ПОЛУЧЕНИЕ ТЕРМИНАЛЬНЫХ АЛКЕНОВ С ПОМОЩЬЮ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЯ 3-ГИДРОКСИАЛКАНОЕВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2015 года по МПК C12P5/02 C12N9/88 C12N15/60 C12N15/63 C12N1/20 C12N1/21 

Введение

Настоящее изобретение относится к способу получения алкенов с помощью биологического процесса. В частности, изобретение относится к способу получения терминальных алкенов (в частности, пропилена, этилена, 1-бутилена, изобутилена или изоамилена) из молекул типа 3-гидроксиалканоата.

Предпосылки создания изобретения

Большое количество химических соединений в настоящее время получают из нефтехимических продуктов. Алкены (такие, как, например, этилен, пропилен, различные бутены, а также пентены) используются в промышленности по производству пластмасс, например, для получения полипропилена или полиэтилена, а также в других областях химической промышленности и в производстве горючего и топлива.

Этилен, самый простой алкен, лежит в основе промышленной органической химии: он представляет собой органическое соединение, которое наиболее широко производится в мире. Он используется, в частности, для получения полиэтилена, основного пластика. Этилен может также превращаться во множество других промышленно полезных продуктов путем химической реакции (окисления, галогенирования).

Пропилен играет подобную роль: его полимеризация приводит к получению пластического материала, полипропилена. Технические свойства этого продукта в отношении устойчивости, прочности, плотности, твердости, способности к деформации и прозрачности не имеют себе равных. Мировой рынок для полипропилена постоянно растет с момента его открытия в 1954.

Бутилен существует в четырех формах, одна из которых изобутилен, входит в состав с метил-трет-бутилового этера (МТВЕ), противодетонационной присадки для автомобильного топлива. Изобутилен может также использоваться для получения изооктена, который, в свою очередь, может восстанавливаться до изооктана (2,2,4-триметилпентан); при этом очень высокое соотношение возгорания/воспламенения делает его наилучшим топливом для так называемых "газолиновых" моторов.

Амилен, гексен и гептен существуют во множестве форм в соответствии с положением и конфигурацией двойной связи. Эти продукты имеют реальное промышленное применение, но являются менее важными, чем этилен, пропилен или бутены.

Все эти алкены в настоящее время получают путем каталитического крекинга нефтепродуктов (или с помощью модификации процесса Фишера-Тропша в случае гексена из угля или газолина). Его цена, таким образом, естественно индексируется по отношению к цене нефти. Кроме того, каталитический крекинг иногда ассоциируется со значительными техническими сложностями, которые увеличивают сложность процесса и затраты на производство.

Вне зависимости от приведенных выше соображений биопродукция пластмасс ("биопластмассы") представляет собой процветающую отрасль. Такой подъем стимулируется экономическими целями, связанными с ценой на нефтепродукты, и из соображений охраны окружающей среды, обе эти предпосылки являются глобальными (продукты с нейтральным показателем высвобождения углерода) и локальными (контроль и утилизация отходов).

Основное семейство биопластмасс представляет собой таковое на основе полигидроксиалканоатов (РНА). Они представляют собой полимеры, полученные путем конденсации молекул, включающих как кислотную группу, так и спиртовую группу. Конденсация осуществляется путем эстерификации кислоты на спирте следующего мономера. Эфирная связь не является настолько стабильной, как непосредственная связь углерод-углерод, которая присутствует в полимерах традиционным пластмасс, что объясняет тот факт, почему РНА имеют способность к биоразложению в течение от нескольких недель до нескольких месяцев.

Семейство РНА включает, в частности, поли-3-гидроксибутират (РНВ), полимер 3-гидроксибутират, и полигидроксибутират-валерат (PHBV), альтернативный полимер 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата.

РНВ обычно получают при использовании некоторых штаммов бактерий, таких, как Alcaligenes eutrophus и Bacillus megaterium. В общем случае были созданы лабораторные бактерии, подобные E.coli, обладающие интегрированными синтетическими путями превращения, приводящими к получению РНВ или РНА. Соединение или его полимер могут при некоторых лабораторных условиях насчитывать вплоть до 80% массы бактерий (Wong MS и др., Biotech. Bioeng., 2008). Попытки получения РНВ в промышленных масштабах были предприняты в 1980-ые годы, однако затраты на получения соединения путем ферментации считались достаточно высокими на то время. Проекты, вовлекающие непосредственное получение этих соединений в генетически модифицированных растениях (которые содержат интегрированные ключевые ферменты синтетического пути РНВ, присутствующие в бактерии-продуценте), сейчас находятся на стадии развития и могут повлечь за собой снижение затрат на производство.

Получение алканов или других биологических молекул, которые могут использоваться в качестве топлива или в качестве предшественников синтетических смол, с помощью биологического предусматривается в контексте сбалансированной промышленной эксплуатации в соответствии с геохимическими циклами. Первое поколение биотоплива заключалось в ферментативном получении этанола, в виде процессов ферментации и дистилляции, которые уже существовали в пищевой промышленности. Получение второго поколения биотоплива находится на фазе испытания и охватывает, в частности, получение длинноцепочечных спиртов (бутанола и пентанола), терпенов, линейных алканов и жирных кислот. Два новых обзора обеспечивают общее рассмотрение исследований в этой области: Ladygina N и др., Process Biochemistry, 2006, 41: 1001; и Wackett LP, Current Opinions in Chemical Biology, 2008, 21: 187.

В химическом семействе алкена изопрен (2-метил-1,3-бутадиен) представляет собой фрагмент терпена, который при полимеризации приводит к получению резины. Также могут разрабатываться другие терпены, с помощью химического, биологического или смешанного пути, в качестве используемых продуктов, таких, как биотопливо, или для производства пластмасс. Современная литература демонстрирует, что мевалонатный путь (ключевое промежуточное соединение в биосинтезе стероидов во многих организмах) может использоваться для того, чтобы эффективно получать продукты из семейства терпена с промышленным выходом (Withers ST и др., Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73: 6277).

Получение терминальных алкенов [этилен моно- или ди-замещенный в положении 2: H₂C=C(R¹)(R²)] очевидным образом является менее исследованным. Было обнаружено получение изобутилена из изовалерата с помощью дрожжей Rhodotorula minuta (Fujii Т. и др., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54: 583), однако эффективность такого превращения, составляющего менее 1 миллионную часть в минуту или приблизительно 1 для 1000 в день, является далеким от того, чтобы позволить осуществлять промышленное использование. Механизм реакции был изучен Fukuda H. и др. (BBRC, 1994, 201(2): 516), он вовлекает фермент цитохром Р450, который декарбоксилирует изовалерат путем восстановления группы оксоферрила Fe^V=O. Ни на каком этапе реакция не предполагает гидроксилирования изовалерата. Изовалерат также представляет собой промежуточное соединение в катаболизме лейцина. Биосинтез изобутилена в промышленных масштабах с помощью этого пути представляется в значительной степени нецелесообразным, поскольку он будет требовать синтеза и разложения одной молекулы лейцина с образованием одной молекулы изобутилена. Кроме того, фермент, который катализирует реакцию, использует гем в качестве кофактора, который является слабо пригодным как таковой для рекомибинантной экспрессии в бактериях и для улучшения параметров фермента. По всем этим причинам представляется крайне маловероятным, чтобы этот путь, известный из уровня техники, мог служить в качестве основы для промышленной эксплуатации. Были также описаны другие микроорганизмы, как такие, которые являются более или менее способными к природному получению изобутилена из изовалерата; полученные выходы являются даже более низкими, чем те, которые получены при использовании Rhodotorula minuta (Fukuda Н. и др., Agric. Biol. Chem., 1984, 48: 1679).

Эти исследования также описывают природное получение пропилена: многие микроорганизмы являются способными к продукции пропилена, но опять-таки с чрезвычайно малым выходом.

Продукция этилена является известной давно (Meigh и др., 1960, Nature, 186: 902). В соответствии с выясненным путем метаболизма метионин представляет собой предшественник этилена (Adams и Yang, PNAS, 1979, 76: 170). Превращение 2-оксоглутарата также было описано (Ladygina N. и др., Process Biochemistry 2006, 41: 1001). Поскольку единственная молекула этилена требует предварительного получения четырех или пятиуглеродной цепи, потребности в оборудовании и энергии всех этих путей превращения являются неблагоприятными и не предвещают ничего хорошего для биопродукции алкена.

Перед характеристикой ферментативных этапов, которые в растениях превращают в этилен его истинный метаболический предшественник S-аденозилметионин (SAM) путем образования 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата (АСС) (Adams и Yang, PNAS, 1979, 76: 170), было предложено несколько других гипотез в научной литературе для объяснения получения этилена, среди которых было декарбоксилирование акрилата (H₂C=CH-CO₂H), получаемого в результате дегидратации 3-гидроксипропионата. В некоторых статьях, в частности, предполагается возможность метаболического пути, который будет превращать 3-гидроксипропионат в этилен через акрилат, для того, чтобы интерпретировать радиоизотопные исследования продукции этилена, где меченные ¹⁴С субстраты добавляются к препаратам растений: бета-аланин-2-¹⁴С вносят к экстрактам семядолей бобов (Stinson и Spencer, Plant Physiol., 1969, 44: 1217; Thompson и Spencer, Nature, 1966, 210: 5036), a пропионат-2-¹⁴С к гомогенатам мякоти бананов (Shimokawa и Kasai, Agr. Biol. Chem., 1970, 34(11): 1640). Все эти гипотезы вовлечения 3-гидроксипропионата и акрилата в метаболическую продукцию этилена, что не приводило к характеристике ферментативной активности, исчезли из научной литературы, как только была открыта роль метионина, SAM и АСС (Hanson и Kende, Plant Physiology, 1976, 57: 528; Adams и Yang, PNAS, 1979, 76: 170).

Таким образом, по нашему мнению, в настоящее время не существует никакого эффективного способа для получения терминальных, алкенов, таких, как этилен, пропилен, 1-бутилен, изобутилен, 1-амилен или изоамилен, путем микробиологического синтеза. Такой способ позволит устранить применение нефтепродуктов и снизить затраты на получение пластиков и топлива. В завершение, это может потенциально обладать значительным глобальным воздействием на окружающую среду путем создания возможности для углерода накапливаться в твердой форме.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение описывает способ осуществления синтеза соединений алкена с помощью биологического процесса.

