СПОСОБ ОЦЕНКИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СТАТУСА ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для оценки качества тромбоцитов и эффективности их применения в клинической практике при лечении больных с неотложными состояниями.

Тромбоциты предупреждают и прекращают кровотечения и кровоточивость, связанные с их недостатком в циркулирующей крови (тромбоцитопения) или с их функциональной неполноценностью (тромбоцитопатия). Определены показания к переливанию концентрата тромбоцитов (КТ): спонтанная мелкоточечная кровоточивость или локальные кровотечения при уровне тромбоцитов менее 20·10⁹/л, обусловленном депрессией кроветворения; гипокоагуляционная фаза ДВС синдрома; острая массивная кровопотеря, сопровождающаяся снижением уровня тромбоцитов менее 100·10⁹/л [Инструкция по применению компонентов крови, утверждена приказом Минздрава РФ №363 от 25.11.2002]. Биологическая полноценность и функциональная активность клеток, используемых в клинической практике, определяют проведение обоснованной компенсации нарушений в системе клеточного гомеостаза и лечебную эффективность [Приложение 1 к «ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГЛАМЕНТУ О ТРЕБОВАНИЯХ БЕЗОПАСНОСТИ КРОВИ, ЕЕ ПРОДУКТОВ, КРОВЕЗАМЕЩАЮЩИХ РАСТВОРОВ И ТЕХНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТРАНСФУЗИОННО-ИНФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ», постановление правительства РФ №29 от 26.01.2010 года, таблица 1]. Анализ показывает, что в представленных показателях нет данных, регламентирующих биологическую полноценность и функциональную активность тромбоцитов. Следовательно, требуется разработка и внедрение адекватной оценки функциональной активности тромбоцитов, используемых в клинической практике.

Таблица 1 Перечень показателей биологической полноценности, функциональной активности и лечебной эффективности донорской крови и ее компонентов (приведены только тромбоциты) Показатель Приемлемые характеристики Тромбоциты, восстановленные из дозы крови [тромбоцитный концентрат из дозы крови] Объем Не менее 40 мл Тромбоциты* Не менее 60×10⁹ / эквивалент одной дозы крови Лейкоциты* - до удаления лейкоцитов   а. из обогащенной тромбоцитами плазмы Не более 0,2×10⁹ / эквивалент одной дозы крови б. из лейкотромбослоя Не более 0,05×10⁹ / эквивалент одной дозы крови Лейкоциты**
- после удаления лейкоцитов Не более 0,2×10⁶ / эквивалент одной дозы крови рН*** (при +22°С) в конце рекомендованного срока хранения от 6,4 до 7,4 * - должны соответствовать не менее 75% обследованных доз
** - должны соответствовать не менее 90% обследованных доз
*** - измерение рН предпочтительно проводить в закрытой системе во избежание выхода СО₂; измерение может быть выполнено при любой температуре, и значение расчетным методом конвертировано применительно к рН +22°С; другие пределы рН могут применяться, если при конкретном методе приготовления и хранения тромбоцитов будет приемлемый прирост тромбоцитов in vivo; если срок хранения тромбоцитов не превышает трех суток - измерение рН может не проводиться Тромбоциты, полученные методом афереза [тромбоцитный концентрат, полученный методом афреза] Объем Не менее 40 мл на 60×10⁹ тромбоцитов Тромбоциты* Не менее 200×10⁹ / доза Лейкоциты* - после удаления лейкоцитов Не более 1,0×10⁶ / доза рН** (при +22°С) в конце рекомендованного срока хранения от 6,4 до 7,4 * - должны соответствовать не менее 90% обследованных доз
** - измерение рН предпочтительно проводить в закрытой системе во избежание выхода СО₂; измерение может быть выполнено при любой температуре, и значение расчетным методом конвертировано применительно к рН +22°С; другие пределы рН могут применяться, если при конкретном методе приготовления и хранения тромбоцитов будет приемлемый прирост тромбоцитов in vivo; если срок хранения тромбоцитов не превышает трех суток - измерение рН может не проводиться Криоконсервированные тромбоциты, полученные методом афереза Объем От 50 до 200 мл Количество тромбоцитов Не менее 40% от содержания до замораживания Остаточные лейкоциты Не более 0,2×10⁶ на 60×10⁹ тромбоцитов

