СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2013 года по МПК A61K35/56 A61K38/00 A61P39/00 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к новым лекарственным средствам для лечения воспалительных заболеваний.

Новым подходом к проблеме коррекции нарушений функций организма является создание лекарственных средств на основе эндогенных биологически активных веществ. Результаты экспериментальных клинических исследований свидетельствуют о том, что пептидные биорегуляторы обладают выраженными противовоспалительными, иммунномодулирующими, антимутагенными и антиканцерогенными свойствами, что позволяет их использовать для профилактики и лечения системных воспалительных и иммуннодефицитных заболеваний.

Проблема поиска новых высокоэффективных противовоспалительных препаратов до сих пор остается весьма актуальной. Применение для лечения заболеваний позвоночника и суставов (ревматоидный и псориатический артрит, остеоартрит, деформирующий остеоартроз, подагра и др.), обусловленных дегенерацией и деструкцией соединительной и хрящевой ткани, нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) (бутадион, оксифенилбутазон, идометацин, вольтарен, ортофен, бруфен и др.), препаратов базисной терапии (кризанол, купренил, делагил, резохин и др.) и цитостатических иммунодепрессантов (азатиоприн, хлорбутин) приводит к серьезным осложнениям в 30-60% случаях. При этом угнетается биосинтез простагландинов, что негативно сказывается на функционировании пищеварительной, сердечно-сосудистой и центральной нервной системы, органов чувств и кроветворения. НПВП могут нарушать свертываемость крови, вызывать угнетение стволовых клеток костного мозга, повреждение почек и печени, могут задерживать воду и натрий, повышать артериальное давление, вызывать головные боли, бронхоспастические явления и аллергические дерматозы [Комаров Ф.И., Кукес В.Г, Сметнев А.С. и др. Внутренние болезни. - М.: Медицина, 1990. - 688 с.].

Таким образом, создание новых средств, характеризующихся высоким фармакологическим действием при минимальных побочных эффектах, является актуальной задачей. Преимуществом создания препаратов из сырья природного происхождения является их высокая терапевтическая активность и низкая токсичность, что позволяет рекомендовать их как для лечения, так и для профилактики.

На современном этапе научно-технического развития, в условиях усиливающегося сырьевого «голода», особо остро проявляющегося в области биологически активных веществ как основы фармакологических препаратов, перспективно изучение и разработка новых методов извлечения биологически активных соединений из морских гидробионтов.

Представители типа иглокожих привлекают к себе устойчивое внимание в связи с высоким регенеративным потенциалом. Известно, что исключительно важную роль в регенеративных процессах у различных иглокожих играют свободноживущие клетки целомической жидкости - целомоциты. При повреждении тела иглокожих целомоциты выполняют, по меньшей мере, тройственную функцию. Во-первых, они быстро агрегируют в поврежденном участке стенки тела, восстанавливая тем самым изоляцию внутренней среды. Во-вторых, в ходе регенерации функцией целомоцитов является фагоцитоз клеточного дебриса и микроорганизмов, проникающих во внутреннюю среду организма в области раны. В-третьих, целомоциты осуществляют синтез множества биологически активных веществ, имеющих защитное и регуляторное значение. К числу факторов, синтезируемых целомоцитами иглокожих, относится белок теплового шока HSP70, оксид азота, компоненты фенолоксидазной защитной системы, активные формы кислорода, факторы-гомологи системы комплемента, лектины, а также белки и пептиды, регулирующие клеточную пролиферацию и миграцию. Система целомоцитов иглокожих в целом рассматривается как примитивная система врожденного иммунитета, вероятно, имеющая некоторую степень гомологии с иммунной системой позвоночных, учитывая филогенетическое сродство данных групп организмов.

Известно средство, обладающее адаптогенным действием из морского животного сырья из группы, включающей морского ежа, краба, трепанга, кальмара, белухи (Pat. RU 2255747 С2, опубл. 27.01.2005).

Известен способ получения биологически активных веществ из целомической полости рыб и пресмыкающихся или брюшной полости млекопитающих, которые могут быть использованы в качестве адаптогенных средств (Pat. RU 2222338 С2, опубл. 27.01.2004).

Из экстракта целомоцитов зеленых морских ежей выделены два антимикробных пептида strongylocins 1 and 2 с молекулярной массой 5.6 and 5.8 kDa (Li С, Haug Т, Styrvold OB, J⌀rgensen T⌀, Stensvåg K. Strongylocins, novel antimicrobial peptides from the green sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis. Dev Comp Immunol. 2008: 32 (12): 1430-40).