Изобретение основывается на модели нового пути синтеза соединений терминального алкена на основе превращения 3-гидроксиалканоатов. Изобретение также основывается на демонстрации того, что указанное превращение может быть осуществлено биологически, при использовании фермента типа декарбоксилазы или его вариантов. Изобретение может использоваться in vitro, в бесклеточных системах, или путем использования микроорганизмов. Изобретение также относится к получению алкенов из источника углерода и, в частности, из углеводов (в частности, глюкозы), полиола (в частности, глицерина), биоразлагаемого полимера (в частности, крахмала, целлюлозы, поли-3-гидроксиалканоата); при этом источник углерода превращается с помощью микроорганизма до метаболического промежуточного соединения, которое принадлежит к семейству 3-гидроксиалканоата, которое потом превращается в терминальный алкен.

В частности, объект настоящего изобретения обеспечивает способ получения терминального алкена, характеризующийся тем, что он включает этап превращения 3-гидроксиалканоата в присутствии фермента, обладающего декарбоксилазной активностью.

Другой объект в соответствии с изобретением основывается на применении соединений 3-гидроксиалканоата в качестве предшественника или субстрата для получения соединений терминального алкена.

В частности, воплощения изобретения:

- 3-гидроксипропионат подвергается превращению до этилена; или

- 3-гидроксибутират подвергается превращению до пропилена; или

- 3-гидроксивалерат подвергается превращению до 1-бутилена; или

- 3-гидрокси-3-метилбутират (или 3-гидроксиизовалерат) подвергается превращению до изобутилена; или

- 3-гидрокси-3-метилвалерат подвергается превращению до изоамилена.

Изобретение дополнительно относится к применению фермента декарбоксилазы, или микроорганизма, продуцирующего декарбоксилазу, для получения соединений терминального алкена из 3-гидроксиалканоатов.

Изобретение также относится к композиции, включающей микроорганизм, продуцирующий декарбоксилазу, приемлемой культуральной среде и соединению 3-гидроксиалканоата, или источнику углерода, который может подвергаться превращению с помощью микроорганизма с образованием соединения 3-гидроксиалканоата.

Другой объект изобретения относится к биокатализатору, включающему фермент декарбоксилазу или микроорганизм, продуцирующий декарбоксилазу, который декарбоксилирует соединение 3-гидроксиалканоата до терминального алкена.

Другой объект изобретения относится к соединению терминального алкена, полученному с помощью способа, такого, как тот, что описан в данном изобретении.

Дополнительный объект изобретения представляет собой изолированный или очищенный фермент, обладающий декарбоксилазной активностью и включающий всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермент, обладающий с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности.

Другой объект изобретения относится к применению фермента, обладающего декарбоксилазной активностью и включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности, для получения терминального алкена.

Другой объект изобретения относится к способу получения фермента, обладающего декарбоксилазной активностью и включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности, при этом способ включает культивирование микроорганизма, включающего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную последовательность в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию указанной последовательности.

Другой объект изобретения относится к микроорганизму, включающему рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, обладающий декарбоксилазной активностью и включающий всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермент, обладающий с ним, по крайней мере, 15% гомологией последовательности.

Определения

"3-гидроксиалканоат", как используется в данной заявке, означает любую молекулу, включающую 3-гидроксипропионат в качестве общего элемента (Фигура 1), и необязательно одно или два замещения алкила на углероде в положении 3. Указанные алкильные остатки или группы могут быть линейными или разветвленными. Как используется в данной заявке, термины "алкоил" и "алкил" имеют одинаковые значения и являются взаимозаменяемыми. Кроме того, термины "остаток" и "группа" имеют одинаковые значения и являются взаимозаменяемыми. Группы метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила представляют собой примеры указанных алкильных групп. Углерод 3 становится хиральным центром, если два алкильных замещения являются различными. Настоящее определение охватывает две хиральные формы, даже если одна из двух форм, например, R форма, представляет собой основную форму, которую получают в природе. Примеры 3-гидроксиалканоатов являются представленными на Фигуре 3. Необязательно, алкильные заместители могут прибавляться на углероде в положении 2, который потом также может становиться хиральным (если два заместителя являются различными). В равной степени конфигурации субстратов 3-гидроксиалканоата в настоящем изобретении охватывают все стереоизомеры. Предпочтительным образом, 3-гидроксиалканоаты соответствуют либо 3-гидроксипропионату, либо вариантам или производным 3-гидроксипропионата, в которых один из двух или два атома водорода, находящиеся на углероде в положении 3, являются замещенными элементом, который состоит только из атомов углерода и водорода, при этом количество атомов углерода указанных заместителей колеблется от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 3, заместители могут представлять собой метил, этил, пропил, изопропил, бутил или изобутил. Суффикс "оат", как используется в данной заявке, может попеременно означать либо ион карбоксилата (СОО-), либо карбоновую кислоту (СООН). Он не используется дл обозначения эстера. В частном воплощении 3-гидроксиалканоаты являются представленными следующими формулами: НО-CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH или O^--CO-CH₂-C(R¹)(R²)-OH.

Термин "терминальные алкены" в соответствии с настоящим изобретением означает молекулы, которые состоят только из углерода и водорода (ненасыщенные углеводороды, имеющие формулу C_nH_2n), включающие этилен и органические молекулы, которые получены из этилена путем моно- или дизамещения двух атомов водорода, связанных с углеродами в положении 2, с помощью неразветвленных или разветвленных алкильных групп. Терминальные алкены являются представленными формулами Н₂С=C(R¹)(R²), где R¹ и R² независимо являются выбранными из группы, состоящей из атома водорода и линейной или разветвленной алкильной группы, предпочтительно содержащей от 1 до 4 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 3 атомов углерода. Предпочтительно, по крайней мере, один из двух заместителей на углероде в положении 2 алкена представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу. Терминальные алкены включают разветвленные соединения изоалкена, такие, как, например, изобутилен. Предпочтительные примеры соединений терминального алкена в соответствии с изобретением представляют собой, в частности, этилен, пропилен, изобутилен и изоамилен (Фигура 4), или также 1-бутилен и 1-амилен.

"Источник углерода", как используется в данной заявке, означает любое углеродное соединение, которое моет использоваться в качестве субстрата для организмов в соответствии с изобретением. Указанный термин включает глюкозу или любую другую гексозу, ксилозу или любую другую пентозу, полиолы, такие как глицерин, сорбит или маннит, или также полимеры, такие как крахмал, целлюлоза или гемицеллюлоза, или также поли-3-гидроксиалканоаты, подобные поли-3-гидроксибутирату. Такой источник может представлять собой любой субстрат, который позволяет выращивать микроорганизмы, такой как, например, формиат. Он может также представлять собой CO₂ в случае, когда организмы являются способными осуществлять фотосинтез.

"Рекомбинант", как используется в данной заявке, означает искусственную генетическую модификацию организма, которая осуществляется либо путем прибавления, либо удаления, либо модификации хромосомного или экстрахромосомного гена или регуляторного элемента, такого, как промотор, или путем слияния организмов, или путем прибавления вектора любого типа, например, плазмидного. Термин "рекомбинантная экспрессия" означает продукцию белка, вовлекающую генетическую модификацию, предпочтительно для того, чтобы получить белок экзогенного или гетерологичного происхождения в отношении его хозяина, то есть, такой, который не существует в природе в хозяине, осуществляющем продукцию, или для того, чтобы получить модифицированный или мутированный эндогенный белок.

"Сверхэкспрессия" или "сверхэкспрессирующий", как используется в данной заявке, означает рекомбинантную экспрессию белка, который предпочтительно происходит от организма, отличного от того, в котором он подвергается экспрессии, повышенной на, по крайней мере, 10% и предпочтительно на 20%, 50%, 100%, 500% и, возможно, более по сравнению с природной экспрессией указанного белка. Это определение также охватывает случай, когда не происходит природной экспрессии указанного белка.

"Косубстрат" представляет собой продукт, который прибавляется к ферментативной реакционной среде для того, чтобы улучшить определенные ее параметры, и прежде всего ее активность, при этом указанный продукт и принципиальный субстрат потребляются в равных количествах. Таким образом, косубстрат должен прибавляться к реакционной среде при концентрации, сравнимой с таковой принципиального субстрата. В зависимости от фермента присутствие косубстрата может требоваться для осуществления ферментативной реакции.

"Кофактор" представляет собой продукт, который прибавляется к ферментативной реакции, для того, чтобы улучшить определенные ее параметры, и прежде всего, ее активность, при этом указанный продукт не потребляется в процессе реакции и таким образом требует прибавления только при низкой концентрации, пропорциональной количеству фермента, при этом указанная концентрация, таким образом, называется "каталитической".

Термин "часть" аминокислотной последовательности означает фрагмент, включающий, по крайней мере 10, предпочтительно, по крайней мере 10 20, 30, 40 или 50 последовательных аминокислотных остатков указанной последовательности.

"Гомология" означает существование подобности между двумя последовательностями, как измеряется в процентах идентичности между двумя указанными последовательностями.

Химические соединения часто являются известными под несколькими наименованиями, официальным и традиционным. В данной заявке традиционные наименования молекул являются предпочтительными. Таким образом:

- "этилен" используется для обозначения этена

- "пропилен" используется для обозначения пропена

- "бутилен" используется для обозначения бутена

- "изобутилен" используется для обозначения 2-метилпропена или изобутена

- "амилен" используется для обозначения пентена

- "изоамилен" используется для обозначения 2-метил-бут-1-ена или изопентена

- "пропионат" используется для обозначения пропионовой кислоты или пропаноатного иона

- "бутират" используется для обозначения бутановой кислоты или бутаноатного иона

- "валерат" используется для обозначения пентановой кислоты или пентаноатного иона.

