ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ПЕДИФЕНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПОРАЖЕНИЯ НЕЛЕТАЛЬНЫМИ РАЗДРАЖАЮЩИМИ СРЕДСТВАМИ Российский патент 2013 года по МПК A61K31/137 A61K9/08 A61K9/12 A61P23/02 A61P27/02 A61P39/04 A62B29/00 

Предполагаемое изобретение относится к области медицины, а именно, к химико-фармацевтической промышленности, конкретно, к производству лекарственных средств, предназначенных для лечения поражения нелетальными раздражающими средствами. Основным действующим лекарственным соединением предлагаемой фармацевтической композиции является педифен.

Педифен представляет собой гидрохлорид N,N-диэтил-5,5-дифенил-2-пентиниламина.

(C₆H₅)₂CN-СН₂-С≡С-CH₂N(С₂Н₅)₂·HCl

Педифен относится к производным ацетиленовых аминов, обладающих н-холинолитическим действием.

Под термином «педифен» в медицинской литературе понимаются как соли педифена, так и его основание. В практической медицине этот термин используется для обозначения как растворов самого педифена, так и фармацевтических композиций, содержащих педифен.

Субстанция педифена выпускается ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России № Р N002888/01 от 06.06.2008.

Фармако-токсикологическая оценка педифена дана в диссертации Онуфриенко М.Э. (Онуфриенко М.Э., Фармако-токсикологическая оценка педифена, Спб, 1995 г.). Установлена антистрессовая, иммуностимулирующая и ростстимулирующая активность педифена. Другие виды фармакологической активности в литературе не описаны.

Россия вместе с другими странами подписала Конвенцию о запрещении Химического оружия, к которому отнесены все отравляющие вещества смертельного действия. Ряд веществ раздражающего действия (ирританты) отныне, как и в других странах, рассматриваются в качестве «полицейских« газов и как химическая основа гражданского газового оружия. Несмотря на то, что ирританты в газовом оружие используются в раздражающих концентрациях, они могут вызывать химические ожоги глаз, которые характеризуются длительностью течения патологического процесса и развитием осложнений (посттравматический кератит, кератоувеит, травматическая катаракта и др.),, характеризующиеся длительностью течения патологического процесса и в ряде случаев приводящие к снижению остроты зрения и инвалидизации потерпевших. Это обусловливает необходимость разработки эффективных и безопасных средств профилактики и терапии поражений веществами раздражающего действия.

Известно лечение унитиолом химической травмы глаз, вызванной ирритантом хлорацетофеноном (Муковский Л.А., Панчешена В.М., Бржевский В.В. и др., Токсикол. вестник, 2009, №6, стр.7-10). Этому же вопросу посвящена диссертация Панчешиной В.М. «Особенности поражений глаз аэрозольным газовым оружием и их лечение» Спб, 2007 г. Где делается вывод о том, что в настоящее время наиболее эффективным способом оказания медицинской помощи при поражении глаз лакриматорами являются промывания конъюнктивальной полости раствором унитиола или частыми инстилляциями натрия азапентацена полисульфоната. Однако для этого необходимы условия стационара.

Наиболее близким к данному техническому решению является применение 4% спрея лидокаина для лечения поражения нелетальными раздражающими средствами (Заявка на патент РФ №2011125817/15 от 24.06.2012 г.). Недостатком известного лечения являются относительно частое побочное действие лидокаина, вызывающего аллергическую реакцию, в том числе анафилактический шок, и ограничения по дозам этого преапрата.

Задачей настоящего изобретения является улучшенный способ лечение поражений нелетальными раздражающими средствами.

Поставленная задача решается тем, что в предлагаемой фармацевтической композиции в виде спрея содержится в качестве действующее вещество - педифен. В предлагаемой фармацевтической композиции и экспериментальной части под термином педифен описывается гидрохлорид N,N-диэтил-5,5-дифенил-2-пентиниламина.

Как установлено в ходе настоящего исследования Педифен обладает выраженным местноанестезирующим действием. При изучении терминальной анестезии установлено, что по активности он не уступает дикаину, а при проводниковой превосходит новокаин.

Педифен обладает стимулирующим воздействием на центральную нервную систему.

Педифен является антиоксидантом. В опытах in vitro было показано, что Педифен, примерно в 10 раз превосходит аскорбиновую кислоту, уступая по активности токоферолу. Введение Педифена «интактным» животным сопровождается снижением свободно-радикального окисления тканей и повышением их антиокислительной активности. Предупреждает активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ). У Педифена обнаружены и мембраностабилизирующие свойства, которые, возможно, также связаны с его антиокислительной активностью.

Педифен обладает выраженной спазмолитической активностью, превышая папаверин по данному показателю в 6,5 раз.

Показано, что педифен не обладает аллергенными свойствами.

Педифен обладает антимикробной активностью в отношении грамположительной (стафилококки) и грамотрицательной (синегнойная и кишечные палочки) микрофлоры, поэтому необходимость в консервантах при создании лекарственной формы отсутствует.

Согласно настоящему изобретению для лечения поражения нелетальными раздражающими средствами предлагается следующая фармацевтическая композиция:

Педифен 0,01-5,0 г Натрия хлорид 0,1-10,0 г Вода для инъекций до 100 мл

Преимущественное содержание педифена в растворе 0,1-1,0 г в 100 мл раствора.

Отличительными особенностями предлагаемой фармацевтической композиции являются использование исходных ингредиентов (в указанных выше соотношениях), и хлористого натрия для создания оптимального осмотического давления композиции.

Учитывая особенности слизистой оболочки глаза, причем подвергнутого действию раздражающего средства, необходимо точное соблюдение соотношений исходных ингредиентов. Использование педифена ниже нижнего предела не позволяет гарантировать наступление желаемого эффекта. При концентрации педифена более 10% ограничены возможности разрешенного использования препарата по данному назеачению.

Окончательный подбор концентраций был основан на данных биологического исследования.

Возможно использование в предлагаемой композиции смягчающих компонент, например, гипромеллозы, гидроксипилгуара или гиалуроной кислоты, однако в этом нет особенной необходимости.

Преимущества педифена перед лидокаином в том, что последний часто оказывает аллергическое и даже анафилактическое действие.

Подострое (14 дней) ежедневное интраконъюнктивальное применение лекарственной формы педифена экспериментальным животным в дозах, превышающих терапевтические для человека в десятки-сотни раз, не оказывало вредного воздействия на основные адаптационные системы (нервную, сердечно-сосудистую, кроветворную, выделительную, антитоксическую), обмен веществ, общее состояние и развитие, основные гомеостатические параметры организма.

Следует отметить также отсутствие у лекарственной формы препарата Педифен 0.25% раздражающего действия на ткани в месте аппликации (интраконъюнктивальном). Все это относится как к грызунам, так и негрызунам, т.е. свидетельствует об универсальном характере безвредности нового препарата.

В результате изучения возможного аллергенного действия препарата Педифен 0.25% в виде спрея на морских свинках обоего пола было показано, что он не вызывает реакции общей анафилаксии при применении препарата даже в дозах, в 10 раз больше терапевтической. Кроме того, конъюнктивальные пробы, реакции дегрануляции тучных клеток и реакции иммунных комплексов были отрицательными. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что препарат не обладает аллергезирующим действием.

Проведенные эксперименты показали, что введение препарата Педифен 0.25% в виде спрея не оказывает иммунотоксического действия

Нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают притязания заявителей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Для приготовления фармацевтической композиции в виде спрея берут примерно 70 мл воды для инъекций (ФС 42-2620-97), в которой растворяют необходимое количество педифена гидрохлорида (НД 42-14192-06) (в пересчете на безводное вещество), натрия хлорида (ФСП 42-0474-4119-03 или Евр. Фарм.) и перемешивают в течение 15 минут, доводят до необходимого объема водой для инъекций (ФС 42-2620-97), фильтруют через стерильный фильтр 0,22 µм, разливают в тару, обычно снабженную распылителем, упаковывают в полиэтиленовый пакет и стерилизуют радиационно.

На основании проведенных предварительных биологических исследований нами изучена предлагаемая в настоящем патенте фармакологическая композиция под условным названием «педифен 0,25% в виде спрея» следующего состава:

Педифен гидрохлорид (НД 42-14192-06) (в пересчете на безводное вещество) 0,25 г Натрия хлорид (ФСП 42-0474-4119-03, Евр. Фарм.) 0,6 г Вода для инъекций (ФС 42-2620-97) до 100 мл

ОЦЕНКА ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА ПЕДИФЕН 0.25%

Для определения показателей острой токсичности препарат per os вводили белым мышам и крысам обоего пола внутрижелудочно (в/ж) через атравматичный металлический зонд в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Расчеты средних летальных доз проводили по В.Б. Прозоровскому (Фармакология и токсикология, 1978, №4, с.497-502). Для достижения больших доз препарата введение осуществляли повторно с интервалом 20-30 минут в течение 4 часов. Контрольные животные получали аналогичные по объемам введения растворителя - воды для инъекций.

Дозирование осуществляли на общую массу препарата (действующего начала и вспомогательных веществ), условно принимая, что 1 мл весит приблизительно (с учетом удельного веса) 1 г.

Для изучения воздействия препарата при закапывании в глаза его закапывали в конъюнктивальные мешки и на роговицу в максимальных дозах. Контрольным животным капали тем же способом аналогичную дозу воды для инъекций. После этого животные помещались на 14 дней в клетки для наблюдения.

Зависимые от доз эффекты препарата Педифен 0.25% представлены в таблицах 1-4.

Таблица 1 Летальные эффекты (пало/всего) лекарственной формы препарата Педифен 0.25% при в/ж введении мышам-самцам Доза, г/кг 3 5 7.5 10 15 Педифен 0.25% 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 ЛД₅₀>15.0 г/кг

Таблица 2 Летальные эффекты (пало/всего) лекарственной формы препарата Педифен 0.25% при в/ж введении мышам-самкам Доза, г/кг 3 5 7.5 10 15 Педифен 0.25% 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 ЛД₅₀>15.0 г/кг

Таблица 3 Летальные эффекты (пало/всего) лекарственной формы препарата Педифен 0.25% при в/ж введении крысам-самцам Доза, г/кг 6 8 10 12 15 Педифен 0.25% 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 ЛД₅₀>15.0 г/кг

Таблица 4 Летальные эффекты (пало/всего) лекарственной формы препарата Педифен 0.25% при в/ж введении крысам-самкам Доза, г/кг 6 8 10 12 15 Педифен 0.25% 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 ЛД₅₀>15.0 г/кг

Полученные данные показывают, что половых различий в показателях острой токсичности лекарственной формы препарата не проявляется. Это позволяет объединить данные по летальности у самцов и самок и выполнить расчет летальных доз без учета пола. Как можно видеть, различия в значениях ЛД₅₀ лекарственной формы препарата Педифен 0.25% для двух видов лабораторных животных отсутствуют.

Внутрижелудочное введение

Гибели мышей и крыс при введении доз лекарственной формы до максимального значения (15 г/кг) не наблюдалось. Первым и единственным внешним проявлением токсического действия являлось кратковременное оцепенение животных, которое сохранялось первые минуты после введения. В дальнейшем состояние животных не отличалось от контрольной группы. Гибели животных в контрольных группах не отмечалось. В первый и второй дни отмечалось незначительное снижение потребленя корма. В остальные дни их состояние не отличалось от обычного.

Половых различий в течение интоксикации не отмечалось.

Результаты измерения массы тела животных, переживших интоксикацию в максимальной дозе представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5 Влияние острого внутрижелудочного лекарственной формы препарата
Педифен 0.25% на массу тела мышей, г Сроки исследования Интактные Контроль «Педифен» 1 2 3 4 Самцы 14 дней Фон 19.9±0.3 20.1±0.4 19.6±0.1 7 дней 20.7±0.2 19.9±0.3 21.0±0.1 14 дней 21.9±0.4 21.8±0.5 22.0±0.3 Самки 14 дней Фон 18.7±0.1 19.2±0.4 19.7±0.1 7 дней 20.4±0.1 21.0±0.3 20.1±0.4 14 дней 21.0±0.4 21.4±0.4 20.4±0.1

Таблица 6 Влияние острого внутрижелудочного лекарственной формы препарата
Педифен 0.25% на массу тела крыс, г Сроки исследования Интактные Контроль «Педифен» 1 2 3 4 Самцы 14 дней Фон 180.2±1.4 180.6±1.1 180.6±1.4 7 дней 182.8±1.4 194.7±2.1 180.2±1.3 14 дней 200.9±1.7 201.8±1.2 198.3±1.7 Самки 14 дней Фон 174.6±1.9 181.3±1.0 177.2±0.9 7 дней 186.4±1.9 187.6±1.6 188.6±1.7 14 дней 188.6±2.4 189.8±1.9 190.0±1.8

Анализ полученных данных показывает некоторое снижение средней массы тела у всех животных, получавших препарат, на второй день после введения. Этот же эффект отмечался и в контроле (хотя и в меньшей степени), так что он может быть вызван общим стрессом.

Педифен обладает сравнительно низкой токсичностью. Не кумулирует.

Изучение токсичности при закапывании в глаза

При закапывании препарата в глаза, гибели животных не наблюдалось. Объем вводимого препарата при определении параметров острой токсичности при интраконъюнктивальной аппликации соответствовал максимально технически возможному для введения в течение дня. Соответственно для крыс и кроликов указанные объемы равны 1,0 и 8,0 мл. Никаких внешних патологических проявлений, которые можно было бы принять за признаки интоксикации, не отмечалось. Однако, у животных, получавших модельный образец и воду для инъекций в глаза, отмечены гиперемия слизистых оболочек глаз, слезотечение. Достоверных изменений диаметра зрачка и реакции на свет (зрачковый рефлекс) не зарегистрировано. При обследовании животных через 24 часа у кроликов наблюдались симптомы конъюнктивита в легкой степени (гиперемия в 1 балл, серозное отделяемое из конъюнктивальной полости). У животных контрольной группы указанные симптомы были менее выражены. Результаты пробы с флуоресцеином у кроликов всех экспериментальных групп отрицательные (отсутствие органических повреждений роговицы).

Состояние и поведение подопытных животных в дальнейшие сроки наблюдения не отличалось от поведения контрольных и во всех группах соответствовало нормальному состоянию и поведению интактных крыс и кроликов. Динамика массы тела животных во всех опытных группах также не отличалась от контроля.

Данные вскрытия (некропсии)

На вскрытии крыс и мышей в конце эксперимента (через 14 дней) различий между животными, получавшими препарат, не установлено.

Шерсть опытных животных имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Питание животных было удовлетворительным.

При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось.

Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы имели овальную или округлую форму, однородный розоватый или желтоватый цвет и умеренную плотность.

Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и плотность, розовато-красноватый цвет. Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию.

Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца была коричневатой, плотной.

Поверхность легких имела бледно-розовую окраску; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка внелегочных бронхов была гладкой, блестящей, бледно-розовой.

Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотноватую консистенцию.

Поджелудочная железа была бледно-розовой, дольчатой.

Величина и форма печени изменений не представляли. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию.

Величина и форма почек не отличались от контроля, капсула легко снималась. Поверхность органа была гладкой, однородной коричневато-сероватой окраски. На разрезе почек отчетливо различались корковое и мозговое вещество.

Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или яичек не отличались от контроля.

Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество головного мозга имело умеренную плотность. Расширения желудочков мозга не наблюдалось.

У животных, получивших препараты и воду для инъекций внутрижелудочно, видимых нарушений со стороны органов желудочно-кишечного тракта не наблюдалось. Слизистая пищевода была блестящей, гладкой, бледного цвета. Величина и форма желудка изменений не представляли. Его просвет был заполнен пищевым содержимым. Гиперемии, эрозий, кровоизлияний, свидетельствующих о раздражающем действии введенного препарата, не наблюдалось. Просвет 12-перстной кишки изменений не представлял, слизистая кишки была блестящей, гладкой, бледно-розовой. Слизистая оболочка тонкой кишки была так же бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки имела слегка сероватый оттенок, была гладкой, блестящей.

