СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРА β-ОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2003 года по МПК C12P7/42 C12P7/42 C12R1/05 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и предназначено для получения полимера β-оксимасляной кислоты (полиоксибутирата, ПОБ). Полиоксибутират является наиболее широко известным представителем семейства перспективных и экологически чистых биополимеров нового поколения - полиоксиалканоатов. Полиоксиалканоаты представляют собой новое поколение материалов XXI века, масштабы применение которых сдерживаются в настоящее время высокой стоимостью. Полиоксибутират аналогично полипропилену термопластичен и, помимо этого, обладает широким спектром полезных коммерческих свойств. ПОБ биоразрушаем, совместим с животными тканями, обладает антиоксидантными, пьезоэлектрическими и др. свойствами, поэтому имеет широкие перспективы применения в различных сферах (медицина, фармакология, сельское и коммунальное хозяйство, пищевая промышленность) (1).

Полиоксибутират с различной эффективностью способны синтезировать природные микроорганизмы, относящиеся к различным таксонам, а также полученные трансгенные продуценты, в т.ч. бактерии, дрожжи и высшие растения (2). Однако низкие выходы полиоксибутирата (5-10% к абсолютно сухой биомассе), достигнутые в генетически модифицированных высших растениях, в настоящее время не приемлемы для промышленного внедрения (3), а имеющиеся высокопродуктивные трансгенные штаммы-продуценты полиоксибутирата на основе E.coli для выращивания нуждаются в дорогостоящих средах (1, 4).

Микроорганизмы, синтезирующие полиоксибутират, в принципе способны для роста усваивать разнообразные субстраты - органические кислоты, спирты, сахара, а также отходы ряда производств (сахаров, жиров, кисломолочных продуктов, гидролизной промышленности). Однако эти процессы, ориентированные на отходы производств, не имеют собственной сырьевой базы и их масштабы ограничиваются реально существующими производствами.

Известны способы получения полиоксибутирата на сахарах, в том числе отходах, - мелассе, сахарозе, глюкозе, фруктозе, сахарных сиропах, с затратами субстрата от 2.7. до 3.3 т на т полимера на основе различных, в т.ч. мутантных, штаммов (Alcaligenes latus DSM NN 1122-1124, Alcaligenes eutrophus H16, ATCC) (5-8). Недостатком способов являются высокие затраты дорогостоящего органического сырья пищевого назначения.

Известен способ получения полиоксибутирата на метаноле на основе Methylobacterium orgcinophilum. штаммы NN 11482-11488 (9). Недостатком способа являются высокие затраты органического субстрата на производство полиоксибутирата (от 4.2 до 5.0 т на 1 т полимера).

Таким образом известные способы базируются на использовании для получения полиоксибутирата дорогостоящих органических субстратов, в т.ч. пищевого назначения; при этом стоимость только углеродсодержащего субстрата составляет от 580 до 1300 $ США на 1 т полимера, последнее сказывается на цене полиоксибутирата (10).

Известен способ получения полиоксибутирата на минеральном субстрате - минеральной солевой среде и газовой смеси - водороде и углекислоте в качестве основного ростового субстрата (11). Способ заключается в выращивании водородных бактерий Alcaligenes eutrophus ВКПМ В5786 на минеральной солевой среде, аэрируемой водородом и углекислотой, и обеспечивает получение высоких выходов полимера, до 82-86% к весу сухой биомассы, при затратах 1 т водорода и 1.8 т углекислоты на 1 т полимера. Способ не зависит от источников органического сырья и обеспечивает эффективное получение полиоксибутирата на минеральном сырье. Данный способ является прототипом изобретения. Недостатком прототипа является использование в качестве основного субстрата для синтеза полимера достаточно дорогого водорода, получаемого электролизом воды (стоимость 1 т электролизного водорода составляет до 500 $ США/т).

Целью изобретения является расширение сырьевой базы и удешевление стоимости сырья на получение полиоксибутирата.

В принципе источником водорода, помимо электролиза воды, могут быть процессы конверсии природного и отходящего нефтяного газов, а также газификации природного углеродсодержащего сырья, включая низкосортные угли (запасы которых значительны), лигнин, растительную биомассу, образуемые ежегодно в огромных количествах.

Цель достигается в результате использования для получения полиоксибутирата в качестве ростового субстрата синтез-газа, образуемого при газификации низкосортных углей.