Подробное описание изобретения

В частности, изобретение обеспечивает способ получения терминальных алкенов, включающий этап ферментативного декарбоксилирования соединений 3-гидроксиалканоата. Изобретение также относится к применению декарбоксилаз для катализа этой реакции и, в частности, ферментов типа мевалонатдифосфат декарбоксилазы, и субстратов, таких, как 3-гидроксибутират, 3-гидроксивалерат, 3-гидрокси-3-метилбутират (или 3-гидроксиизовалерат) и 3-гидроксипропионат. Изобретение описывает применение кофакторов, включающих этил дифосфат, пропилдифосфат, метилдифосфат, аналогов указанных молекул, и пирофосфата. Изобретение дополнительно описывает применение косубстратов, таких, как АТФ или других соединений, содержащих фосфоангидридную связь.

Изобретение также относится к применению источников углерода, таких, как глюкоза, для непосредственного получения терминальных алкенов из цельных клеток, синтетического пути, осуществляемого с помощью 3-гидроксиалканоатов.

Изобретение дополнительно относится к природным или модифицированным организмам, которые эндогенно продуцируют 3-гидроксиалканоат, и также экспрессирующим декарбоксилазу, превращающую указанные 3-гидроксиалканоаты в терминальные алкены.

Продуцируемые соединения алкена, в частности, пропилен, этилен и изобутилен, представляют собой ключевые молекулы в промышленности по производству пластмасс и топлива, и их промышленное получение при использовании биологического пути, из возобновляемых источников, представляет собой основную инновацию.

Таким образом, изобретение вытекает из модели нового синтетического пути для соединений типа терминального алкена, основы превращения соединений типа 3-гидроксиалканоата. Изобретение демонстрирует, что указанное превращение может осуществляться биологически, при использовании фермента типа декарбоксилазы, что позволяет осуществлять превращение 3-гидроксиалканоата в терминальный алкен. Как проиллюстрировано на Фигуре 2, указанное превращение осуществляется посредством реакции промежуточного соединения, которое обладает структурой 3-фосфогидроксиалканоата.

Этап превращения в соответствии с изобретением может осуществляться in vitro, в присутствии изолированного фермента (или ферментной системы, которая дополнительно включает один или более кофакторов), или в культуре, в присутствии микроорганизма, продуцирующего фермент.

Как описано в данной заявке в Примере 5, при некоторых условиях можно наблюдать соотношение сигнал-шум (измеренное при отсутствии фермента), составляющее приблизительно 100-кратное значение для выхода реакции превращения. Аффинность для 3-гидроксиизовалерата (HIV), как было измерено, составляла приблизительно 40 мМ. Не является очевидным, что может быть получена такая весьма существенная ферментативная активность: несомненно, биохимику, знакомому с теорией и практикой энзимологии, хорошо известно, что фермент активирует сайты, содержащие структурные элементы, которые позволяют осуществлять узнавание, связывание и химическое превращение определенных специфических субстратов. Научная литература изобилует экспериментальными данными, указывающими на то, что изменение размеров или электрического заряда, даже незначительное, может приводить к исключению субстратов. В частности, никакое научное предсказание не позволяет предположить, что MDP декарбоксилаза может в общем случае использовать в качестве субстрата молекулы типа 3-гидроксиалканоата, и, в частности, 3-гидроксиизовалерат, последний отличается от мевалонатдифосфата не только своим размером (MW 118 против 308 для мевалонатдифосфата), но также электрическими зарядами группы дифосфата, которая является присутствующей на природном субстрате, мевалонатдифосфате.

В особом воплощении кофактор прибавляют к реакционной смеси для того, чтобы обеспечить стерическую или электронную комплементацию в каталитическом желобке. Кофактор предпочтительно выбирают из группы, которая состоит из иона пирофосфата, метилдифосфата, этилдифосфата или пропилдифосфата. В общем случае, кофактор представляет собой соединение, которое содержит элемент фосфоангидрида, имеющего общую формулу R-O-PO₂H-O-РО₃Н₂, в которой R представляет собой, в частности, атом водорода, линейную, разветвленную или циклическую группу алкила, предпочтительно содержащую от 1 до 10 или от 1 до 5 атомов углерода, или любую другую моновалентную органическую группу. Аналогичные элементы, соответствующие моноэстерам метилен дифосфоната, представленные общей формулой R-O-PO₂H-СН₂-РО₃Н₂, в которой фосфоангидрид является замещенным метиленовым мостиком, имеют преимущество, которое заключается в том, что они не подвергаются гидролизу, что также представляет собой часть изобретения.

В предпочтительном воплощении превращение осуществляется в присутствии косубстрата, при этом указанный косубстрат предпочтительно представляет собой соединение, содержащее фосфоангидрид, и предпочтительно представляющий собой АТФ, рНТФ, дНТФ или смесь из нескольких таких молекул, полифосфат или пирофосфат. Косубстрат обычно присутствует в хозяине. Однако в другом частном воплощении косубстрат, который может прибавляться к реакционной смеси, предпочтительно является выбранным из группы, состоящей из АТФ, рНТФ, дНТФ, смеси нескольких рНТФ или дНТФ, полифосфата, и предпочтительно пирофосфата, или соединения, содержащего фосфоангидрид (которое является представленным общей формулой Х-РО₃Н₂ на Фигуре 2).

В особом воплощении изобретения используется микроорганизм, который продуцирует декарбоксилазу. В предпочтительном воплощении микроорганизм является рекомбинантным в отношении того, что он продуцирует гетерологичную по отношению к организму хозяина-продуцента декарбоксилазу. Способ может, таким образом, осуществляться непосредственно в культуральной среде без необходимости отделения или очистки ферментной системы. В особенно предпочтительном воплощении используется микроорганизм, обладающий природным или синтетическим свойством эндогенной продукции одного или более 3-гидроксиалканоатов, а также экспрессии или сверхэкспрессии декарбоксилазы, природной или модифицированной, так, что является возможным получение терминальных алкенов непосредственно из источника углерода, присутствующего в растворе.

Используемый в изобретении микроорганизм может быть прокариотическим или эукариотическим и, в частности, представляет собой бактерии, грибы, клетки растений, грибов и плесени, животные клетки. В особом воплощении эти микроорганизмы представляют собой бактерии, в частности, штамм Alcaligenes eutrophus или Bacillus megaterium.

В другом частном воплощении эти микроорганизмы представляют собой рекомбинантные бактерии штамма Escherichia coli, который является модифицированным так, чтобы эндогенно продуцировать один или более 3-гидроксиалканоатов, и превращать их в терминальные алкены.

В другом частном воплощении эти микроорганизмы представляют собой рекомбинантные дрожжи, продуцирующие 3-гидроксиалканоаты, и превращающие их в терминальные алкены.

В другом частном воплощении используют микроорганизм, который продуцирует один или более 3-гидроксиалканоатов, с одной стороны, и декарбоксилазу, необязательно экспрессируемую другим микроорганизмом, с другой стороны. Необязательно, можно культивировать и одновременно использовать два организма в способе в соответствии с изобретением.

В другом частном воплощении цельные растения или животных, необязательно модифицированные с помощью трансгенеза, используются для получения терминальных алкенов из 3-гидроксиалканоатов, при этом таковые обеспечиваются эндогенно или экзогенно.

В другом частном воплощении используют фотосинтетический микроорганизм, обладающий природным или искусственно созданным свойством эндогенно продуцировать один или более 3-гидроксиалканоатов, а также сверхэкспрессировать декарбоксилазу, природную или модифицированную, так, чтобы непосредственно получить терминальные алкены из CO₂, присутствующего в растворе. Предпочтительно, микроорганизм представляет собой фотосинтетическую бактерию или микроскопические водоросли.

Настоящее изобретение дополнительно относится к организмам, описанным в данной заявке выше, и их применению для получения соединений терминального алкена.

Как описывается ниже, способ в соответствии с изобретением может осуществляться в микроаэрофильных условиях.

Кроме того, в предпочтительном воплощении способ осуществляют в присутствии системы для сбора газа терминальных алкенов, которые удаляются из реакционной смеси.

Декарбоксилаза, как используется в данной заявке, означает любой фермент, способный превращать 3-гидроксиалканоат с n атомами углерода до соединения терминального алкена с n-1 атомами углерода. Как иллюстрируется на Фигуре 2, способ в соответствии с изобретением предпочтительно осуществляется через промежуточную реакцию 3-фосфогидроксиалканоата, и используемый фермент предпочтительно обладает активностью декарбоксилазы и активностью фосфорилазы.

В особом воплощении декарбоксилаза представляет собой члена филогенетического надсемейства мевалонатдифосфат (MDP) декарбоксилазы (номенклатура фермента ЕС 4.1.1.33), то есть, природный или синтетический фермент, который кодируется природным или синтетическим геном, и необязательно являющийся способным катализировать реакцию, проиллюстрированную на Фигуре 2.

MDP декарбоксилаза представляет собой фермент, вовлеченный в биосинтез холестерина. Указанный фермент был изолирован из разнообразных организмов, включая животных, грибы, дрожжи и некоторые бактерии. Он может также экспрессироваться некоторыми растениями (Lalitha и др., 1985). Многие гены, кодирующие этот фермент, были клонированы и секвенированы. Эти ферменты в общем случае состоят из 300-400 аминокислот и используют АТФ в качестве косубстрата, который превращается в процессе реакции в АДФ и неорганический фосфат. Группа фосфата переносится с молекулы АТФ на третичный спирт мевалонатдифосфата, что приводит к высвобождению АДФ. Фосфорилированное по группе 3-гидроксила промежуточное соединение, полученное в результате реакции, потом подвергается удалению фосфатной группы при высвобождении в физиологическом отношении изопентилпирофосфата (Фигура 2).

Трехмерные структуры некоторых ферментов из этого семейства были разрешены. На сегодняшний момент было осуществлено относительно немного исследований на ферментах из этого семейства, и эти ферменты исследовались только в контексте только описания пути биосинтеза холестерина. С другой стороны, насколько нам известно, еще не было проведено никаких исследований для того, чтобы отклонить этот фермент от его природной функции и превратить его в промышленный катализатор.

Некоторые примеры MDP декарбоксилазы из различных организмов являются приведенными в последовательностях SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 16.