Тромбоцит рассматривают как клетку с полифункциональной активностью - коагулологическая, ангиотрофическая и эндотелиальноподдерживающая, транспортная, рост стимулирующая функции, участие в воспалении, репарации и регенерации [Мининкова А.И. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). I ЧАСТЬ; ИССЛЕДОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ДИТОФЛЮОРИМЕТРИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). II ЧАСТЬ. Клиническая лабораторная диагностика, 2010, №11, с.21-26; 2011, №4, с.25-30; Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб. ГМУ, 2000, 227 с.; Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М.-Тверь, «Триада», 2005, 227 с.]. Морфологически в тромбоцитах выделяют четыре зоны: 1-я - надмембранный слой (гликокаликс); 2-я - мембрана, 3-я зона - матрикс или гель-зона: 4-я - зона органелл, содержащая в высоких концентрациях гранулы с биологически активными веществами, синтезируемые и выделяемые тромбоцитами (таблица 2).

Таблица 2 Химический состав содержимого гранул тромбоцитов Вещество Биологическое действие Фракция плотных гранул Серотонин Увеличивает проницаемость сосудов АДФ Вызывает агрегацию тромбоцитов; АТФ Активирует нейтрофилы; увеличивает адгезию нейтрофилов; при разрушении образуется аденозин (ингибитор нейтрофилов) Гистамин Повышает проницаемость сосудов Фракция α-гранул Фибриноген Агрегирует тромбоциты; фактор свертывания Фактор V α Фактор свертывания Катионные белки Антибактериальное действие Фактор VII Фактор свертывания Фактор 4 Хемоаттрактант нейтрофилов Фактор роста Индуцирует пролиферацию фибробластов и гладких мышц сосудов Тромбоспондин Молекула адгезии тромбоцитов и моноцитов Гликопротеины 11b Молекула адгезии тромбоцитов к субэндотелию Гликопротеин 1b Рецептор фактора Виллебранда ТФР-β Индуцирует пролиферацию сосудов β-лизины Антибактериальное действие Фракция лизосом и пузырьков Протеазы (нейтральные) Расщепляют С 5 до С 5 α Катепсин А, коллагеназа, эластаза, галактозилтрансфераза Переваривание бесклеточного матрикса Продукты, образуемые de novo 12-гидроэйкозатетраеноевая кислота Повышает продукцию ПГЕ2 эндотелиальными клетками; стимулирует респираторный взрыв нейтрофилов ФАТ Хемотаксический фактор для нейтрофилов; стимулирует респираторный взрыв; агрегирует нейтрофилы и тромбоциты; увеличивает проницаемость сосудов Тромбоксан А2 Агрегирует тромбоциты, увеличивает адгезию нейтрофилов Реактивные продукты кислорода Антимикробное, антипаразитарное действие

Следовательно, морфологическое исследование фракции плотных гранул, фракции α-гранул, фракции лизосом и пузырьков тромбоцитов человека позволяет адекватно оценить их морфофункциональный статус. Значимость такого подхода эффективна при диагностике различных типов тромбоцитопатий [Amy D. Shapiro Platelet Function Disorders. Treatment of Hemophilia Monograph Series, Number 19. World Federation of Hemophilia: 1999]. Таким образом, исследование гранул тромбоцитов может служить интегральным параметром оценки их функции.

Исследование морфологии тромбоцитов с помощью электронной и атомно-силовой микроскопии имеет ряд существенных недостатков: высокая стоимость оборудования, трудоемкость и длительность подготовки и фиксация образцов препятствуют активному использованию метода в целях клинической диагностики [Донников М.Ю., Орлов С.А., Зиновьева А.В. КАЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ ПО ДАННЫМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ. Клиническая лабораторная диагностика, 2009, №8, с.30-32].

