты, % 20±0.2 0.3±0.3 2,4±0.4 1,3±0,4 Лейкоциты, 10⁹/л 7.6±0.3 1.4±02* 8.2±0.2 5,4±0,3* Палочкоядерные нейтрофилы, % 05±03 1.9±0.6 0 0,9±0.,2 Сегментоядерные нейтрофилы, % 13.2±2.7 51,3±4.4* 14.0±2,1 34,8±2,3 Базофилы, % 0 0 0 0 Лимфоциты, % 781±2.4 35.5±2.8* 78,5±2,6 58,3±3,3* Моноциты, % 2.1±0.2 6.3±0.5* 2,4±0,3 3,0±0,3 Эозинофилы, % 2.0±0.4 0.3±0.2 1,7±0,1 0 Плазматические клетки, % 0.6±0.2 0 0,5±0,2 2,2±0,4* Нормоциты. % 0 0 0 0 Полихроматофилы, % 0 2.2±1.1 0 1,3±0,7 Примечание: значком 't) отмечены достоверные отличия от интактной группы на доверительном уровне Р>0,95.

Таблица 8 Миелограмма самцов крыс с цитопенией на фоне предварительного введения циклафосфана в дозе 100 мг/кг и лечения V-002 в дозах 5 и 10 мг/кг Исследуемые показатели Интактные (физраствор) Циклофосфан V-002, 10 мг/кг Циклофосфан + V-002, 10 мг/кг     10-й день     Кол-во ЯСК клеток, 10⁶/л 73.2±4,6 34,7±5,0* 76.4±5,0 60.4±6,6 Недифференцированные бласты, % 0.5±0.1 0* 0.5±0.2 0.4±0.2 Проэритробласты, % 0 0 0.1±0.05 0.1±0.05 Эритробласты, % 0.8±0.1 0.4±0,1 1.0±0.2 1.7±0.3* Пронормобласты, % 0.6±0.1 0* 0.7±0.1 0.6±0.1 Базофильные нормобласты, % 7.4±0.8 2.8±0.4* 7.3±0.6 6.4±0.4 Полихроматофильные нормобласты, % 8.3±1.0 3.2±1.2* 8.6±1.5 11.0±1.9* Эозинофильные нормобласты, % 5.8±1.2 2.4±0.8 5.2±1.3 8.0±1.4 Число митозов красной крови, % 0.56±0.10 0.19±0.08* 0,60±0.12 0.75±0.16 Миелобласты, % 2.2±0.5 1.2±0.2* 2.4±0.3 2.0±0.6 Промиелоциты, % 4.0±0.4 1.8±0.5* 4.3±0.6 4.0±0.6 Миелоциты, % 6.2±0.7 3.4±1,1* 6,1±0.7 5.5±0.9 Метамиелоииты, % 8.1±1.2 4.5±0.8* 8.3±1.0 6.8±1.4 Палочкоядерные нейтрофилы, % 11.8±1.4 4.2±1.0* 12.0±1,4 7,7±1.3 Сегментоядерные нейтрофилы, % 16.6±3.2 35.2±4.3* 17.2±4.1 32.5±4.8* Эозинофилы, % 7.5±1.1 3.2±1.0* 7.6±1.1 7.0±1.3 Базофилы, % 0 0 0 0.1±0.05 Число митозов белой крови, % 0.45±0.13 0.17±0.04* 0.44±0.12 0.37±0.13 Пролимфоциты, % 0.1±0,1 0 0 0.1±0.1