Таким образом, в предпочтительном воплощении используемый фермент представляет собой декарбоксилазу, предпочтительно включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, или последовательности, обладающие, по крайней мере, 15% гомологией последовательности с одной из указанных последовательностей и сохраняющие активность декарбоксилазы. Предпочтительные ферменты преимущественно обладают, по крайней мере, 50% гомологией последовательности, предпочтительно, по крайней мере, 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, даже более предпочтительно, по крайней мере, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией с одной из первичных последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16. Процент гомологии последовательности может быть определен с помощью различных способов и при использовании компьютерных программ, известных специалисту в данной области техники, таких, как, например способ CLUSTAL или BLAST и производных от них программ, или при использовании алгоритма сравнения последовательностей, такого, как описано Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443) или Smith и Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147: 195).

Предпочтительная декарбоксилаза в соответствии с изобретением является представленной ферментом, обладающим последовательностью SEQ ID NO: 6, а также любым ферментом, обладающим значительной гомологией последовательности. Предпочтительные ферменты преимущественно обладают, по крайней мере, 50% гомологией последовательности, предпочтительно, по крайней мере 80%, более предпочтительно, по крайней мере, 85%, даже более предпочтительно, по крайней мере, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией последовательности с первичной последовательностью SEQ ID NO: 6. Указанный фермент был клонирован из Picrophilus torridus и получен с помощью рекомбинантных способов в соответствии с данным изобретением. Как иллюстрируется в примерах, этот фермент является особенно эффективным при получении соединений терминального алкена в соответствии с настоящим изобретением. Этот фермент также представляет собой объект настоящего изобретения, как и его получение и применение в качестве катализатора. В частности, объект настоящего изобретения представляет собой применении фермента декарбоксилазы, включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего значительной гомологией последовательности, и предпочтительно, по крайней мере, 15% гомологией с последовательностью SEQ ID NO: 6, для получения соединений терминального алкена. Значительная гомология последовательности означает гомологию последовательности, которая может определяться при использовании упомянутых выше алгоритмов, и предпочтительно гомологию последовательности, большую, чем 15%. Организмы, имеющие близкое филогенетическое родство с Picrophilus torridus, такие, как Ferroplasma acidarmanus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium и Picrophilus oshimae, являются способными продуцировать MDP декарбоксилазы, близкие к SEQ ID NO: 6. Например, MDP декарбоксилаза Thermoplasma acidophilum (AC номер Q9HIN1) обладает 38% гомологией последовательности с SEQ ID NO: 6; таковая Thermoplasma volcanium (Q97BY2) обладает приблизительно 42% гомологией. Применение этих MDP декарбоксилаз подробно рассматривается в настоящем изобретении.

Другие ферменты типа декарбоксилазы, природные или синтетические, могут быть выбраны в соответствии со своей способностью продуцировать терминальные алкены в соответствии с изобретением. Таким образом, анализ отбора включает приведение в контакт очищенного фермента или микроорганизма, продуцирующего фермент, с субстратом реакции и измерение продукции соединения терминального алкена. Такие анализы являются описанными в экспериментальной части, где было проанализировано свыше 60 различных ферментов.

Фермент, который используется, может представлять собой любую декарбоксилазу, которая может быть природной или искусственной, или оптимизированной. В частности, предпочтительно можно использовать декарбоксилазу, обладающую оптимизированной активностью в отношении одного или более 3-гидроксиалканоатов.

Фермент может быть получен или отобран из характерных декарбоксилаз (природных или уже синтетических или оптимизированных), с помощью методик конструирования белков, таких, как случайный мутагенез, массированный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, перестановка в ДНК, синтетическая перестановка, in vivo эволюция или полный синтез генов.

В этой связи один из аспектов изобретения также относится к способу получения фермента, обладающего декарбоксилазной активностью по отношению к субстрату 3-гидроксиалканоата, при этом способ включает этап обработки источника фермента и отбор фермента, обладающего улучшенными свойствами по отношению к указанному субстрату, по сравнению с необработанным ферментом.

Используемый в изобретении фермент может, таким образом, быть природным или синтетическим, и может быть получен с помощью химических, биологических или генетических способов. Он может быть также химически мождифицированным, например, для того, чтобы улучшить его активность, устойчивость, специфичность, очистку или для иммобилизации на подложке.

Изобретение характеризуется применением декарбоксилазы, в частности, природной или модифицированной MDP декарбоксилазы, для превращения 3-гидроксиалканоатов до терминальных алкенов.

Природный субстрат MDP декарбоксилазы представляет собой мевалонатдифосфат, который не подпадает под определение 3-гидроксиалканоатов.

Генерическая реакция, осуществляемая с помощью MDP декарбоксилазы при использовании различных 3-гидроксиалканоатов, отражается на Фигуре 2В. При этом является понятным, что эти реакции непосредственно приводят к получению терминальных алкенов в один этап.

В первом воплощении нативный или рекомбинантный фермент, очищенный или нет, используется для превращения 3-гидроксиалканоата в терминальный алкен. Для осуществления этого форменный препарат инкубируют в присутствии субстрата в физико-химических условиях, позволяющих ферменту оставаться активным, и осуществляют инкубацию, которая длится в течение достаточного периода времени. В конце процесса инкубации необязательно измеряют присутствие терминального алкена при использовании любой системы для определения, известной специалисту в данной области техники, такой, как газовая хроматография или хроматографические анализы для измерения образования продукта алкена или свободного фосфата, или также для измерения исчезновения субстрата 3-гидроксиалканоата или АТФ.

В предпочтительном воплощении прибавляют кофакторы для лучшей имитации природной реакции. Фактически структура 3-гидроксиалканоатов в общем случае соответствует фрагменту MDP, оставляя, таким образом, большое пространство в каталитическом желобке свободным во время связывания фермента и субстрата. Заполнение этого пространства с помощью кофактора для замены отсутствующей части субстрата имеет целью наиболее полную имитацию MDP молекулы. Поскольку кофактор не модифицируется в процессе реакции, то он, таким образом, будет прибавляться в каталитических количествах. В случае, когда субстрат реакции представляет собой 3-гидроксипропионат, комплементарный кофактор будет представлять собой пропилдифосфат. В случае, когда субстрат представляет собой 3-гидроксибутират или 3-гидрокси-3-метилбутират, комплементарный кофактор будет представлять собой этилдифосфат. В случае, когда субстрат представляет собой 3-гидроксивалерат или 3-гидрокси-3-метилвалерат, комплементарный кофактор будет представлять собой метилдифосфат. Эти различные молекулы являются представленными на Фигуре 5. Иногда может случиться так, что комплементарный кофактор реакции оказывает положительный эффект на реакцию другого субстрата. В общем случае кофактор может быть молекулой, включающей фосфоангидрид, и, таким образом, имеет общую формулу R-PO₂H-O-РО₃Н₂, в которой R представляет собой, в частности, Н, линейную, разветвленную или циклическую группу алкила или другую моновалентную органическую группу. Аналогичные фрагменты, соответствующие моноэстерам метилендифосфоната, имеющие общую формулу R-O-PO₂H-СН₂-РО₃Н₂, в которой фосфоангидрид замещается метиленовым мостиком, обладают преимуществом, выражающимся в том, что он не гидролизуется, такие фрагменты также составляют часть изобретения.

В общем случае кофакторы могут представлять собой монофосфат или даже свободные от фосфата аналоги предыдущих молекул, или также любую другую молекулу, которая может улучшать выход реакции путем обеспечения стерической или электронной комплементации в каталитическом сайте фермента.

В особом воплощении к реакционной смеси прибавляют косубстрат. Указанный косубстрат может представлять собой либо АТФ, иными словами, природный косубстрат MDP декарбоксилазы, или любой из рНТФ (рибонуклеозид трифосфат) или дНТФ (дезоксирибонуклеозид трифосфат) или любую смесь рНТФ или дНТФ, или также пирофосфат или другой полифосфат, или также любую молекулу, содержащую группу фософангидрида (Х-РО₃Н₂, как представлено на Фигуре 2).

В предпочтительном воплощении для превращения 3-гидроксиалканоата в терминальный алкен используют фермент, обладающий, по крайней мере, 15% гомологией последовательности, предпочтительно, по крайней мере, 30%, 50% и даже более предпочтительно, по крайней мере, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологией с природным ферментом, обладающим декарбоксилазной активностью и, в частности, с одним из ферментов, соответствующих последовательностям SEQ ID NO: 1-16. В частности, фермент может быть модифицирован путем конструирования при использовании одного из ферментов SEQ ID NO: 1-16 или любой другой декарбоксилазы, идентифицированной из других источников. Такой фермент может характеризоваться потерей своей MDP декарбоксилазной активности, в частности, его получают посредством генетического конструирования в лаборатории, а также в процессе природной эволюции (в случае которой можно говорить о малейших признаках MDP декарбоксилазы), он может сохранять или повышать свою активность по отношению к одной или более молекулам типа 3-гидроксиалканоата. Получение вариантов этих ферментов, более реактивных по отношению к указанным субстратам, делает возможным повысить выход реакции в соответствии с изобретением. Например, реактивность MDP декарбоксилазы дикого типа по отношению к 3-гидроксиалканоатам не является обязательно оптимальной. Любой подход, известный специалисту в данной области техники, с помощью которого получают и отбирают такие варианты, такие, как случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, массированный мутагенез, перестановка в ДНК или in vivo эволюция, может использоваться.

Изобретение также характеризуется применением полностью искусственного фермента, полученного путем конструирования и продуцирования синтетического гена, кодирующего полностью новый фермент, с целью превращения 3-гидроксиалканоата в терминальный алкен при использовании или без использования известных данных в отношении MDP декарбоксилазы для ее конструирования.

Другой объект в соответствии с изобретением представляет собой изолированный или очищенный фермент, обладающий декарбоксилазной активностью и включающий всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6.

Другой объект изобретения относится к применению фермента, обладающего декарбоксилазной активностью и включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего гомологией последовательности такой, как описано выше, для получения терминального алкена. В одном варианте последовательность может дополнительно включать добавочные остатки, такие, как например гистидиновая метка на N-терминальном конце.