Прототип - оценка функциональной полноценности концентрата живых тромбоцитов с помощью метода витальной компьютерной морфометрии на основе отечественного фазово-интерференционного микроскопа «Цитоскан». Из локтевой вены осуществляют забор крови в объеме 1,0 мл в стандартную пробирку из ареактивного пластика с антикоагулянтом (ЭДТА). Исследуют тромбоциты в капле плазмы, обогащенной тромбоцитами, для получения которой кровь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Алгоритм морфометрии обеспечивает автоматическое определение заданных размерных параметров отдельных клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем), подсчет процента активированных тромбоцитов, статистическую обработку данных на популяционном уровне и документирование результатов в виде цитограмм. Уровень функциональной активности тромбоцитов определяли на основании подсчета различных морфологических типов. Подавляющее большинство тромбоцитов представлено плоскими, округлыми клетками с гладкой или складчатой поверхностью - «гладкие» и «рифленые» дискоциты, идентифицируемые как клетки «покоя» (1-й морфологический тип). Ко 2-му типу тромбоцитов были отнесены дискоидные клетки округлой, неправильной формы с гладкой или складчатой поверхностью и одним-тремя короткими (меньше диаметра клетки) отростками-псевдоподиями, являющимися выростами поверхностной мембраны - тромбоциты с низким уровнем активности. Клетки, имеющие от двух до пяти длинных (больше диаметра клетки) отростков-«антенн», отнесены к 3-му типу и отличались большим многообразием форм: от плоских дисков до неправильной причудливой формы - высокоактивированные тромбоциты. Тромбоциты неправильной формы с неровной бугристой поверхностью, большим количеством отростков различной длины и многочисленными вакуолями были отнесены к 4-му морфологическому типу - дегенеративно-измененным клеткам, практически исчерпавшим свой функциональный резерв. Распределение морфологических типов клеток в концентрате тромбоцитов (КТ) оказалось 56,7%; 26,2%; 14,1%; 3,0%. В крови соматически здоровых людей соотношение морфологических типов клеток составляет - 64, 21, 12 и 3% соответственно. Метод позволяет исследовать живые нативные тромбоциты, не подвергавшихся предварительной обработке или фиксации [прототип - Колосова Е.Н., Василенко И.А., Ковалева Л.Г. Оценка морфофункционального состояния тромбоцитов у больных идиопатической тромбоцитопеничской пурпурой методом витальной компьютерной морфометрии. Бюллетень СО РАМН, 2011, 31, №2, с.58-63]. Недостатками данного метода являются: необходимость получения плазмы, богатой тромбоцитами; предлагаемый алгоритм морфометрии клеток (диаметр, периметр, высота, площадь, объем) не позволяет оценить целостность внутреннего состава исследуемых тромбоцитов; отсутствие адекватного анализа высокой и низкой функциональной активностью среди дисковидных тромбоцитов; использование дорогостоящей уникальной микроскопической аппаратуры. Итак, предлагаемый биофизический метод не отражает структурно-функциональную целостность тромбоцитов. Следовательно, для оценки клетки как единого целого необходимо использовать методы, витального окрашивания тромбоцитов, позволяющие оценить функциональную активность живых клеток [Pollard M.D., Earnshaw W.C. Cell Biology // - Elsivier Science, 2007, 928 с.].

Достигаемым техническим результатом является объективная оценка морфофункционального статуса тромбоцитов человека за счет учета данных, полученных путем исследования витально окрашенных клеток во флуоресцентном микроскопе.

Значительную часть цитоплазмы тромбоцита составляют везикулы (гранулы) с различными секреторными веществами [Хэм А., Кормак Д. Гистология / Пер. с англ. // М.: Мир, 1983]. При различных заболеваниях увеличивается доля тромбоцитов, не содержащих гранул: такие клетки обладают сниженной функциональной активностью или являются дегенеративными [Walker HK, Hall WD, Hurst JW Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3rd edition. // Boston: Butter-worth's; 1990]. Следовательно, наличие в тромбоците гранул, а также их количество можно рассматривать в качестве критериев жизнеспособности и функциональной активности клеток. Известно, что часть тромбоцитарных гранул обладает сродством к акридиновым красителям - в частности, к акридиновому оранжевому. Флуорохром акридиновый оранжевый (АО) широко используется в клеточной биологии, в том числе и для прижизненных исследований. Другой акридиновый краситель - трипафлавин - обладает способностью прижизненно окрашивать мембранные компоненты клеток, т.е. с помощью этого флуорохрома возможно окрасить цитоплазму нефиксированных тромбоцитов. Таким образом, имеются весомые основания полагать, что прижизненный краситель на основе этих флуорохромов (трипафлавина и АО) позволит выявить цитоплазму нефиксированных тромбоцитов и гранулы в их составе. Для дифференциального прижизненного окрашивания тромбоцитов нами предложен краситель, изготовленный на основе 2-х флуорохромов - трипафлавина и акридинового оранжевого. В нефиксированных тромбоцитах после окрашивания отчетливо выявляются гранулы, имеющие характерное красное свечение во флуоресцентном микроскопе, при этом контуры тромбоцитов четко различимы.