Исследуемые показатели Интактные (физраствор) Циклофосфан V-002, 10 мг/кг Циклофосфан + V-002, 10 мг/кг Лимфоциты, % 8.0±1.0 2.1±0,5* 8.5±1.3 6.1±0.8 Плазматические клетки, % 1.4±0.3 0 1.2±0.3 0.8±0.2* Промоноциты, % 0 0 0 0 Моноциты, % 0.7±0.2 0.2±0.05* 0.8±0.2 0.4±0.2 Ретикулоциты, % 2.4±0.5 1.0±0.3 2.2±0.4 2.3±1.0 Мегакариоциты и мегакариобласты, % 0.43±0.08 0.13±0.05* 0.53±0.00 0.34±0.09 Кол-во клеток, 10¹¹/л 71.6+4.5 35.5+4.8* 74.6±5.6 63.6±6.2 Недифференцированные бласты, % 0.5±0.1 0* 0.5±0.1 0.6±0.3 Проэритробласты, % 0 0 0.1±0.05 0.1±0.05 Эритробласты, % 0.9±0.2 0.3±0,1* 1.2±0.2 1.8±0.3* Пронормобласты, % 0,7±0.1 0.2±0.1 0.7±0.1 0.5±0.1 Базофильные нормобласты, % 7.5±0.5 2.3±0.5* 7.7±0.8 6,6±1.0 Полихроматофильные нормобласты, % 8.8±1.2 3.0±0.8* 8.8±1.2 10.3±1.6* Эозинофильные нормобласты, % 5.7±1.0 2.8±0.9 5.4±1.4 7.0±1.5 Число митозов красной крови, % 0.57±0.11 0.20±0.10* 0.63±0.12 0.74±0.12 Миелобласты, % 2.1±0.2 1.4±0.4 2.2±0.4 2.1±0.8 Промиелоциты, % 40±0.6 1.5±0.3* 4.0±0.8 3.7±0.7 Миелоциты, % 6.1±0.6 3.3±0.5* 6.2±0.5 5.3±0.6 Метамиелоциты, % 8.4±1.0 3.5±0.9* 8.2±1.1 6.7±1.1 Палочкоядерные нейтрофилы, % 11.2±1.1 3.5±0.7* 11.7±1 3 7.9±1.6 Сегментоядерные нейтрофилы, % 16.2±2.7 38,6±48* 16.4±40 31.1±3.9* Эозинофилы, % 7,4±1.0 3.1±0.9* 7,7±1.3 7,1±1.3 Базофилы, % 0 0 0 0 Число митозов белой крови, % 0,46±0,10 0,15±0,04* 0,45±0,14 0,35±0.10 Пролимфоциты, % 0 0 0.3±0.2 0.2±0.1 Лимфоциты, % 8.1±0.7 2.0±0.4* 8.2±1,2 6.3±2.0 Плазматические клетки, % 1.2±0.2 0 1.7±0.4 1.0±0.5 Промоноциты, % 0 0 0.1±0.05 0 Моноциты, % 0.8±0.2 0.1±0.05* 0.8±0.2 0.5±0.2 Ретикулоциты, % 2.3±0.5 1.4±0.3 2.7±0.5 1.9±0.6 Мегакариоциты и мегакариобласты, % 0.51±0.12 0.18±0.08* 0.55±0.08 0.47±0.10

Введение V-002 оказывает явный стимулирующий эффект, в большей степени выраженный на красном ростке кроветворения. При этом можно говорить о том, что эритроидные процессы вытесняли лейкоцитарные. Кроме того, наблюдалось расширение гранулоцитарного ростка. Появление в крови незрелых форм свидетельствует об активации костно-мозгового кроветворения.

Наблюдается улучшение общего состояния, положительная динамика массы тела. Гибели животных не отмечалось.

Эффективность препарата V-002 на модели свинцовой анемии

Данные анализов периферической крови и миелогаммы животных, получавших «V-002» и препарат сравнения, представлены в таблицах 9 и 10.

