КОСТНО-ПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ С ВЫСОКОАДГЕЗИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61L27/24 A61F2/28 A61K35/32 A61P19/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, при заполнении диастазов в процессе проведения реконструкции костной ткани.

Уровень техники

В настоящее время ведется активная разработка имплантов и биологических конструкций для стимуляции остеогенеза и регенерации костной ткани. Для обозначения таких изделий часто используют термин «костнопластический материал» (КПМ). По своему химическому составу образцы КПМ разделяют на биоорганические, керамические, синтетические, композиционные, КПМ могут включать диплоидные клетки, а также факторы роста, факторы дифференцировки, цитокины [Кирилова ИА, Подорожная ВТ, Ардашев ИП, Черницов СВ. Различные виды костнопластических материалов для восстановления костной структуры. Политравма. 2008; 4: 60-64]. Показано, что коллаген значительно повышает биокондуктивные свойства трансплантатов, стимулирует миграцию собственных клеток пациента, может быть использован ими в качестве субстрата для формирования собственной кости [Walsh W., Oliver R.A., Christou C., Lovric V., Walsh E.R., Prado G.R., Haider T. Critical Size Bone Defect Healing Using Collagen-Calcium Phosphate Bone Graft Materials. PLoS ONE. 2017; 12(1): e0168883. doi: 10.1371/journal.pone.0168883]. При использовании костного материала в виде дисперсных структур (костной крошки) появляется возможность получения пластичных трансплантатов заданного размера и формы. Раствор коллагена способствует инкорпорированию костных гранул, уменьшая риск их смещения или выдавливания при механических нагрузках [Fan Q., Zeng H., Fan W., Wu T., Sun J., Yan Q., Shi B. Ridge preservation of a novel extraction socket applying Bio-Oss® collagen: An experimental study in dogs. J. Dent. Sci. 2021;16(3): 831-839. doi: 10.1016/j.jds.2021.03.005]. Костная крошка обладает остеогенными и остеоиндуктивными свойствами и широко используется в клинической практике, изделия на основе костной крошки и коллагена считаются очень перспективными при лечении дефектов губчатой и кортикальной кости. Однако при комбинации костной крошки и коллагена с различными характеристиками образуется материал с различными свойствами, как физико-химического, так и биологического характера, которые не учитываются при использовании материала в лечении тканевых дефектов. Эффективность репаративного процесса может зависеть от таких параметров КПМ, как размер костной крошки, концентрация коллагена в исходном растворе, качество коллагеновых волокон, характер распределения гранул костной крошки и др. На сегодняшний день не показано, как биологические параметры КПМ влияют на скорость репарации и регенерации, жизнеспособность клеток, их миграцию, адгезию и пролиферацию. При разных патологиях необходимо стимулировать разные биологические процессы, в связи с чем актуальным является разработка КПМ с определенным набором биологических свойств, наиболее оптимальных для решения той или иной клинической задачи.

Из уровня техники известен костно-пластический материал и способ получения такого материала с регулярной структурой волокон на основе коллагена, стабилизированного 0,25% глутаровым альдегидом, наночастиц гидроксиапатита, который может быть дополнительно стабилизирован микрочастицами магния с целью повышения структурной целостности трансплантата [Antoniac I., Antoniac A., Vasile E., Tecu C., Fosca M., Yankova V., Rau J. In vitro characterization of novel nanostructured collagen-hydroxyapatite composite scaffolds doped with magnesium with improved biodegradation rate for hard tissue regeneration // Bioact Mater. 2021 Mar 19;6(10):3383-3395. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.02.030]. Однако получение КПМ связано с использованием специального инструментария для работы с наночастицами, отсутствует указание на биологический источник используемого коллагена, что затрудняет получение стандартизированного изделия, может вызывать развитие иммунологических реакций у пациента, не указана возможность использования в составе КПМ ростовых факторов. Кроме того, при получении КПМ используют глутаровый альдегид, который является токсичным для клеток.