Изготовление красителя. Смесь трипафлавина и акридинового оранжевого готовят на 0,15 М фосфатном буфере Зеренсена (рН 7.3). Для получения 100 мл 0,15 М этого буфера смешивают 23 мл 0,15 М NaH₂PO₄·Н₂О (18,38 г в 1000 мл диет H₂O) и 77 мл 0.15 М Na₂HPO₄ (18.92 г в 1000 мл дист. Н₂О).

Приготовление красителя состоит из двух этапов. На первом этапе готовят концентрированные растворы трипафлавина (раствор А) и акридинового оранжевого (Раствор Б): Раствор А - трипафлавин разводят 0.15 М буфером Зеренсена в соотношении 1:2000-1:5000. Необходимо добиться полного растворения кристаллов трипафлавина. Раствор Б - акридиновый оранжевый разводят 0.15 М буфером Зеренсена в соотношении 1:1500-5000. Затем оба красителя смешивают в соотношении 1:1, получают рабочий раствор. Прижизненную окраску тромбоцитов можно производить как в пробирке, так и на предметном стекле. Тромбоциты крови, плазма обогащенная тромбоцитами, тромбоконцентрат заготавливали на соответствующем антикоагулянте. Соотношение крови и антикоагулянта (CPD) составляло 7:1; соотношение плазмы, обогащенной тромбоцитами, и антикоагулянта (ACD-A) - 16:1; соотношение тромбоцонцентрата, полученного методом афереза, и антикоагулянта (Haemonetics) - 12:1 [Инструкция Министерства здравоохранения РФ по заготовке и консервированию донорской крови от 29.05.1995 г., новая редакция от 08.09.1999 г.].

В пробирке смешивают 10-20 мкл анализируемого образца и 10-20 мкл рабочего раствора красителя. Окрашивание проводят в течение 5-10 минут. Затем пипеткой отбирают 10-15 мкл смеси, переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Оценку прижизненно окрашенных тромбоцитов проводят с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив ×100, числовая апертура 1.25, λ возбуждения 450-490 нм, λ эмиссии - от 520 нм) в полуавтоматическом режиме. С помощью цифровой фотокамеры при экспозиции 0.25-0.5 сек получают цифровые изображения тромбоцитов и переносят в компьютер. Для морфометрического исследования тромбоцитов используют программу Adobe Photoshop. Анализ характера и интенсивности свечения прижизненно окрашенных тромбоцитов можно наблюдать в течение длительного времени (24-48 часов). При этом среди пула анализируемых тромбоцитов отчетливо выявляются клетки с гранулами и клетки без гранул (рисунок 1. Обозначения: А) клетки без гранул; Б) клетка содержат 2 гранулы; В) клетки содержат от 3 до 7 гранул; Г) клетки содержат более 10 гранул). Подчеркнем, что интенсивность свечения тромбоцитов зависит от количества в них гранул и существенно выше интенсивности свечения клеток без гранул (таблица 3). Тромбоциты с гранулами содержат от 3 до 15 визуально различимых везикул диаметром 300-600 нм, которые распределены по всему объему клетки и интенсивно окрашиваются также на Са²⁺ и серотонин. Тромбоциты без гранул не содержат везикул диаметром 300-600 нм или содержат 1-2 меньших размеров гранулы, которые всегда связаны с клеточной оболочкой и практически не окрашиваются на Са²⁺ и серотонин. Тромбоциты, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым, сохраняют свою адгезивную и агрегационную активность, которая зависит от количества тромбоцитов, содержащих более 3 гранул (таблица 4). Кроме того, в экспериментах показано, что как неокрашенные, так и окрашенные флуохромами тромбоциты после их активации кальцием проявляют ростстимулирующее действие в культуре фибробластов человека.

Таким образом, прижизненно окрашенные трипафлавином и акридиновым оранжевым тромбоциты человека полностью сохраняют свою функциональную активность. Результаты этих исследований обосновывают возможность оценки морфофункциональной активности этих клеток.

Таблица 3 Интенсивность (яркость) свечения тромбоцитов, прижизненно окрашенных трипафлавином и акридиновым оранжевым Количество гранул в тромбоците Яркость свечения тромбоцита (единиц измерения): фут-кандел/клетку в баллах 0 5-30 5-30 1-2 31-41 31-41 3-10 42-55 42-55 ≥10 57-75
76-85* 57-75
76-85* * В редких случаях наблюдали очень высокую яркость тромбоцитов, содержащие гранулы очень крупных размеров в количестве менее 10. Полагаем, что это связано с оптическим слиянием более мелких гранул.