Таблица 9 Гематологические показатели животных экспериментальных групп в модели свинцовой анемии Исследуемые показатели Интактные Ацетат Pb V-002 Ацетат Pb + V-002 Ацетат Pb + эпокрин Гемоглобин, г/дл 12.9±0.4 5.0±0.4* 14.0±0.2 - 9.2±0.3* 10.0±0.4* Гематокрит, г% 46.6±1.0 19.9±0.9* 49.1±1.1 30.8±0.9* 33.0±1.0* Эритроциты, 10¹²/л 6.3±0.3 3.1±0.4* 6.8±0.3 4.4±0.3* 4.8±0.3* Цветовой показатель (МСН), пг 20.5±0.3 16.1±0.4* 20.6±0.5 18.6±0.2 18.3±0.2 СОЭ, мм/ч 5.5±0.2 17.4±0.3* 5.6±0.2 13.8±0.3 14.1±0.2 Ретикулоциты, % 2.1±0.3 10.1±0.8 2.0±0.5 8.4±0.2* 8.0±0.5* Полихроматофилы, % 0.2±0.05 1.2±0.2* 0.2±0.05 0.7±0.2 0.8±0.2 Эритроциты с базофильной зернистостью, 1/млн 140±100 1100±300* 160±100 400±200* 520±200* Тромбоциты, 10⁹/л 680±54 320±42* 722±86 469±50* 503±56* Лейкоциты, 10⁹/л 7.1±0.2 5.1±0.3* 7.4±0.3 6.3±0.2* 6.0±0.3* Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.5±0.3 0.6±0.7 0.5±0.2 0.6±0.3 0.5±0.4 Сегментоядерные нейтрофилы, % 14.3±3.0 16.4±3.7 14.3±2.9 16.0±3.3* 17.3±2.7 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Лимфоциты, % 79.8±2.1 73.5±2.5 78.5±1.9 74.9±2.8 73.5±2.3 Моноциты, % 2.5±0.2 4.9±0.7* 2.8±0.7 4.8±0.6* 3.8±0.5 Эозинофилы, % 2.3±0.3 4.0±0.3 2.1±0.3 3.2±0.3 4.0±0.5* Плазматические клетки, % 0.5±0.2 0.6±0.2 0.3±0.2 0.3±0.2 0.7±0.3 *) - достоверные отличия от интактной группы при Р>0.95.

Таблица 10 Показатели миелограммы животных экспериментальных 5 групп в модели свинцовой анемии Исследуемые показатели Интактные Ацетат Pb V-002 Ацетат Pb + V-002 Ацетат Pb + эпокрин Кол-во клеток, 10¹¹/л 73.2±3.6 57.7±4.0* 76.4±5.0 64.2±4.2 63.4±6.6 Недифференцированные бласты, % 0.1±0.1 1.9±0.6 0.5±0.2 0.2±0.2 0.5±0.2 Проэритробласты, % 0 0 0.1±0.05 0 0.1±0.05 Эритробласты, % 0.8±0.1 0.6±0.1 1.0±0.2 1.6±0.3* 1.7±0.3* Пронормобласты, % 0.6±0.1 0.5±0.1 0.7±0.1 0.5±0.2 0.6±0.1 Базофильные нормобласты, % 7.4±0.8 6.9±0.4 7.3±0.6 5.9±0.7 7.0±0.4 Полихроматофильные нормобласты, % 9.3±1.0 8.5±1.2 8.6±1.5 7.2±1.7 8.5±1.9 Эозинофильные нормобласты, % 5.8±1.2 6.3±0.8 5.2±1.3 5.5±1.8 5.4±1.4 Число митозов красной крови, % 0.56±0.10 0.35±0.08* 0.60±0.12 0.71±0.18 0.75±0.16 Миелобласты, % 2.2±0.5 3.8±0.2 2.3±0.3 2.9±0.8 3.3±0.6 Промиелоциты, % 4.0±0.4 3.8±0.5 4.3±0.6 3.6±0.7 4.0±0.6 Миелоциты, % 6.2±0.7 4.4±1.1 6.1±0.7 5.8±0.8 5.5±0.9 Метамиелоциты, % 9.1±1.2 7.5±0.8 8.3±1.0 7.6±1.4 6.8±1.4 Палочкоядерные нейтрофилы, % 11.8±1.4 14.2±1.0 12.0±1.4 12.9±1.5 12.7±1.3 Сегментоядерные нейтрофилы, % 16.6±3.2 20.2±4.3 17.2±4.1 18.8±5.5 18.5±4.8 Эозинофилы, % 7.5±1.1 6.2±1.0 7.6±1.1 7.2±1.2 7.0±1.3 Базофилы, % 0 0 0 0 0.1±0.05 Число митозов белой крови, % 0.45±0.13 0.32±0.04* 0.44±0.12 0.52±0.11 0.48±0.13 Пролимфоциты, % 0.1±0.1 0 0 0.3±0.1 0.2±0.1 Лимфоциты, % 8.3±1.0 6.9±0.5* 8.5±1.3 7.4±1.1 7.1±0.8 Плазматические клетки, % 0.8±0.3 0 1.2±0.3 0.7±0.2 0.5±0.2 Промоноциты, % 0 0 0 0.1±0.05 0 Моноциты, % 0.7±0.2 0.6±0.05 0.8±0.2 0.5±0.2 0.7±0.2 Ретикулоциты, % 2.4±0.5 4.2±0.3* 2.2±0.4 3.1±0.8 3.3±1.0 Мегакариоциты и мегакариобласты, % 0.43±0.08 0.45±0.05* 0.53±0.09 0.42±0.12 0.34±0.09