Другой объект изобретения относится к способу получения фермента, обладающего декарбоксилазной активностью и включающего всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермента, обладающего гомологией последовательности, такой, как описывается выше, при этом способ включает культивирование микроорганизма, включающего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную последовательность в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию указанной последовательности. В этом контексте настоящее изобретение описывает, в дополнение к нативной нуклеиновой кислоте (SEQ ID NO: 19), нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, которая является оптимизированной для экспрессии фермента SEQ ID NO: 6 в бактерии, в частности, в E.coli (SEQ ID NO: 17). Эта нуклеиновая кислота и любая нуклеиновая кислота (то есть та, которая позволяет достигать, по крайней мере, 30% улучшения экспрессии по сравнению с последовательностью дикого типа) представляют собой объекты настоящей заявки.

Другой объект изобретения относится к микроорганизму, включающему рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, обладающий декарбоксилазной активностью и включающий всю или часть последовательности SEQ ID NO: 6, или фермент, обладающий гомологией последовательности, такой, как описано выше. Микроорганизм предпочтительно представляет собой бактерию, дрожжи или грибки. Изобретение также относится к любому растению или животному, отличному от человека, включающему рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую декарбоксилазу в соответствии с изобретением.

В одном воплощении MDP декарбоксилаза используется в очищенной форме для превращения 3-гидроксиалканоатов в терминальные алкены. Однако этот способ является дорогим, поскольку затраты на получение и очистку фермента и субстрата являются высокими.

В другом воплощении MDP декарбоксилаза является присутствующей в реакции в виде неочищенного экстракта или также в форме не подвергшейся лизису бактерии, так, что является возможным снизить затраты на очистку белка. Однако затраты, ассоциированные с этим способом, все же остаются высокими по причине затрат на получение и очистку субстратов.

В другом воплощении изобретения способ использует живой микроорганизм, продуцирующий фермент, с помощью которого осуществляют превращение. Изобретение, таким образом, характеризуется генетически сконструированной модификацией бактериального штамма, продуцирующего один или более 3-гидроксиалканоатов [например, Alcaligenes eutrophus или Bacillus megaterium, или также штамма Е.coli, модифицированного в лаборатории для продукции указанного(ых) продукта(ов)], так, что указанный бактериальный штамм сверхэкспрессирует декарбоксилазу, при этом указанный фермент предпочтительно имеет происхождение от организма, отличного от хозяйского микроорганизма, и может непосредственно генерировать один или более терминальных алкенов. Генетическая модификация может состоять в интеграции гена декарбоксилазы в хромосому, экспрессии фермента на плазмиде, содержащей промотор, расположенный выше последовательности, кодирующей фермент, при этом промотор и кодирующая последовательность предпочтительно имеют происхождение от различных организмов, или в любом другом способе, известном специалисту в данной области техники. Альтернативно, другие бактерии или дрожжи могут иметь специфическое преимущество и могут также быть выбраны. Например, дрожжи, такие, как Saccharomyces cerevisiae, экстремофильные бактерии, такие, как Thermus thermophilus, или анаэробные бактерии из семейства Clostridiae, например, могут использоваться микроводоросли или фотосинтетические бактерии. Таким образом, для оптимизации продукции 3-гидроксиалканоата(ов), которые потом будут подвергаться превращению до терминальных алкенов, штаммы могут быть также модифицированы с помощью генетической инженерии, то есть путем in vitro рекомбинации с помощью непосредственной in vivo эволюции.

В одном воплощении способ в соответствии с изобретением характеризуется превращением источника углерода, такого как глюкоза, до 3-гидроксиалканоата, после чего осуществляют превращение указанного первичного продукта во вторичный продукт, иными словами, в терминальный алкен. Различные этапы указанного способа являются приведенными на Фигуре 6.

В особом воплощении изобретение характеризуется превращением полигидроксиалканоатов в 3-гидроксиалканоат при использовании фермента или приемлемого физико-химического способа, после чего осуществляют превращение указанного первичного продукта во вторичный продукт, иными словами, терминальный алкен. Необязательно, полигидроксиалканоат получали с помощью растения, пути метаболизма которого являются модифицированными так, что они обеспечивают высокую продукцию полигидроксиалканоата.

В особом воплощении изобретение заключается в интегральном способе для получения продуктов из атмосферного CO₂ или из CO₂, который искусственно прибавляется к культуральной среде. Способ в соответствии с изобретением применяется в организме, способном осуществлять фотосинтез, таком, как, например, микроводоросли.

В этих воплощениях способ в соответствии с изобретением дополнительно характеризуется способом восстановления продуктов, которые удаляются из культуры. В действительности, короткие терминальные алкены, и в частности, изомеры этилена, пропилена, бутена, приобретают газообразное состояние при комнатной температуре и атмосферном давлении. Способ в соответствии с изобретением, таким образом, не требует экстракции продукта из жидкой культуральной среды, этапа, который всегда является весьма дорогостоящим при осуществлении изобретения в промышленном масштабе. Откачивание и хранение газообразных углеводородов и их возможное физическое отделение и химическое превращение может осуществляться в соответствии с любым способом, известным специалисту в данной области техники.

В особом воплощении изобретение также включает определение алкена (в частности, пропилена, этилена и изобутилена), присутствующего в газовой фазе способа. Присутствие целевых соединений в воздухе или других газах, даже в небольших количествах, может определяться при использовании различных методик и, в частности, при использовании систем газовой хроматографии с инфракрасным определением или определения на основе ионизации в пламени, или путем сочетания с масс-спектрометрией.

В особом воплощении полученные терминальные алкены конденсируются, потом необязательно восстанавливаются при использовании методик, известных специалисту в данной области техники, для того, чтобы получить более длинную цепь алкенов или более длинную цепь алканов. В частности, изобутилен может использоваться для синтеза изооктана: каталитические способы для успешного осуществления этой реакции уже подробно были описаны

В особом воплощении способ предусматривает культивирование микроорганизмов при стандартных условиях культивирования (30-37°С при 1 атм в ферментере, позволяющем осуществлять аэробный рост бактерий) или при нестандартных условиях (более высокая температура, для того, чтобы соответствовать условиям культивирования термофильного организма, например).

В особом воплощении эти микроорганизмы культивируют в микроаэрофильных условиях, при этом количество вводимого воздуха является ограничивающим для того, чтобы минимизировать концентрации остаточного кислорода в газообразных промышленных отходах, содержащих углеводороды на основе алкена.

Другие аспекты и преимущества изобретения будут описаны в следующих примерах, которые являются приведенными с целью иллюстрации, но не для ограничения.

Условные обозначения к чертежам

Фигура 1: фрагмент 3-гидроксипропионата.

Фигура 2: Декарбоксилирование мевалонатдифосфата с помощью MDP декарбоксилазы - генерическая активность.

Фигура 3: Примеры 3-гидроксиалканоатов.

Фигура 4: Применение MDP декарбоксилазы для получения терминальных алкенов.

Фигура 5: Кофакторы, которые могут использоваться в реакции для целей структурной комплементации в каталитическом сайте.

Фигура 6: Интегральный способ для получения алкена из глюкозы.

Фигура 7: Хроматограмма ферментативных реакций, которые осуществляются в условиях №1 Примера 4.

Фигура 8: SDS-ПАГЭ этапов сверхэкспрессии и очистки фермента последовательности SEQ ID NO: 6.

1. Маркеры

2. Культура до инкубации

3. Лизат

4. Фракция, не адсорбированная на колонке

5. Фракция промывки колонки

6. Очищенный фермент, MB 36,8 кДа

Фигура 9: GC/MS хроматографический анализ превращения HIV в IBN.

1 и 2: Негативные контроли, соответствующие фоновому шуму при отсутствии фермента.

3 и 4: Реакции в присутствии фермента SEQ ID NO: 6.

Фигура 10: Соотношение продукции IBN в присутствии и при отсутствии АТФ.

Фигура 11: Соотношение продукции IBN в присутствии и при отсутствии Mg²⁺.

Фигура 12: Ферментативная активность в соответствии с температурой. Соотношение: количество IBN, образовавшегося в присутствии фермента, против фона.

Фигура 13: Продукция IBN в соответствии с концентрацией HIV субстрата.

Фигура 14: Измерение оптимизированной реакции и сравнение с фоном. Измерение с помощью газовой хроматографии с определением на основе ионизации в пламени.

Фигура 15: Улучшенный уровень экспрессии путем оптимизации нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6.

Полоса М: маркеры молекулярного веса.

Полосы 1, 2, 3: нативная нуклеотидная последовательность

(1) Клеточный лизат, растворимая фракция, загруженная на колонку для очистки

(2) Фракция лизата, не удерживаемая колонкой для очистки

(3) Элюированная фракция: 10 мкг очищенного фермента

Полосы 4, 5, 6: Оптимизированная нуклеотидная последовательность

(4) Клеточный лизат, растворимая фракция, загруженная на колонку для очистки

(5) Фракция лизата, не удерживаемая колонкой для очистки

(6) Элюированная фракция: 10 мкг очищенного фермента

Примеры

Пример 1: Клонирование и экспрессия нескольких MDP декарбоксилаз.

Синтезировали ген, кодирующий MDP декарбоксилазу Saccharomyces cerevisiae, из перекрывающихся нуклеотидов и клонировали в рЕТ плазмиду (Novagen), которая позволяет осуществлять экспрессию в бактериях. Указанную плазмиду потом трансформировали путем электропорации в бактериальный штамм BL21 (Invitrogen). Бактерии высаживали штрихом на чашки Петри, содержащие ампициллин и инкубировали при 37°С. На следующий день случайным образом отбирали бактериальную колонию и использовали ее для инокуляции 50 мл среды LB, которая содержит ампициллин. Культуру инкубировали в течение 24 часов при встряхивании, после которого культуру центрифугировали и бактерии подвергали лизису путем обработки ультразвуком, и готовили экстракт общего белка. Аликвоту экстракта загружали в гель для проведения электрофореза вместе с белковым экстрактом, полученным из того же штамма, который не был трансформирован, и с маркерами молекулярного веса. Дорожка, соответствующая трансформированному штамму, содержала одну полоску молекулярного веса приблизительно 30 кДа, который соответствовал ожидаемому размеру белка, указанная полоска отсутствовала в дорожке, которая была загружена нетрансформированной бактерией.