У животных, получавших модельный образец и воду для инъекций в глаза, отмечены гиперемия слизистых оболочек глаз, слезотечение. Достоверных изменений диаметра зрачка и реакции на свет (зрачковый рефлекс) не зарегистрировано. При обследовании животных через 24 часа у кроликов наблюдались симптомы конъюнктивита в легкой степени (гиперемия в 1 балл, серозное отделяемое из конъюнктивальной полости). У животных контрольной группы указанные симптомы были менее выражены. Результаты пробы с флуоресцеином у кроликов всех экспериментальных групп отрицательные (отсутствие органических повреждений роговицы).

В таблицах 7 и 8 приведены массовые коэффициенты внутренних органов мышей и крыс, усредненные по группам.

Таблица 7 Массовые коэффициенты (МК) органов у белых мышей при остром внутрижелудочном введении лекарственной формы препарата Педифен 0.25% (г/кг веса тела) Орган Интактные Контроль «Педифен» 1 2 3 4 Самцы 14 дней Сердце 3.3±0.1 3.2±0.2 3.6±0.09 Легкие с трахеей 6.4±0.2 6.4±0.2 6.2±0.09 Тимус 0.88±0.02 0.90±0.02 0.87±0.02 Печень 38.6±1.7 40.0±1.3 39.8±2.6 Селезенка 2.9±0.08 2.9±0.1 3.3±0.09 Почка (левая) 4.2±0.2 4.2±0.1 4.3±0.2 1 2 3 4 Надпочечники 0.18±0.01 0.18±0.01 0.17±0.01 Головной мозг 15.1±0.5 15.7±0.4 15.6±0.4 Яички или яичники 4.0±0.09 4.0±0.1 3.9±0.2 Самки 14 дней Сердце 3.4±0.3 3.4±0.2 3.2±0.3 Легкие с трахеей 6.5±0.1 6.7±0.2 6.7±0.2 Тимус 0.85±0.06 0.87±0.06 0.88±0.06 Печень 35.6±1.4 37.0±1.4 36.9±2.3 Селезенка 3.2±0.1 3.0±0.09 3.0±0.2 Почка (левая) 4.3±0.2 4.3±0.3 4.6±0.09 Надпочечники 0.17±0.009 0.15±0.01 0.17±0.01 Головной мозг 16.5±0.4 15.9±0.3 16.2±0.4 Яички или яичники 0.20±0.01 0.24±0.02 0.19±0.01

Таблица 8 Массовые коэффициенты (МК) органов у белых крыс при остром внутрижелудочном введении лекарственной формы препарата Педифен 0.25% (г/кг веса тела) Орган Интактные Контроль «Педифен» 1 2 3 4 Самцы 14 дней Сердце 3.8±0.02 3.8±0.1 3.7±0.03 Легкие с трахеей 7.4±0.09 7.2±0.2 7.6±0.07 Тимус 1.36±0.04 1.34±0.11 1.41±0.06 Печень 42.6±0.9 36.8±1.5 43.7±0.9 Селезенка 4.7±0.07 4.2±0.1 4.4±0.2 Почка (левая) 4.0±0.01 4.4±0.09 4.0±0.009 Надпочечники 0.12±0.002 0.10±0.02 0.10±0.001 Головной мозг 6.9±0.01 8.7±0.4 7.0±0.05 Яички или яичники 12.5±0.09 12.7±0.09 11.7±0.09 Самки 14 дней Сердце 3.4±0.03 3.6±0.02 3.6±0.02 Легкие с трахеей 8.2±0.07 8.4±0.07 8.3±0.1 Тимус 1.46±0.05 1.52±0.04 1.50±0.05 Печень 40.5±0.9 40.8±0.7 41.0±0.9 Селезенка 4.8±0.05 4.8±0.07 4.9±0.09 Почка (левая) 4.1±0.02 4.3±0.01 4.2±0.02 Надпочечники 0.12±0.001 0.11±0.001 0.10±0.001 Головной мозг 7.31±0.09 7.03±0.08 7.13±0.06 Яички или яичники 0.61±0.03 0.61±0.04 0.60±0.05

Анализ величин массовых коэффициентов не выявил каких-либо достоверных отличий как между группами животных, получавшими модельный образец препарата по отношению к контрольной группе.

Заключение по результатам исследования острой токсичности исследуемого лекарственной формы препарата:

Исследование острой токсичности на грызунах - нелинейных белых мышах и крысах - показало, что препарат Педифен 0.25% по параметрам острой токсичности относится к практически нетоксичным веществам. Об этом свидетельствуют следующие экспериментальные данные.

Значения ЛД₅₀ препарата Педифен 0.25% для беспородных белых мышей и крыс обоего пола при в/ж введении лежат заведомо выше 15 г/кг, что приблизительно в семьсот раз больше максимальной суточной дозы для человека - 20 мг/кг.

Препарат Педифен 0.25% при его остром в/ж введениях в дозах до 15 г/кг беспородным бельм мышам и крысам обоего пола не приводил к гибели животных, не вызывал макроскопических изменений головного мозга, внутренних и эндокринных органов, не вызывал дистрофии внутренних органов, что подтверждается величинами их массовых коэффициентов, а также не отмечалось его раздражающего действия на слизистые органов ЖКТ.

Интраконъюнктивальное введение препарата в максимально возможной дозе более 5 г/кг не оказывает выраженного раздражающего действия на слизистые оболочки глаз лабораторных животных.

В острых экспериментах по применению препарата Педифен 0.25% не отмечалось признаков, свидетельствующих о раздражающем действии препарата на слизистые органов ЖКТ и глаз лабораторных животных.

Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в 14-дневном периоде после острого применения, а также данные патоморфологических исследований позволяют отнести препарат Педифен 0.25% к VI классу относительно безвредных лекарственных веществ (Н.Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed.IV, Baltimore, 1975, 427 p.; K.K. Сидоров, 1973) (таблица 9). Состояние переживших острые эксперименты животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические в сотни раз.

Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии противопоказаний по показателям острой токсичности для клинических испытаний или медицинского применения препарата Педифен 0.25%.

Таблица 9 Степени токсичности лекарственных препаратов (по Hodge и Sterner) Степень токсичности Термин ЛД₅₀, однократно per os, крысы (мг/кг) ЛД₅₀, однократно i/v*, крысы (мг/кг) 1 Чрезвычайно токсично <1 <0.1 2 Высокотоксично 1-50 0.1-50 3 Умеренно токсично 50-500 5-50 4 Малотоксично 500-5000 50-500 5 Практически не токсично 5000-15000 500-1500 6 Относительно безвредно >15000 >1500 * - градации степеней токсичности при внутривенном пути введения определяются посредством умножения значений стандартных доз для оценки токсичности препарата при пероральном пути введения на коэффициент 0,1

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОДОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА ПЕДИФЕН 0.25% ПРИ ИНТРАКОНЪЮНКТИВАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ

Суточная терапевтическая доза для человека составляет по 2 капли в каждый глаз однократно, с возможностью повторного введения через 30 минут, но не более чем 0,8 мл однократно, с возможностью повторного введения через 30 минут, но не более чем 0,8 мл на взрослого человека. Максимальная терапевтическая доза для человека средней массой 60 кг составит 0,013 мл/кг (приблизительно 0,01 мл/кг). По правилам экстраполяции терапевтическая доза для грызунов в 5,7 раз больше, чем для человека, то есть составляет 0,057 мл/кг (0,006 мл/100 г). Это будет первая терапевтическая доза. Ее дозировали каплями с помощью автоматической микропипетки. Терапевтическая доза для кроликов массой от 2 кг по расчетам с использованием коэффициента перерасчета доз в 3 раза больше, чем для человека - 0,039 мл/кг (приблизительно 0,04 мл/кг). Для удобства дозирования и расчетов в качестве максимальной терапевтической дозы было решено принять 0,05 мл/кг.

Исследуемые дозы

1. Для крыс: 1 доза 0,006 мл в один глаз. Соответственно 0,012 мл в сутки - максимальная терапевтическая доза (0,06 мл/кг). 2-я доза составила по 0,018 мл в оба глаза. Соответственно 0,036 мл в сутки - трехкратная максимальная терапевтическая доза (0,18 мл/кг). 3-я доза составила по 0,6 мл в оба глаза, что составляет 0,12 мл в сутки (0,6 мл/кг), доза в 60 раз превышающая максимальную терапевтическую дозу для человека, или 12 капель на одно животное; закапывание производилось в несколько приемов в оба глаза.

2. Для кроликов: 1 доза 0,05 мл в один глаз. Соответственно 0,1 мл в сутки - максимальная терапевтическая доза (0,05 мл/кг). 2-я доза составила по 0,15 мл в оба глаза. Соответственно 0,3 мл в сутки - трехкратная максимальная терапевтическая доза (0,15 мл/кг). 3-я доза составила по 0,5 мл в оба глаза, что составляет 1,0 мл в сутки (0,5 мл/кг), доза в 50 раз превышающая максимальную терапевтическую дозу, или 10 капель на одно животное; закапывание производилось в несколько приемов в оба глаза.

Частота нанесения 1 раз в день в течение 14 дней.

Общая продолжительность наблюдения - 21 день.

Физиологические параметры регистрировались до начала эксперимента (фон), через 14 и 21 день.

Гематологические и биохимические параметры оценивали на 14 и 21 день исследования.

Макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов проводилось посмертно после окончания введения и в конце периода наблюдения.

При офтальмологическом исследовании у животных оценивали состояние слизистых оболочек, наличие роговичных рефлексов, измеряли величину зрачка (р) и ширину глазной щели (f) левого (s) и правого (d) глаз. В течение всего периода наблюдения у животных контрольной и опытных групп отечности или гиперемии слизистых не отмечалось.

В таблице 10 представлены результаты измерения величины зрачка и ширины глазной щели. При анализе представленных данных достоверных отличий показателей у всех экспериментальных групп не выявлено.

Таблица 10 Влияние лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на величину зрачка и ширину глазной щели у белых крыс (мм, М±m) Показатель Интактные Контроль Дозы препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг   М F М F М F М F М F Фон pd 1.08±0.09 1.08±0.09 1.02±0.04 1.08±0.09 1.06±0.01 1.08±0.09 1.02±0.11 1.03±0.04 1.01±0.05 1.08±0.1 ps 1.06±0.1 1.05±0.05 1.06±0.1 1.06±0.01 1.03±0.04 1.05±0.05 1.06±0.09 1.08±0.03 1.08±0.01 1.06±0.09 Fd 2.8±0.1 2.7±0.09 3.1±0.13 2.8±0.1 2.7±0.09 2.87±0.11 3.1±0.13 2.8±0.11 3.08±0.14 2.74±0.1 Fs 2.6±0.1 2.8±0.11 3.8±0.11 2.84±0.07 2.74±0.15 2.91±0.09 3.08±0.14 2.84±0.07 3.03±0.1 2.9±0.12 Длитель-ность анестезии 0 0 0 0 24.1±0.8 23.2±0.9 24.6±0.9 24.1±0.8 26.5±0.9 25.8±0.9 14 суток pd 1.08±0.09 1.08±0.09 1.02±0.05 1.1±0.1 1.02±0.11 1.02±0.04 1.08±0.05 1.10±0.09 1.03±0.05 1.1±0.09 ps 1.03±0.04 1.05±0.05 1.03±0.04 1.05±0.13 1.08±0.07 1.05±0.09 1.06±0.1 1.05±0.05 1.05±0.05 1.06±0.1 fd 3.0±0.01 3.0±0.01 3.03±0.11 2.84±0.07 2.83±0.11 2.95±0.16 3.03±0.1 2.76±0.15 3.1±0.13 2.72±0.09 fs 2.84±0.07 3.03±0.11 3.0±0.01 2.76±0.15 2.87±0.09 2.95±0.17 3.00±0.1 2.83±0.09 3.0±0.1 2.8±0.12 Длитель-ность анестезии 0 0 0 0 24.6±0.9 24.1±0.8 24.1±0.8 23.2±0.9 25.8±0.9 26.5±0.9

ВЛИЯНИЕ НА МАССУ ТЕЛА

Динамика изменений массы тела животных экспериментальных групп представлена в таблице 11.

Динамика роста массы тела во всех экспериментальных группах была одинакова.

Анализ данных подтверждает отсутствие какого-либо различия между группами: величина F-критерия для критерия значимости равна 0.73 при критическом значении F 0.95; 10,90=1.99.

Таблица 11 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на массу тела белых крыс Сроки исследования Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг (дни) М F М F М F М F М F Фон 184±2.0 179±2.7 186±2.6 185±1.8 188±2.9 183±2.8 185±1.9 187±2.9 187±1.9 180±2.8 7 день 199±1.8 187±2.0 193±2.5 189±2.2 193±2.4 184±2.0 200±1.8 201±2.9 200±1.8 188±2.0 14 день 211±2.5 207±2.3 215±1.9 206±2.4 210±2.0 204±2.4 211±2.5 201±2.3 211±2.5 204±2.3 21 день 216±2.1 206±2.3 218±1.7 216±2.5 220±1.8 206±2.2 217±2.1 209±3.0 217±2.1 209±2.4

ВЛИЯНИЕ НА КОЛИЧЕСТВО ПОТРЕБЛЯЕМОГО КОРМА И ВОДЫ

С целью определения количества потребляемого корма и воды крысы помещались на сутки в обменные клетки.

Данные по всем экспериментальным группам представлены в таблицах 12 и 13.

Таблица 12 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на потребление корма белых крыс (г, М±m) Сроки исследования Группы животных Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг (дни) М F М F М F М F М F Фон 20.2±0.9 19.2±0.4 19.4±0.8 19.1±1.0 19.6±0.7 19.3±1.0 19.3±0.9 19.7±0.9 19.4±1.0 19.3±0.9 7 день 20.4±0.6 20.1±0.6 20.1±0.9 20.4±0.9 19.9±0.9 20.4±0.9 20.8±0.9 20.0±1.0 20.9±0.9 20.8±1.0 14 день 21.5±0.6 21.3±0.9 21.3±0.9 20.3±0.9 21.2±1.0 20.5±1.0 21.3±0.9 20.2±0.8 21.4±0.9 21.2±0.9 21 день 20.9±0.9 21.3±0.7 19.7±1.0 19.7±0.8 19.6±1.0 19.9±0.9 20.8±0.8 20.9±0.9 20.9±0.8 20.7±0.9

Таблица 13 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на потребление воды белыми крысами (г, М±m) Сроки
исследования Группы животных Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг (дни) М F М F М F М F М F Фон 15.5±0.5 16.0±0.7 15.3±0.7 15.6±0.5 15.3±0.8 16.1±0.6 16.3±1.5 15.3±1.0 16.4±1.5 15.5±0.5 7 день 15.6±0.8 16.6±0.9 15.5±0.9 16.4±0.8 16.4±0.6 16.4±1.0 16.8±1.1 16.4±0.7 16.9±1.1 16.4±0.8 14 день 16.7±0.7 17.0±1.1 17.0±1.0 15.2±0.8 15.5±0.6 17.2±1.1 17.7±0.6 17.4±0.9 17.6±0.5 15.4±0.9 21 день 16.6±0.9 16.5±0.9 16.4±0.6 16.4±0.7 16.4±0.8 16.2±0.9 17.1±0.9 16.6±0.9 17.3±0.8 16.4±0.7

ВЛИЯНИЕ НА ДВИГАТЕЛЬНУЮ И ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКУЮ АКТИВНОСТЬ

В таблице 14 представлены данные по влиянию лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на спонтанную двигательную активность крыс.