Известна комбинация биоактивного концентрата из животного или морского сырья и хондроитин сульфата в комбинации с синергистическими субстанциями (например, гепарин, витамин Е, растительные экстракты и др.), обладающая антигиалуронидазной и противовоспалительной активностью и применяемой в виде инъекций, мазей, гелей и суппозиториев (Pat. US 5965151, опубл. 12.10.1999).

В качестве прототипа выбран препарат Алфлутоп, производимый в Румынии. Препарат выпускают в виде 1% раствора для инъекций. Активным компонентом препарата является биоактивный концентрат из мелкой морской рыбы: кильки (Sprattus sprattus sprattus), мерланга черноморского (Odontogadus merlangus euxinus), пузонка черноморского (Alosa tanaica nordmanni) и анчоуса черноморского (Engraulis encrassicholus ponticus), полученный путем экстракции с последующей депротеинизацией и делипидизацией. В его состав входят глюкозаминогликаны, включая хондроитин, дерматан сульфат, аминокислоты, полипептиды и микроэлементы. Содержание аминокислот составляет 3,7-12% (Rosoiu N. et al. Original bioactive complexes rich in glycosaminoglycans obtained from small fish // Roum. Biotechnol. Lett., 2008, 13 (5), 3944-3954). Показаниями к применению Алфлутопа у взрослых являются первичный и вторичный остеоартроз различной локализации, остеохондроз и спондилез.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение ассортимента средств, обладающих противовоспалительной активностью.

Поставленная задача решается путем создания средства, обладающего противовоспалительным действием, которое в качестве активного компонента содержит комплекс, получаемый из целомической жидкости морских ежей, содержащий пептиды и аминокислоты при следующем их количественном соотношении (1-2):(2-6), и не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты).

Существенной особенностью нового комплекса сложного состава является присутствие в нем наряду с пептидами и аминокислот, что повышает его эффективность как биологически активного средства по сравнению с известными аналогичными комплексами. Состав получаемого комплекса находится в прямой зависимости от способа получения (Pat. RU №2432956 (С1), опубл. 10.11.2011), согласно которому к целомической жидкости прибавляют 1,5-3 объема спирта этилового (предпочтительно 2-2,5 объема), оставляют на ночь при температуре 3-15°С (предпочтительно 8-12°С) и затем отфильтровывают выпавший осадок (белковый концентрат); полученный экстракт концентрируют до 0,2-0,5 объемов, декантируют липидный слой, замораживают и лиофильно высушивают, получая на выходе пептидно-аминокислотный комплекс.

В пептидно-аминокислотном комплексе обнаружено 20-40% микроэлементоов. Отделенная фракция микроэлементов не проявляла заявленных фармакологических свойств.

Заявленные свойства продукт проявляет только при указанном соотношении пептидной и аминокислотной фракций. Выделение из продукта отдельных пептидных фракций или отдельных аминокислот с последующим определением их фармакологической активности свидетельствовало об уменьшении выраженности эффектов и не достижении заявленного в настоящем изобретении суммарного противовоспалительного действия.

Технический результат, обеспечиваемый настоящим изобретением, заключается в применении пептидно-аминокислотного комплекса, полученного из целомической жидкости морских ежей, в качестве средства, которое оказывает противовоспалительное действие путем ингибирования продукции провоспалительных цитокинов (TNF-α) и снижением уровня нейтрофилов.

Приведенная совокупность отличительных признаков заявляемого комплекса в литературе не описана, а их влияние на достижение технического результата не следует из известного уровня знаний в области технологии производства лекарственных препаратов.

Технический результат изобретения заключается также в получении безопасного средства на основе пептидно-аминокислотного комплекса в виде готовой лекарственной формы для парентерального применения с выраженным терапевтическим эффектом. Новое свойство пептидно-аминокислотного комплекса из целомической жидкости морских ежей установлено авторами впервые экспериментально.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Раствор для парентерального применения (в г на 100 г).

Пептидно-аминокислотный комплекс - 0,001-1,0

Консерванты - q.s

Вода для инъекций - до 100.

В стакан объемом 100 мл помещают 70-80 мл воды для инъекций и рассчитанное количество вспомогательных веществ, перемешивают до полного растворения компонентов, затем вносят пептидно-аминокислотный комплекс, перемешивают и добавляют оставшуюся воду до 100 г. Полученный водный раствор фильтруют, подвергают стерилизующей фильтрации в токе азота и затем разливают в асептических условиях в ампулы коричневого стекла. Ампулы запаивают и получают стабильный инъекционный препарат, содержащий пептидно-аминокислотный комплекс из целомической жидкости морских ежей.

