СРЕДСТВО, ОБОГАЩЕННОЕ ПЕПТИДАМИ, АМИНОКИСЛОТАМИ И ФОСФОЛИПИДАМИ Российский патент 2013 года по МПК A61K38/00 A61K35/56 A61P29/00 A61P37/00 

Беспозвоночные являются одним из перспективных объектов мирового промысла: на их долю приходится 8-8,5% улова. Известно около 800 видов съедобных морских беспозвоночных, которые широко используются для приготовления пищевой, технической, кормовой продукции, а также в лечебно-профилактических целях [1].

Морские ежи являются типичными представителями беспозвоночных и источником ряда интересных биологически активных веществ [2, 3].

Известен способ комплексной переработки морских ежей, в котором морских ежей предварительно разделывают на четыре фракции, получают икру, целомическую жидкость, внутренности и панцирь, далее проводят извлечение целевых продуктов: пептидно-аминокислотного комплекса из целомической жидкости; ганглиозидов и фосфолипидного концентрата из икры; суммы хиноидных пигментов, хитозана, кальция из панциря; ферментов из внутренностей [4]. Недостатком данного изобретения является потеря части биологически активных веществ, содержащихся во внутренностях, например пептидов, аминокислот, минеральных веществ.

Известен способ получения лечебно-профилактических средств, пищевых и кормовых добавок, питательных сред для культивирования микроорганизмов и клеток эукариот. Технический результат в предлагаемом изобретении достигают созданием способа получения ферментативного гидролизата на основе белков рыб, в котором согласно изобретению белоксодержащую массу получают из внутренностей рыб или путем смешивания внутренностей и тушек рыб, а гидролиз массы проводят непосредственно или смешивая ее с водой, при этом в качестве щелочного агента используют гидроокись кальция, а кислотного - ортофосфорную кислоту. Окончательную очистку продукта (удаление пигментов, специфического запаха и вкуса рыбы) проводят хроматографией на носителях типа Амберлайт XAD. Изобретение обеспечивает получение конечного продукта с низким содержанием золы (солей); уменьшение длительности технологических режимов проведения процесса; улучшение вкусовых свойств получаемого продукта за счет устранения специфического запаха [5]. Недостатком данного изобретения является применение гидролизной технологии, приводящей к большому количеству отходов и сточных вод, требующих очистки.

Известен способ получения кормовой добавки для животных из голотурии: голотурии (трепанг и кукумария) разделывают, удаляют внутренности, венчики и внутрибрюшную пленку и варят в морской, пресной или подсоленной воде в течение 5-15 мин при соотношении 1:1 или 1:2 (по массе). Варку в одной и той же варочной среде новых порций сырья проводят от 3 до 5 раз, получая полуфабрикат для изготовления пищевой продукции, подбирая кратность варки таким образом, чтобы в варочных водах количество сухих веществ составляло от 4 до 10%, сушку термически обработанной кукумарии производят при температуре от 10 до 65°C до содержания воды в продукте, равного 5-12%, минеральных веществ 4-8% с получением полуфабриката для производства пищевого продукта. Внутренности голотурии, венчики и внутрибрюшную пленку подвергают стечке, легкой подпрессовке, подмораживанию, измельчению и сушке при температуре 10-75°C, до остаточного содержания воды 5-15%. Охлаждают до температуры окружающего воздуха, упаковывают во влагонепроницаемые пакеты и хранят при температуре не выше 20°C в течение 8 мес. Полученную кормовую биологически активную добавку используют как средство, повышающее устойчивость животных к инфекционным заболеваниям в виде добавки к корму [6]. Недостатками данной технологии является многократное выпаривание при высоких температурах, присутствие в конечном продукте липидов, приводящих к быстрой порче конечного продукта, а также ограниченность применения в качестве кормовой добавки для животных.