Таблица 14 Влияние лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на структуру поведения белых крыс (М±m) Исследуемые показатели Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг 1 2 3 4 5 6 Самцы, фон Латентный период 96±12 86±10 99±22 92±15 86±12 Горизонтальная активность 1.7±0.1 2.1±0.5 2.1±1.2 2.2±0.2 1.4±0.1 Вертикальная активность 2.0±0.3 1.8±0.4 2.0±0.6 1.3±0.2 1.9±0.1 Заглядывания 1.5±0.2 4.4±0.5 1.8±0.3 2.1±0.4 1.9±0.1 Груминг 0.8±0.2 1.3±0.09 1.7±0.3 0.9±0.3 1.5±0.1 Болюсы 1.6±0.09 1.8±0.4 1.7±0.2 1.2±0.2 1.1±0.2 Самки, фон Латентный период 88±18 89±14 86±10 93±20 86±9 Горизонтальная активность 2.2±0.3 2.2±0.2 2.0±0.4 1.6±0.4 2.0±0.4 Вертикальная активность 2.6±0.2 2.1±0.2 1.5±0.3 1.8±0.4 1.7±0.3 Заглядывания 3.0±0.7 2.5±0.2 2.1±0.2 3.0±0.6 2.4±0.5 Груминг 1.8±0.09 0.7±0.2 0.4±0.2 1.6±0.1 0.6±0.1 Болюсы 1.4±0.2 1.7±0.2 1.6±0.4 1.4±0.1 1.5±0.08 Самцы, 14 дней Латентный период 90±13 91±13 91±19 90±11 89±11 Горизонтальная активность 1.6±0.5 2.3±0.6 2.3±1.1 2.1±0.1 2.0±0.5

Вертикальная активность 1.9±0.3 1.6±0.4 1.9±0.6 2.3±0.2 1.7±0.4 Заглядывания 3.5±0.2 3.4±0.3 1.8±0.3 2.5±0.5 3.4±0.5 Груминг 1.1±0.09 1.9±0.4 1.6±0.3 0.6±0.3 1.3±0.09 Болюсы 1.3±0.1 1.8±0.3 1.7±0.2 1.5±0.09 1.7±0.3 Самки, 14 дней Латентный период 88±16 84±14 88±18 92±21 93±17 Горизонтальная активность 1.4±0.4 2.3±0.4 2.1±0.3 1.5±0.4 1.2±0.09 Вертикальная активность 1.4±0.7 2.1±0.6 2.5±0.1 1.7±0.3 1.8±0.6 Заглядывания 4.1±0.4 2.1±0.2 2.7±0.3 2.9±0.6 3.4±0.7 Груминг 1.4±0.1 0.5±0.1 0.7±0.2 1.6±0.2 1.6±0.2 Болюсы 1.5±0.1 1.6±0.3 1.8±0.4 1.3±0.3 1.5±0.3 Самцы 21 день Латентный период 91±11 85±12 90±13 94±21 88±16 Горизонтальная активность 1.7±0.2 1.4±0.09 2.1±0.2 1.4±0.4 1.2±0.4 Вертикальная активность 2.0±0.3 1.9±0.09 1.3±0.3 1.8±0.3 1.6±0.7 Заглядывания 1.4±0.1 1.9±0.09 2.0±0.3 2.9±0.8 4.3±0.5 Груминг 0.8±0.1 1.5±0.2 0.7±0.2 1.6±0.1 1.3±0.1 Болюсы 1.5±0.08 1.0±0.2 1.3±0.2 1.3±0.2 1.5±0.1 Самки 21 день Латентный период 95±10 95±18 94±21 94±17 96±18 Горизонтальная активность 1.5±0.1 1.8±0.4 2.3±1.1 2.2±0.3 1.7±0.4 Вертикальная активность 2.0±0.1 2.1±0.3 2.0±0.6 2.5±0.2 1.9±0.5 Заглядывания 1.5±0.2 3.8±0.3 1.8±0.3 2.5±0.2 3.8±0.3 Груминг 0.8±0.1 1.4±0.2 1.6±0.4 0.8±0.2 1.3±0.1 Болюсы 1.7±0.09 1.1±0.3 1.2±0.3 1.7±0.1 1.1±0.2

Какого-либо различия между группами не выявляется: значение F0 - 0.11, что заставляет исключить влияние применения препарата на исследованный показатель.

ВЛИЯНИЕ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ГЕКСЕНАЛОВОГО СНА

Детоксицирующую функцию печени оценивали по продолжительности гексеналового сна. Данные представлены в таблице 15.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии достоверных изменений продолжительности гексеналового сна во всех экспериментальных группах после 14-дневной аппликации лекарственной формы препарата и в конце периода наблюдения (21 день).

Таблица 15 Влияние лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на продолжительность гексеналового сна белых крыс (М±m) Сроки исследова-ния Группы животных Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг (дни) М F М F М F М F М F 14 день 28.5±1.3 29.9±2.0 26.8±2.3 25.9±2.0 32.6±2.7 27.9±2.2 30.4±2.1 27.7±2.2 27.6±2.3 32.1±2.7 21 день 33.5±1.5 31.1±.9 26.2±2.0 32.2±2.8 30.8±2.3 28.8±2.4 32.2±1.5 32.7±2.9 27.9±1.3 26.7±2.4

ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПОЧЕК

Анализы мочи проведены до начала эксперимента, на 14-й день и в конце срока наблюдения. Результаты исследований представлены в таблицах 16

Таблица 16 Результаты анализа мочи у белых крыс при исследовании подострой токсичности лекарственной формы препарата Педифен 0.25% (М±m) Исследуемые показатели Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг 1 2 3 4 5 6 Самцы, фон Кол-во выделенной мочи, мл 15.6±1.7 15.4±1.5 14.57±1.6 16.1±2.3 14.7±1.6 pH 5.9±0.06 6.0±0.09 5.9±0.08 6.0±0.08 6.0±0.09 Удельный вес, г/мл 1.03±0.0008 1.01±0.0008 1.00±0.001 1.00±0.0009 1.01±0.0009 Глюкоза, г/мл 0 0 0 0 0 Билирубин, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Кетоновые тела, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Белок, г/л 3.1±0.08 2.8±0.08 2.9±0.08 2.9±0.08 3.1±0.08 Лейкоциты, кол-во в поле зрения 0-1 0-1 0-1 0-1 0-0 Эритроциты, кол-во в поле зрения 0-1 0-1 0-1 0-1 0-1 Цвет От светло-желтого до темно-желтого Прозрачность В основном прозрачная Самки, фон Кол-во выделенной мочи, мл 15.5±0.7 16.4±2.6 15.3±1.6 19.2±0.7 16.7±2.7 pH 5.7±0.08 5.9±0.07 6.2±0.08 6.0±0.06 5.7±0.08 Удельный вес, г/мл 1.0±0.002 0.98±0.0009 0.96±0.002 1.0±0.004 1.0±0.0008 Глюкоза, г/мл 0 0 0 0 0 Билирубин, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Кетоновые тела, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Белок, г/л 3.2±0.08 3.0±0.09 3.0±0.1 2.9±0.09 3.0±0.06 Лейкоциты, кол-во в поле зрения 0-1 0-1 1-2 1-2 0-0 Эритроциты, кол-во в поле зрения 0-0 1-2 0-1 0-1 0-0 Цвет От светло-желтого до темно-желтого Прозрачность В основном прозрачная Самцы, 14 день Кол-во выделенной мочи, мл 14.6±1.7 14.5±1.6 15.2±1.9 19.0±0.8 15.48±1.8 pH 6.0±0.06 6.2±0.08 6.0±0.09 6.0±0.07 6.0±0.08 Удельный вес, г/мл 0.98±0.001 1.01±0.001 1.00±0.001 1.01±0.005 1.02±0.001 Глюкоза, г/мл 0 0 0 0 0 Билирубин, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0

Продолжение таблицы 16 1 2 3 4 5 6 Кетоновые тела, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Белок, г/л 2.9±0.07 2.9±0.09 2.9±0.07 3.1±0.08 3.1±0.09 Лейкоциты, кол-во в поле зрения 0-1 0-1 0-1 0-0 0-1 Эритроциты, кол-во в поле зрения 0-2 0-1 0-1 0-1 0-1 Цвет От светло-желтого до темно-желтого Прозрачность В основном прозрачная Самки, 14 дней Кол-во выделенной мочи, мл 17.1±2.8 15.7±2.6 16.0±1.7 15.6±4.9 13.9±3.1 pH 5.8±0.07 6.1±0.09 6.2±0.08 5.7±0.08 6.0±0.09 Удельный вес, г/мл 1.04±0.001 1.04±0.001 0.96±0.002 1.04±0.001 1.04±0.002 Глюкоза, г/мл 0 0 0 0 0 Билирубин, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Кетоновые тела, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Белок, г/л 3.3±0.09 2.9±0.09 3.1±0.09 3.1±0.1 3.1±0.08 Лейкоциты, кол-во в поле зрения 0-1 0-1 0-0 1-2 0-1 Эритроциты, кол-во в поле зрения 0-0 1-2 0-1 0-1 1-2 Цвет От светло-желтого до темно-желтого Прозрачность В основном прозрачная Самцы 21 день Кол-во выделенной мочи, мл 17.3±2.6 15.4±1.8 16.3±1.8 14.9±1.9 15.9±2.6 рН 6.0±0.06 5.9±0.07 5.8±0.09 5.9±0.09 6.0±0.08 Удельный вес, г/мл 1.00±0.0008 1.01±0.0009 1.00±0.0009 1.00±0.001 1.00±0.0009 Глюкоза, г/мл 0 0 0 0 0 Билирубин, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Кетоновые тела, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Белок, г/л 3.0±0.07 2.9±0.09 3.1±0.1 3.2±0.08 3.2±0.1 Лейкоциты, кол-во в поле зрения 0-0 0-1 0-0 0-0 0-1 Эритроциты, кол-во в поле зрения 0-0 0-1 0-1 0-1 0-0 Цвет От светло-желтого до темно-желтого Прозрачность В основном прозрачная Самки 21 день Кол-во выделенной мочи, мл 16.2±0.9 15.3±0.9 15.9±1.8 16.9±2.5 84±14 pH 6.2±0.07 5.7±0.09 5.9±0.08 6.0±0.07 6.0±0.06 Удельный вес, г/мл 1.02±0.005 1.02±0.004 1.00±0.002 0.99±0.001 0.99±0.001 Глюкоза, г/мл 0 0 0 0 0 Билирубин, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Кетоновые тела, есть (1), нет (0) 0 0 0 0 0 Белок, г/л 3.1±0.08 3.1±0.09 3.2±0.09 3.0±0.07 3.1±0.09

Продолжение таблицы 16 1 2 3 4 5 6 Лейкоциты, кол-во в поле зрения 0-0 0-1 0-0 0-0 0-1 Эритроциты, кол-во в поле зрения 0-1 0-2 0-1 0-0 0-1 Цвет От светло-желтого до темно-желтого Прозрачность В основном прозрачная

Как можно видеть, показатели мочи во всех экспериментальных группах близки по значению, достоверных отличий между какими-либо группами не выявляется.

ВЛИЯНИЕ НА ХАРАКТЕР ЭЛЕКТРОКАРДИОГРАФИИ

Данные по влиянию введения подострого 14-дневного введения препарата на параметры электрокардиографии представлены в таблице 17.

Таблица 17 Влияние лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на ЧСС и характер ЭКГ белых крыс (М±m) Исследуемые показатели Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг 1 2 3 4 5 6 Самцы, фон ЧСС/мин 453±18 465±21 445±36 459±21 439±28 Р, мВ 0.09±0.01 0.08±0.01 0.08±0.01 0.09±0.02 0.10±0.02 R, мВ 0.60±0.05 0.61±0.10 0.63±0.09 0.60±0.06 0.64±0.10 S, мВ 0.02±0.03 0.04±0.04 0.04±0.03 0.03±0.04 0.04±0.04 Т, мВ 0.15±0.02 0.13±0.009 0.13±0.03 0.16±0.01 0.14±0.04 PQ, мс 46.3±1.0 46.4±2.1 46.1±1.1 45.3±1.1 44.1±1.0 QT, мс 53.8±2.1 54.5±3.2 58.0±2.2 57.4±2.2 56.2±3.1 Самки, фон ЧСС/мин 459±27 442±20 470±23 467±33 425±12 Р, мВ 0.09±0.01 0.10±0 0.10±0 0.09±0.02 0.10±0.009 R, мВ 0.62±0.06 0.66±0.10 0.63±0.11 0.60±0.10 0.69±0.09 S, мВ 0.04±0.04 0.01±0.01 0.02±0.02 0.03±0.03 0.01±0.02 Т, мВ 0.14±0.01 0.16±0.02 0.15±0.03 0.16±0.01 0.14±0.03 PQ, мс 46.6±2.1 45.4±1.0 47,6±2.1 46.4±2.1 46.0±1.0 QT, мс 61.3±3.1 55.9±3.2 58.3±1.1 56.1±3.2 55.9±3.2 Самцы, 14 день ЧСС/мин 472±23 454±22 453±21 426±21 455±20 Р, мВ 0.09±0 0.09±0.02 0.09±0 0.09±0 0.10±0 R, мВ 0.61±0.09 0.59±0.10 0.60±0.10 0.66±0.09 0.62±0.10 S, мВ 0.02±0.01 0.03±0.03 0.02±0.02 0.009±0.01 0.02±0.02

Продолжение таблицы 17 1 2 3 4 5 6 Т, мВ 0.17±0.009 0.16±0.02 0.16±0.02 0.16±0.02 0.16±0.03 PQ, мс 46.4±1.1 45.6±2.2 47.0±2.2 45.3±1.1 47.7±2.0 QT, мс 57.8±3.2 56.1±3.1 56.5±1.0 56.1±3.1 59.2±1.1 Самки, 14 день ЧСС/мин 462±23 440±13 429±19 474±20 450±36 Р, мВ 0.09±0 0.11±0.01 0.09±0 0.10±0 0.08±0.01 R, мВ 0.62±0.08 0.68±0.10 0.64±0.09 0.61±0.11 0.61±0.09 S, мВ 0.01±0.01 0.02±0.02 0.01±0.01 0.03±0.02 0.03±0.03 Т, мВ 0.16±0.01 0.15±0.03 0.15±0.03 0.16±0.02 0.13±0.02 PQ, мс 46.7±1.0 46.0±1.1 45.5±1.1 46.6±2.1 47.0±1.1 QT, мс 57.2±3.1 56.0±3.2 57.0±3.1 57.5±1.1 58.3±2.1

Анализ полученных данных показывает отсутствие отличий величины ЧСС и характера ЭКГ во всех экспериментальных группах. На 14-й день значение критерия межгруппового различия - величина F0 - было равно 0.71 при критическом значении F0.95; 10,90=1.99.

На рисунке 1 представлена ЭКГ белой крысы через 14-й дней исследования в максимальной дозе.

ВЛИЯНИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Гематологические и биохимические исследования крови проводились через 14 дней и в конце исследования. Кровь получали после одномоментного гильотинирования.

Данные, полученные на 14 сутки эксперимента представлены в таблице 18.