Существо способа заключается в культивировании штамма-продуцента Alcaligenes eutrophus ВКПМ В5786 (12) при перемешивании и аэрации на жидкой солевой среде при лимите азота в периодическом режиме в две стадии с использованием в качестве основного ростового субстрата синтез-газа, получаемого газификацией бурых углей. Данный штамм-продуцент, обладающий СО-резистентностью, позволяет использовать газовый субстрат, содержащий в своем составе, помимо биогенных компонентов (водорода и углекислоты), окись углерода. Допустимый диапазон концентрации СО в составе синтез-газа выбран, исходя из кинетической зависимости μ/S_co для данного штамма. В связи с тем, что накопление полиоксибутирата с высокими выходами (свыше 70-75%) в штамме-продуценте реализуется при дефиците азота в среде (50% от потребности) и низких скоростях роста (0.01 и менее 1/час), присутствие токсичной окиси углерода в определенном диапазоне концентраций не влияет на общую продуктивность процесса и выходы полимера.

Бурый уголь газифицируют пароводяным способом в стационарном слое при температуре 800-850^oС и давлении 16-20 атм в установке аллотермического газификации периодического действия. При высокотемпературной газификации углей происходит превращение органической массы топлива в простые молекулы - СО, СО₂, Н₂, Н₂О, и образующийся при этом режиме синтез-газ свободен от смолистых составляющих. Режим обеспечивает получение синтез-газ следующего состава (об.%): водород - 50.0-69.5; двуокись углерода - 10.0-16.9; окись углерода - 10.7-30.0; метан - 0.1-0.5. Затраты угля для получения 1 нм³ синтез-газа составляют 0.4 кг угля (абсолютно сухого) и 0.5 кг водяного пара. Подобранный режим и параметры газификации позволяют получать синтез-газ с соотношением компонентов, отвечающим физиологическим потребностям продуцента и обеспечивающим высокие выходы полиоксибутирата. После охлаждения и очистки от возможных механических примесей синтез-газ компремируют и далее используют для культивирования штамма-продуцента в качестве источника энергии и углерода. Синтез-газ из баллонов поступает в газгольдер, в который добавляют кислород. Газовую смесь с помощью компрессора непрерывно прокачивают через культуру бактерий. Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме с подпиткой субстратом на жидкой солевой среде при рН 7.0 и 30^oС и постоянном перемешивании и насыщение культуральной среды газовой смесью. В ферментер с заданной скоростью поступают необходимые минеральные элементы. После завершения ферментационного цикла собранную после центрифугирования биомассу клеток обрабатывают с целью выделения полимера.

ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ СПОСОБА:
ПРИМЕР 1.

Измельченный бурый уголь с фракционным составом 2.0-2.5 мм загружают в установку, включают нагрев и задают температурный режим в реакторе 800^oС и давление 20 атм и проводят газификацию при постоянном расходе водяного пара 0.5 кг/час. Полученную в процессе газификации смесь газов направляют в холодильник, где происходит конденсация не прореагировавшего водяного пара и охлаждение синтез-газа до температуры 40^oС. Далее на фильтре-поглотителе смесь очищают от возможных механических примесей и летучих соединений. Состав полученного синтез-газа следующий (об.%): водород 62.0, углекислый газ 12.1, окись углерода 25.7, метан 0.2. Охлажденный и очищенный синтез-газ компремируют. Синтез-газ из баллонов поступает в газгольдер ферментационной установки объемом 50 л, в который добавляют кислород. После добавления кислорода газовая смесь содержит (об.%): водород 54.6, углекислый газ 8.0, окись углерода 19.1, кислород 18.3, метан - следы.

Для получения инокулята лиофильно высушенную музейную культуру штамма-продуцента вносят в жидкую питательную среду, содержащую (г/л):
Na₂HPO₄•9H₂O - 9.5
КН₂РO₄ - 1.5
MgSO₄ - 0.2
CO[(NH)₂]₂ - 2.0
5 мл раствора железа лимоннокислого (5 г/л).

3 мл стандартного раствора микроэлементов, содержащего (г/л):
Н₃ВО₃ - 0.228
СоСl₂•6Н₂O - 0.030
CuSO₄•5Н₂О - 0.008
MnCl₂•4Н₂О - 0.008
ZnSO₄• 7Н₂O - 0.007
NaMoO₄•2Н₂O - 0.008
NiCl₂ - 0.008
Культивирование проводят в 10-литровом ферментере с рабочим объемом 3 л, оснащенном мешалкой (1500 об/мин), термо- и рН-стабилизацией. В ферментер носят 3 л посевного материала музейного штамма-продуцента и начинают ферментацию при непрерывном перемешивании, 30^oС, рН 7.0 и снабжении культуры газовой смесью. Газовую смесь с помощью компрессора непрерывно прокачивают через культуру со скоростью 8 л/ч. Культивирование проводят в периодическом режиме в две стадии. На первой стадии в течение 30 ч реализуют режим с подпиткой субстратом. Подпитывающий раствор содержит (г/л): мочевины 10.0, сульфата магния 3.5. Скорость подачи компонентов составляет 500 и 120 мг/ч соответственно. На данной стадии происходит наращивание биомассы при удельной скорости роста бактерий 0.01 1/час. К завершению первой стадии концентрация полиоксибутирата в биомассе составляет 45-50%. Вторая стадия культивирования происходит при тех же параметрах, что и на первой стадии при перемешивании и непрерывном снабжении культуры газовой смесью, но без подпитки субстратом в течение 30-35 ч. Конечная концентрация полиоксибутирата в клетках составляет 85%.

