СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОПОЛИМЕРА 3-ГИДРОКСИМАСЛЯНОЙ И 3-ГИДРОКСИВАЛЕРИАНОВОЙ КИСЛОТ Российский патент 2013 года по МПК C12P7/62 C12N1/20 C12R1/05 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения сополимера - 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот. Сополимер 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (ПЗГБ/ЗГВ) является одним из наиболее перспективных представителей семейства термопластичных и биоразрушаемых полимеров микробиологического происхождения - полигидроксиалканоатов (ПГА) и предназначен для применения в различных областях (медицина, фармакология, сельское и коммунальное хозяйство, пищевая промышленность) [Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters // Prog. Polym. Sci. - 2000. - V.25. - P.1503-1555].

Известен способ получения сополимера 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом на основе штамма Azotobacter chroococcum 12A на среде с сахарами (20 г/л) в качестве основного ростового субстрата и добавками валерата (1 или 2 г/л), который является предшественником для синтеза мономеров 3-гидроксибутиората [патент РФ №2307159, МПК C12N 1/20, опубл. 27.09.2007 г.]. Недостаток способа - низкий общий выход сополимера (62-70%) и низкое содержания в нем фракции 3-гидроксивалерата (10-18 мол.%)

Известен также способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот при культивировании микроорганизмов на среде с валериановой кислотой или смеси масляной и валериановой кислот в качестве основного ростового субстрата [ЕР №00052459, МПК А61К 9/22, опубл. 18.11.1980]. Способ позволяет получать сополимер с содержанием в нем фракции 3-гидроксивлериата до 50 мол.%.

Недостатком способов является использование дорогостоящего и дефицитного сырья - органических кислот (стоимость которого в несколько раз превосходит стоимость сахаров) и ограниченный уровень содержания 3-гидроксивалерата в сополимере.

Известен способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот с использованием в качестве продуцента мутантных штаммов Alcallgenes eutrophus NCIB 11599, H-16 ATCC 17699 в двухстадийной периодической культуре при лимите азота в среде, содержащей в качестве основного ростового субстрата глюкозу (20 г/л) или валериановую кислоту, или их смеси. В зависимости от скорости подачи основного ростового субстрата (глюкозы или валерата) соотношение мономеров в сополимеров варьирует от 10 до 100 мол.% для 3-гидроксибутирата и от 90 до 0 мол.% - для 3-гидроксивалерата при общих затратах времени на ферментацию 72 ч [ЕР №00052459, МПК А61К 9/22, опубл. 18.11.1980].

Недостаток способа - использование дорогостоящего сырья, в том числе - пищевого назначения, а также длительность ферментации.

Известен способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот на основе природного штамма Alcallgenes eutrophus B-5786 (таксой Alcallgenes переименован в Ralstonia) на среде, содержащей в качестве основного ростового субстрата - непищевое сырье - смеси водорода и углекислого газа или ацетат и добавки валериановой (или пропионовой) кислот [патент РФ №2051968, МПК С12P 7/62, опубл. 10.01.1996 г.(прототип)]. Культивирование проводят в периодическом режиме в одну стадию при лимите азота в среде (концентрация NH₄Cl в питательной среде 0,03 г/л). В зависимости от дозы и количества добавок валерианой (или пропионовой) кислот способ позволяет при использовании непищевого сырья получать сополимер с содержанием 3-гидроксивалерата в сополимере от 50 до 92 мол.% при затратах времени на культивирование штамма-продуцента от 32 до 58 часов.

Недостатки прототипа:

1) использование в качестве основного ростового субстрата электролизного водорода (или ацетата), стоимость которых достаточно высока (см. таблицу 1);

2) выбранный одностадийный режим культивирования бактерий без смены среды или организации подпитки субстратом (указанные в прототипе одностадийное культивирование штамма-продуцента на питательной среде с содержанием источника азота в среде (0,3 г/л) не может обеспечить высокие общие выходы биомассы и полимера);

3) дробный режим дозирования в культуру валериановой (или пропионовой) кислот, которые, во-первых, подкисляют среду, поэтому возникает необходимость корректировки рН и, во-вторых, токсичны для культуры, в результате чего необходим постоянный контроль текущей концентрации этого субстрата в культуре.

Техническим результатом изобретения является расширение сырьевой базы и снижение затрат на производство сополимера 3-гидроксибутрата с 3-гидроксивалератом, обеспечение высокого общего выхода сополимера (не ниже 80%) за счет оптимизации режима дозирования в культуру солей валериановой кислоты.

Технический результат достигается тем, что в способе получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, включающем культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей, водород- и углеродосодержащий ростовой субстрат с добавлением соли валериановой кислоты, новым является то, что культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 осуществляют в две стадии при непрерывной подаче источника азота в течение 24-36 часов на первой стадии и без азота - на второй, а в качестве ростового субстрата используют газовую смесь Н₂, CO₂, СО и O₂, причем O₂ подают в культуру отдельным потоком при непрерывном режиме подачи в культуру валерата калия.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данных и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Масштабы производства и применения этих полимеров зависят от их стоимости, которая в значительной мере определяется стоимостью исходного ростового субстрата дл штамма-продуцента (таблица 1).