Таблица 18 Влияние лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на основные гематологические показатели периферической крови белых крыс (М±m, n=10) Исследуемые показатели Интактные Контроль Доза препарата 0.06 мл/кг 0.18 мл/кг 0.6 мл/кг 1 2 3 4 5 6 Самцы, 14 дней Гемоглобин, г/дл 11.9±0.2 11.9±0.2 12.1±0.1 12.1±0.1 12.0±0.1 Гематокрит, % 49.8±1.1 49.9±1.2 50.5±1.1 51.4±1.2 50.1±1.2 Эритроциты, 10¹²/л 6.5±0.2 6.5±0.3 6.4±0.1 6.3±0.3 6.3±0.2 Цветовой показатель (МСН), пг 24.8±0.8 23.9±0.8 22.8±0.7 22.7±0.5 23.7±1.0 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 77.6±0.7 76.5±0.7 77.8±0.5 76.8±0.6 77.6±0.6 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 24.5±0.3 23.5±0.2 23.5±0.1 24.4±0.2 23.4±0.1 СОЭ, мм/ч 4.2±0.4 4.8±0.4 5.3±0.3 4.6±0.4 4.9±0.3 Тромбоциты, 10⁹/л 580±12.1 582±10.9 630±10.9 614±10.3 600±11.0 Лейкоциты, 10⁹/л 6.7±0.4 6.6±0.2 7.0±0.09 6.4±0.2 6.5±0.2 Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.3±0.009 0.2±0.009 0.2±0.01 0.3±0.01 0.2±0.01 Сегментоядерные нейтрофилы, % 12.4±1.0 12.7±1.1 12.5±1.1 12.7±1.2 12.6±1.1 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 3.4±0.2 3.6±0.2 3.4±0.2 3.3±0.2 3.5±0.2 Ионоциты, % 3.2±0.2 2.8±0.3 3.3±0.4 3.0±0.2 2.9±0.3 Лимфоциты, % 77.4±0.9 77.0±1.0 77.9±1.2 78.9±1.2 76.9±1.0 Плазматические клетки, % 0.2±0.02 0.1±0.01 0.1±0.02 0.1±0.01 0.1±0.01 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 42.7±1.8 42.1±2.0 41.2±2.0 41.3±1.81 41.7±1.9 Протромбиновое время, с 15.4±1.1 15.0±1.1 14.2±1.2 13.7±0.9 14.9±1.2 Самки, 14 день Гемоглобин, г/дл 12.2±0.3 12.3±0.2 12.4±0.1 12.4±0.2 12.1±0.1 Гематокрит, % 49.75±1.0 50.4±0.9 49.2±1.1 49.4±1.0 50.2±0.9 Эритроциты, 10¹²/л 6.3±0.1 6.5±0.3 6.2±0.1 6.3±0.2 6.5±0.2 Цветовой показатель (МСН), пг 23.2±0.7 22.6±0.6 23.7±0.9 23.6±1.0 25.1±0.8 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 77.8±0.7 77.6±0.6 77.4±0.5 77.3±0.5 78.1±0.6 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 24.0±0.2 23.5±0.2 24.4±0.2 24.4±0.2 24.4±0.3 СОЭ, мм/ч 4.7±0.3 3.8±0.3 3.3±0.2 3.4±0.2 4.5±0.3

Продолжение таблицы 18 1 2 3 4 5 6 Громбоциты, 10⁹/л 623±10.9 648±9.9 619±10.0 578±11.0 580±10.4 Лейкоциты, 10⁹/л 6.8±0.2 6.2±0.2 6.5±0.2 5.9±0.2 5.6±0.2 Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.1±0.01 0.2±0.01 0.2±0.01 0.1±0.01 0.3±0.01 Сегментоядерные нейтрофилы, % 12.0±0.8 12.5±0.9 12.1±1.1 11.9±1.2 12.0±1.1 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 3.3±0.2 3.5±0.3 3.1±0.3 2.9±0.1 3.0±0.2 Моноциты, % 3.2±0.3 3.7±0.3 3.7±0.1 3.8±0.2 3.6±0.1 Лимфоциты, % 78.5±0.8 78.8±1.0 78.5±1.1 76.5±1.2 78.7±1.0 Плазматические клетки, % 0.2±0.01 0.2±0.008 0.3±0.008 0.1±0.008 0.1±0.02 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 39.2±1.8 40.3±1.9 40.8±2.0 42.3±1.9 43.8±2.0 Протромбиновое время, с 13.8±1.1 14.0±1.2 14.7±1.0 15.7±1.0 16.4±1.1 Самцы, 21 день Гемоглобин, г/дл 12.3±0.2 12.5±0.2 12.1±0.2 12.0±0.2 12.2±0.2 Гематокрит, % 49.6±1.0 49.7±1.1 50.2±1.2 50.3±1.3 49.9±1.0 Эритроциты, 10¹²/л 6.3±0.2 6.2±0.2 6.4±0.3 6.5±0.3 6.3±0.2 Цветовой показатель (МСН), пг 23.9±1.0 23.4±1.0 23.7±1.0 23.9±0.9 23.1±0.6 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 77.5±0.6 77.4±0.6 76.5±0.7 76.4±0.8 77.4±0.7 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 24.6±03 24.4±0.2 23.4±0.1 23.5±0.2 23.6±0.3 СОЭ, мм/ч 3.4±0.3 3.5±0.3 4.9±0.4 4.8±0.4 4.8±0.3 Тромбоциты, 10⁹/л 578±12.0 589±11.0 594±11.0 584±11.0 627±11.0 Лейкоциты, 10⁹/л 6.3±0.4 6.6±0.5 6.6±0.2 6.7±0.2 6.8±0.4 Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.2±0.01 0.2±0.01 0.2±0.01 0.2±0.01 0.3±0.01 Сегментоядерные нейтрофилы, % 12.0±1.2 12.1±1.3 12.6±1.1 12.8±1.1 12.2±1.0 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 3.2±0.3 3.1±0.3 3.6±0.2 3.7±0.2 3.2±0.3 Моноциты, % 3.8±0.3 3.6±0.3 2.8±0.3 2.9±0.3 3.4±0.4 Лимфоциты, % 77.2±1.1 77.0±1.2 76.9±1.0 77.4±1.0 78.2±1.0 Плазматические клетки, % 0.2±0.01 0.3±0.01 0.1±0.01 0.1±0.01 0.4±0.01

Продолжение таблицы 18 1 2 3 4 5 6 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 42.5±2.0 41.5±1.9 41.7±1.9 42.3±2.0 40.0±1.83 Протромбиновое время, с 14.9±1.2 14.7±1.1 14.9±1.2 15.0±1.1 13.9±1.0 Самки, 21 день Гемоглобин, г/дл 12.1±0.2 12.1±0.2 12.1±0.1 12.1±0.2 12.2±0.3 Гематокрит, % 50.1±1.2 51.3±1.0 51.0±1.2 50.7±1.3 52.0±1.1 Эритроциты, 10¹²/л 6.3±0.3 6.5±0.1 6.5±0.1 6.3±0.09 6.1±0.2 Цветовой показатель (МСН), пг 22.2±0.6 22.9±0.7 23.1±0.9 23.8±1.0 24.4±0.8 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 76.6±0.7 77.5±0.7 77.5±0.7 76.7±0.7 77.6±0.8 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 23.9±0.1 23.9±0.3 23.3±0.1 23.5±0.1 24.3±0.2 СОЭ, мм/ч 4.7±0.3 5.2±0.3 4.8±0.4 5.8±0.3 7.3±0.5 Тромбоциты, 10⁹/л 615±10.4 635±9.9 563±11.1 599±9.9 586±12.0 Лейкоциты, 10⁹/л 7.3±0.1 7.4±0.1 6.3±0.1 6.1±0.2 7.0±0.1 Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.3±0.01 0.2±0.01 0.1±0.01 0.1±0.01 0.4±0.02 Сегментоядерные нейтрофилы, % 12.3±1.3 12.7±1.2 12.4±1.0 12.7±1.0 13.0±1.0 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 3.5±0.3 3.4±0.2 3.6±0.1 3.7±0.1 3.8±0.3 Моноциты, % 3.1±0.3 4.3±0.5 3.8±0.3 3.4±0.3 4.1±0.3 Лимфоциты, % 77.7±1.3 78.6±1.2 76.7±1.0 77.1±0.9 77.8±0.9 Плазматические клетки, % 0.09±0.01 0.09±0.01 0.1±0.01 0.09±0.01 0.1±0.01 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 43.8±1.5 44.2±1.7 43.6±2.0 44.2±1.9 43.4±1.9 Протромбиновое время, с 15.4±0.9 15.8±1.1 14.9±1.2 15.8±1.3 15.4±1.2

Статистический анализ полученных данных не выявил значимых отличий между всеми экспериментальными группами ни по одному из показателей (для всех показателей критерий неоднородности групп оказался ниже критического значения).

Микроскопические исследования мазков крови показали следующее. Лимфоциты имеют сильно пикнотическое ядро, иногда обнаруживается значительная азурофильная зернистость. Основная масса сегментоядерных клеток имеет нежную, нейтрофильную, не вполне ясно выраженную зернистость в мазках. Ядра эозинофильных клеток образованы из рыхлого хроматинового вещества и имеют почти круглую форму. Ядра эозинофилов и нейтрофилов образуются по кольчатому типу, поэтому нередко встречаются кольцеобразные ядра у палочковидных форм. Моноциты сильно отличаются от лимфоцитов. Последние равны по величине двум эритроцитам, имеют большое бобовидное ядро и широкую протоплазматическую кайму, которая окрашивается в синий или фиолетовый цвет с нежной грануляцией. Кровяные пластинки лежат большими кучками. Достоверных отличий между показателями контрольной и опытных групп не наблюдается. Половых различий не выявлено. Таким образом, периферическая кровь крыс всех экспериментальных групп после 14-дневного исследования по своему количественному и качественному составу соответствовала видовой физиологической норме.

ВЛИЯНИЕ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ

В таблице 19 представлены значения основных биохимических показателей крови крыс всех экспериментальных групп, полученные на 14 день исследования.

Анализ данных в таблице 19 не выявил какого-либо сдвига биохимических показателей крови в опытных группах как по отношению к контролю, так и по отношению друг к другу. Таким образом, к 14-му дню исследования результат применения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% не привел к каким-либо заметным эффектам со стороны биохимических показателей крови.

Достоверных отличий между уровнем изучаемых показателей в конце периода наблюдения (на 21 день) также не выявлено.

ДАННЫЕ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

В разделе представлены обобщенные данные некропсии крыс всех исследованных групп, так как по результатам макроскопического исследования изучаемых органов различий между группами не установлено.

Крысы правильного телосложения, удовлетворительного питания. При наружном осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. У большинства животных шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не определяется.

Глаза сохранены. Глазная щель обычных размеров. Слизистые конъюнктивы обычной окраски. Признаков раздражения нет.

Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно, деформации или отека конечностей нет.

Грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие.

Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледно-желтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски.

Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции. Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров.

Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержится незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная.

Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски.

Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой части желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая тела желудка складчатая, розоватая, блестящая.

Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая.

Форма и величина печени изменений не представляют. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная.

Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции.

Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы.

Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество.

Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью, умеренно плотные. На разрезе выделяется темно-окрашенное мозговое вещество.

Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски.

Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие, слизистая - блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности.

Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.

В таблице 20 представлены данные по массовым коэффициентам органов у белых крыс из всех экспериментальных групп на 14 день эксперимента.

Из данных приведенных в таблице следует, что достоверных отличий массовых коэффициентов внутренних органов крыс ни в одной из опытных групп от контрольных нет. Патологических сдвигов не отмечено и 21 день.

Таким образом, 14-дневное внесение в глаза лекарственной формы препарата Педифен 0.25% в трех диапазонах доз, не вызывает заметных морфологических изменений внутренних органов, в том числе головного мозга, и не оказывает местного раздражающего действия на слизистые оболочки глаз.

РЕЗУЛЬТАТЫ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты фиксировали в 10% формалине или жидкости Карнуа и заливали в парафин. Головной мозг фиксировали в 96% спирте и заливали в целлоидин или парафин. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону, срезы головного мозга окрашивали по Нисслю.

При просмотре гистологических препаратов изучаемых органов различий между группами не обнаружено.

Цитоархитектоника коры больших полушарий головного мозга не нарушена, очагов выпадения нет. Сосуды мозговых оболочек умеренно полнокровные; кортикальные сосуды равномерного диаметра. Содержат единичные эритроциты. Признаки острого или хронического заболевания нейронов отсутствуют. Ядра нейронов светлые, ядерная мембрана тонкая, ядрышки четкие. В цитоплазме определяется достаточное количество хроматофильной зернистости Ниссля: пылевидной в цитоплазме нейронов 2-3-го слоев и более крупной - в цитоплазме нейронов 5-го слоя коры больших полушарий. Нейроны разных ядерных образований среднего и продолговатого мозга содержат крупные глыбки тигроида. Ядра нервных и глиальных клеток не изменены - ядерная мембрана тонкая, содержание хроматина нормальное, ядрышки четкие.

Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Деструкции эластических волокон средней оболочки нет. Поперечная исчерченность миофибрилл во всех отделах сердца отчетливая, ядра кардиомицитов содержат достаточное количество хроматина, ядерная оболочка тонкая. Очагов нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Избыточного разрастания стромы (кардиофиброза) нет.

Эпителий гортани, трахеи, крупных бронхов не изменен, ядра четкие. Альвеолы всех долей легких содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма оксифильная. Эпителий внутрилегочных бронхов без изменений. Острые воспалительные изменения легочной ткани отсутствовали.

Трабекулярное строение печени на срезах, полученных из объектов разных долей печени, нарушений не представляет. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабо оксифильная. Очаговых нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Ядра содержат четкие ядрышки и достаточное количество хроматина. Ядерная мембрана тонкая. Синусоиды печени полнокровные.

Капилляры клубочков и интерстициальной ткани почек полнокровные, цитоплазма эпителия проксимальных канальцев почек оксифильная, клеточные границы различимы, ядра нефроэпителия светлые, четкие.

Сосуды коры и мозгового вещества надпочечников полнокровные. Все зоны коры надпочечников отчетливо выражены, клеточные ядра содержат достаточное количество хроматина. Цитоплазма клеток пучковой зоны вакуолизирована за счет содержания большого количества липидов. Клетки мозгового вещества крупные, овальной формы, объединенные в гроздья и тяжи.

Лимфоретикулярные элементы лимфатических узлов и селезенки с четкими ядрами, деструкции или атрофии фолликулов нет. В красной пульпе селезенки видны очаги кроветворения с единичными мегакариоцитами.

Слизистая оболочка безжелезистой части желудка выстлана многослойным плоским эпителием, клетки которого изменений не представляют. Покровный эпителий слизистой тела желудка образован слизистыми цилиндрическими клетками, дефектов эпителиальной выстилки нет. Главные и обкладочные клетки желез тела желудка не изменены. Дефектов многослойного плоского неороговевающего эпителия слизистой пищевода нет.

Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Клетки островков Лангерганса содержат светлые, четкие ядра, цитоплазма слабо оксифильная. Эпителиальные клетки внешнесекреторной части железы базофильные, ядра, расположенные в средней части, четкие, с достаточным количеством хроматина Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные.

Фолликулы щитовидной железы заполнены небольшим количеством оксифильного, слабовакуолизированного коллоида. Эпителий фолликул обычной высоты, ядра четкие. Сосуды стромы умеренно полнокровные. Строение подчелюстных желез нарушений не представляет. Эпителиальные клетки концевых отделов и выводных протоков с четкими ядрами, деструкции клеток нет.

Тимус сохраняет выраженное дольчатое строение. Корковое вещество долек заполнено лимфоцитами/тимоцитами. Мозговое вещество тимуса содержит меньшее количество лимфоцитов, а также светлые эпителиальные клетки, местами образующие концентрические фигуры и тельца Гассаля. Строма тимуса умеренно полнокровная.

В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания. Фолликулярный эпителий не изменен, ядра светлые, четкие, мозговое вещество яичников полнокровное. Клетки семенных канальцев яичек самцов находятся на разных стадиях сперматогенеза. Эпителий семенных канальцев и интерстициальные клетки не изменены. Ядра четкие.

Таким образом, по результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное применение лекарственной формы препарата Педифен 0.25% в трех диапазонах доз в течение 14 дней у крыс обоего пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей глаза, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов крыс.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОДОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ПРИ ИНТРАКОНЪЮНКТИВАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ У КРОЛИКОВ

ВЛИЯНИЕ НА ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

В ходе проведения эксперимента регистрировали следующие показатели: интенсивность блефароспазма, слезотечения, гиперемию конъюнктивы век и склеры по ее выраженности и продолжительности, выраженность зрачкового рефлекса, чувствительность роговицы (роговичный рефлекс), наличие повреждений роговицы (флуоресцеиновая проба).