Таблица 4 Сравнение функциональной активности тромбоцитов человека до и после прижизненного окрашивания трипафлавином-АО гранул клеток Анализируемый пул тромбоцитов человека Содержание тромбоцитов с гранулами Параметры функциональной активности тромбоцитов Концентрация клеток 250-275 тыс/мкл (%) Агрегационная активность Индуктор - коллаген -2 мкг/мл (в Ом·мин) Адгезивная активность на стекле (в % или баллах) До окрашивания 10-20 0 0-3 После окрашивания 10-20 0 0-2 До окрашивания 21-35 10-21 5-18 После окрашивания 21-35 8-22 5-20 До окрашивания 40-45 28-35 37-48 После окрашивания 40-45 25-38 35-40 До окрашивания 50-65 50-65 55-70 После окрашивания 50-65 47-59 57-69 До окрашивания 70-85 65-85 75-90 После окрашивания 70-85 63-80 74-85

Установлено, что прижизненно окрашенные тромбоциты после воздействия индуктором агрегации (коллаген) образуют тесное скопление клеток (агрегатов), которые не содержат гранул (рис 2.). Следовательно, отсутствие или уменьшение количества тромбоцитов с гранулами указывает на прошедший процесс активирования клеток в анализируемой популяции. Эти клетки либо потеряли, либо снизили свой функциональный потенциал. Клиническая эффективность трансфузии такой популяции тромбоцитов для коррекции система гемостаза у больных не высока или отсутствует. С другой стороны, выявление популяции тромбоцитов без или с повышенным количеством гранул в крови имеет большое диагностическое значение. Такая информация указывает на активацию (возможность тромбообразования) или подавления (возможность кровотечения) системы гемостаза и обосновывает необходимость проведения соответствующей коррекции у больного.

Единицы оценки качества тромбоцитов.

1. Концентрация тромбоцитов (С_тр) в анализируемом образце (тыс/мкл) (определяют с помощью гематологического анализатора).

2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (D_тр.гр), выражают в %. При большом увеличении (объектив ×100) оценивают от 150 до 200 прижизненно окрашенных клеток и регистрируют количество тромбоцитов, содержащих более 3 гранул в цитоплазме, и выражают в %. Например, при исследовании 150 тромбоцитов 85 клеток содержали гранулы. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (D_т.гр) равна 85:150×100-56,5%.

Относительное содержание тромбоцитов без гранул (D_{тр.безгр.}) рассчитывают по формуле D_{тр.безгр.}=100%-D_т.гр., или 100,0%-56,5%=43,5%.

3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (C_тр.гр) в анализируемом образце (тыс/мкл). Определяется по формуле - С_тр.гр=С_тр×D_тр.гр, т.е.количество тромбоцитов в образце (тыс/мкл) × долю тромбоцитов с гранулами (100%=1,0; 25%=0,25; 50%=0,5; 75%=0.75 и т.д.)

Например, при исследовании концентрата тромбоцитов количество клеток составило 2000 тыс/мкл, а доля тромбоцитов с гранулами составила 69,3% или в доле 0,693. Количество тромбоцитов с гранулами в концентрате тромбоцитов равнялось 2000 тыс/мкл×0,693=1386 тыс/мкл.

4. Морфофункциональная активность тромбоцита (МФАТ) в популяции анализируемого образца крови, плазмы, обогащенной тромбоцитами, тромбоцитном концентрате. Измеряют яркость свечения от 100 до 200 витально окрашенных трипафлавином-АО клеток, рассчитывают среднюю величину интенсивности свечения тромбоцита. Единицу яркости свечения выражают в фут-канделах на 1 клетку или в баллах. 1 фут-кандел эквивалентен 1 баллу [Поликарпов И.А., Эрлихман В.Д. Photoshop 4, изучение на примерах, Харьков, Омега, 1997; 415 с.]. МФАТ или удельная яркость свечения тромбоцита = ∑ свечений обследованных тромбоцитов делят на количество обследованных тромбоцитов.