Известен способ комплексной переработки двустворчатых зарывающихся моллюсков с получением деликатесной продукции, биологически активных веществ и минерально-белковых подкормок для животных и птиц. В качестве сырья используют моллюски любого размера. Способ предусматривает сортировку, мойку моллюсков, извлечение из раковины сырой мышечной ткани моллюсков и внутренностей, разделку мышечной ткани с отделением двигательного мускула - ноги и мантии с аддуктором, мойку и гидротермическую обработку последних в течение 5-25 мин при температуре 40-55°C. Затем двигательный мускул - ногу и мантию с аддуктором обрабатывают посольной смесью или посольной смесью с ферментным препаратом, в качестве которого используют протеолитический фермент из печени камчатского краба в количестве 0,5-1,5% к массе сырья, промывают водой и выдерживают в растворе уксусной кислоты pH 3,2±0,2 в течение 20-25 мин. Полученное сырье используют либо для получения пресервов либо паштета. В качестве сырья для получения биологически активных веществ и минерально-белковой подкормки для животных и птиц используют внутренности и раковины моллюсков. При разделке моллюсков внутренности и раковины отбирают отдельно. Внутренности измельчают, обезвоживают и делят на белковую и жировую фракции. Раковины варят в воде в течение 40-60 мин и затем измельчают с получением минеральной муки. Белковую фракцию внутренностей смешивают с минеральной мукой и получают минерально-белковую кормовую добавку для животных и птиц [7]. Недостатком данного изобретения является использование ферментативного гидролиза, приводящего к получению большого количества сточных вод, требующих очистки, и отсутствие подтвержденной биологической активности у продукта, получаемой из внутренностей с последующим присоединением данной фракции к кормовой добавке.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ комплексной переработки внутренностей голотурий с получением биологически активных добавок к пище и биологически активных пищевых добавок "ТИНГОЛ-2" и "ЭРОГОЛ" [8], характеризующийся тем, что внутренности голотурий измельчают до частиц величиной не более 0,5 мм, экстрагируют этиловым спиртом в соотношении от 1:1 до 1:3 при температуре от минус 5 до плюс 60°C в течение от 5 ч до 10 суток, отделяют жидкую часть с получением водно-спиртового экстракта, затем остаток внутренностей голотурий с содержанием воды от 55 до 75% высушивают при 60-75°C в течение 2,5-4 ч, измельчают до порошкообразного состояния, таблетируют или капсулируют. В результате переработки внутренностей голотурий по данному способу получают две биологически активные добавки (БАД) к пище: БАД "ТИНГОЛ-2", представляющий собой водно-спиртовой экстракт из внутренностей голотурии, содержащий тритерпеновые гликозиды в количестве 700-3500 мкг/мл с содержанием спирта 10-50% и липидов 0,5-4% и БАД "Эрогол", представляющий собой сухой порошок, содержащий 3-12% воды, тритерпеновые гликозиды в количестве 800-4500 мкг/мл, белка 35-45%, марганца 13,5-24,5 мг/кг, цинка 44,0-82,0 мг/кг, железа 481,2-893,5 мг/кг, меди 5,6-10,4 мг/кг, никеля 2,4-4,2 мг/кг, а также суммы элементов кальция, магния, калия 6500-12000 мг/кг. Используемая в качестве сырья голотурия богата тритерпеновыми гликозидами.

Из литературных данных известно, что иглокожие, в частности целомическая жидкость морских ежей является источником пептидов [9]. Однако во внутренностях ежей содержатся и другие биологически активные вещества.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, обладающих противовоспалительной и иммунотропной активностью.

Поставленная задача решается путем создания комплекса биологически активных веществ, содержащего пептиды, аминокислоты, фосфолипиды и минеральные вещества, природного происхождения, полученного из внутренностей морского ежа, обладающего противовоспалительной и иммунотропной активностью.

Задача изобретения решается тем, что в известном способе внутренности голотурий измельчают до частиц величиной не более 0,5 мм, экстрагируют этиловым спиртом в соотношении от 1:1 до 1:3 при температуре от минус 5 до плюс 60°C в течение от 5 ч до 10 суток, отделяют жидкую часть с получением водно-спиртового экстракта, остаток внутренностей голотурий с содержанием воды от 55 до 75% высушивают при 60-75°C в течение 2,5-4 ч, измельчают до порошкообразного состояния, таблетируют или капсулируют, согласно изобретению после отделения гонад из ежей извлекают внутренности, экстрагируют этиловым спиртом в соотношении 1:1-3 при температуре от 0 до плюс 10°C в течение от 2 ч до 10 суток, отделяют жидкую часть с получением водно-спиртового экстракта, отгоняют спирт, высушивают, используют в качестве средства, обладающего противовоспалительной и иммунотропной активностью.