Пример 2: Измерение активности белковых экстрактов в отношении 3-гидрокси-3-метилбутирата.

3-гидрокси-3-метилбутират (Sigma, ссылочный номер 55453 под названием β-гидроксиизовалериановая кислота) суспендировали при концентрации 10 г/л. Мевалонат дифосфат синтезировали из мевалонолактона и других реагентов (Sigma) с помощью традиционного способа и ресуспендировали при концентрации 10 г/л.

Готовили шесть хроматографических пробирок. К каждой пробирке прибавляли 50 мкл буфера, содержащего 50 мМ Бистрис/HCl 1 мМ дитиотреитола, 10 мМ MgCl₂ и 5 мМ АТФ.

Пробирки 1 и 4: прибавляли 5 мкл воды (без субстрата).

Пробирки 2 и 5: прибавляли 5 мкл препарата мевалонатдифосфата (позитивный контроль).

Пробирки 3 и 6: прибавляли 5 мкл препарата 3-гидрокси-3-метилбутирата (HIV).

Пробирки 1, 2 и 3: потом прибавляли 5 мкл воды (без фермента).

Пробирки 4, 5 и 6: прибавляли 5 мкл препарата фермента, описанного в Примере 1.

Пробирки закрывали крышками, которые завинчивали. Все пробирки инкубировали при 37°С в течение периода времени от 4 часов до 3 дней.

После инкубации использовали газовый шприц для сбора газа, присутствующего в каждой пробирке, и концентрацию CO₂ в образцах измеряли с помощью газовой хроматографии. Пробирка 5 имела очень высокую концентрацию CO₂, a CO₂ в очень низкой концентрации также определяли в пробирке 6, что свидетельствует о значительной активности препапарата фермента в отношении 3-гидрокси-3-метилбутирата.

Присутствие изобутилена в образце газа из пробирки 6 потом измеряли с помощью газовой хроматографии с инфракрасным определением или определением на основе ионизации в пламени.

Пример 3: Оптимизация условий реакции при использовании кофактора.

Осуществляли ту же реакцию, что описана для пробирки предыдущего примера, но в один из образцов прибавляли в качестве кофактора синтезированный этилдифосфат.

В этом примере использовали три пробирки. Первая содержала буфер, АТФ и экстракт фермента в количествах, описанных в предыдущем примере. Вторая пробирка содержала те же компоненты, но дополнительно содержала также 3-гидрокси-3-метилбутират в количествах, описанных в предыдущем примере. Третья пробирка содержала в дополнение к 3-гидрокси-3-метилбутирату 10 мкл 10 мг/л этилдифосфата.

Как и в предыдущем примере, образование изобутилена измеряли с помощью газовой хроматографии с инфракрасным определением или с определением на основе ионизации в пламени. Было обнаружено, что когда присутствует этилдифосфат то количество продуцируемого изобутилена с течением времени значительно повышалось.

Пример 4: Скрининг ферментной библиотеки.

Получали библиотеку из 63 генов, кодирующих ферменты из семейства MDP декарбоксилазы, и анализировали их активность на HIV в качестве субстрата.

Клонирование, бактериальные культуры и экспрессия белков.

Гены, кодирующие мевалонатдифосфат (MDP) декарбоксилазу семейства ЕС 4.1.1.33 клонировали в рЕТ 25b вектор (Novagen) в случае эукариотических генов и рЕТ 22b (Novagen) для генов прокариотического происхождения, с 6-гистидиновой меткой на N-терминальном конце непосредственно после инициации кодона метионина. Компетентные клетки Е.coli BL21(DE3) (Novagen) трансформировали с помощью этих векторов путем теплового шока. Клетки выращивали при встряхивании (160 об/мин) при 30°С в ТВ среде, содержащей 0,5 М сорбита, 5 мМ бетаина, 100 мкг/мл ампициллина, до достижения значения OD при 600 нм в интервале о приблизительно 0,8 до 1. Потом прибавляли изопропил-В-D-тиогалактопиранозид (IPTG) до заключительной концентрации 1 мМ и экспрессию белка измеряли при 20°С в течение ночи (приблизительно 16 часов). Клетки собирали с помощью центрифугирования при 4°С, 10000 об/мин в течение 20 минут и осадки замораживали при -80°С.

Лизис клеток

1,6 г размораживали на льду и ресуспендировали в 5 мл 50 мМ Na₂HPO₄ pH 8, содержащем 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT. Прибавляли двадцать микролитров лизоназы (Novagen). Клетки инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и потом вновь возвращали на лед на 20 минут. Лизис клеток завершали путем обработки ультразвуком 3×5 минут на ультразвуковой водяной бане при 0°С; образцы подвергали гомогенизации между сигналами. Потом осветляли бактериальные экстракты путем центрифугирования при 4°С, 10,000 об/мин в течение 20 мин.

Очистка и концентрирование белка (комплект PROTINO)

Осветленные бактериальные лизаты загружали на колонку PROTINO-1000 Ni-IDA (Macherey-Nagel), предусматривая адсорбцию белков, меченных 6-His меткой. Колонки промывали и ферменты, представляющие интерес, элюировали с помощью 4 мл 50 мМ Na₂HPO₄ pH 8, содержащего 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 250 мМ имидазола. Элюаты потом концентрировали в Amicon Ultra-4 10 кДа ячейках (Millipore) до получения заключительного объема 250 мкл. Белок подвергали количественной оценке по способу Бредфорда.

Ферментативные реакции

Желаемую ферментативную реакцию (превращение 3-гидрокси-3-метилбутирата или 3-гидроксиизовалерата, или также HIV) подвергали анализу в двух экспериментальных условиях, которые отличаются в отношении буфера и реакции pH.

Экспериментальные условия №1.

100 мМ цитрат

10 мМ MgCl₂

10 мМ АТФ

20 мМ KCl

200 мМ HIV

Заключительное значение pH доводили до 5,5

Экспериментальные условия №2.

100 мМ Трис-HCl рН 7,0

10 мМ MgCl₂

10 мМ АТФ

20 мМ KCl

200 мМ HIV

Заключительное значение pH доводили до 7,0

Прибавляли фермент к реакционной смеси. Поскольку выход белка варьирует, то количество прибавляемого фермента колебалось от 0,01 и 1 мг/мл в зависимости от образца. Контрольные реакции без фермента осуществляли параллельно.

1 мл реакционной смеси помещали в пробирки на 2 мл (Interchim) и закрывали с помощью тефлоновой/силикатной/тефлоновой пробки (Interchim). Реакционные смеси инкубировали без встряхивания при 37°С в течение 72 часов.

Анализ реакций

Газ, который присутствовал над реакционной смесью, собирали шприцом, оснащенным механизмом, препятствующим обратному оттоку. Образцы газа подвергали анализу с помощью газовой хроматографии (ГХ), совмещенной с масс-спектрометрией (МС). Прибор предварительно градуировали при использовании интервала концентраций изобутилена.

Колонка: ВРХ5 (SGE)

ГХ/МС: MSD 5973 (HP)

Для каждой хроматограммы получали три принципиальных пика, первый соответствовал воздуху, второй - воде, а третий - изобутилену. Из 63 полученных и проанализированных ферментов, идентифицировали 11 потенциальных кандидатов в первичном скрининге. Некоторые из этих кандидатов обозначены стрелками на Фигуре 7. Их характеристика представлена ниже, а их последовательности приведены в SEQ ID NO: 6-16 (His-метка не показана).

Кандидат 1: SEQ ID NO: 7

Genebank депозитный номер: CAI97800.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q1GAB2

Микроорганизмы: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (штамм АТСС 11842/DSM 20081)

Кандидат 2: SEQ ID NO: 8

Genebank депозитный номер: CAJ51653

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q18K00

Микроорганизмы: Haloquadratum walsbyi DSM 16790

Кандидат 3: SEQ ID NO: 9

Genebank депозитный номер: ABD99494.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q1WU41

Микроорганизмы: Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (штамм UCC118)

Кандидат 4: SEQ ID NO: 10

Genebank депозитный номер: ABJ57000.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q04EX2

Микроорганизмы: Oenococcus oeni (штамм BAA-331/PSU-1)

Кандидат 5: SEQ ID NO: 11

Genebank депозитный номер: ABJ67984.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q03FN8

Микроорганизмы: Pediococcus pentosaceus ATCC 25745

Кандидат 6: SEQ ID NO: 12

Genebank депозитный номер: ABV09606.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: A8AUU9

Микроорганизмы: Streptococcus gordonii (штамм Challis/ATCC 35105/CH1/DL1/V288)

Кандидат 7: SEQ ID NO: 13

Genebank депозитный номер: ABQ14154.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: A5EVP2

Микроорганизмы: Dichelobacter nodosus VCS1703A

Кандидат 8: SEQ ID NO: 14

Genebank депозитный номер: EDT95457.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: B2DRT0

Микроорганизмы: Streptococcus pneumoniae CDC0288-04

Кандидат 9: SEQ ID NO: 15

Genebank депозитный номер: ААТ86835

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q5XCM8

Микроорганизмы: Streptococcus pyogenes serotype М6 (ATCC BAA-946/MGAS10394)

Кандидат 10: SEQ ID NO: 6

Genebank депозитный номер: ААТ43941

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q6KZB1

Микроорганизмы: Picrophilus torridus DSM 9790

Кандидат 11: SEQ ID NO: 16

Genebank депозитный номер: AAV43007.1

Swissprot/TrEMBL депозитный номер: Q5FJW7

Микроорганизмы: Lactobacillus acidophilus NCFM

Наивысшие уровни продукции изобутилена (IBN) наблюдали при использовании кандидата 10, то есть с очищенным ферментом декарбоксилазой с последовательностью SEQ ID NO: 6 из Picrophilus torridus. Этот фермент оставляли для дополнительной характеристики.

Пример 5: Характеристика фермента последовательности SEQ ID NO: 6

Рекомбинантный фермент очищали так, как описано в Примере 4. Результаты, представленные на Фигуре 8, показывают, что чистота фермента в заключительном образце белка составляла приблизительно 90%.