Оценку блефароспазма проводили визуально по продолжительности сокращения круговой мышцы глаза (сек).

Выраженность слезотечения оценивали методом Ширмера (в модификации для кроликов) по интенсивности смачивания бумажной ленты (мм).

Интенсивность гиперемии конъюнктивы век и склеры глазного яблока оценивали визуально: 1 балл - сосуды инъецированы, 2 балла - отдельные сосуды трудно различимы, 3 балла - диффузное глубокое покраснение.

Выраженность отека век также оценивалась визуально: слабый отек век - 1 балл, выраженный отек с частичным выворачиванием век - 2 балла, в результате отека глаз закрыт наполовину - 3 балла, результате отека век глаз закрыт более чем наполовину - 4 балла.

Оценку зрачкового рефлекса проводят в помещении со слабым освещением. Диаметр зрачка определяют линейным пупиллометром. В качестве светового раздражителя используют узкий пучок направленного света (медицинский фонарик).

Состояние эпителия роговицы оценивалось методом флуоресцеиновой пробы В конъюнктивальный мешок глаза вводят 1-2 капли 0,5% раствора флуоресцеина натрия. Положительная проба (+) при появлении зеленого окрашивания эпителия роговицы указывает на повреждение эпителия роговицы. У всех животных трех опытных групп отсутствовали блефароспазм и отек век, флуоресцеиновая проба была отрицательной. Результаты представлены в таблице 21

Таблица 21 Выраженность ответной реакции со стороны глаз кроликов после 14-ти дней инсталляции лекарственной формы препарата Педифен 0.25% (M±m) Исследуемые показатели Интактные Контроль Педифен 0.25% 0.05 мл/кг 0.15 мл/кг 0.5 мл/кг 1 2 3 4 5 6 Самцы, 14 сут Блефароспазм (с) 0 0 0 0 0 Слезотечение, мм 9.8±0.9 9.5±0.9 11±1.8 12.5±1.8 11.9±2.3 Гиперемия конъюнктивы (балл) 0 0-1 0-1 1.7 2.0±0.0 Отек конъюнктивы век (балл) 0 0 0 0 0 Флуоресц. проба (+)(-) - - - - - Длительность анестезии (мин) 0 0 26,3±1.8 26,3±1.6 28,0±1.8 Диаметр зрачка, мм рассеян. св. 8.2±0.35 8.0±0.18 5.7±0.35 7.7±0.18 7.5±0.16 направл. св. 6.2±0.5 6.1±0.5 6.1±0.5 6.3±0.5 5.6±0.18 Самки, 14 сут Блефароспазм (с) 0 0 0 0 0 Слезотечение, мм 9.5±0.1 10.5±2.3 10.8±2.3 10.8±2.3 12.8±1.4 Гиперемия конъюнктивы (балл) 0 1.7 1.8±0.4 12.4±1.2 1.7±0.45 Отек конъюнктивы век (балл) 0 1 0 0 0 Флуоресц. проба (+)(-) - - - - - Длительность анестезии (мин) 0 0 24.8±1.4 28,3±2.7 28,0±1.8 Диаметр зрачка, мм рассеян. св. 8.3±0.5 8.2±0.3 8.5±0.5 8.0±0.35 7.8±0.35 направл. св. 6.3±0.5 6.1±0.5 6.1±0.7 6.2±0.35 5.8±0.35

У кроликов первой группы на 7-14 сутки эксперимента регистрировали незначительное увеличение слезотечения, появление гиперемии конъюнктивы век, регистрируемой у 2/3 экспериментальных животных интенсивностью 1 балл, продолжительность анестезии (отсутствие корнеального рефлекса) составляла до 25 мин. Все симптомы раздражения глаз после инстилляции препарата в дозе 0,05 мг/кг сохранялись не более 30-60 мин. На следующие сутки после прекращения 14-ти дневного воздействия Педифен 0.25% в указанной дозе, глаза опытных животных были без патологии и не отличались от контроля.

В первые и последующие дни после инстилляции препарата Педифен 0.25% в дозе 0,15 мг/кг отмечалось повышение интенсивности слезотечения. В первые сутки появилась гиперемия конъюнктивы век до 1 балла, выраженность которой постепенно нарастала к 14 дню введения до 1,7 балла. Вместе с тем, продолжительность гиперемии была не более 2 часов после введения препарата. Продолжительность анестезии после каждой инсталляции составляла 26-27 мин. На следующие сутки после 14-кратного введения все симптомы раздражения со стороны оболочек глаз исчезали.

У всех животных III группы после ежедневной инстилляции лекарственной формы препарата Педифен 0.25% отмечали небольшое усиление интенсивности слезотечения. Уже после 1 дня введения у всех животных (100%) появлялась гиперемия (не менее 1 балла), начиная с 7 дня введения, интенсивность гиперемии конъюнктивы глаза увеличивалась до 2-х баллов и сохранялась на следующие сутки, уменьшаясь до 1 балла. Через 2 суток после последней инстилляции препарата гиперемия конъюнктивы исчезала. Интенсивность слезотечения также нормализовалась (8,5±0.5 мм). Продолжительность местной анестезии после каждой инстилляции препарата Педифен 0.25% регистрировали на протяжении 28-30 мин. Через 48 часов после последнего введения в конъюнктивальный мешок водного раствора препарата все признаки раздражающего действия практически отсутствовали (рисунок 2).

Животным контрольной группы ежедневно вводили в конъюнктивальный мешок левого глаза максимальные объемы дистиллированной воды, по 0,5 мл в течение 14 дней.

Результаты исследования свидетельствуют, что использованный в настоящей работе растворитель модельного препарата (вода дистиллированная), при ежедневном применении в течение 14 дней не вызывает ответной реакции со стороны конъюнктивальных оболочек глаз (блефароспазм, слезотечение, гиперемию конъюнктивы, отек конъюнктивы, угнетение корнеального рефлекса, органических повреждений конъюнктивы глаз). Незначительная гиперемия, отмеченная с 7 суток, скорее всего, связана с ежедневными манипуляциями (оценка слезотечения, многократные инстилляции больших объемов) и имела кратковременный характер (приблизительно 2 часа).

Таким образом, ежедневное интраконъюнктивальное введение лекарственной формы в трех дозах (максимальной терапевтической, 3-х и 10-ти кратной максимальной терапевтической) не оказывает выраженного раздражающего действия на слизистые оболочки глаз. Отмеченные симптомы раздражения имеют кратковременный характер и могут быть также спровоцированы ежедневными манипуляциями, связанными с офтальмологическим осмотром.

ВЛИЯНИЕ НА МАССУ ТЕЛА

Результаты взвешивания кроликов представлены в таблице 22

Как видно из данных, представленных в таблице, динамика роста массы тела во всех экспериментальных группах была одинакова. Анализ данных подтверждает отсутствие какого-либо различия между группами: величина F-критерия для критерия значимости равна 0.73 при критическом значении F0.95; 10,90=1.99.

Таблица 22 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на массу тела кроликов (г, М±m) Сроки исследования (дни) Группы животных Ингактные Контроль 0.05 мл/кг 0.15 мл/кг 0.5 мл/кг М F М F М F М F М F Фон 2529±30 2478±26 2471±30 2437±23 2499±31 2500±24 2548±30 2505±22 2521±32 2438±25 7 день 2569±32 2481±26 2564±31 2550±25 2560±33 2561±24 2663±33 2485±25 2545±32 2486±26 14 день 2736±34 2560±25 2737±31 2558±26 2696±32 2531±26 2660±31 2625±26 2712±32 2593±28 21 день 2791±33 2687±27 2803±32 2682±28 2820±31 2696±29 2758±31 2657±28 2764±32 2697±29

ВЛИЯНИЕ НА ПОТРЕБЛЕНИЕ ВОДЫ И КОРМА

Определение потребления воды и корма определяли у всех групп животных один раз в неделю и через 7 дней после окончания инстилляций. Результаты представлены в таблице 23 и 24

Таблица 23 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на потребление корма кроликами (г, М±m) Сроки исследования (дни) Группы животных Интактные Контроль 0.05 мл/кг 0.15 мл/кг 0.5 мл/кг М F М F M F М F М F Фон 194±1 189±2 191±2 193±1 191±3 192±4 195±2 200±1 196±1 188±3 7 день 195±1 193±1 201±2 199±2 194±3 192±1 190±1 200±2 193±3 195±2 14 день 196±2 199±3 194±3 197±1 187±3 196±3 194±3 196±1 202±3 197±2 21 день 206±1 205±2 199±2 197±3 192±1 195±3 204±1 205±2 198±2 210±2

Таблица 24 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на потребление воды кроликами (мл, М±m) Сроки исследования Группы животных Интактные Контроль 0.05 мл/кг 0.15 мл/кг 0.5 мл/кг (дни) М F М F М F М F М F Фон 76±2 73±1 71±3 72±1 75±3 75±1 73±2 75±3 78±1 78±2 7 день 70±1 76±1 80±1 70±3 77±2 72±2 78±3 79±1 76±2 77±3 14 день 77±2 72±2 79±3 79±1 74±3 77±2 80±1 72±2 80±2 72±2 21 день 81±2 77±2 81±2 79±1 78±2 80±2 81±2 77±3 78±3 77±2

Достоверных отличий потребления корма и воды у кроликов всех экспериментальных групп не выявлено.

ВЛИЯНИЕ НА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТУЮ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

Данные по влиянию подострого 14-дневного введения препарата на частоту сердечных сокращений представлены в таблице 25.

Таблица 25 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на частоту сердечных сокращений (ЧСС) кроликов (уд/мин, М±m) Сроки исследования (дни) Группы животных Интактные Контроль 0.05 мл/кг 0.15 мл/кг 0.5 мл/кг М F М F М F М F М F Фон 301±9 309±11 304±8 324±10 298±12 309±10 321±11 335±9 334±9 317±8 14 день 324±11 296±12 324±9 338±11 311±10 322±11 304±11 270±12 289±12 321±10

Достоверных отличий в показателях ЧСС у кроликов экспериментальных групп по сравнению с контролем не выявлено (рисунок 3).

ВЛИЯНИЕ НА ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Гематологическое исследование крови проводилось в конце исследования. Кровь получали после одномоментного гильотинирования.

Полученные данные представлены в таблице 26.

Таблица 26 Влияние подострого интраконъюнктивального введения лекарственной формы препарата Педифен 0.25% на основные гематологические показатели периферической крови кроликов (М±m) Исследуемые показатели Интактные Контроль Доза препарата 0.05 мл/кг 0.15 мл/кг 0.5 мл/кг 1 2 3 4 5 6 Самцы, 14 дней Гемоглобин, г/дл 16.7±0.08 16.1±0.1 17.1±0.09 17.0±0.09 16.4±0.09 Гематокрит, % 41.8±1.7 45.1±1.5 43.4±1.5 45.5±1.7 42.6±1.9 Эритроциты, 10¹²/л 6.9±0.09 5.8±0.09 6.8±0.09 6.7±0.09 6.4±0.1 Цветовой показатель (МСН), пг 23.8±0.9 23.7±0.8 22.9±0.7 23.1±0.7 22.7±0.6 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 63.7±1.6 65.0±1.1 63.0±1.6 62.8±0.8 62.4±0.9 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 38.5±0.4 37.5±0.4 36.8±0.4 37.3±0.6 38.2±0.5 СОЭ, мм/ч 5.2±0.5 4.7±0.4 5.6±0.4 5.4±0.4 5.0±0.4 Тромбоциты, 10⁹/л 247±9 238±9 269±7 263±8 268±10 Лейкоциты, 10⁹/л 10.3±0.4 12.6±0.5 10.2±0.6 10.1±0.5 10.2±0.5 Палочкоядерные нейтрофилы, % 1.5±0.12 1.1±0.11 1.5±0.10 1.4±0.10 1.2±0.13 Сегментоядерные нейтрофилы, % 70.7±0.8 71.2±0.9 73.0±0.4 72.9±0.7 70.4±0.9 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 2.1±0.09 2.1±0.1 2.0±0.09 1.8±0.1 1.9±0.1 1 2 3 4 5 6 Моноциты, % 5.7±0.4 5.7±0.5 5.9±0.3 6.3±0.3 5.8±0.4 Лимфоциты, % 18.7±0.5 18.0±0.9 18.9±0.6 18.0±0.9 18.1±1.0 Плазматические клетки, % 0.4±0.01 0.4±0.02 0.3±0.02 0.3±0.03 0.5±0.04 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 49.9±1.4 50.8±1.2 48.5±1.3 49.1±1.4 48.1±1.5 Протромбиновое время, с 19.5±1.4 19.8±1.3 18.7±1.1 18.7±1.2 18.8±1.0 Самки, 14 дней Гемоглобин, г/дл 17.2±0.1 16.8±0.5 15.8±0.2 15.9±0.1 16.4±0.09 Гематокрит, % 45.9±1.3 45.9±1.6 46.1±1.3 45.6±1.6 44.4±1.7 Эритроциты, 10¹²/л 6.4±0.09 6.1±0.08 6.2±0.09 6.1±0.1 6.1±0.09 Цветовой показатель (МСН), пг 22.7±0.7 23.0±0.6 24.4±0.6 22.7±0.6 22.5±0.6 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 61.9±0.9 61.1±1.0 63.5±0.9 60.9±0.6 60.0±0.8 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 32.6±0.2 36.0±0.6 33.8±0.09 35.5±0.4 35.0±0.3 СОЭ, мм/ч 4.6±0.9 4.0±0.9 4.2±1.0 5.2±0.5 5.0±0.4

Продолжение таблицы 26 1 2 3 4 5 6 Тромбоциты, 10⁹/л 243±10 235±10 269±8 269±9 273±9 Лейкоциты, 10⁹/л 12.6±0.3 11.6±0.7 11.9±0.3 11.3±0.6 11.4±0.6 Палочкоядерные нейтрофилы, % 1.1±0.12 0.9±0.15 1.3±0.12 1.1±0.10 1.2±0.11 Сегментоядерные нейтрофилы, % 67.9±0.8 68.7±0.5 67.8±0.7 69.3±1.0 68.7±0.8 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 3.4±0.2 3.7±0.2 3.1±0.3 3.5±0.1 3.3±0.1 Моноциты, % 6.6±0.5 6.2±0.3 6.5±0.4 7.0±0.3 7.0±0.3 Лимфоциты, % 19.6±0.5 19.8±0.5 19.8±0.6 20.3±1.4 20.2±1.5 Плазматические клетки, % 0.3±0.03 0.2±0.02 0.3±0.01 0.4±0.01 0.3±0.02 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 49.9±1.9 50.6±1.2 50.7±1.7 47.7±1.6 48.7±2.0 Протромбиновое время, с 19.8±1.0 18.8±1.1 18.9±1.0 18.4±1.1 18.7±1.0 Самцы 21 день Гемоглобин, г/дл 16.6±0.09 16.7±0.1 16.7±0.09 16.6±0.08 16.3±0.1 Гематокрит, % 43.3±1.8 46.8±1.4 44.1±1.8 43.7±1.7 42.9±1.5 Эритроциты, 10¹²/л 6.7±0.09 5.8±0.08 6.8±0.08 7.0±0.1 5.9±0.09 Цветовой показатель (МСН), пг 22.8±0.6 23.9±0.8 23.9±0.5 23.5±0.9 23.7±0.6 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 63.3±0.7 59.1±0.7 60.8±0.8 64.1±.7 63.7±1.1 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 37.7±0.3 33.4±0.2 39.0±0.4 33.5±0.09 36.1±0.4 СОЭ, мм/ч 4.9±0.2 4.5±0.9 5.3±0.5 4.1±1.0 3.9±0.9 Тромбоциты, 10⁹/л 233±9 236±9 253±9 267±8 239±10 Лейкоциты, 10⁹/л 12.7±0.4 12.4±0.3 10.5±0.4 11.8±0.3 11.6±0.7 Палочкоядерные нейтрофилы, % 1.0±0.09 1.0±0.12 1.4±0.11 1.1±0.12 0.9±0.15 Сегментоядерные нейтрофилы, % 71.1±0.7 73.0±0.3 71.9±0.7 68.4±0.4 70.5±0.4 Базофилы, % 0 0 0   0 Эозинофилы, % 2.0±0.09 1.8±0.08 2.0±0.08 3.8±0.1 3.7±0.2 Моноциты, % 5.6±0.5 6.0±0.3 5.4±0.3 6.3±0.4 6.3±0.3 Лимфоциты, % 18.5±0.8 18.6±0.6 19.0±0.4 3.7±0.1 19.3±0.5 Плазматические клетки, % 0.2±0.02 0.2±0.02 0.3±0.009 6.2±0.4 0.3±0.01 Активирован. парциальн. ромбопластин. время, с 51.8±1.3 50.3±1.3 49.7±1.4 50.8±1.3 49.2±1.3 Протромбиновое время, с 19.4±1.3 19.5±0.9 19.9±1.3 19.4±0.9 17.7±1.1 Самки 21 день Гемоглобин, г/дл 17.2±0.08 16.3±0.09 16.0±0.09 16.0±0.1 16.5±0.09 Гематокрит, % 43.9±1.6 44.0±1.7 45.6±1.3 45.3±1.7 44.3±1.3 Эритроциты, 1012/л 6.8±0.1 6.5±0.09 6.0±0.1 5.9±0.1 6.2±0.09 Цветовой показатель (МСН), пг 23.5±0.8 23.0±0.6 23.3±0.8 23.1±0.7 23.5±0.7