Причем в качестве сырья используют внутренности морских ежей в свежем, мороженом или сухом виде.

Отличительной особенностью настоящего изобретения является:

- использование внутренностей промысловых морских ежей любых видов, в частности зеленых морских ежей;

- получение в конечном итоге продукта, представляющего собой комплекс биологически активных веществ, содержащий пептиды, аминокислоты, фосфолипиды и минеральные вещества, обладающий противовоспалительной активностью.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение комплекса биологически активных веществ, получаемого из внутренностей морского ежа, который является селективными ингибиторами циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), оказывает противовоспалительное и иммунотропное действие.

Новое свойство комплекса биологически активных веществ, содержащего пептиды, аминокислоты, фосфолипиды и минеральные вещества, выделяемого из внутренностей морского ежа, установлено авторами впервые экспериментально.

Новое свойство комплекса биологически активных веществ, содержащего пептиды, аминокислоты, фосфолипиды и минеральные вещества, выделяемого из внутренностей морского ежа, явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе.

В качестве противовоспалительного и иммунотропного средства комплекс биологически активных веществ, содержащий пептиды, аминокислоты, фосфолипиды и минеральные вещества, выделяемые из внутренностей морского ежа, можно использовать для профилактики и лечения различных заболеваний, включая воспалительные и аллергические процессы на коже и слизистой: дерматиты различной этиологии; кожные проявления заболеваний внутренних органов, острые заболевания суставов, заболевания носоглотки (острые риносинуситы и др.).

Технический результат изобретения заключается в получении безопасного средства в виде различных готовых лекарственных форм с выраженным терапевтическим эффектом для лечения воспалений различной этиологии.

Проведенные нами исследования показали, что свежие, замороженные или сушеные внутренности морских ежей, являющиеся отходами после добычи съедобных гонад, измельчать не требуется. Внутренности заливают спиртом при соотношении сырье: экстрагент 1:1-1:3. Суспензию инкубируют при температуре от 0 до плюс 10°C в течение от 2 ч до 10 суток. Нагрев выше 10°C может привести к разложению биологически активных веществ. Инкубирование при отрицательных температурах требует дополнительного охлаждения и не приводит к повышению выхода целевых компонентов. Осадок целесообразно отделять на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия. После фильтрации и отгонки спирта твердый остаток сушат тем или иным способом, за исключением высокотемпературного выпаривания.

Конечный продукт представляет собой субстанцию светло-коричневого цвета, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. является безопасным.

Продукт содержит пептидов 10-15%, аминокислот 35-45%, фосфолипидов 4-8%, микроэлементы. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выяснилось, что в конечном продукте остаются пептидные фракции с молекулярной массой 19-15 кДа, 6-3,5 кДа и менее 3,5 кДа. В пептидной субстанции отсутствуют высокомолекулярные белковые соединения (по качественной реакции на белок методом осаждения трихлоруксусной кислотой).

Пример 1

К 1 кг внутренностей морских ежей добавляют 2,5 л 95% спирта этилового, экстрагируют при 5°C в течение 7 суток, фильтруют. Полученную жидкую часть упаривают до удаления спирта и высушивают. В результате получают 18 г сухого биологически активного комплекса.

Конечный продукт представляет собой порошок светло-коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом, не содержит токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК, и патогенную микрофлору, т.е. соответствует показателям безопасности.

Пример 2

Раствор для ингаляционного применения (в г на 100 г)

Биологически активный комплекс - 0,01

Консерванты - q.s.

Вода для инъекций - до 100

Пример 3

Раствор для парентерального применения (в г на 100 г)

Биологически активный комплекс - 0,1

Консерванты - q.s.