Таким образом, введение препарата «V-002» оказывало явный стимулирующий эффект, в большей степени выраженный на красном ростке кроветворения. При этом можно говорить о том, что эритроидные процессы вытесняли лейкоцитарные. Кроме того, наблюдалось расширение гранулоцитарного ростка. Появление в крови незрелых форм свидетельствовало об активации костномозгового кроветворения.

Стимулирующий эффект препарата был более выражен на фоне экспериментальной анемии, вызванной введением уксуснокислого свинца.

По отношению к препарату сравнения эпокрину исследуемый препарат «V-002» обладал практически такой же эффективностью.

Миелостимулирующая активность V-002 в условиях экспериментальной бензольной лейкопении

Ежедневное введение в течение 7 дней бензола крысам в дозе 0.1 мг/кг оказывает серьезное гемо- и миелотоксическое действие. При этом в наиболее значительной степени сокращается количество гранулоцитарных клеток, абсолютное число которых снижается в 8-10 раз по сравнению с нормальным уровнем.

Следует отметить, что в контрольной группе, получавшей только бензол, погибли четыре крысы на 10, 11, 12 и 14 сутки. Практически все животные в этой группе были вялыми, астеничными, выглядели истощенными, их шерсть имела неопрятный вид.

Исследование крови и костного мозга, проведенное в этой группе спустя 10 дней после прекращения введения бензола, показало значительное снижение количества всех форменных элементов крови. Общее число лейкоцитов оказалось сниженным более чем на 50%, при этом в наибольшей степени затронутыми оказались клетки гранулоцитарного ряда. Аналогичную картину показало и исследование костного мозга: количество кардиомиелоцитов было сокращено почти на 50% от нормы, доля гранулоцитов сокращена, митотическая активность была также снижена.

В группе, получавшей «V-002», не погибло ни одно из животных. При этом отмечалось улучшение общего состояния животных, положительная динамика массы тела. Гематологические исследования показали, что содержание гемоглобина, а также число всех клеток крови, хотя и оставалось сниженным по отношению к уровням у интактных животных, находилось практически на нижней границе нормы. Появление в крови незрелых форм свидетельствовало об активации костно-мозгового кроветворения. Последнее подтверждают и результаты миелографического исследования - общее число миелокариоцитов было ближе к норме, чем в контроле, митотическая активность - выше, чем даже у интактных животных.

Введение пентоксила и метилурацила также снижало гемо- и миелотоксическое действие бензола. Однако в группах, получавших препараты сравнения, отмечалась гибель животных: пентоксил - одной крысы на 14 день; метилурацил - две на 11 и 14 день.

Судя по результатам гематологических и миелографических исследований, оба препарата сравнения по своему гемопоэтическому эффекту уступают новому препарату «V-002».

