ШТАММ БАКТЕРИЙ Azotobacter chroococcum 12А - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИ-3-ОКСИБУТИРАТА И СОПОЛИМЕРА 3-ОКСИБУТИРАТА С 3-ОКСИВАЛЕРАТОМ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12R1/65 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый штамм Azotobacter chroococcum, используемый для получения термопластичного, биодеградабельного и биосовместимого полимера поли-3-оксибутирата (ПОБ) и сополимера 3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ), которые могут найти применение в медицине - биоразлагаемые и биосовместимые хирургические нити, пластины, пленки для покрытия ран, матрицы для лекарств пролонгированного действия с регулируемым сроком высвобождения и др.; в промышленности - включение биополимера в другие полимеры, не являющиеся биодеградабельными, упаковки и материалы одноразового пользования; а также в сельском хозяйстве - системы медленного высвобождения удобрений и агрохимикатов.

Известны продуценты полигидроксиалканоатов (ПОА), принадлежащие к различным родам бактерий Azotobacter, Alkaligenes, Methylobacterium (Патент РФ № 2051967, кл. С12Р 1/04, 1992 г., Патент РФ № 2123048, кл. С12Р 7/62, 1993 г.). Они обладают высокотехнологическими показателями, такими как высокое содержание ПОБ и ПОБВ в клетках, выход биомассы, скорость синтеза биомассы и накопления биополимера. Однако они растут преимущественно на газообразных источниках углерода, большинство штаммов получены генетическим путем, что может приводить к потере способности синтезировать целевой продукт, максимальный выход полимера составляет обычно 65-75%.

В качестве прототипа выбран штамм Azotobacter chroococcum 7Б - продуцент ПОБ, способный использовать в качестве источника углерода углеводы. Выход целевого продукта - 70-90% (Патент РФ № 2194759, кл. С12Р 7/62, С12N 1/20, 2001 г.).

Задачей изобретения является получение нового устойчивого штамма бактерий, способного с высоким выходом синтезировать ПОБ, а также ПОБВ, что позволяет получать биополимеры с разными физико-химическими свойствами и тем самым расширяет сферу их применения в различных областях.

Данная задача решается новым штаммом Azotobacter chroococcum 12А, который является сверхпродуцентом ПОБ, а также ПОБВ. Штамм хранится в коллекции Института им.А.Н.Баха РАН. Штамм выделен из дерново-подзолистой почвы Московской области.

Штамм имеет следующую характеристику:

Культурально-морфологические признаки

Крупные клетки овальной формы, грамотрицательные, размером 2,0-2,5×3,5-5,0 мкм с мелкозернистой цитоплазмой и компактным нуклеоидом. Молодые клетки имеют перитрихиальные жгутики, а также фимбрии, способны к движению. С возрастом культура становится полиморфной, клетки соединяются в цепочки, образуют нитчатые формы и сарциноподобные пакеты. В цитоплазме клеток появляется зернистость, связанная с накоплением гранул резервного соединения поли-3-оксибутирата. Стадия покоя характеризуется образованием цист и слизистых капсул. Колонии на агаризованной среде Эшби - полупрозрачные, беловатые, слизисто-морщинистые, со временем приобретают коричнево-черный цвет.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода - использует глюкозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маннит, крахмал, метанол, этанол, уксусную, лимонную, пропионовую и валериановую кислоты.

Облигатный аэроб.

Отношение к источникам азота - фиксирует атмосферный азот, использует нитратный азот.

Желатину не разжижает, нитраты не восстанавливает.

Растет при температуре от +10 до +40°С, оптимум роста в диапазоне 28-32°С.

Диапазон рН, при котором возможен рост от 5,0 до 8,6 с оптимумом, 7,2-7,6.

Штамм продуцирует до 90% ПОБ и ПОБВ.

Оптимум биосинтеза ПОБ при 30°С и рН 7,2.

Для получения ПОБ штамм Azotobacter chroococcum 12А выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода и минеральные соли. А для получения ПОБВ к основному источнику углерода - углеводам добавляют дополнительный источник углерода - соль органической кислоты. Через двое суток выход биомассы составляет 2-12 г/л (сух.в.), а содержание ПОБ или ПОБВ - 30-95%.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1

Штамм Azotobacter chroococcum 12А поддерживают на питательной среде Эшби, содержащей (г/л: К₂НРО₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄·2H₂О - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20; агар - 20). Культивирование осуществляют в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 28-30°С в течение 48 часов. Состав питательной среды (г/л): MgSO₄·7Н₂О - 0,4; FeSO₄·7H₂О - 0,01; Na₂MoO₄·2H₂О - 0,006; цитрат Na - 0,5; CaCl₂ - 0,1; K₂HPO₄·3Н₂O - 1,05; КН₂РО₄ - 0,2; сахароза-40. В конце культивирования (48 час) концентрация биомассы составляет 9,7 г сух.в./л, а содержание ПОБ, определенного по методу Brandl (Brandl H., Gross R., Lenz R., Fuller R. Plastics from bacteria and for bacteria: poly(β-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatible, and biodegradable polyesters // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol, V.41. P.77-93, 1990), составляет 85%.

Пример 2

Способ осуществляется по примеру 1, но для получения ПОБВ используют дополнительный источник углерода - валериановую кислоту 1,0 г/л. В конце культивирования (48 час) концентрация биомассы составляет 4 г сух.в./л, а содержание ПОБВ, определенного по методу Brandl, составляет 70%. Молярный процент включения 3-оксивалерата в полимерную цепь - 10%.

Пример 3

Способ осуществляется по примеру 1, но для получения ПОБВ используют дополнительный источник углерода - валериановую кислоту 2,0 г/л. В конце культивирования (48 час) концентрация биомассы составляет 2,5 г сух.в./л, а содержание ПОБВ, определенного по методу Brandl, составляет 62%. Молярный процент включения 3-оксивалерата в полимерную цепь - 18%.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Azotobacter chroococcum 12A является продуцентом поли-3-оксибутирата и сополимера 3-оксибутирата с 3-оксивалератом. Штамм выращивают на питательной среде, содержащей сахара в качестве основного источника углерода для биосинтеза поли-3-оксибутирата и валериановой кислоты в качестве дополнительного источника углерода для синтеза его сополимера. Выход поли-3-оксибутирата и его сополимера составляет 30-90%. Изобретение позволяет синтезировать полиоксиалканоаты не только в лабораторных, но и в производственных условиях.

Штамм бактерий Azotobacter chroococcum 12A - продуцент поли-3-оксибутирата и сополимера 3-оксибутирата с 3-оксивалератом.