Продолжение таблицы 26 1 2 3 4 5 6 Средний объем эритроцитов MCV, мкм³ 63.1±1.6 62.7±0.8 62.3±0.8 61.9±0.6 62.2±0.7 Средняя конц. гемоглобина в эритроците МСНС, % 35.6±0.6 37.4±0.6 33.3±0.09 34.2±0.2 32.6±0.3 СОЭ, мм/ч 3.9±0.9 4.1±0.9 4.1±0.9 5.1±0.4 4.6±0.8 Тромбоциты, 10⁹/л 233±9 268±9 268±9 265±8 239±8 Лейкоциты, 10⁹/л 12.2±0.7 11.6±0.2 11.7±0.3 11.0±0.4 12.0±0.4 Палочкоядерные нейтрофилы, % 0.9±0.14 1.2±0.14 1.2±0.12 1.0±0.13 1.0±0.12 Сегментоядерные нейтрофилы, % 66.7±0.3 69.2±0.6 70.8±0.2 66.8±0.4 66.3±0.6 Базофилы, % 0 0 0 0 0 Эозинофилы, % 3.6±0.09 3.1±0.1 3.6±0.09 3.7±0.09 3.2±0.2 Моноциты, % 5.9±0.2 6.2±0.4 6.3±0.2 6.5±0.3 6.6±0.1 Лимфоциты, % 18.9±0.4 20.3±0.5 20.4±0.3 19.4±0.5 19.2±0.3 Плазматические клетки, % 0.2±0.009 0.2±0.008 0.2±0.02 0.3±0.009 0.3±0.02 Активирован. парциальн. тромбопластин. время, с 51.6±1.2 50.9±1.6 50.6±1.1 49.6±1.3 47.6±1.7 Протромбиновое время, с 18.1±1.1 19.4±1.0 18.1±1.1 18.7±1.1 18.0±1.0

Статистический анализ полученных данных не выявляет значимых отличий между всеми экспериментальными группами ни по одному из показателей (для всех показателей критерий неоднородности групп оказался ниже критического значения).

ВЛИЯНИЕ НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ

В таблице 27 представлены значения основных биохимических показателей крови кроликов всех экспериментальных групп, полученные в конце исследования.

Анализ данных, представленных в таблице 27, не выявил какого-либо сдвига биохимических показателей крови в опытных группах как по отношению к контролю, так и по отношению друг к другу. Таким образом, к концу 14-дневного исследования результат применения обоих препаратов не привел к каким-либо заметным эффектам со стороны биохимических показателей крови.

Данные патоморфологического исследования

При наружном осмотре установлено, что кролики правильного телосложения, удовлетворительного питания. Выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, опрятного вида, очагов облысения не определяется. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие.

Глаза без воспаления. Придаточный аппарат не изменен. Конъюнктива розовой окраски. Патологического отделяемого из слезных каналов и конъюнктивальной полости нет. Радужная оболочка без патологических включений. Роговица имеет ровную, прозрачную поверхность.

Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно.

Деформации или отека конечностей нет.

Грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие. Лимфатические узлы сероватого цвета, округлой формы, с гладкой поверхностью и плотной беловатой капсулой. Между собой и с подлежащими тканями узлы не спаяны. Щитовидная железа розовато-красного цвета, обычной величины и формы, умеренно плотной консистенции. Тимус представляет собой плоское образование, бледного, чуть розоватого цвета, лежащее среди жировой ткани переднего средостения у рукоятки грудины. Размеры и плотность не изменены.

Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен. Листки перикарда тонкие, блестящие, гладкие. Величина и форма сердца изменений не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержатся темно-красные сгустки и жидкая кровь. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная.

Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски.

Слюнные железы овальной формы, желтоватого цвета, умеренно плотные, на разрезе зернистого вида. Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка желудка складчатая, блестящая, бледного цвета. Слизистая оболочка 12-перстной кишки бледно-розового цвета, гладкая, блестящая. Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая. Форма и величина печени изменений не представляют.

Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная. Поджелудочная железа обычной формы и величины, умеренной плотности, беловатой, чуть розовой окраски, дольчатая. Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции, с морщинистой капсулой. На разрезе на темно-красном фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы.

Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула плотная, беловатого цвета, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество. Надпочечники овальной формы, беловатого цвета, обычных размеров и плотности. Мочевой пузырь заполнен небольшим количеством прозрачной мочи. Слизистая оболочка пузыря складчатая, блестящая, бледной окраски. Тело матки самок умеренно плотной консистенции, форма и размеры не изменены, слизистая оболочка труб бледная, блестящая, гладкая. Яичники обычной величины и плотности, с неровной поверхностью, сероватого цвета. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и плотности, поверхность разреза зернистая, однородной бледной окраски. Капсула плотная, непрозрачная.

Твердая мозговая оболочка головного мозга плотная, беловатого цвета, снимается легко, сращений с веществом мозга нет. Вещество мозга обычной плотности. Борозды и извилины головного мозга хорошо выражены. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.

В таблице 28 представлены данные по массовым коэффициентам органов у кроликов из всех экспериментальных групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Цитоархитектоника коры больших полушарий головного мозга не нарушена. Нейроны всех слоев двигательной области коры содержат обычное количество хроматофильной зернистости Ниссля, имеющей вид крупных глубок в пирамидных клетках 5-го слоя. Ядра светлые, ядерная мембрана тонкая, ядрышки четкие. Нейроны разных ядерных образований среднего мозга (глазодвигательного нерва, красного ядра, черной субстанции) содержат крупные глыбки тигроида и светлые ядра с тонкой мембраной. Нейроны разных ядерных образований продолговатого мозга (ретикулярной формации, ядер черепно-мозговых нервов) содержат крупные глыбки тигроида и светлые ядра с четкими ядрышками. Признаки острого или хронического заболевания нейронов отсутствуют. Глиальные клетки (астроциты и олигодендроглия) не изменены. Ядра глиальных клеток содержат достаточное количество хроматина. Регрессивные или прогрессивные изменения глии отсутствуют.

Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Изменений эластического каркаса стенки аорты нет. Поперечная исчерченность миофибрилл левого и правого желудочков сердца и межжелудочковой перегородки отчетливая, ядра кардиомицитов светлые, цитоплазма оксифильная. Очагов нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Изменений соединительнотканной стромы миокарда не определяется. Эпителий слизистой оболочки гортани, трахеи, крупных бронхов сохранен, ядра эпителиальных клеток светлые. Сосуды под слизистого слоя обычного диаметра. Острые воспалительные изменения отсутствуют.

Альвеолы всех долей легких содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие. Эпителий альвеол и внутрилегочных бронхов без изменений. Просвет бронхов широкий. Острые воспалительные изменения отсутствуют.

Печень имеет выраженное дольчатое строение. Трабекулярная структура долек нарушений не представляет. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма зернистая, слабо оксифильная. Очаговых нарушений тинкториальных свойств цитоплазмы нет. Ядра содержат четкие ядрышки и достаточное количество хроматина. Синусоиды печени полнокровные.

Эпителий извитых канальцев почек не изменен. Цитоплазма оксифильная, ядра четкие, с тонкой мембраной и достаточным количеством хроматина, клеточные границы различимы. Капилляры клубочков и сосуды, расположенные между канальцами, полнокровные. Все зоны коры надпочечников отчетливо выражены. Клеточные границы отчетливые, ядра светлые. В цитоплазме клеток пучковой зоны видны вакуоли, представляющие собой капли жира на препаратах, окрашенных Суданом. Сосуды мозгового вещества полнокровные.

Лимфоидные элементы селезенки с четкими ядрами, деструкции или атрофии фолликулов нет. Ретикулярные клетки со светлыми, крупными ядрами. Эндотелий синусов не изменен.

Дефектов эпителиальной выстилки желудка не наблюдается. Главные и обкладочные клетки желез тела желудка без изменений. Плоский неороговевающий эпителий слизистой пищевода выраженного слоистого строения, с четкой базальной мембраной и светлыми ядрами. Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Клетки островков Лангерганса содержат светлые, четкие ядра, цитоплазма - слабо оксифильная. Эпителиальные клетки внешнесекреторной части железы базофильные, ядра, расположенные в средней части, четкие. Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные.

Фолликулы щитовидной железы имеют разные размеры и заполнены оксифильным коллоидом. Эпителий фолликул кубический, обычной высоты, ядра четкие. Сосуды стромы умеренно полнокровные. Строение подчелюстных слюнных желез нарушений не представляет. Светлые эпителиальные клетки слизистого отдела желез окружены базофильными белковыми полулуниями. Эпителий выводных протоков имеет четкие клеточные границы и светлые ядра. Лимфоретикулярные элементы подчелюстных лимфатических узлов не изменены. Деструкции, воспаления или атрофии узлов нет.

Тимус сохраняет выраженное дольчатое строение. Лимфоидные клетки (тимоциты), содержат четкие ядра с достаточным количеством хроматина и тонкой ядерной мембраной. Мозговое вещество тимуса содержит небольшое количество лимфоидных элементов, а также светлые эпителиальные клетки с крупными, бледно-окрашенными ядрами. Эпителиальные клетки образуют концентрические фигуры, напоминающие жемчужины - тельца Гассаля. Строма тимуса умеренно полнокровная.

В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания. Фолликулярный эпителий не изменен, ядра четкие, мозговое вещество яичников полнокровное. Яички самцов - эпителий семенных канальцев и интерстициальные клетки не изменены. Ядра четкие, цитоплазма оксифильная.

Глаза. При гистологическом исследовании срезов бульбарная конъюнктива характеризовалось отсутствие очагов некроза эпителия. Пласт эпителия был сохранен на всем протяжении. Пласты покровного эпителия без изменений. Межэпителиальные щели отчетливы. Кровеносные сосуды и воспалительная инфильтрация не определялись. В склере под конъюнктивой изменений воспалительного характера не отмечалось. Микроскопически в хрусталике без видимых изменений.

Таким образом, ежедневное интраконъюнктивальное введение лекарственной формы препарата Педифен 0.25% в разных дозах в течение 14 дней кроликам обоего пола не вызывает дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме изучаемых органов, а также не сопровождается местно-раздражающим действием на глаза.

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА ПЕДИФЕН 0.25% ПРИ ПОРАЖЕНИИ ГЛАЗ ИРРИТАНТАМИ

При проведении экспериментальной оценки эффективности лекарственной формы препарата Педифен 0.25% в качестве препарата сравнения был использован 2% раствор Дикаина (в форме глазных капель).

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СРЕДСТВА ТЕРАПИИ ПРИ ПОРАЖЕНИИ ГЛАЗ МОРФОЛИДОМ ПЕЛАРГОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Эксперименты по отработке схемы терапии поражений глаз, вызванных воздействием морфолида пеларгоновой кислоты (МПК), проводились на кроликах породы «Шиншилла». Экспериментальные животные были разбиты на три группы: 1 - в качестве средства терапии использовался препарат Педифен 0.25%; 2 - раствор Дикаина 2% (глазные капли); 3 - контроль без лечения. Схема терапии применялась по ранее отработанной методике, а именно двукратное интраконъюнктивальное введение препарата и интервалом 30 минут после инсталляции раствора МПК (3% раствор в объеме 0,02 мл). Наблюдение за животными осуществлялось в течение 14 суток. В ходе проведения эксперимента установлено, что в первые сутки после воздействия МПК состояние слизистых оболочек глаза кроликов практически не отличалось. Следует отметить более быстрое снижение выраженности слезотечения в группе №1. В дальнейшем, начиная с 3 сут отмечено стихание воспалительных явлений в группе №1. Проба с флуоресцеином была положительна у всех животных в течении 3-4 суток. Динамика стихания воспалительных и деструктивных изменений приведена в таб.29.

Таблица 29 Эффективность применения лекарственных средств (сроки нормализации при остром поражении глаз кроликов веществом МПК). Исследуемые показатели Сроки исчезновения симптомов поражения (сутки)   1 группа 2 группа 3 группа Гиперемия конъюнктивы 3-4 6-8 12 Отек конъюнктивы 1-2 4 8 Отделяемое 1 2 2-3 Флуоресцеиновая проба 4 8-9 10-14

Таким образом, несмотря на то, что при воздействии МПК не выявлено органического повреждения роговицы и выздоровление наступает самостоятельно, применение лекарственного препарата Педифен 0.25% в сравнении с дикаином в ранние сроки после воздействия РВ значительно ускоряет динамику процесса выздоровления.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СРЕДСТВА ТЕРАПИИ ПРИ ПОРАЖЕНИИ ГЛАЗ о-ХЛОРБЕНЗИЛИДЕНМАЛОНОДИНИТРИЛОМ

Воздействие орто-хлорбензилиденмалонодинитрилом (CS) сопровождалось обильным слезотечением (40-60 мм) в течение 15-30 минут, блефароспазмом, гиперемией конъюнктивы интенсивностью 2-3 балла, отеком конъюнктивы (1-2 балла), снижением чувствительности роговицы. Офтальмоскопия с помощью щелевой лампы через сутки выявляла локальные и очаговые помутнения эпителия роговицы (1-2 балла), микро- и очаговые помутнения в поверхностных и передних слоях стромы в виде кристаллических бесцветных и коричневатых включений. В одном случае наблюдали обширный инфильтрат роговицы с васкуляризацией и Рубцовыми изменениями. Таким образом, у животных без лечения в первые сутки после воздействия CS развивалась типичная картина ожогового процесса второй степени. Процесс обратного развития симптомов поражения глаз у животных без лечения (3 группа) составлял 7-9 дней. Результаты представлены в таблице 31.

Животным 1 группы после инстилляции вещества CS в глаза через 10 мин проводили закапывание препарата Педифен 0.25% по приведенной выше схеме. Наблюдение за глазами животных начинали сразу же после воздействия CS и осуществляли в течение 14 суток. У кроликов, которым проводили лечение вышеуказанным препаратом, такие проявления химического ожога, как отек век, гиперемия слизистых оболочек глаза проходили уже через 3-5 дней. Восстановление поврежденного эпителия роговицы (отрицательная флуоресцеиновая проба) происходило через 4 дня. Через 3-4 дня исчезала гиперемия конъюнктивы, через 5 дней полностью исчезал отек конъюнктивы. Видимое полное исчезновение симптомов воспаления происходило на 6 сутки.