ПРИМЕР 2.

Газификацию бурого угля проводят аналогично примеру 1 при температуре, равной 820^oС, и давлении 17 атм. Полученный синтез-газ содержит (об.%): водород 64.0, углекислый газ 15.5, окись углерода 20.0, метан 0.5. После добавления кислорода газовая смесь содержит (об.%): водород 56.8, углекислый газ 9.0, окись углерода 14.2, метан 0.1, кислород 19.9. Масштаб и параметры культивирования штамма-продуцента аналогичны примеру 1. Длительность процесса культивирования составляет 60 ч; конечная концентрация полимера в биомассе 82.7%.

ПРИМЕР 3.

Газификацию бурого угля проводят аналогично примеру 1 при температуре 850^oС и давлении 16 атм. Полученный синтез-газ содержит (об.%): водород 69.0, углекислый газ 14.0, окись углерода 16.6, метан 0.4 подают в газгольдер. После добавления кислорода газовая смесь содержит (об.%): водород 61.3, углекислый газ 9.3, окись углерода 10.6, метан 0.1, кислород 18.7. Культивирование проводят в ферментере объемом 30 л с исходным объемом культуры 10 л. Режим и параметры процесса культивирования аналогично примеру 1. Подпитывающий раствор содержит раствор мочевины и сульфата магния в концентрации аналогично примеру 1; скорость подачи компонентов составляет 1500 и 360 мг/ч, соответственно, для мочевины и сульфата магния. Длительность двухэтапного периодического процесса культивирования составляет 65 ч, конечная концентрация полиоксибутирата составляет 87.6%.

Предложенный способ позволяет реализовать эффективный режим получения полиоксибутирата на основе штамма-продуцента Alcaligenes eutrophus ВКПМ В5786 с использованием в качестве основного ростового субстрата синтез-газа, получаемого газификацией низкосортных бурых углей Канско-Ачинского месторождения. Способ делает независимым процесс получения полиоксибутирата от ограниченных по масштабам дефицитных источников органического сырья, расширяет и удешевляет сырьевую базу для получения экологически чистого полимерного материала, обладающего комплексом ценных коммерческих свойств.

ЛИТЕРАТУРА
1. Braunegg G. , Lefebvre G., Genzer K.F. - J. of Biotechnol. 1998. V. 65:127-161.

2. Madison L.L. and Hiusman G.W. - Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63:21-53.

3. Gengross T. U. and Slater S.C. - Scientific American. 2000. August: 37-41.

4. Choi J., Lee S.Y. - Appl Microbiol Biotechnol. 1999. V. 51: 13-21.

5. Патент ФРГ 3343576, кл. С 12 Р 1/04, 1985.

6. Пaтeнт ФPГ 3343551, кл. С 12 Р 1/04, 1985.

7. Патент СССР 1303035, кл. С 12 Р 7/42, 1987.

8. Патент США 4433053, кл. С 12 Р 7/52, 1984.

9. Патент США 4436334, кл. С 12 N 1/32, 1982.

10. Lee S.Y. Biothechnol. and Bioengin. 1996. 49:1-14.

11. Патент РФ 2051967, C 12 Р 1/04, 10.01.1996, Бюл. 1.

12. Патент РФ 2053292, С 12 N 1/20, 27.01.1996, Бюл. 3.

Изобретение относится к микробиологическому получению экологически чистого биополимера полиоксибутирата. Способ предусматривает ферментацию в периодическом режиме культуры бактерий Alcaligenes eutrophus ВКПМ В5786 с подпиткой субстратом при лимите азота, при непрерывном перемешивании и аэрации культуры смесью синтез газа с кислородом при 30^oС и рН 7,0. Синтез-газ, используемый в качестве источника водорода и углекислоты, получают пароводяной газификацией низкосортных бурых углей. Способ позволяет реализовать эффективный процесс получения полиоксибутирата с высокими выходами, расширить сырьевую базу и снизить стоимость водорода, являющегося основным ростовым субстратом.

Способ получения полимера β-оксимасляной кислоты, заключающийся в культивировании штамма-продуцента Alcaligenes eutrophus ВКПМ В5786 в условиях аэрации на жилкой солевой среде при лимите азота, содержащей в качестве ростового субстрата водород и углекислый газ, отличающийся тем, что в качестве источника водорода и углекислого газа используют синтез-газ, получаемый газификацией бурых углей, содержащий, об.%: водород 50,0-69,5, углекислый газ 10,0-16,9, окись углерода 10,7-30,0, метан 0,1-0,5.