Данные анализов периферической крови и миелогаммы животных, получавших «V-002» и препараты сравнения в модели бензольной лейкопении, представлены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11 Гематологические показатели животных экспериментальных групп в модели бензольной лейкопении Исследуемые показатели Интактные Бензол Бензол + V-002 Бензол + пентоксин Бензол + метилурацил Гемоглобин, г/дл 12.9±0.4 8.0±0.4* 11.8±0.2 11.1±0.4 9.9±0.4* Гематокрит, г % 46.6±1.0 29.5±0.9* 40.5±0.8* 39.1±1.4* 35.8±1.3* Эритроциты, 10¹²/л 6.3±0.3 4.2±0.4* 5.8±0.3 5.5±0.3* 5.1±0.4* Цветовой показатель (МСН), пг 20.5±0.3 10.0±0.4* 20.3±0.4 20.2±0.4 19.4±0.4* СОЭ, мм/ч 5.5±0.2 17.4±0.3* 9.2±0.3* 10.7±0.7* 9.4±1.3* Тромбоциты, 10⁹/л 680±54 415±66* 493±52 522±43 460±61* Лейкоциты, 10⁹/л 7.1±0.2 2.8±0.3* 5.2±0.3* 4.6±0.2* 4.5±0.4* Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.5±0.3 0.1±0.1* 0.6±0.2 0.3±0.2 0.4±0.2 Сегментоядерные нейтрофилы, % 14.3±3.0 4.4±5.7* 10.4±2.4 11.0±2.8 10,2±3.3 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Лимфоциты, % 79.8±2.1 85.4±3.5 82.4±4.4 80.4±4.4 81.0±2.6 Моноциты, % 2.5±0.2 4.8±0.6* 2.9±0.7 3.1±0.3 4.1±0.4* Эозинофилы, % 2.3±0.3 3.9±0.3 2.7±0.3 3.1±0.6 3.8±0.2 Плазматические клетки, % 0.5±0.2 0 0 0.6±0.2 0 Нормоциты, % 0 0 0 0 0 Полихроматофилы, % 0 1.2±0.5 0 0.6±0.4 0.3±0.2 *) - достоверные отличия от интактной группы при Р>0.95.

Таблица 12 Показатели миелограммы животных экспериментальных групп в модели бензольной лейкопении Исследуемые показатели Интактные Бензол Бензол + V-002 Бензол + пентоксин Бензол + метилурацил Кол-во клеток, 10¹¹/л 73.2±3.6 34.7±5.0* 52.4±5.0 50.0±6.1 48.5±2.3* Недифференцированные бласты, % 0.1±0.1 1.1±0.2* 0.6±0.2 1.0±0.3 0.8±0.3 Проэритробласты, % 0 0 0.1±0.05 0.1±0.05 0 Эритробласты, % 0.8±0.1 1.2±0.2* 1.0±0.2 0.8±0.2 1.5±0.3 Пронормобласты,% 0.6±0.1 1.4±0.3* 1.2±0.4 0.9±0.3 1.1±0.3* Базофильные нормобласты, % 7.4±0.8 9.5±0.6* 7.8±0.5 8.2±0.7 8.8±0.8 Полихроматофильные нормобласты, % 9.3±1.0 12.2±1.2* 10.2±0.8 11.4±1.0 11.0±1.3* Эозинофильные нормобласты, % 5.8±1.2 7.4±0.8 6.4±0.7 7.3±1.1 7.5±1.2 Число митозов красной крови, % 0.56±0.10 0.37±0.08* 0.64±0.10 0.60±0.21 0.52±0.18 Миелобласты, % 2.210.5 2.2±0.2 1.8±0.3 1.6±0.4 0.8±0.4* Промиелоциты, % 4.0±0.4 4.4±0.4 3.5±0.6 3.6±0.5 2.6±0.5* Миелоциты, % 6.2±0.7 6.4±1.1 5.5±0.9 5.8±0.8 4.8±0.6 Метамиелоциты, % 9.1±1.2 10.2±0.8 7.9±1.0 7.9±0.8 9.5±1.0 Палочкоядерные нейтрофилы, % 11.8±1.4 6.5±1.0* 12.6±1.4 9.2±1.3 9.7±1.2* Сегментоядерные нейтрофилы, % 16.6±3.2 9.2±2.1* 14.1±3.0 12.4±2.4 10.1±1.8* Эозинофилы, % 7.5±1.1 8.1±1.0* 6.0±1.1 5.6±0.4 4.2±0.9 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Число митозов белой крови, % 0.45±0.13 0.33±0.10 0.68±0.18 0.57±0.16 0.53±0.14 Пролимфоциты, % 0.1±0.1 0 0 0.4±0.2 0 Лимфоциты, % 8.3±1.0 12.4±0.8* 10.7±1.3 11.2±1.1* 13.4±1.5 Плазматические клетки, % 0.8±0.3 1.8±0.3 2.0±0.5* 2.4±0.4* 2.8±0.5* Промоноциты, % 0 0 0 0.1±0.05 0 Моноциты, % 0.7±0.2 1.1±0.1 1.0±0.1 0.4±0.2 0.7±0.3 Ретикулоциты, % 2.4±0.5 2.1±0.3 2.1±0.5 1.8±0.4 2.2±0.6 Мегакариоциты и мегакариобласты, % 0.43±0.08 0.53±0.05 0.47±0.15 0.33±0.11 0.41±0.15