Подтверждали активность изолированного фермента. Реакцию осуществляли в следующих условиях:

100 мМ Трис-HCl рН 7.0

10 мМ MgCl₂

10 мМ АТФ

20 мМ KCl

250 мМ HIV

Заключительное значение рН доводили до 6,0

3 мг/мл фермента

Спустя 72 часа инкубации при 30°С сигнал измеряли с помощью ГХ/МС. Результаты показаны на Фигуре 9. В присутствии фермента продукция IBN повышалась приблизительно в 2,3 раза по сравнению с фоновым шумом. Фоновый шум, который наблюдали в этом случае, находился в соответствии с литературой по органической химии, демонстрируя тот факт, что в водном растворе и при температуре приблизительно 100°С 3-гидроксиизовалериановая кислота медленно декарбоксилирует до трет-бутанола, который подвергается частичной дегидратации до изобутилена, в соответствии с равновесием, благоприятным для образования трет-бутанола (Pressman и Luca, J. Am. Chem. Soc. 1940).

Эффект АТФ косубстрат

Условия анализа

100 мМ цитрат

50 мМ KCl

10 мМ MgCl₂

200 мМ HIV (указанный)

1 мг/мл очищенного фермента

рН 5,5

Инкубация в течение 72 часов при 30°С

Условия Заключительная концентрация АТФ Фермент 1 0 мМ 0 мг/мл 2 0 мМ 1 мг/мл 3 10 мМ 0 мг/мл 4 10 мМ 1 мг/мл

Результаты, представленные на Фигуре 10, показывают, что активность фермента наблюдается только в присутствии косубстрата АТФ. Другие молекулы, и в частности, те, которые содержат фосфоангидридную связь, могут также быть эффективными косубстратами для фермента.

Эффект Mg²⁺ кофактора

Условия анализа

100 мМ цитрата рН 5,5

50 мМ KCl

10 мМ АТФ

200 мМ HIV (указанный)

рН 5,5

1 мг/мл очищенного фермента

Инкубация 72 часа при 30°С

Условия Заключительная концентрация MgCl₂ Фермент 1 0 мМ 0 мг/мл 2 0 мМ 1 мг/мл 3 5 мМ 0 мг/мл 4 5 мМ 1 мг/мл

Результаты, представленные на Фигуре 11, показывают, что активность фермента улучшается в присутствии ионов Mg²⁺. Другие ионы, и в частности, другие дивалентные ионы, могут использоваться в качестве кофактора вместо или в дополнение к ионам Mg²⁺.

Ферментативная активность в соответствии с температурой

Условия анализа

100 мМ буфер

50 мМ KCl

10 мМ АТФ

200 мМ HIV (указанный)

1 мг/мл очищенного фермента

Инкубация в течение 72 часов при разных температурах.

Результаты, представленные на Фигуре 12, показывают, что фермент является умеренно термоактивным с температурным оптимум, составляющим 50°С.

Активность в соответствии с рН

Условия анализа

100 мМ буфер

50 мМ KCl

10 мМ АТФ

200 мМ HIV (указанный)

1 мг/мл очищенного фермента

Инкубация в течение 72 часов при 30°С

Оптимальные условия получали с рН 5,5 в 100 мМ цитрата.

Параметры фермента

Разнообразные субстраты анализировали в описанных выше условиях в условиях инкубации при 50°С. Значение Km фермента составляло приблизительно 40 мМ HIV.

Оптимизация условий реакции

Условия оптимальной реакции были искомыми и сохраняли следующие условия:

100 мМ цитрата

50 мМ KCl

40 мМ АТФ

200 мМ HIV

1 мг/мл фермента

Инкубация в течение 48 часов при 50°С

Как показано на Фигуре 14, соотношение сигнала сверх фонового шума составляло приблизительно 100.

Пример 6: Оптимизация экспрессии декарбоксилазы MDP P.torridus в Е.coli.

Начальный уровень экспрессии E.coli BL21 был ниже, поскольку полоса является трудной для рассмотрения на SDS-ПАГЭ перед очисткой. Индекс оптимизации кодонов (CAI) нативной последовательности для экспрессии в E.coli измеряли с помощью программы "Optimizer", доступной на http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/, и основанной на способе Sharp и Li (1987). Полученный объем составлял только 0,23, отражая низкий уровень экспрессии белка в E.coli.

Получали последовательность, кодирующую идентичный белок, но содержащую лучшие кодоны, адаптированные для экспрессии в Е.coli. Эта последовательность имела значение CAI 0,77, что является более близким к оптимуму, составляющему 1.

Нативная последовательность и оптимизированая последовательность показаны в SEQ ID NO: 17 (оптимизированная последовательность Р.torridus (ААТ43941) MDP декарбоксилазы, включающая His метку) и SEQ ID NO: 19 (нативная последовательность Р.torridus (ААТ43941) MDP декарбоксилазы, включающая His метку).

Оптимизированную последовательность синтезировали с помощью последовательного связывания олигонуклеотидов и клонировали в экспрессионный вектор рЕТ25. После трансформации вектора в штамм E.coli BL21 (DE3) и идукции в соответствии с описанной выше прописью получали, очищали и анализировали белки на геле так, как описано ранее. В соответствии с той же прописью осуществляли обработку нативной последовательности с целью сравнения.

Сравнение уровня экспрессии кандидата 224 при использовании либо нативной нуклеотидной последовательности, либо последовательности, оптимизированной для экспрессии в Е.coli.

Результаты, представленные на Фигуре 15, показывают, что белок, соответствующий оптимизированному гену, был четко виден на геле в неочищенном клеточном лизате (полоса 4), что указывает на весьма значительное повышение экспрессии. Уровень чистоты белка после этапа очистки был также выше в случае оптимизированного гена.

Активность измеряли в сырьевом лизате. Никакой активности не определяли в сырьевом лизате, соответствующем нативной последовательности нуклеиновой кислоты. Экспрессия белка повышалась так, что сырьевой лизат, полученный при использовании улучшенной последовательности (оптимизированный клон 224), в данном случае продемонстрировал эту активность.

В анализе использовали следующую реакционную среду:

Реакционная среда

Продукты Заключительная концентрация Ацетатный реакционный буфер (500 мМ, рН 5,5) 50 мМ MgCl₂ (1 M) 10 мМ KCl (1 M) 20 мМ HIV (3 M) 50 мМ АТФ (100 мМ) 40 мМ Ингибитор протеазы (100Х) 1Х H₂O   Фермент 89 мкг общего белка (сырьевой лизат)

Инкубация в течение 2 дней при 50°С.

Результаты

Условия №1: лизат оптимизированного клона 224

Условия №. 2: лизат клона GB6 (пустая рЕТ плазмида)

Условия Площадь поверхности сигнала Соотношение 1 1083 22 2 49

Пример 7: Способ синтеза изобутилена из 3-гидрокси-3-метилбутирата и превращение до изооктана.

Реакцию, идентичную той, что описана для пробирки 3 в Примере 3, осуществляли в объеме 1 литр, в ферментере, оснащенном системой для экстракции газа. Присутствие рекомбинантного фермента индуцировало превращение 3-гидрокси-3-метилбутирата до изобутилена, который удаляется естественным путем, и который восстанавливается с помощью системы для экстракциим газа, которая размещается в нижней части ферментера. Изобутилен потом использовали для получения изооктена путем добавления катализированной Amberlyst 35wet или 36wet смолы (Rohm и Haas). Изооктен восстанавливали вслед за изооктаном с помощью каталитической гидрогенизации.

Пример 8: Сконструированный фермент для улучшения эффективности для субстратов.

Методику случайного мутагенеза использовали для создания библиотеки, содержащей тысячи мутантов гена, описанного в Примере 1. Эту библиотеку мутантов потом клонировали в экспрессионную плазмиду и трансформировали в компетентный бактериальный штамм BL21.

Потом изолировали тысячу бактерий и инокулировали их в пробирки Эппендорфа, содержащие 500 мкл среды LB, дополненной ампициллином. Образцы инкубировали в устройстве для встряхивания в течение 15 часов. На следующий день определяли количество полученного изобутилена при использовании одной или другой экспериментальной прописи, описанной в предыдущих примерах.

Клоны с существенно повышенным количеством изобутилена потом перепроверяли при использовании той же экспериментальной прописи. Как только такое улучшение было подтверждено, экстрагировали и секвенировали плазмиду из каждого улучшенного клона. Идентифицировали мутации, ответственные за улучшенную активность и объединяли в одной плазмиде. Плазмиду, которая содержала различные улучшающие мутации, в свою очередь трансформировали в компетентные бактерии и осуществляли тот же анализ.

Клон, содержащий объединенные мутации и обладающий значительно большей активностью, чем таковой, содержащий только одну улучшающую мутацию, потом использовали в качестве основы для осуществления нового цикла мутации/скрининга, для идентификации мутантов с дополнительно улучшенной активностью.

По завершению этой прописи отбирали клон, содержащий несколько мутаций и обладающий наилучшей активностью.

Пример 9: Способ синтеза этилена из 3-гидроксипропионата.

Ген, кодирующий фермент, описанный в Примере 1, встраивали в плазмиду, что давало возможность осуществлять экспрессию рекомбинантных белков в штамме Е.coli. Плазмиду трансформировали в бактерии указанного штамма. Трансформированные бактерии потом инкубировали в ферментере в присутствии пропилдифосфата (10 мг/л) и 3-гидроксипропионата (1 г/л). Присутствие рекомбинантного фермента приводило к превращению 3-гидроксипропионата в этилен, который спонтанно выделялся, и который потом извлекали при использовании системы для экстракции газа, которая размещается в верхней части ферментера. Потом измеряли этилен в образце газа с помощью газовой хроматографии с инфракрасным определением в той части спектра, в которой этилен имеет сильное излучение.

Пример 10: Способ синтеза пропилена из 3-гидроксибутирата.