Таблица 1 Затраты и стоимость сырья для синтеза 1 т полимера^х Субстрат Стоимость субстрата, $ США /т Выход полимера, т/т субстрата Стоимость субстрата $ США /т полимера Глюкоза 220-493 0.38 580-1300 Сахароза 290 0.40 720 Метанол 110 0.18 610 Этанол 440 0.50 880 Уксусная кислота 370-595 0.33-0.38 1220-1560 Декстроза 360 0.33 1180 Водород 500 1.0 500 Тростниковый сахар 200 0.33 660 Меласса 220 0.42 520 Молочная сыворотка 71 0.33 220 Гемицеллюлозные экстракты 69 0.20 340

^xпо данным [Collins S.H. Choice of substrate in polyhydroxybutyrate synthesis. Carbon Substrates in Biotechnology. - 1987. - V.21. - P.161-169. Lee S.Y. Bacterial Polyhydroxyalkanoates (Rewiew) // Biotechnol. and Bioengin. - 1996 a. - V. - 49.-P.-1-14].  

Как видно из представленной таблицы 1, затраты на ростовой субстрат и его количество, необходимое для синтеза единицы продукта, существенно варьируют. Снижение затрат на производство полимеров этого класса в целом и расширение спектра ПГА, характеризующихся различными свойствами, - актуальное направление исследований.

Использование в качестве ростового субстрата водородсодерожащих газовых ресурсов, например синтез-газа, который может быть получен газификацией природного углеродсодержащего сырья (углей, природного газа, отходов растительного сырья); 3-ступенчатая парокислородная конверсия синтез-газа позволяет получать газовые смеси с различным соотношением водорода и окислов углерода, при этом чем ниже содержание окислов углерода в смеси, тем длительнее процесс конверсии и дороже получаемый газовый субстрат. Для выращивания штамма-продуцента привлекается газовый субстрат с содержанием монооксида углерода не ниже 25 об.%.

Сущность изобретения заключается в следующем: культуру штамма - продуцента Ralstonia eutropha B-5786 засевают в жидкую солевую среду, содержащую в качестве основного ростового газовый субстрат, содержащий водород - источник энергии, кислород и источник углерода (моно- и диоксид углерода), а в качестве предшественника для синтеза мономеров 3-гидроксивалерата - добавки валерата калия. Валерат калия подается в культуру бактерий не пробно (как в прототипе), а непрерывно с помощью перистальтического насоса-дозатора, что не вызывает изменения рН, обеспечивает постоянный и заданный уровень текущей концентрации валерата в культуре и исключает ингибирование культуры. Данный штамм-продуцент, обладающий СО-резистентностью, позволяет использовать газовый субстрат, содержащий в своем составе монооксид углерода. Культивирование бактерий проводят в стерильном режиме с использованием ферментационного комплекса BioFlo 110 («New Brunswick Scientific», США) объемом 7 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (рН, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде Шлегеля [Шлегель, Г.Г. Общая микробиология. - М: Наука, 1984]. Коэффициент заполнения ферментера составляет от 0.5 до 0.7. Культивирование проводят в периодической культуре в два этапа с подпиткой культуры азотом на первом этапе и без азота - на втором при 30°С и рН 7.0. На первом этапе, длительность которого составляет не менее 24 ч и не более 36 ч, в культуру непрерывно насосом-дозатором подают раствор восстановленного источника азота (CO(NH₂)₂ или NH₄Cl); на втором этапе подача азота не предусмотрена. Для синтеза мономеров 3-гидроксивалерата в культуру подается отдельным потоком субстрат-предшественник - валерат калия. В зависимости от дозы подаваемого валерата калия и времени культивирования штамма-продуцента соотношение мономеров 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата в сополимере варьирует в широких пределах. Концентрацию сополимера в клеточной биомассе и состав мономеров в нем определяют после предварительного метанолиза проб на хроматомасс-спектрометре Agilent 5975Inert, фирмы «Agilent» (США).

Пример 1.

Музейную культуру штамма-продуцента Ralstonia eutropha B-5786 суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей, г/л:

Na₂HPO₄·9Н₂O 9,5 KH₂PO₄ 1.5 MgSO₄ 0.2,

а также 5 мл раствора железа лимоннокислого (5 г/л) и 3 мл стандартного раствора микроэлементов, содержащего, г/л:

Н₃ВО₃ 0.228 CoCl₂·6H₂O 0.030 CuSo₄·5H₂O 0.008 MnCl₂·4H₂O 0.008 ZnSO₄·7H₂O 0.176 NaMoO₄·2H2O 0.008 NiCl₂ 0.008