По сумме морфофункциональной и адгезивной активностей, выраженных в баллах, оценивают морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ), который при 80-130 баллах считают нормальным, при 60-79 баллах - сниженным, при 41-59 баллах - низким, при менее чем 40 баллах - очень низким, при 131-150 баллах - высоким, при 151-170 баллах - очень высоким.

Пример 1. При исследовании популяции из 100 тромбоцитов 72 клетки (72% или 0,72) содержали более трех гранул и 28 клеток (28% или 0,28) не содержали гранул. Яркость свечения клеток с гранулами ваьировала от 60 до 70, составляя в среднем 66,3 фут-кандел на 1 тромбоцит; яркость свечения клеток без гранул - варьировала от 10 до 30, составляя в среднем 17,7 фут-кандел на 1 тромбоцит. Расчет морфофункциональной активности тромбоцитов анализируемой популяции:

МФАТ = 66,3×0.72+17.7×0,28=47,7+5,0=52,7 фут-кандел на 1 клетку или 52.7 балла

Пример 2. При исследовании популяции из 200 тромбоцитов 40 клеток (20% или 0,2) содержали более трех гранул и 160 клеток (80% или 0,8) не содержали гранул. Яркость клеток с гранулами варьировала от 25 до 40, составляя в среднем 33,1 фут-кандел на 1 тромбоцит, яркость клеток без гранул - варьировала от 5 до 20, составляя в среднем 12,7 фут-кандел на 1 тромбоцит. Расчет морфофункциональной активности тромбоцитов анализируемой популяции:

МФАТ = 33,7×0.20+12.7×0,80=6,7+10,2=16,9 фут-кандел на 1 клетку или 16,9 балла.

5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле морфологический анализ. Препарат с прижизненно окрашенными трипафлавином-АО клетками на стекле помещают на 10-15 мин в термостат при 37°С, затем с помощью флуоресцентного микроскопа определяют количество адгезировавших тромбоцитов в расчете на 100 или 150 анализируемых клеток. Адгезировавшие тромбоциты представляют собой большие распластанные клетки овальной или округлой формы (их диаметр в 2-3 раза больше диаметра исходных неадгезировавших тромбоцитов), в которых гранулы распределены по периферии клетки вблизи ее границ или уже выходят за пределы клетки (рис.3). Адгезивная активность выражают в % адгезировавших тромбоцитов к общему числу обследованных тромбоцитов или в баллах. 1% адгезивной активности равен 1 баллу.

Например, при исследовании 150 витально окрашенных тромбоцитов отмечено 95 больших распластанных по стеклу клеток. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) равна 95:150×100=63,3% или 63,3 балла.

6. Морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ). Расчет этого показателя осуществляют по формуле МФСТ=МФАТ+ААТ и выражают в баллах.

Проведена оценка качества тромбоцитов в крови, ее компонентах (плазма, обогащенная тромбоцитами, концентрат тромбоцитов) у доноров и больных по 6 предложенным параметрам (таблица 5).

У доноров крови концентрация тромбоцитов (С_тр) варьировала от 180 до 320 тыс/мкл, относительное содержание тромбоцитов с гранулами (D_тр.гр) - от 35 до 80%, концентрация тромбоцитов с гранулами (С_тр.гр) - от 60 до 180 тыс/мкл, морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ)- от 37 до 57 фут-кандел/клетку или 37-57 баллов; адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ) - от 40 до 70% и или 40-70 баллов: морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ) - от 77 до 127 баллов.

Проведен анализ распределения тромбоцитов крови доноров по морфофункциональной активности (МФАТ). Выявлено три популяции клеток: основная - 82% клеток (МФАТ - 42-55 фут-кандел/тромбоцит или 42-55 баллов); с пониженной активностью клеток - 16% (МФАТ - 37-40 фут-кандел/тромбоцит или 37-40 баллов) и умеренно повышенной активностью - 2% (МФТА - 57-60 фут-кандел/тромбоцит или 57-60 баллов). С учетом этих данных представлен анализ распределения тромбоцитов в крови у 4 группы больных с различными заболеваниями (Рис.4. На абсциссе МФАТ в фут-канделах на клетку или баллах). Больные с травмой конечностей (группа №3) по 6 анализируемым параметрам качества тромбоцитов соответствовали таковым у доноров. Больные с экзогенными отравлениями (группа №2) имели снижение морфофункциональной активности клеток - МФАТ варьировала от 32 до 42 фут-кандел/тромбоцит или 32-42 балла, подавление адгезивной активности клеток (ААТ), которая варьировала от 10 до 45% или 10-45 баллов и уменьшение морфофункционального статуса тромбоцитов (МФСТ) - 40-87 баллов.