Таким образом, введение препарата «V-002» на фоне экспериментальной бензольной лейкопении оказало явный лечебный эффект: в группе, получавшей препарат, гибели животных не отмечалось, в то время как в контроле она составила 3 из 10. Введение препарата оказало явный гемопоэтический эффект, в большей степени выраженный на наиболее подавленном - гранулоцитарном - ростке кроветворения.

При этом «V-002» оказался даже более эффективным, чем официнальные препараты пентоксил и метилурацил.

Экспериментальное изучение влияния препарата "V-002" на резистентность организма (выживаемость) и эритропоэз при синдроме длительного сдавления

Результаты исследования

Влияние V-002 на резистентность организма

У белых мышей, подвергнутых компрессионной травме в течение 2,5-3 ч, летальность в первые 3 сут посткомпрессионного периода составила 43,7%. Введение физиологического раствора по лечебно-профилактической схеме статистически достоверного влияния на выживаемость животных не оказало (гибель составила 33,3%; р>0,05). В то же время назначение V-002 привело к существенному повышению выживаемости травмированных животных: в опытных группах мышей, получивших V-002, гибель находилась в пределах 5-10% (р<0,05). Полученные результаты представлены в табл.13.

В следующей серии опытов, выполненных на белых крысах, оценивали эффективность лечебного действия V-002 при анемии, формирующейся в посткомпрессионном периоде и вызванной, в основном, угнетением эритропоэза (табл.16.). У крыс определяли число эритроцитов в периферической крови перед сдавлением, а затем через 1, 2, 4, 8, 11 и 14 сут после компрессионной травмы. Установлено, что в течение первых двух суток число эритроцитов в периферической крови оставалось в пределах нормы, хотя и имелась некоторая тенденция к его повышению (на 2-3%). Однако с 4-х сут количество эритроцитов начинало снижаться, достигая максимально низкого уровня (65,3% от исходного значения - к 11 сут наблюдения) примерно через неделю после травмы. У крыс контрольной группы, которым вводили физраствор, достоверно низкое количество эритроцитов оставалось и в течение остального времени наблюдения, т.е. до 14 сут. В то же время у животных опытных групп, получавших V-002, процент снижения количества эритроцитов был в 2 раза ниже, и к концу срока наблюдения число эритроцитов в периферической крови в значительной степени увеличивалось, достигая 94% от нормы, что на 20-25% выше, чем в контроле.

Анализ результатов, представленных в настоящем разделе, позволяет заключить, что назначение препарата V-002 в дозе 10 мг/кг в виде курса из 3-4 инъекций белым мышам в условиях компрессионной травмы повышает общую резистентность травмированных животных. Это подтверждается достоверным снижением процента летальности в группах, получивших препарат, по сравнению с контролем (35-45% - в контроле и 5-10% - в опыте). Препарат V-002 при внутримышечном введении в дозе 10 мг/кг в течение 14 суток способствует восстановлению эритропоэза у белых крыс, перенесших компрессионную травму.