Пример 2. Гель для наружного применения (в г на 100 г).

Пептидно-аминокислотный комплекс - 0,05

Гидроксиэтилцеллюлоза - 1,15

Триэтаноламин - 1,37

Полиэтиленгликоль - 17,30

Консерванты - 0,13

Вода очищенная - 80.

В стакан объемом 100 мл помещают 80 мл воды очищенной, нагревают до 70-75°С, добавляют 0,13 г консервантов и перемешивают до полного растворения компонентов. Затем раствор консервантов охлаждают до температуры 35-40°С. вносят 0,05 г пептидно-аминокислотного комплекса, перемешивают. При этой же температуре при постоянном перемешивании небольшими порциями вносят гидроксиэтилцеллюлозу и продолжают перемешивать до получения однородного состава. После набухания полимера вносят триэтаноламин и перемешивают достаточное время до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего геля. Полученный гель с пептидно-аминокислотным комплексом расфасовывают во флаконы с крышкой и дозатором.

Пример 3. Крем для наружного применения (в г на 100 г).

Пептидно-аминокислотный комплекс - 1,0

Цетилстеариновый спирт - 10,87

Цетиарат-25 - 3,25

Цетиарат-6 - 3,25

Минеральное масло - 12,00

Пропиленгликоль - 7,30

Консерванты - 0,13

Вода очищенная - до 100

В стакан объемом 100 мл помещают воду очищенную, нагревают до 70-75°С, добавляют 0,13 г консервантов и перемешивают до полного растворения компонентов. Одновременно готовят расплав цетилстеаринового спирта. Цетиарата-25, цетиарата-6 и минерального масла при температуре 75-80°С. Затем к расплаву при перемешивании добавляют раствор консервантов (раствор I). Перемешивание продолжают до получения однородной массы. Пептидно-аминокислотный комплекс растворяют в пропиленгликоле (раствор II). Соединяют растворы I и II при перемешивании, остужают до комнатной температуры и выдерживают до загустения массы. Готовый крем фасуют в алюминиевые тубы.

Пример 4. К 3,4 л целомической жидкости прибавляют 8 л спирта этилового, оставляют на ночь при температуре 10°С и затем отфильтровывают выпавший осадок. Полученный экстракт концентрируют до 1 л, декантируют липидный слой, содержащий фосфолипиды, замораживают и лиофильно высушивают. Полученный комплекс содержит 16% пептидов (по методу Кристиана-Варбурга), 47% аминокислот (по реакции с о-фтальдиальдегидом), реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты отрицательная.

Пример 5. К 2,0 л целомической жидкости прибавляют 3 л спирта этилового, оставляют на ночь при температуре 10°С и затем отфильтровывают выпавший осадок. Полученный экстракт концентрируют до 0,5 л, декантируют липидный слой, содержащий фосфолипиды, замораживают и лиофильно высушивают. Полученный комплекс содержит 12% пептидов (по методу Кристиана-Варбурга), 25% аминокислот (по реакции с о-фтальдиальдегидом), реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты отрицательная.

Пример 6. К 2,5 л целомической жидкости прибавляют 7,5 л спирта этилового, оставляют на ночь при температуре 10°С и затем отфильтровывают выпавший осадок. Полученный экстракт концентрируют до 0,5 л, декантируют липидный слой, содержащий фосфолипиды, замораживают и лиофильно высушивают. Полученный комплекс содержит 20% пептидов (по методу Кристиана-Варбурга) и 60% аминокислот (по реакции с о-фтальдиальдегидом), реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты отрицательная.

Пример 7. Исследование противовоспалительной активности на модели воспаления «каррагениновый мешочек» у крыс.

Дизайн исследования выполнен в соответствии с Current Protocols in Pharmacology, Models of inflammation: Carrageenan Air Pouch in the rat (UNIT 5.6.2): За шесть дней до начала лечения крыс помещали в СО₂ камеру для достижения анестезии на 30 секунд. Стерильным шприцом объемом 20 мл, заполненным воздухом, для создания воздушного мешочка вводили 15 мл воздуха подкожно во внутрикапсульную область спины крысы. Через 3 суток для поддержания целостности воздушного мешочка без увеличения раны вводили 7,5 мл воздуха в то же место.

На 6 сутки под кратковременной СО₂ анестезией вызывали воспаление, вводя 3 мл 0,5% раствора каррагенина непосредственно в мешочек.