Таблица 5 Морфофункциональные параметры оценки качества тромбоцитов человека Объект исследования Концентрация тромбоцитов (тыс/мкл) Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (%) Концентрация тромбоцитов с гранулами (тыс/мкл) МФАТ, (фут-кандел на клетку) или баллах ААТ(в %) или баллах МФСТ (в баллах) Доноры. Кровь 180-320 35-80 60-180 37-57 40-70 77-127 Доноры. Плазма, обогащенная тромбоцитами 400-800 30-75 180-490 37-56 30-70 67-126 Доноры. Концентрат тромбоцитов, нативный 1000-5000 20-60 200-1500 30-52 20-60 50-112 Доноры Концентрат тромбоцитов после криоконсервирования 1000-5000 12-50 100-1200 28-49 10-50 38-99 Больные с травмой конечностей. Кровь. 160-340 35-80 60-210 36-60 35-80 71-140 Больные с экзогенными отравлениями. Кровь. 160-300 10-50 25-100 30-42 10-45 40-87 Гематологические больные с геморрагическим синдромом. Кровь. 2-100 0-10 0-5 10-30 0 10-30 Больные с тромбоэмболическими осложнениями. Кровь. 340-800 80-90 270-700 65-80 80-90 145-170

У гематологических больных с геморрагическим синдромом (группа №1) морфофункциональная активность была крайне подавлена, что привело к угнетению клеточного звена системы гемостаза и развитию геморрагического синдрома. С другой стороны, у больных с тромбоэмболиболическими осложнениями (группа 4) имела место резкая активация системы клеточного звена гемостаза, что проявлялось в резком увеличении концентрации тромбоцитов, содержащих гранулы (до 700 тыс/мкл), МФАК была максимальной - 65-80 фут-кандел на клетку или 65-80 баллов, адгезивная активность составляла 80-90% или 80-90 баллов.

Апробация предложенного способа оценки морфофункционального статуса тромбоцитов в клинической практике выявила тесную взаимосвязь МФАТ с относительным содержанием тромбоцитов с гранулами (рис.5).

Обоснованность и достоверность предложенного способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека подтверждена корреляционным и математическим анализом тесной взаимосвязи агрегационной, адгезивной и морфофункциональной активности анализируемых тромбоцитов человека (рис.6.)

Для лучшего понимания предложенного «Способа оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека» приводим несколько конкретных примеров:

№1а Методом афереза от донора получен тромбоцитный концентрат в объеме 100 мл. Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов предлагаемым способом.

№1б Тот же тромбоцитный концентрат в объеме 100 мл на 5 сутки хранения при комнатной температуре. Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов предлагаемым способом. Результаты исследования отражены в таблице 6.

Таблица 6. Анализируемые параметры Тромбоконцентрат в первые сутки хранения пример №1а Тромбоконцентрат через 5 суток хранения пример №1б Концентрация тромбоцитов (С_тр), тыс/мкл 3000 2000 Количество тромбоцитов в 100 мл (млрд в дозе) 300 200 Относительное содержание 55 1 тромбоцитов с гранулами (D_тр.гр), %     Концентрация тромбоцитов с гранулами (С_тр.гр), млрд в дозе 165 2 Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ), фут-кандел/клетку или баллах 47 12 Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ), % или баллах 53 0 Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ), баллы 100 12 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Тромбоциты имеют нормальный морфофункциональный статус. Рекомендованы к использованию в клинической практике. Тромбоциты имеют очень низкий морфофункциональный статус. Противопоказано их использование в клинической практике.

Пример 2. Б-й М., возраст 32 года. Диагноз: острый миелоидный лейкоз, выраженный геморрагический синдром 1-й степени (на коже). Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов крови предлагаемым способом. Получены следующие результаты

1. Концентрация тромбоцитов (С_тр) - 14 тыс/мкл, или 14×10⁹/л, или 14 млрд клеток в л.

2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (D_тр.гр) - 5%.

3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (С_тр.гр) - 0.7 тыс/мкл или 0,7 млрд/л.

4. Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ) - 10 фут-кандел/клетку или 10 баллов.

5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ) - от 0% или 0 баллов.

6. Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ) - 10+0=10 баллов.