Вода для инъекций - до 100

Пример 4. Оценка противовоспалительного действия на модели экспериментального острого риносинусита у крыс, индуцированного интраназальным введением формалина.

Средство, приготовленное по примеру 2, вводили интраназально в дозах 0,025; 0,050; 0,100 мл/носовой ход крысы в течение 7 дней.

Установлено, что средство, приготовленное по пр. 2, оказало выраженный дозозависимый противовоспалительный эффект. Количество бокаловидных клеток значимо отличалось от показателей в интактной и контрольной группах животных. В максимальной дозе средство статистически значимо снижало выраженность инфильтрации мононуклеарами и лейкоцитами в собственной пластинке слизистой оболочки и инфильтрацию лейкоцитами в подслизистом слое. Такой эффект связан с более ранним по завершении воспалительного процесса исчезновением клеток крови, которые появились в очаге раньше (нейтрофильные гранулоциты), и более поздней элиминацией мононуклеаров, обладающих меньшей хемотоксической чувствительностью. Данные факты указывают на выздоровление и отражают выраженный противовоспалительный эффект композиции на основе комплекса биологически активных веществ, превосходящее по действию препараты сравнения.

Пример 5. Оценка иммунотропного действия

Для оценки влияния композиции на клеточный иммунный ответ в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

С целью выявления фармакологической активности средства в отношении Т-клеточного иммунного ответа мышам вводили средство, приготовленное по примеру 3, в дозе 40 мкг/кг массы мыши в течение 6 суток (период развития реакции гиперчувствительности замедленного типа). Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.

Установлено, что средство, приготовленное по пр. 3, оказывает влияние на развитие реакции замедленного типа, в частности сокращает ее практически в 2 раза. Полученные данные свидетельствуют о том, что шестидневное введение средства оказывает иммуносупрессорное действие.

Таблица 1 Реакция гиперчувствительности замедленного типа у инбредных мышей при внутримышечном введении препарата (M±m) Группа Количество животных в группе Индекс реакции Интактная 10 0,4±0,1 Контроль 10 6,9±0,9^* Средство по примеру 3 10 3,3±1,3^* _** * - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой при p<0,05, ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем при p<0,05.

Пример 6. Влияние на энзиматическую активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2

Влияние средства по пр.1 на энзиматическую активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2 проводилось с использованием коммерческого набора СОХ inhibitor screening assay kit (Cayman Chemical, USA). В качестве препаратов сравнения использовали селективный ингибитор ЦОГ-1 - SC-560 и неспецифичный ингибитор ЦОГ-2 - индометацин. Средство по примеру 1 исследовали в диапазоне концентраций 0,1-200 мкг/мл.

Тест-система напрямую оценивает количество простагландина F2a (PGF2α), сформированного в ходе редукции индуцированной хлоридом олова (SnCl2) PGH2 - продукта взаимодействия циклооксигеназы (фермента) и арахидоновой кислоты (субстрата). Тест-система включает телячью ЦОГ-1 и человеческую рекомбинантную ЦОГ-2, позволяя тем самым определять активность фармакологических субстанций в отношении обоих ферментов.

Установлено, что средство по примеру 1 обладает дозозависимым ингибирующим эффектом в отношении фермента ЦОГ-2. Ингибирование фермента в концентрациях 100 и 200 мкг/мл составило 43 и 55%, соответственно. IC50 средства по примеру 1 составила 67 мкг/мл. В отношении ЦОГ-1 активности не было выявлено. Таким образом, биологически активный комплекс из внутренностей морского ежа является селективным ингибитором фермента ЦОГ-2.

Пример 7. Оценка специфической фармакологической активности на модели экспериментального острого бронхита, индуцированного сигаретным дымом

Экспериментальная модель острого бронхита вызвана индукцией сигаретным дымом в течение 28 дней. Средство по примеру 1 вводили ингаляционно в дозе 100 мкг/кг массы тела крысы, в качестве препарата сравнения использовали амбробене в дозе 125 мг/кг.