Таким образом, средство по изобретению - бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: цис-диаминодихлорпалладий: медь двухлористая (GSSGLi₂/Pd/Cu=1000/1/1) характеризует способность восстанавливать физиологически необходимый уровень гемопоэза, нарушения которого возникли вследствие радиационных, токсических и травматических воздействий. Терапевтическая эффективность действия средства по изобретению сопоставима с действием средств селективной стимуляции гемопоэза препаратов на основе эритропоэтина, колониистимулирующих факторов, тромбопоэтина. В отличие от них средство по изобретению характеризует возможность длительного хранения при комнатной температуре и использования в качестве средства неприкосновенного запаса на случай чрезвычайных ситуаций с большим количеством раненых и пораженных, нуждающихся в гемостимуляторах.

Пример 3. Получение лекарственной формы средства по изобретению

В емкости для приготовления раствора вместимостью 1,0 л к 0,8 л воды для инъекций добавляют 13,6 г ацетата натрия 3-водного, 60 г субстанции средства по изобретению и перемешивают до растворения с последующим доведением общего объема до 1,0 л. Определяют значение рН с помощью рН-метра и доводят 20% уксусной кислотой до рН 6,0±0,2. Проводят стерилизующую фильтрацию с использованием стерилизующего фильтра с размером пор 0,22 мкм и проводят розлив (1 мл - 1 ампула) в стеклянные ампулы. В результате получают 970 ампул (с учетом потерь), содержащих композицию для внутривенного или внутримышечного введения, соответствующую требованиям нормативной документации в течение 3 лет и имеющую следующий состав:

Средство по изобретению 60 г Ацетат натрия, 3-водный 13,6 г Уксусная кислота до рН 6,0 Вода до 1000 мл

Пример 4. Получение лекарственной формы средства по изобретению

В емкости для приготовления раствора вместимостью 1,0 л к 0,8 л воды для инъекций добавляют 13,6 г ацетата натрия 3-водного, 30 г субстанции средства по изобретению и перемешивают до растворения с последующим доведением общего объема до 1,0 л. Определяют значение рН с помощью рН-метра и доводят 20% уксусной кислотой до рН 6,0±0,2. Проводят стерилизующую фильтрацию с использованием стерилизующего фильтра с размером пор 0,22 мкм и проводят розлив (1 мл - 1 ампула) в стеклянные ампулы. В результате получают 970 ампул (с учетом потерь), содержащих композицию для внутривенного или внутримышечного введения, соответствующую требованиям нормативной документации в течение 3 лет и имеющую следующий состав:

Средство по изобретению 30 г Ацетат натрия, 3-водный 13,6 г Уксусная кислота до рН 6,0 Вода до 1000 мл

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и представляет собой обладающую активностью стимулятора гемопоэза комбинацию бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевой соли и координационных соединений, образованных палладием, медью и (γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицином, где мольное соотношение бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: палладий: медь находится в диапазоне 100-10000:1-10:1-10. Изобретение обеспечивает стимулирование гемопоэза без негативного влияния на эндогенную продукцию собственного гемопоэза, 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 пр., 14 табл.

1. Обладающая активностью стимулятора гемопоэза комбинация бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевой соли и координационных соединений, образованных палладием, медью и (γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицином, где мольное соотношение бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: палладий: медь находится в диапазоне 100-10000:1-10:1-10.

2. Комбинация по п.1, где мольное соотношение бис-(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина дилитиевая соль: палладий: медь составляет 1000:1:1.

3. Комбинация по п.1, где в качестве источника палладия выбран цис-диаминодихлорпалладий.

4. Комбинация по п.1, где в качестве источника меди выбрана медь двухлористая.

5. Комбинация по п.1, полученная путем окисления литиевой соли -(γ-L-глутамил)-L-цистеинил-глицина с использованием цис-диаминодихлорпалладия и меди двухлористой.

6. Комбинация по любому из пп.1-5 для применения в терапии.

7. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью стимулятора гемопоэза, содержащая комбинацию по пп.1-6 и фармацевтически приемлемые эксципиенты.

8. Способ стимулирования гемопоэза, при котором нуждающемуся в этом пациенту вводят комбинацию по любому из пп.1-6 или фармацевтическую композицию по п.7.