Заключение: тромбоциты крови имеют очень низкий морфофункциональный статус, что может привести к развитию клинических осложнений в виде геморрагического синдрома.

Пример 3. Больной К., диагноз - тромбоз сосудов печени, тромбоцитоз. Проведена оценка морфофункционального статуса тромбоцитов крови предлагаемым способом. Получены следующие результаты

1. Концентрация тромбоцитов (С_тр) в крови - 800 тыс/мкл, или или 800×10⁹/л, или 800 млрд клеток в л.

2. Относительное содержание тромбоцитов с гранулами (D_тр.гр) - 85%.

3. Концентрация тромбоцитов с гранулами (С_тр.гр) - 640 тыс/мкл или 640×10⁹/л, или 640 млрд/л.

4. Морфофункциональная активность тромбоцитов (МФАТ) - 64 фут-кандел/клетку или 64 балла.

5. Адгезивная активность тромбоцитов (ААТ) на стекле (морфологический анализ) - 85% или 85 баллов.

6. Морфофункциональнальный статус тромбоцитов (МФСТ) - 64+85=149 баллов.

Заключение: тромбоциты крови имеют высокий морфофункциональный статус. Активирована система клеточного звена гемостаза, возможно тромбообразование.

Изобретение относится к области медицины, а именно производственной и клинической трансфузиологии, и может быть использовано для оценки качества тромбоцитов и эффективности их применения в клинической практике. Образцы крови, или плазмы, или концентрата тромбоцитов, окрашивают в микропробирке трипафлавином и акридиновым оранжевым, с помощью флуоресцентного микроскопа оценивают количество тромбоцитов с гранулами, измеряют яркость свечения 100-200 витально окрашенных клеток, суммируют значения яркости и делят на количество обследованных тромбоцитов, рассчитывают среднюю величину интенсивности свечения тромбоцита и выражают в фут-канделах на 1 клетку, соответствующего одному баллу, характеризующую морфофункциональную активность тромбоцитов (МФАТ). Далее препарат с витально окрашенными тромбоцитами помещают в термостат, с помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают число распластанных тромбоцитов с выходящими наружу гранулами, делят на общее число обследованных клеток и выражают в %, причем один процент соответствует одному баллу, характеризующих адгезивную активность тромбоцитов (ААТ). Затем по сумме МФАТ и ААТ оценивают морфофункциональный статус тромбоцитов. Способ обеспечивает объективную оценку морфофункционального статуса тромбоцитов человека. 6 ил., 6 табл., 3 пр.

Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов, включающий морфометрию параметров отдельных клеток, подсчет процента активированных тромбоцитов, отличающийся тем, что образцы крови, или плазмы, или концентрата тромбоцитов окрашивают в микропробирке в течение 5-10 мин при комнатной температуре витальным флуорохромным красителем на буферном растворе, содержащим трипафлавин и акридиновый оранжевый в соотношении 1:1, затем окрашенные клетки переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и с помощью флуоресцентного микроскопа - объектив ×100, длина волны возбуждения 450-490 нм, длина волны эмиссии - от 520 нм, оценивают количество тромбоцитов с гранулами, измеряют яркость свечения витально окрашенных трипафлавином и акридиновым оранжевым клеток, измеряют яркость свечения 100-200 витально окрашенных трипафлавином-АО клеток, суммируют значения яркости обследованных клеток, делят на количество обследованных тромбоцитов, рассчитывают среднюю величину интенсивности свечения тромбоцита и выражают в фут-канделах на 1 клетку, соответствующего одному баллу, характеризующую морфофункциональную активность тромбоцитов (МФАТ) анализируемого образца, далее препарат с витально окрашенными тромбоцитами помещают в термостат при 37°С на 5-15 мин, после чего с помощью флуоресцентного микроскопа подсчитывают число распластанных тромбоцитов с выходящими наружу гранулами, делят на общее число обследованных клеток и выражают в %, причем один процент соответствует одному баллу, характеризующих адгезивную активность тромбоцитов (ААТ) анализируемого образца, затем по сумме морфофункциональной и адгезивной активностей, выраженных в баллах, оценивают морфофункциональный статус тромбоцитов (МФСТ), который при 80-130 баллах считают нормальным, при 60-79 баллах - сниженным, при 41-59 баллах - низким, при менее чем 40 баллах - очень низким, при 131-150 баллах - высоким, при 151-170 баллах - очень высоким.