Средство по примеру 1 вводили по профилактической схеме, в течение 6 дней, один раз в сутки, внутримышечно в дозе 1,2 мг/кг массы крысы. Первое введение осуществляется сразу после формирования воздушного мешочка, последнее - непосредственно за один час до введения каррагенина.

Спустя 6 часов после инъекции каррагенина животные подвергали эвтаназии в СО₂ камере, после чего внутрь мешочка вводили 10 мл физиологического раствора комнатной температуры. После легкого массажа области воздушного мешочка он вскрывается сагиттальным разрезом, экссудат собирается в стерильные пробирки объемом 15 мл и центрифугируется в течение 10 минут при 1860 g и температуре +4°С.

Для определения TNFα надосадочную жидкость хранили при -20°С.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.

Было установлено, что средство, приготовленное по примеру 1, вызывает снижение до уровня интактных животных уровня цитокинов TNFα, запускающих каскад воспалительных реакций, и нейтрофилов - основных клеток, участвующих в остром воспалении, что свидетельствует о снижении воспалительного процесса.

Пример 8. Антиоксидантная активность в отношении радикала DPPH.

Не так давно удалось установить роль токсических дериватов кислорода (супероксидного аниона кислорода и гидроксильного радикала ОН) в развитии воспалительных изменений в суставе.

Природные объекты содержат часто сложный комплекс соединений, оказывающих различное и многостороннее действие на организм человека. Антиоксиданты относятся к классу биологически активных веществ, которые связывают излишние свободные радикалы, препятствуют ускоренному окислению липидов и образованию нежелательных продуктов окисления.

В эксперименте in vitro установили, что IC₅₀ для средства по примеру 1 составляет около 5,9 мг/мл, что сравнимо с IC₅₀ для препарата Алфлутоп (4,6 мг/мл).

Пример 9. Определение анальгетической и противоотечной (противовоспалительной) активности на модели формалин-индуцированного отека задней лапы крысы.

Нарушение микроциркуляции и формирование отека относятся к основным признакам воспаления как возникшей в ходе эволюции реакции живой ткани на местное воспаление. В формировании острой воспалительной реакции принимают участие многочисленные медиаторы и модуляторы воспаления, образование и стадийное выделение которых отражает не только характер и интенсивность повреждающего фактора, но и длительность его воздействия. Изменение соотношения биогенных веществ способствует переходу острого воспаления в хроническую фазу с преобладанием пролиферативного компонента тканевой реакции. В этой связи при оценке противовоспалительного действия целесообразным является исследование действия средства на основе пептидно-аминокислотного комплекса из целомической жидкости морских ежей как на моделях острого экссудативного, так и хронического пролиферативного воспаления.

Дизайн исследования выполнен в соответствии с Руководством по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств (1980, с.126-133): в правую заднюю лапу крысы вводили 50 мкл водного 2,5%-го раствора формалина в субплантарное пространство. Левая задняя лапа, в которую не вводился формалин, служила контролем.

Препараты вводили внутримышечно, ежедневно в течение 7 суток. Первое введение препаратов исследования проводилось за один час до индукции воспаления (формалиновый тест), внутримышечно в заднюю левую лапу. Препарат по примеру 1 вводили в объеме 0,5 мл на животное. Контрольной группе внутримышечно вводился физиологический раствор в объеме 0,5 мл.

На восьмые сутки после индукции патологии животные подвергались эвтаназии ингаляцией CO₂. Сразу же после эвтаназирования проводилась экзартикуляция в голенопредплюсневом суставе и взвешивание обеих отсеченных конечностей.

Первичные данные регистрировали в виде количественного измерения в единицу времени (минуту) двух типов ответных болевых реакций, так называемых паттернов - сгибания + встряхивания и активного вылизывания пораженной конечности - в двух фазах: 0-10 мин острая (нейрогенная фаза) - характеризует центрально опосредованную боль с выделением вещества Р; 11-60 мин тоническая (воспалительная фаза) - характеризует периферический, воспалительный путь возникновения боли в результате высвобождения медиаторов воспаления. Противовоспалительную активность оценивали по степени влияния на количество лейкоцитов крови и СОЭ, а также на отек тканей путем измерения прижизненных толщины и объема лапы и посмертного взвешивания отсеченных лап.

Экспериментальные данные показали, что предлагаемое средство по примеру 1, содержащее пептидно-аминокислотный комплекс из целомической жидкости морских ежей, оказывает выраженное анальгетическое действие в хронической фазе, проявляющееся в достоверном уменьшении количества паттернов «сгибания + встряхивания» на 47% и уменьшении количества паттернов «вылизывания» на 65% по сравнению с контрольной группой.