Животным 2 группы в качестве средства оказания первой помощи интраконъюнктивально использовали раствор дикаина 2%. В первые сутки клиническая картина поражений слизистых оболочек глаз практически не отличалась от группы 1. В дальнейшем установлено, что исчезновение воспалительных явлений у животных данной группы протекает медленнее, но по сравнению с контрольной группой, с положительной динамикой.

Результаты эффективности лечения представлены в таблице 30.

Таблица 30 Эффективность применения лекарственных средств (сроки нормализации при остром поражении глаз кроликов веществом CS) Исследуемые показатели Сроки исчезновения симптомов поражения (сутки)   1 группа 2 группа 3 группа Гиперемия конъюнктивы 3-5 6 7-8 Отек конъюнктивы 3-5 6 9 Отделяемое 1 2 4 Флуоресцеиновая проба 4 6-7 7-9

С целью исследования особенностей развития отдаленных последствий поражений глаз веществом CS в условиях применения лекарственной терапии глаза всех животных подвергались через 3 месяца биомикроскопии роговицы и конъюнктивы с помощью щелевой лампы. В результате осмотра было установлено, что в некоторых случаях даже при наличии блестящей гладкой (здоровой на вид) роговицы на ее поверхности обнаруживались как легкие, поверхностные, так и глубокие очаги помутнения стромы различной формы, прорастание через лимб поверхностных и глубоких сосудов. Результаты влияние лекарственных препаратов на предупреждение отдаленных последствий (по наблюдениям через 3 месяца) после поражения глаз CS представлены в таблице 31

Таблица 31 Влияние лекарственных препаратов на предупреждение отдаленных последствий (по наблюдениям через 3 месяца) после поражения глаз CS. Интегральный результат Наблюдаемые группы животных   1 группа 2 группа 3 группа Число кроликов без патологии конъюнктивы глаз 4 4 1 Число кроликов с патологией роговицы 1 2 4

Таким образом, применение препарата Педифен 0.25% позволяет сократить сроки выздоровления и предупредить развитие последующих осложнений со стороны глаз, вызываемых веществом после поражения веществом CS.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СРЕДСТВ ТЕРАПИИ ПРИ ПОРАЖЕНИИ ГЛАЗ ДИБЕНЗ[b,f]-1,4-ОКСАЗЕПИНОМ (CR)

Воздействие вещества CR сопровождалось развивающимся блефароспазмом, нарастающим слезотечением, гиперемией конъюнктивы, отеком конъюнктивы, снижением чувствительности роговицы. Через 20-120 минут после инсталляции раствора вещества CR у всех животных наблюдали достаточно интенсивное слезотечение, умеренный блефароспазм, интенсивную гиперемию конъюнктивы, множественные субконъюнктивальные кровоизлияния, хемоз, отек век, отечность третьего века. При проведении флуоресцеиновой пробы отмечалось интенсивное прокрашивание в нижних квадрантах всех глаз. Через 24 и 48 часов наблюдали выраженную гиперемию роговицы; флуоресцеиновая проба сопровождалась обширным (иногда тотальным прокрашиванием переднего отдела роговицы, что указывает на эрозию роговой оболочки глаз. Прокрашивание флуоресцеином переднего отрезка глаза у отдельных животных контрольной группы, выраженное в меньшей степени, наблюдалось до 8 дней после инстилляции вещества CR.

Значительное снижение воспалительных явлений конъюнктивы и век, отсутствие отека век и третьего века. У части животных положительная флуоресцеиновая проба в области нижних сегментов зрачка. Спустя 14 дней после инстилляции у некоторых животных регистрировали легкую гиперемию (1 балл), точечные окрашивания нижнего отдела роговицы при проведении флуоресцеиновой пробы.

Таким образом, полное восстановление переднего отдела глаза после травмы, вызванной веществом CR в количестве 0,05 мг, наступает через 2 недели.

Через 10 мин после воздействия ирританта на фоне выраженного слезотечения, гиперемии конъюнктивы, век и третьего века, нарастающего отека век проводили двухкратное закапывание препарата Педифен 0.25% с интервалом в 10 сек и повторное закапывание препарата Педифен 0.25% через 30 мин. Через 10 мин после повторного закапывания препарата Педифен 0.25% в течение 20 мин фиксировали отсутствие роговичного рефлекса, а в последующем - снижение чувствительности роговицы. Спустя 60 мин наблюдали умеренное слезотечение, гиперемию слизистых век до 3 баллов, хемоз, конъюнктивит с серозными выделениями через 10 мин после повторного закапывания препарата Педифен 0.25%. В течение 20-30 мин после каждого закапывания препарата отмечали отсутствие или значительное снижение роговичного рефлекса, положительную флуоресцеиновую пробу в нижних сегментах с захватом оптической зоны. В течение первых суток острые воспалительные явления не проходили.

Через двое суток после лечения интенсивность слезотечения приближалась к исходным данным, гиперемия конъюнктивы век, третьего века быстро уменьшалась, отек век составлял 1 балл.

Через 3 суток наступает практически нормализация слезотечения, остается умеренная гиперемия век (2 балла), отек век до 1 балла, положительная флуоресцеиновая проба с захватом нижних отделов радужки. Прокрашиваются точечные кровоизлияния.

Через 5 дней после воздействия вещества CR и последующего лечения препаратом Педифен 0.25% отмечалось отсутствие большинства проявлений интоксикации: повышенного слезотечения, гиперемии слизистых оболочек век, отека конъюнктивы, век, полное стихание воспалительных проявлений тканей глаз. Вместе с тем, сохранялось нарушение целостности эпителия роговицы у части животных, что подтверждалось частичным прокрашиванием при проведении флуоресцеиновой пробы. Полное восстановление регистрировали на 7-8 сутки, что практически в 2 раза превосходит сроки нормализации состояния слизистых оболочек глаз лабораторных животных, в отношении которых не проводились лечебные мероприятия.

При применении в качестве препарата сравнения раствора Дикаина, сроки выздоровления были незначительно сокращены, что составило 10-12 суток.

Таким образом, в результате экспериментальной оценки эффективности лекарственной формы препарата Педифен 0.25% показано, что применение указанного препарата в ранние сроки после поражения глаз ирритантами значительно сокращает сроки проявления раздражающего действия, способствует более быстрому восстановлению поврежденных слизистых в результате воздействия химического фактора газового оружия и предупреждает развитие отдаленных последствий. Препарат в экспериментальных исследованиях продемонстрировал лучшие результаты в сравнении с препаратом сравнения, т.к. наряду с местным анетезирующим действием обладает и другими фармакологическими свойствами. Педифен 0.25% является антиоксидантом, что значительно сокращает сроки течения воспалительного процесса и способствует регенераторным процессам.

ИЗУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕННОСТИ И ИММУНОТОКСИЧНОСТИ ОЦЕНКА АЛЛЕРГЕННЫХ СВОЙСТВ

Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)

Морским свинкам препарат вводили интраконъюнктивально в течение 5 дней. Через 21 день после окончания сенсибилизации животным внутрисердечно вводили разрешающую дозу, равную суммарной сенсибилизирующей. Такую же дозу вводили морским свинкам контрольных групп.

Учет интенсивности анафилактического шока проводился в индексах по Weigle:

++++ - шок со смертельным исходом;

+++ - шок тяжелой степени (общие судороги, асфиксия, животное теряет способность удерживаться на лапах, падает на бок, не погибает);

++ - шок умеренный (небольшие судороги, выраженные явления бронхоспазма);

+ - шок слабый (некоторое беспокойство, учащенное дыхание, почесывание мордочки, непроизвольное мочеиспускание, дефекация, шерсть взъерошена);

0 - шок не развился, признаки его отсутствуют.

Реакция иммунных комплексов

Для постановки реакции использовали морских свинок, которым вводили препарат Педифен 0.25% интраконъюнктивально. В контрольных группах использовали воду в таком же объеме.

Через 10 суток после последнего введения препарата осуществляли введение разрешающей дозы внутрикожно.

Разрешающую дозу препарата определяли на интактных животных. За разрешающую дозу принимали наибольшее разведение антигена, не вызывающее видимых изменений в коже через 1 час после введения. В контрольных группах таким же способом вводили растворитель.

Учет реакции проводили визуально (в баллах по С.В.Суворову). В положительном случае уже через 30 минут на месте инъекции может развиться отек и гиперемия. Через 2-3 часа воспалительный очаг может уплотниться, и кожа становится буро-красной. При гистологическом исследовании в случае положительной реакции может быть обнаружено острое геморрагическое воспаление, в инфильтрированном участке могут быть видны полиморфно-ядерные лейкоциты.

Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток.

Для получения тучных клеток использовали беспородных крыс. Для этого обескровленным крысам в брюшную полость вводили 6 мл стерильного физиологического раствора (рН=7.4), подогретого до температуры 37°С. После массажа в течение 1 мин брюшной стенки по средней линии брюшины делали разрез длиной 1.5 см. Переворачивали тушку разрезом вниз и собирали экссудат, стекающий по петлям кишечника в стерильную пробирку.

Препараты готовили на предметных стеклах, окрашенных заранее 0.3% спиртовым раствором нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре.

К 30 мкл взвеси тучных клеток добавляли 30 мкл сыворотки опытного животного и 30 мкл исследуемого препарата в заранее подобранной дозе таким образом, чтобы дегрануляция тучных клеток в контроле не превышала 5%. В случае Педифен 0.25% таким оптимальным разведением явилось разведение 1 мг/мл.

Затем препараты покрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелином, и инкубируют в термостате при 37°С в течение 15 минут.

После этого препарат микроскопируют под увеличением ×20. Оценку результатов проводят дифференциальным способом учета, подсчитывая показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) по формуле:

ПДТК=(1·а+2·б+3·е+3·д)/100,

где а, б, с, д - количество (среднее из трех повторений) дегранулированных клеток соответственно степени дегрануляции (слабо выраженной, умеренной, резкой и полной дегрануляции клеток). В каждом препарате подсчитывали 100 клеток. Реакцию считали положительной, если ПДТК превышал 0.2.

Конъюнктивальная проба

Для постановки пробы 50 мг (мкл) препарата вводили под верхнее веко морских свинок контрольных и опытных групп. Под верхнее веко второго глаза вводили такое же количество воды (контроль).

Реакцию учитывали через 15 минут и через 24-48 часов в баллах.

ОЦЕНКА АЛЛЕРГЕННЫХ СВОЙСТВ

Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок)

Через 21 день после окончания введения препарата внутрисердечно всем опытным и контрольным группам была введена разрешающая доза Педифена 0.25%.

Оценку реакции проводили в индексах по Weigle. Полученные результаты представлены в таблице 32.

Таблица 32 Оценка реакции общей анафилаксии (индексы по Weigle) у морских свинок после применения препарата Педифен 0.25% Экспериментальные группы Пол Номера животных 1 2 3 4 5 6 Контроль М 0 0 0 0 0 0 F 0 0 0 0 0 0 Педифен 0.25% М 0 0 0 0 0 0 F 0 0 0 0 0 0

Таким образом, признаки даже умеренного шока не были выявлены ни у одного животного из группы самок и из группы самцов, получавших Педифен 0.25% в исследованной дозе.

Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток

Эксперименты выполнены на морских свинках, у которых на 10 день после интраконъюнктивального введения Педифена 0.25% была взята кровь для получения сыворотки. Полученные показатели дегрануляции тучных клеток крыс в присутствии опытных и контрольных сывороток, препарата Педифен 0.25% или физиологического раствора в контроле представлены а таблице 33.

Таблица 33 Реакция дегрануляции тучных клеток крыс (ПДТК) в присутствии сывороток морских свинок, получавших Педифен 0.25% в течение месяца Экспериментальные группы Пол Номера животных 1 2 3 4 5 6 Контроль М 0.09 0.10 0.12 0.16 0.14 0.11 F 0.15 0.16 0.14 0.12 0.12 0.13 Педифен 0.25% М 0.16 0.10 0.14 0.14 0.12 0.15 F 0.18 0.14 0.13 0.17 0.16 0.15

Среди полученных показателей дегрануляции тучных клеток ни в одном из случаев не превышали значение 0.2, после которого эта реакция считается положительной. Во всех остальных случаях он был ниже этого значения и, следовательно, отрицательным. Полученные данные, обработанные статистически, представлены в таблице 34.

Таблица 34 Сравнение показателей дегрануляции тучных клеток в опытных и контрольных группах морских свинок Экспериментальные группы Пол ПДТК (М±m) t-критерий Стьюдента Вероятность (р) Контроль М 0.120±0.011 - - F 0.137±0.007 - - Педифен 0.25% М 0.135±0.009 1.08 >0.05 F 0.155±0.008 1.81 >0.05

Таким образом, достоверных отличий в средних значениях ПДТК в опытных и контрольных группах самок и самцов морских свинок, получавших препарат Педифен 0.25% в течение месяца, не выявлено. Эти данные позволяют заключить, что при интраконъюнктивальном введении препарат Педифен 0.25% не обладает аллергенными свойствами, выявляемыми в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток.

Реакция иммунных комплексов

Сенсибилизацию морских свинок осуществляли путем интраконъюнктивального введения препарата Педифен 0.25% в течение 5 дней. Через 10 суток после последнего введения внутрикожно вводили разрешающую дозу препарата. Эту дозу определяли на интактных животных и наибольшим разведением препарата, не вызывающим видимых изменений в коже через час после внутрикожной инъекции. В контроле вводили такое же разведение растворителя - физиологического раствора. Полученные результаты представлены в таблице 35.

Учет реакции проводили визуально начиная с 30 мин после введения разрешающей дозы. На этом сроке никаких проявлений на коже обнаружено не было. Никаких признаков реакции не было обнаружено спустя 1, 4 и 24 часа после ее постановки.

Таблица 35 Реакция иммунных комплексов у морских свинок после введения разрешающей дозы Педифена 0.25% Экспериментальные группы Пол Номера животных 1 2 3 4 5 6 Через 1 час Контроль М 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 F 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Педифен 0.25% М 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 F 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Через 4 ч Контроль М 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 F 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Педифен 0.25% М 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 F 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Через 24 ч Контроль М 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 F 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Педифен 0.25% М 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 F 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Примечание: в числителе - результат реакции в опыте, в знаменателе - результат в контроле.

Учитывая отсутствие показателей реакции в опыте и контроле на всех сроках наблюдения, можно прийти к выводу, что при интраконъюнктивальном применении препарат Педифен 0.25% не обладает аллергенными свойствами, выявляемыми в реакции иммунных комплексов.

Конъюнктивальная проба

Конъюнктивальную пробу проводили на 10 день после окончания интраконъюнктивального введения Педифена 0.25% (опытные группы) или равного объема воды в течение 5 дней.

Ни у одного животного опытных и контрольных групп не было реакции на введение препарата, как и в контроле с дистиллированной водой.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у Педифена 0.25% аллергенных свойств, выявляемых в конъюнктивальной пробе.

ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Определение фагоцитарной активности макрофагов

Оценку влияния препарата на естественную резистентность организма проводили, определяя фагоцитарную активность макрофагов в опытных (получавших препарат в течение 14 дней) и контрольных (получавших воду в соответствующем объеме) группах мышей СВА обоего пола (по 6 животных в каждой группе).