После курсового применения средства по примеру 1 в клиническом анализе крови было отмечено изменение со стороны красной крови - развитие гипохромной микроцитарной анемии, но со стороны белой крови изменения были минимальны, и показатели не отличались от интактной группы животных. Также нормализовались и показатели антиоксидантной системы - концентрация малонового диальдегида MDA была минимальна и незначительно превышала интактные показатели. Патогистологическое исследование у всех животных выявило развитие острого катарального бронхита с увеличением толщины слизистой бронхов в 1,9 раза, при этом воспалительные изменения были минимальны как в ткани легкого, так и в организме в целом и сопоставимы с действием препарата сравнения - амбробене. В лейкоцитарной формуле по сравнению с интактной группой выявлено незначительное увеличение общего количества лейкоцитов с преобладанием гранулоцитов.

Источники информации

1. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих / под ред. В.П.Быкова. - М.: Изд-во ВНИРО, 1999. - 262 с.

2. Воробьев В.В. Создание биоактивных фармакологических субстанций и лекарственных средств из морских гидробионтов // Вестник биотехнол. - 2009. - Т.4, №1. - С.33-38.

3. Bhakuni D.S., Rawat D.S. Bioactive marine natural products: Anamaya Publishers, New Delhi, India. 2005. 382 p.

4. Пат. RU 2432956 C1, A61K 35/56, B01D 11/02, 08.07.2010.

5. Пат. RU 2262859, C2, A23J 1/04, A23L 3/30, A23K 1/10, 22.08.2003.

6. Пат. RU 2236155, C2, A23L 1/30, A23L 1/305, A23L 1/333, 05.08.2002.

7. Пат. RU 2231272, C2, A23L 1/33, 19.04.2002.

8. Пат. RU 2215532, C2, A61K 35/56, А61Р 15/00, 10.12.2001.

9. Haug Т., Kjuul A.K., Styrvold O.B. et al. Antibacterial activity in Strongylocentrotus droebachiensis (Echinoidea), Cucumaria frondosa (Holothuroidea), and Asterias rubens (Asteroidea) // J Invertebrate Pathology. - 2002. - 81 (2). - P.94-102.

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, а также фармацевтической, пищевой и косметической промышленности и касается средства из внутренностей морского ежа, являющихся отходами после отделения съедобных гонад. Средство, обладающее противовоспалительной и иммунотропной активностью, характеризуется тем, что представляет собой спиртовой экстракт, полученный из внутренностей морских ежей после отделения гонад, содержащий 10-15% пептидов, 35-45% аминокислот, 4-8% фосфолипидов, микроэлементы, при этом имеет следующие характеристики: молекулярная масса пептидных фракций, определенная при проведении электрофореза в полиакриламидном геле, составляет 19-15 кДа, 6-3,5 кДа и менее 3,5 кДа. Средство получено путем отделения гонад из морских ежей, извлечения внутренностей, их экстракции этиловым спиртом в соотношении 1:1-3 при температуре от 0 до плюс 10°С в течение от 2 ч до 10 суток, отделении жидкой части с получением водно-спиртового экстракта, отгонке спирта, высушивании. Изобретение обеспечивает получение безопасного средства с выраженным терапевтическим эффектом. 2 з.п. ф-лы, 7 пр., 1 табл.

1. Средство, обладающее противовоспалительной и иммунотропной активностью, характеризующееся тем, что представляет собой спиртовой экстракт, полученный из внутренностей морских ежей после отделения гонад, содержащий 10-15% пептидов, 35-45% аминокислот, 4-8% фосфолипидов, микроэлементы, при этом имеет следующие характеристики: молекулярная масса пептидных фракций, определенная при проведении электрофореза в полиакриламидном геле, составляет 19-15 кДа, 6-3,5 кДа и менее 3,5 кДа.

2. Средство по п.1, где в качестве сырья используют внутренности морских ежей в свежем, мороженном или сухом виде.

3. Средство по п.1, получаемое после отделения гонад путем извлечения внутренностей, их экстракции этиловым спиртом в соотношении 1:1÷3 при температуре от 0 до 10°С в течение от 2 ч до 10 суток, отделения жидкой части с получением водно-спиртового экстракта, отгонки спирта, высушивания.