Оценка противовоспалительного эффекта проводилась на модели острого воспаления лапы у крыс через 3 часа после индукции воспаления формалином. Критерием эффективности (при альтернативной оценке реакции) по данному тесту считали достоверное уменьшение отека лапы не меньше, чем на 30% по сравнению с контролем.

Проведенные исследования показали (табл.2), что средство обладает достаточно выраженным противовоспалительным эффектом (достоверное уменьшение отека лапы, более чем на 30% по сравнению с контролем).

Пример 10. Антигиалуронидазная активность

Антигиалуронидазная активность и синтез гиалуроновой кислоты объясняют широкий спектр фармакологического действия: противовоспалительную, трофическую, регенеративную и биостимулирующую активность. Алфлутоп^® - инъекционный антиревматический препарат с выраженной антигиалуронидазной активностью, принадлежит к группе хондропротекторов, обеспечивающих стабильность хряща путем улучшения метаболизма хондроцитов. Механизм действия Алфлутопа обусловлен блокадой активности гиалуронидазы при стимуляции синтеза гиалуроновой кислоты, усилением репаративных процессов в хрящевой ткани.

Антигиалуронидазную активность измеряли методом Morgan-Elson в нашей модификации. Было установлено, что средство по примеру 1, содержащее пептидно-аминокислотный комплекс из целомической жидкости морских ежей, обладает антигиалуронидазной активностью уже в концентрации 0,05%, ингибируя активность фермента гиалуронидазы на 35%. При этом Алфлутоп в такой же концентрации практически не проявил антигиалуронидазную активность - ингибирование гиалуронидазы составляло 10%. Свою максимальную антигиалуронидазную активность Алфлутоп проявил только в концентрации 1% (ингибирование гиалуронидазы составляло 83%).

Таким образом, установлено, что предлагаемое средство, содержащее пептидно-аминокислотный комплекс из целомической жидкости морских ежей, является противовоспалительным средством, обладает противоотечной, анальгетической, антиоксидантной и антигиалуронидазной активностью.

Таблица 1. Противовоспалительная активность на модели «каррагениновый мешочек» Группа Лейкоциты, ×10⁹ кл/л Лимфоциты, ×10⁹ кл/л Макрофаги, ×10⁹ кл/л Нейтрофилы, ×10⁹ кл/л TNFα, пг/мл Интактные 1,1±0,1 0,8±0,1 0,10±0,03 0,20±0,02 65,7±8,8 Контроль 9,3±0,7* 1,1±0,1* 0,70±0,29 7,2±0,6* 492,7±12,0* Средство по пр.1 5,6±0,4*** 1,1±0,1 0,94±0,21* 3,6±0,4*** 78,0±30,5** Примечание:
* - различие статистически значимо в сравнение с интактной группой по критерию Стъюдента, при р<0,05
** - различие статистически значимо в сравнение с контрольной группой по критерию Стъюдента, при р<0,05

Таблица 2. Действие средства, содержащее пептидно-аминокислотный комплекс из целомической жидкости морских ежей, на выраженность отека лапы крысы при развитии острого экссудативного воспаления (М±m) Группа Срок наблюдения, сут. Выраженность отека Критерий эффективности противовоспалительного действия (%) мм % Контроль (объем лапы, мл) 0 0,0±0,0 100   1 71,4±18,4* 100 4 50,0±18,9* 100 8 50,0±18,9* 100 Средство по пр.1 (объем лапы, мл) 0 0,0±0,0 - - 1 50,0±15,43* 70,0 30,0 4 14,3±9,2* 28,0 72,0 8 7,1±0,6* 14,2 85,8 Примечание: * - достоверность различий с контролем, р<0,05

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему противовоспалительным действием. Средство, обладающее противовоспалительным действием, которое в качестве активного компонента содержит комплекс, получаемый из целомической жидкости морских ежей, содержащий пептиды и аминокислоты, при определенном соотношении компонентов. Вышеописанное средство обладает выраженным противовоспалительным действием. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 10 пр.

1. Средство, обладающее противовоспалительным действием, которое в качестве активного компонента содержит комплекс, получаемый из целомической жидкости морских ежей, содержащий пептиды и аминокислоты при следующем их количественном соотношении (1-2):(2-6), и не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты).

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно может быть выполнено в форме раствора для инъекций, геля или крема.