Мышей опытных и контрольных групп забивали путем дислокации шейных позвонков. Асептически освобождали брюшину и внутрибрюшинно вводили 5 мл среды 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки. После массажа брюшной полости среду отсасывали шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяли в общий пул. Подсчитывали количество клеток в мл среды и доводили концентрацию до 1.5-106 кл/мл. Суспензию разливали по 200 мкл в лунки микропланшета для культивирования и промывали средой 199 в специальной насадке для центрифуги ЦЛР-1. Инкубировали 2 часа при 37°С в CO2-инкубаторе в атмосфере абсолютной влажности с 5% CO2. К осадку клеток добавляли 200 мкл 0.1% раствора нейтрального красного на среде 199. Затем микропланшету инкубировали при 37°С в течение 1 часа.

Микропланшету центрифугировали, осадок отмывали 2 раза физиологическим раствором и добавляли по 200 мкл лизирующего раствора. После этого микропланшету фотометрировали на спектрофотометре «Мультискан» при 450 нм.

Сходный метод описан в работе Uede Т. et al. (1986), посвященной колориметрическому определению фактора некроза опухолей с использованием микропланшет для культивирования и этого же красителя. Преимуществом микромодификации перед макрометодом является меньший расход клеток, меньший объем реагентов и, следовательно, возможность выполнения большего количества повторов измерений в одной и той же группе: в нашем микрометоде использовалось не менее 8 измерений в каждой группе.

Определение титра гемагглютининов в сыворотке крови

Для определения влияния препарата на гуморальный иммунный ответ использовали определение титра антител к эритроцитам барана (ЭБ) в опытных и контрольных группах мышей линии СВА обоего пола, которым вводили препарат.

Затем мышей внутрибрюшинно иммунизировали 0.2 мл 10% ЭБ в физиологическом растворе. На 7 сутки получили сыворотку крови, прогрели ее при 56°С для инактивации комплемента в течение 30 минут.

Для определения титра гемагглютининов использовали микромодификацию реакции гемагглютинации с помощью микротитратора Такачи производства фирмы MOM (Венгрия). Дозатором микротитратора вносили 25 мкл сыворотки в разведении 1:5 в 1 и 2 лунку, где, как и во всех последующих лунках (с 2 по 12) каждого ряда микропланшеты, заранее были внесены 25 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки на 0.15 М NaCl. Затем с помощью устройства для разведения на 25 мкл микротитратора сыворотку перемешивали и переносили 25 мкл во вторую лунку этого ряда и так далее до 11 лунки включительно. Лунка 12 служила контролем, где была только 1% нормальная кроличья сыворотка. После разведения сыворотки получали ряд двукратных разведении, начиная от 1:5, 1:10 и т.д.

Затем во все лунки вносили 25 мкл 0.5% взвеси ЭБ на 1% нормальной кроличьей сыворотке. Планшеты встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 1 час. За это время реакция заканчивалась и в контроле с 1% кроличьей сывороткой формировался осадок, что свидетельствовало об отрицательной реакции в данной лунке. В опытных лунках определяли титр антител, т.е. наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается отчетливая агглютинация эритроцитов. Титр сыворотки выражали в виде обратной величины титра или в log по основанию 2.

Для определения изотипа антител к 25 мкл разведенной в 5 раз иммунной сыворотки добавляли 25 мкл 0.2 М раствора 2-меркаптоэтанола. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Остальные этапы постановки реакции (разведение сыворотки, внесение эритроцитов) осуществляли вышеописанным способом. Оценку класса имму-ноглобулинов антител к ЭБ производили следующим образом: общий титр антител (без 2-МЭ) является суммой взаимодействий IgM- и IgG-антител с ЭБ, а титр IgG-антител является титром реакции в присутствии 2-МЭ, так как IgM-антитела чувствительны к 2-МЭ.

Определение выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа Сенсибилизацию мышей СВА осуществляли 1-107 ЭБ в объеме 0.1 мл подкожно. На 5 сутки в качестве разрешающей дозы вводили 2-108 ЭБ в объеме 20 мкл под апоневротическую пластинку одной из конечностей. В контралатеральную лапу вводили в таком же объеме физиологический раствор. Через 24 часа оценивали выраженность местной реакции по соотношению величины отека стоп опытной и контрольной лап. Объем стопы измеряли с помощью штангенциркуля. Индекс реакции (ИР) вычисляли по формуле

ИР=[(ho-hk)/hk]·100%,

где ho и hk - объем стопы в опыте и контроле соответственно.

Для оценки влияния препарата на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа использовали мышей линии СВА обоего пола, которым вводили препарат Педифен 0.25% в течение 5 дней. Не менее 6 животных было в каждой группе. В контроле были использованы животные обоего пола этой же партии мышей СВА, которым вводили также интраконъюнктивально воду в соответствующем объеме.

Результаты экспериментов обрабатывались методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Определение массы лимфоидных органов

Масса тела и массовые коэффициенты внутренних органов определялась у крыс всех экспериментальных групп. Полученные экспериментальные данные при введении препарата в дозе 14 мг/кг представлены в таблице 36. Практически не было обнаружено различий в массовых коэффициентах тимуса и селезенки в контрольной и опытной группах.

При макроскопии тимус контрольных и опытных групп имел треугольную форму, беловатый цвет и чуть плотноватую консистенцию. Размеры и форма селезенки в опыте также изменений не представляли по сравнению с контролем. Поверхность селезенки имела однородную темно-вишневую окраску, была гладкой. Консистенция селезенки была умеренно плотной. На разрезе органа выделялись сероватые мелкоклеточные фолликулы.

Таблица 36 Массовые коэффициенты (МК) органов белых крыс при введении Педифена 0.25% (г/кг веса тела) Орган Контроль Педифен 0.25% М F М F Сердце 3.7±0.1 3.5±0.1 3.6±0.1 3.7±0.1 Легкие с трахеей 8.9±0.2 9.0±0.2 9.1±0.3 8.8±0.4 Тимус 1.45±0.06 1.46±0.07 1.38±0.04 1.36±0.06 Печень 41.1±1.5 40.7±2.3 41.3±1.4 40.9±2.0 Селезенка 5.7±0.2 6.1±0.1 6.0±0.3 5.8±0.2 Почка (левая) 4.2±0.1 4.1±0.1 4.1±0.1 4.2±.2 Надпочечник (левый) 0.14±0.01 0.16±0.02 0.15±0.03 0.14±0.02 Головной мозг 7.18±0.15 7.20±0.16 7.19±0.12 7.17±0.14 Яички или яичники 13.2±0.20 0.68±0.04 13.5±0.3 0.74±0.05

Полученные данные позволяют заключить, что по данным вскрытия и макроскопического исследования введение препарата Педифен 0.25% в подостром и хроническом эксперименте не приводит к изменению массы центральных органов иммунной системы. В связи с этим определение клеточности этих органов не проводили.

Определение фагоцитарной активности макрофагов

Оценку влияния препарата на естественную резистентность организма проводили, сравнивая фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей СВА опытных (ежедневное введение препарата в течение 5 дней) и контрольных (введение воды в соответствующем объеме) групп. Полученные показатели оптической плотности в различных экспериментальных группах представлены ниже в таблице 37 и в статистически обработанном виде - в таблице 38.

Таблица 37 Результаты измерения оптической плотности в различных экспериментальных группах Экспериментальные группы Пол Измеренные значения оптической плотности Контроль М 0.543 0.618 0.531 0.529 0.602 0.563 0.586 0.625 F 0.629 0.621 0.570 0.599 0.644 0.623 0.619 0.545 Педифен 0.25% М 0.637 0.606 0.577 0.575 0.572 0.573 0.536 0.597 F 0.602 0.573 0.529 0.622 0.580 0.611 0.588 0.546

Таблица 38 Показатели фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей СВА после применения препарата Педифен 0.25% Экспериментальные группы Пол Количество измерений Оптическая плотность t-критерий Стьюдента Вероятность (p) Контроль М 8 0.575±0.014 - - F 8 0.606±0.012 - - Педифен 0.25% М 8 0.584±0.011 0.54 >0.05 F 8 0.581±0.011 1.53 >0.05

Из полученных данных видно, что применение препарата Педифен 0.25% не вызывает изменений фагоцитарной активности в опытных группах по сравнению с контрольными группами самцов и самок.

Таким образом, препарат Педифен 0.25% не обладает иммунотоксическими свойствами, выявляемыми по оценке фагоцитарной активности макрофагов.

Определение влияния препарата Педифен 0.25% на гуморальный иммунный ответ к эритроцитам барана

Для выявления влияния препарата на специфический гуморальный иммунный ответ использовали определение титра гемагглютининов в опытных и контрольных группах мышей СВА, иммунизированных эритроцитами барана. На 7 сутки после иммунизации в сыворотках определяли титр антител к ЭБ и титр IgG-антител к этому антигену. Полученные результаты представлены в таблице 390.

Таблица 39 Титр гемагглютининов в сыворотках опытных и контрольных групп мышей СВА после применения препарата Педифен 0.25% №№ животных Контроль Педифен 0.25% М F М F Общ. титр Титр IgG Общ. Титр Титр IgG Общ. титр Титр IgG Общ. Титр Титр IgG 1 5.31 5.31 5.31 5.31 8.31 7.31 8.31 7.31 2 6.31 5.31 5.31 5.31 6.31 6.31 8.31 7.31 3 9.31 8.31 7.31 6.31 9.31 9.31 8.31 8.31 4 7.31 7.31 7.31 7.31 8.31 8.31 5.31 5.31 5 8.31 8.31 8.31 8.31 6.31 6.31 7.31 7.31 6 8.31 8.31 6.31 6.31 8.31 8.31 8.31 7.31 7 7.31 7.31 7.31 7.31 9.31 8.31 7.31 6.31 8 8.31 8.31 - - 9.31 9.31 8.31 8.31 М±m 7.56±0.45 7.31±0.46 6.74±0.43 6.60±0.42 8.19±0.44 7.94±0.42 7.69±0.38 7.19±0.35 Примечание: Титр антител представлен в единицах log2. В двух группах число животных (самок) равно 7.

Хотя по данным таблицы в опытных группах отмечается некоторая тенденция к увеличению как общего титра антител, так и IgG-антител, это увеличение не имело статистически достоверного характера - максимальное значение t-критерия, полученное при сравнении групп и которое достигается для группы самцов (среднее равно 8.19±0.44 против 7.56±0.45 в контроле), равно 1.66, что значительно ниже критического значения.

Определение влияния препарата Педифен 0.25% на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа

Для изучения влияния препарата на специфический клеточный иммунитет исследовали выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа в опытных, получавших исследуемый препарат в течение 5 дней, а также контрольных группах мышей.

Для индукции гиперчувствительности замедленного типа мышей СВА сенсибилизировали эритроцитами барана и на 5 сутки им вводили разрешающую дозу антигена под апоневротическую пластинку. В контралатеральную лапу вводили такой же объем физиологического раствора и через 24 часа оценивали выраженность местной реакции по соотношению величины отека стоп опытной и контрольной лапы.

В таблице 40 представлены индексы реакции отдельных животных в опытных и контрольных группах:

Таблица 40 Влияние препарата Педифен 0.25% на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа мышей СВА Экспериментальные группы Пол Индексы реакций, % M±m t-критерий Стьюдента Контроль М 100 67 80 67 100 100 85.7±6.7   F 67 92 100 67 67 100 82.2±6.9   Педифен 0.25% М 100 100 93 67 100 77 89.5±5.8 0.43 (р>0.05) F 93 89 67 67 92 100 84.7±5.8 0.28 (р>0.05)

Сравнение полученных данных показывает, что препарат Педифен 0.25% не обладает стимулирующим либо ингибирующим действием в отношении реакции гиперчувствительности замедленного типа у самок мышей СВА.

Таким образом, в результате изучения возможного аллергенного действия препарата Педифен 0.25% на морских свинках обоего пола было показано, что он не обладает аллергенными свойствами, судя по реакции общей анафилаксии при применении препарата даже в дозах, в 10 раз больше терапевтической. Кроме того, конъюнктивальные пробы, реакции дегрануляции тучных клеток и реакции иммунных комплексов были отрицательными.

При изучении вероятных иммунотоксических свойств препарата на мышах линии СВА обоего пола было показано, что препарат Педифен 0.25% при длительном применении не влияет на вес центральных лимфоидных органов и фагоцитарную активность макрофагов.

Полученные данные позволяют заключить, что препарат Педифен 0.25% не обладает аллергенными и имунотоксичными свойствами.

Проведенные экспериментальные исследования общей токсичности (острой, подострой, местного раздражающего действия) лекарственной формы нового препарата Педифен 0.25% в виде спрея показали, что препарат в условиях, как острого введения, так и подострого применения в течение 14 дней практически не оказывает токсического действия на организм теплокровных лабораторных животных (грызунов и негрызунов - кроликов).

При интраконъюнктивальном пути введения крысам и кроликам значение ЛД50 препарата Педифен 0.25% находится выше дозы 5 г/кг, которая является максимально возможной по объему.

Подострое (14 дней) ежедневное интраконъюнктивальное применение лекарственной формы препарата экспериментальным животным в дозах, превышающих терапевтические для человека в десятки-сотни раз, не оказывало вредного воздействия на основные адаптационные системы (нервную, сердечно-сосудистую, кроветворную, выделительную, антитоксическую), обмен веществ, общее состояние и развитие, основные гомеостатические параметры организма.

Следует отметить также отсутствие у лекарственной формы препарата Педифен 0.25% раздражающего действия на ткани в месте аппликации (интраконъюнктивальном). Все это относится как к грызунам, так и негрызунам, т.е. свидетельствует об универсальном характере безвредности нового препарата.

В результате изучения возможного аллергенного действия препарата Педифен 0.25% в виде спрея на морских свинках обоего пола было показано, что он не вызывает реакции общей анафилаксии при применении препарата даже в дозах, в 10 раз больше терапевтической. Кроме того, конъюнктивальные пробы, реакции дегрануляции тучных клеток и реакции иммунных комплексов были отрицательными. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что препарат не обладает аллергезирующим действием.

Проведенные эксперименты показали, что введение препарата Педифен 0.25% в виде спрея не оказывает иммунотоксического действия.

Приложение:

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

F - female - самка

fd(s) - fissura dextra (sinistra) - глазная щель левая (правая)

fd(s) - fissura dextra (sinistra) - глазная щель левая (правая

GLP - «Good Laboratory Practice» - «Добротная лабораторная практика»

МПК - морфолид пеларгоновой кислоты

CR - дибенз(b,f)-1.4-оксазепин

CS - орто-хлорбензилиденмалонодинитрил

МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроцитах

МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах

MCV - средний объем эритроцитов

pd(s) - pupilla dexter (sinister) - зрачок правый (левый)

pd(s) - pupilla dexter (sinister) - зрачок правый (левый)

АД - артериальное давление систолическое

АЛТ - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

в/ж - внутрижелужудочно

М - male - самец

МК - массовый коэффициент

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

ЧД - частота дыхания

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭКГ - электрокардиограмма

Предложена фармацевтическая композиция в виде спрея для лечения поражений нелетальными раздражающими средствами (например, морфолида пеларгониевой кислоты), содержащая педифен, при соотношении ингредиентов, мас./об.%: педифен гидрохлорид 0,01-10,0; натрия хлорид 0,1-10,0; вода для инъекций до 100 мл. Показана эффективность педифена по заявленному назначению благодаря местно-анестезирующему действию и другим фармакологическим свойствам, при этом предупреждалось развитие осложнений со стороны глаз (патология роговицы или конъюнктивы), вызванных раздражающими средствами. Препарат не обладает аллергенными и иммунотоксичными свойствами. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 40 табл.

1. Фармацевтическая композиция в виде спрея для лечения поражений нелетальными раздражающими средствами, отличающаяся тем, что содержит действующее вещество педифен и дополнительно натрия хлорид, при этом соотношение ингредиентов составляет, г:
Педифен гидрохлорид 0,01-10,0 Натрия хлорид 0,1-10,0 Вода для инъекций, мл до 100

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что педифен используют в количестве 0,1-1,0 г.