Ген, кодирующий фермент, описанный в Примере 1, или фермент, описанный в Примере 4, встраивали в плазмиду, что давало возможность осуществлять экспрессию рекомбинантных белков в штамме E.coli. Плазмиду трансформировали в бактерии указанного штамма. Трансформированные бактерии потом инкубировали в ферментере в присутствии этилдифосфата (10 мг/л) и 3-гидроксибутирата (1 г/л) (Sigma, ссылочный номер 166898). Присутствие рекомбинантного фермента приводило к превращению 3-гидроксибутирата в пропилен, который спонтанно выделялся и который потом извлекали при использовании системы для экстракции газа, которая размещается в верхней части ферментера. Потом измеряли пропилен в образце газа с помощью газовой хроматографии с инфракрасным определением в той части спектра, в которой пропилен имеет сильное излучение.

Пример 11: Способ синтеза пропилена из глюкозы.

Ген, кодирующий фермент, описанный в Примере 1, или фермент, описанный в Примере 4, встраивали в плазмиду, что давало возможность осуществлять экспрессию рекомбинантных белков в бактерии Alcaligenes eutrophus. Плазмиду трансформировали в бактерии указанного штамма. Трансформированные бактерии потом инкубировали в ферментере в присутствии глюкозы и этилдифосфата, а также в микроаэрофильных условиях, потом подвергали тепловому шоку, который индуцировал их к продукции больших количеств 3-гидроксибутирата. Присутствие рекомбинантного фермента приводило к одновременному превращению 3-гидроксибутирата в пропилен, который спонтанно выделялся и который потом извлекали при использовании системы для экстракции газа, которая размещается в верхней части ферментера.

Пример 12: Способ синтеза пропилена из глюкозы.

Этот пример описывает способ, который является весьма подобным тому, что описан в Примере 11. Основное отличие состоит в применении штамма E.coli, модифицированного так, чтобы продуцировать 3-гидроксибутират, вместо природного штамма, подобного Alcaligenes eutrophus. Указанный штамм получали путем конструирования метаболических путей так, чтобы привести к аккумуляции 3-гидроксибутирата. Добавление MDP декарбоксилазы такой, как описано в Примере 1 или в Примере 4, позволяет осуществлять превращение 3-гидроксибутирата в пропилен.

Пример 13: Способ синтеза изобутилена из глюкозы.

Ген, кодирующий фермент, описанный в Примере 1, встраивали в плазмиду, позволяющую осуществлять экспрессию рекомбинантных белков в штаммах Е.coli, которые также были подвергнуты метаболическим модификациям для того, чтобы они могли эндогенно синтезировать 3-гидрокси-3-метилбутират.

Бактерии потом инкубировали в ферментере в присутствии глюкозы, а также в микроаэрофильных условиях. Присутствие рекомбинантного фермента индуцировало одновременное превращение 3-гидрокси-3-метилбутирата в изобутилен, который естественно выделял газ, и который потом извлекали при использовании системы для экстракции газа, которая размещается в верхней части ферментера.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения терминального алкена, в конкретном варианте - изобутелена, применение мевалонатдифосфат декарбоксилазы и микроорганизма, продуцирующего мевалонатдифосфат декарбоксилазу, для получения терминального алкена, а также композиция для получения терминального алкена. Способ включает превращение 3-гидроксиалканоата формулы

с помощью мевалонатдифосфат декарбоксилазы в присутствии АТФ, рНТФ, дНТФ или смеси нескольких таких молекул, полифосфата или пирофосфата в терминальный алкен. R¹ и R² независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из атома водорода и линейной или разветвленной алкильной группы, включающей 1-4 атома углерода. Для получения изобутилена осуществляют превращение 3-гидрокси-3-метилбутирата с помощью мевалонатдифосфат декарбоксилазы, включающей последовательность SEQ ID NO:6, или последовательность, обладающую по крайней мере 15%, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией последовательности. Композиция для получения терминального алкена включает микроорганизм, продуцирующий мевалонатдифосфат декарбоксилазу, культуральную среду с источником углерода и 3-гидроксиалканоатом. Изобретения обеспечивают новый путь синтеза терминального алкена на основе ферментативного превращения 3-гидроксиалканоатов, что позволяет устранить применение нефтепродуктов и снизить затраты на получение пластиков и топлива. 5 н. и 20 з.п. ф-лы, 15 ил., 13 пр.

1. Способ получения терминального алкена, характеризующийся тем, что он включает этап превращения 3-гидроксиалканоата с помощью фермента, обладающего активностью мевалонатдифосфат декарбоксилазы, где 3-гидроксиалканоат представляет собой соединение формулы

где R¹ и R² независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из атома водорода и линейной или разветвленной алкильной группы, включающей 1-4 атома углерода, причем указанное превращение происходит в присутствии косубстрата, а указанный косубстрат представляет собой АТФ, рНТФ, дНТФ или смесь нескольких таких молекул, полифосфат или пирофосфат.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что по крайней мере один из двух заместителей при углероде в положении 2 алкена представляет собой линейную или разветвленную алкильную группу.

3. Способ по п.1, в котором алкильная группа включает 1-3 атома углерода.

4. Способ п.1 или 2, включающий этап превращения 3-гидроксибутирата в пропилен.

5. Способ по п.1 или 2, включающий этап превращения 3-гидроксивалерата в 1-бутилен.

6. Способ по п.1 или 2, включающий этап превращения 3-гидрокси-3-метилбутирата в изобутилен.

7. Способ по п.1 или п.2, включающий этап превращения 3-гидрокси-3-метилвалерата в изоамилен.

8. Способ по п.1 или 2, в котором мевалонатдифосфат декарбоксилаза содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-16, или последовательность, обладающую по крайней мере 15% гомологией последовательности с одной из этих последовательностей, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией.

9. Способ по п.1 или 2, характеризующийся тем, что мевалонатдифосфат декарбоксилаза содержит всю или часть последовательности SEQ ID NO:6, или последовательность, обладающую по крайней мере 15% гомологией последовательности, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией.

10. Способ по п.1 или 2, в котором фермент представляет собой декарбоксилазу, обладающую повышенной активностью превращения одного или более 3-гидроксиалканоатов в терминальный алкен.

11. Способ получения изобутилена, характеризующийся тем, что он включает этап превращения 3-гидрокси-3-метилбутирата с помощью мевалонатдифосфат декарбоксилазы, предпочтительно мевалонатдифосфат декарбоксилазы, включающей всю или часть последовательности SEQ ID NO:6, или последовательность, обладающую по крайней мере 15% гомологией последовательности, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией, причем указанное превращение происходит в присутствии косубстрата, а указанный косубстрат представляет собой АТФ, рНТФ, дНТФ или смесь нескольких таких молекул, полифосфат или пирофосфат.

12. Способ по п.1 или п.11, в соответствии с которым к реакционной смеси прибавляют кофактор общей формулы R-O-PO₂H-O-PO₃H₂, в которой R представляет собой атом водорода, группу метила, этила или пропила, и может также быть линейной, разветвленной или циклической алкильной группой.

13. Способ по п.1 или 11, в соответствии с которым к реакционной смеси прибавляют кофактор общей формулы R-O-PO₂H-CH₂-PO₃H₂, в которой R предпочтительно представляет собой атом водорода, группу метила, этила или пропила, и может также быть линейной, разветвленной или циклической алкильной группой, или любой другой моновалентной органической группой.

14. Способ по п.1 или 11, характеризующийся тем, что этап превращения осуществляют in vitro в бесклеточной системе.

15. Способ по п.1 или 11, характеризующийся тем, что этап превращения осуществляют в присутствии микроорганизма, продуцирующего указанную декарбоксилазу, предпочтительно в присутствии микроорганизма, сверхэкспрессирующего указанную декарбоксилазу, природную или модифицированную.

16. Способ по п.15, где микроорганизм представляет собой бактерию Alcaligenes eutrophus или Bacillus megaterium, или бактерию, дрожжи или грибы, которые являются рекомбинантными, предпочтительно посредством хромосомной модификации или трансформации с помощью плазмиды так, чтобы сверхпродуцировать один или более 3-гидроксиалканоатов.

17. Способ по п.16, где культуральная среда для микроорганизма содержит источник углерода, который представляет собой глюкозу или любую другую гексозу, ксилозу или любую другую пентозу, глицерин или любой другой полиол, или также крахмал, целлюлозу, гемицеллюлозу, поли-3-гидроксиалканоат или любой другой полимер, при этом способ осуществляют в присутствии системы для деградации указанного полимера до мономера, такой как, например, приемлемый фермент амилаза, гемицеллюлаза, целлюлаза, поли-3-гидроксиалканоаза и/или специфических химических условий.

18. Способ по п.1 или 2, характеризующийся применением первого микроорганизма, позволяющего осуществлять превращение источника углерода в 3-гидроксиалканоат, и декарбоксилазы, изолированной или экспрессируемой вторым микроорганизмом, позволяющим осуществлять превращение 3-гидроксиалканоата в терминальный алкен.

19. Способ по п.1 или 11, включающий этап сбора газа терминальных алкенов, которые выделяются из реакционной смеси.

20. Способ по п.1 или 11, характеризующийся тем, что способ осуществляют в микроаэрофильных условиях.

21. Применение мевалонатдифосфат декарбоксилазы для получения соединений терминального алкена из 3-гидроксиалканоатов.

22. Применение мевалонатдифосфат декарбоксилазы по п.21, характеризующийся тем, что мевалонатдифосфат декарбоксилаза включает всю или часть последовательности SEQ ID NO:6 или последовательность, обладающую по крайней мере 15% гомологией последовательности, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией.

23. Применение микроорганизма, продуцирующего мевалонатдифосфат декарбоксилазу, для получения соединений терминального алкена из 3-гидроксиалканоатов.

24. Применение микроорганизма, продуцирующего мевалонатдифосфат декарбоксилазу по п.23, характеризующееся тем, что мевалонатдифосфат декарбоксилаза включает всю или часть последовательности SEQ ID NO:6 или последовательность, обладающую, по крайней мере, 15% гомологией последовательности, и предпочтительно 50, 80 или 90% гомологией.

25. Композиция для получения терминального алкена, включающая микроорганизм, продуцирующий мевалонатдифосфат декарбоксилазу, культуральную среду с источником углерода и соединение 3-гидроксиалканоата.