Культивирование штамма проводят в двустадийном периодическом режиме, в качестве ростового субстрата используют водородсодержашую газовую смесь следующего состава, об.%: водород 64, монооксид углерода 26, диоксид углерода 10, которая подается в культуру из газгольдера с помощью компрессора со скоростью 6 л/мин. Отдельным потоком в культуру подается кислород для обеспечения его текущей концентрации в культуре 3-5 мг/л. На первом этапе длительностью 28 ч азот в виде раствора NH₄Cl подается в культуру непрерывным потоком с помощью перистальтического насоса-дозатора. На втором этапе подачу азота прекращают отключением насоса-дозатора и процесс выращивания проводят без подачи азота. Через 28 ч после отключения подачи азота культивирование продолжают еще 30 ч при подаче в культуру с помощью насоса-дозатора валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре - 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 58 ч при общем выходе полимера 84.5%. Состав полимера: 3-гидроксибутират - 32.3; 3-гидроксивалерат - 66.7 (мол.%).

Пример 2.

Культивирование штамма проводят аналогично Пример 1, в качестве ростового субстрата используют водородсодержашую газовую смесь следующего состава, об.%: водород 60, оксид углерода 30, диоксид углерода 10, которуя из газгольдера подают в культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Отдельным потоком в культуру подается кислород для обеспечения его текущей концентрации в культуре 3-5 мг/л. На первом этапе длительностью 24 ч азот в виде раствора CO(NH₂)₂ подается в культуру непрерывным потоком с помощью перистальтического насоса-дозатора. На втором этапе подачу азота прекращают отключением насоса-дозатора и процесс выращивания проводят без подачи азота. Через 24 ч после отключения подачи азота культивирование продолжают еще 32 ч при подаче в культуру непрерывным потоком с помощью насоса-дозатора валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре - 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 56 ч при общем выходе полимера 81.3%. Состав полимера: 3-гидроксибутират - 14.0; 3-гидроксивалерат - 84.6 (мол.%).

Пример 3.

Культивирование штамма проводят аналогично Примеру 1, в качестве ростового субстрата используют водородсодержашую газовую смесь следующего состава, об.%: водород 65, оксид углерода 28, диоксид углерода 7, об.%, который из газгольдера подают в культуру компрессором со скоростью 8 л/мин. Отдельным потоком в культуру подается кислород для обеспечения его текущей концентрации в культуре 3-5 мг/л. На первом этапе длительностью 26 ч азот в виде раствора СО(NH₂)₂ подается в культуру непрерывным потоком с помощью перистальтического насоса-дозатора. На втором этапе подачу азота прекращают отключением насоса-дозатора и процесс выращивания проводят без подачи азота. Через 26 ч после отключения подачи азота в культуру культивирование продолжают еще 24 ч при подаче в культуру непрерывным потоком с помощью насоса-дозатора валерата калия в качестве дополнительного источника углерода (текущая концентрация в культуре - 2 г/л). Общее время культивирования штамма-продуцента составляет 50 ч при общем выходе полимера 80.8%. Состав полимера: 3-гидроксибутират - 14.0; 3-гидроксивалерат - 86.0 (мол.%).

Использование СО-резистентного штамма позволяет привлекать для выращивания бактерий и синтеза сополимера более дешевый по сравнению с электролизным водородом водородсодержащий газовый субстрат, получаемый из природного сырья (бурый уголь, природный газ, отходы растительного сырья). Непрерывный режим подачи в культуру валерата калия, необходимого для синтеза 3-гидроксивалерата, позволяет исключить возникновение эффекта ингибирования культуры этим субстратом и не вызывает изменения рН культуры. Двустадийный режим культивирования штамма-продуцента с непрерывной подачей источника азота на первой стадии и без азота - на второй позволяет получить высокие общие выходы (80-84.6%) сополимера 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом с содержанием 3-гидроксивалерата от 51.0 до 86.0 мол.%.

Способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот включает культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей водород- и углеродосодержащий ростовой субстрат с добавлением соли валериановой кислоты. Культивирование штамма осуществляют в две стадии при непрерывной подаче источника азота в течение 24-36 часов на первой стадии и без азота - на второй. В качестве ростового субстрата используют газовую смесь H₂, СО₂, СО и О₂, причем О₂ подают в культуру отдельным потоком при непрерывном режиме подачи в культуру валерата калия. Изобретение обеспечивает высокие общие выходы 80-84,6% сополимера. 1 табл., 3 пр.

Способ получения сополимера 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, включающий культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 в условиях аэрации и перемешивания на жидкой солевой среде, содержащей водород- и углеродосодержащий ростовой субстрат с добавлением соли валериановой кислоты, отличающийся тем, что культивирование штамма-продуцента Ralstonia eutropha ВКПМ В-5786 осуществляют в две стадии, при непрерывной подаче источника азота в течение 24-36 ч на первой стадии и без азота - на второй, а в качестве ростового субстрата используют газовую смесь Н₂, СО₃, СО и О₂, причем О₂ подают в культуру отдельным потоком, при непрерывном режиме подачи в культуру валерата калия.