Известно получение костно-пластического материала Bio-Oss® на основе гранул губчатой кости и коллагена 1 типа, который может быть дополнительно наполнен остеогенными факторами [Li Y., Yang L., Zheng Z., Li Z., Deng T., Ren W., Wu C., Guo L. Bio-Oss® modified by calcitonin gene-related peptide promotes osteogenesis in vitro. Exp Ther Med. 2017 Nov;14(5):4001-4008]. Однако при производстве КПМ используют ксеногенные источники коллагена и кости, при этом в публикации отсутствуют данные об адгезивных свойствах получаемого материала и скорости его биодеградации.

Наиболее близким к заявляемому является костно-пластический материал InterOss® Collagen и способ его получения [Jain G., Blaauw D., Chang S.J. A Comparative Study of Two Bone Graft Substitutes-InterOss® Collagen and OCS-B Collagen® // Funct Biomater. 2022. Vol.13, N 1. P. 28. doi: 10.3390/jfb13010028]. Для изготовления КПМ используют гранулы костной крошки крупного рогатого скота и коллаген 1 типа, выделенный из свиной кожи. В конечном изделии соотношение гранул костной крошки и коллагена составляет 9:1 по массе. Смесь костной крошки и раствора коллагена замораживают при -40°C в течение 4 часов, проводят 2 цикла лиофилизации - 33 часа при -10°C и 4 часа при 10°C, затем отжигают при температуре 120°C для получения композитных каркасов кубовидной формы (называемых блоками) с последующим дегидротермическим сшиванием. Полученный материал является прочным, эластичным и биосовместимым, не вызывает выраженной воспалительной реакции, стимулирует рост костной ткани у экспериментальных животных, замещается собственной костной тканью в процессе регенерации. Однако данный способ использует ксеногенные источники коллагена и костной крошки, способные вызывать воспалительные и иммунологические осложнения, не содержит данных о размере костной крошки, что затрудняет выбор исходных компонентов для получения смеси раствора коллагена и костной крошки, не позволяет прогнозировать механические свойства готового изделия, не указывает оптимальную концентрацию коллагена в исходном растворе, что затрудняет подготовку раствора коллагена для изготовления материала, не содержит данных об адгезивных свойствах материала и возможности его насыщения ростовыми факторами, усиливающими остеогенез, не учитывает возможные деформации коллагена в процессе получения КПМ и не позволяет оценить структурную целостность коллагена в составе готовых изделий.

Технической проблемой, решаемой заявленным изобретением, является разработка состава и способа получения костно-пластического материала (КПМ) на основе аллогенной кости и коллагена с определенными биологическими свойствами (нетоксичность для клеток in vitro, способность стимулировать адгезию и пролиферацию клеток, отсутствие деформированных коллагеновых волокон в составе КПМ), предназначенного для использования в лечении дефектов костной ткани.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение высокоадгезивного для клеток человека трансплантата КПМ на основе материала тканевых доноров, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс на см² и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой на поверхности КПМ (через 3 суток культивирования in vitro), при обеспечении гомогенности компонентов смеси, характеризующейся отсутствием сгустков крошки и коллагена во всем объеме смеси.

Высокоадгезивный КПМ может найти применение при остеоиндуктивном остеогенезе, при лечении дефектов костной ткани с низкой активностью остеобластов, низкой активностью роста сосудов и малым регенеративным потенциалом ткани. Изобретение позволяет на этапе производства высокоадгезивного КПМ получать материал с оптимальной гомогенностью, критерием которой является отсутствие в полученной смеси сгустков. Например, при смешивании компонентов со скоростью 50-60 оборотов в минуту могут образовываться отдельные сгустки, которые при смешивании со скоростью 70-90 оборотов в минуту исчезают. Наилучшей гомогенностью обладает смесь, при смешивании компонентов которой со скоростью 50-60 оборотов в минуту сгустки не образуются. При этом смешивание может осуществляться с использованием механической мешалки, например, с диаметром лопастей 12-15 см и шириной лопастей 0,5-1 см. КПМ с упомянутыми параметрами гомогенности распределения костной крошки является универсальным, может найти применение при лечении дефектов костной ткани с постоянной высокой и низкой механической нагрузкой.

Технический результат достигается костно-пластическим материалом (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, представляющим собой материал губчатой структуры на основе коллагена и костной крошки губчатой структуры, который в одном из вариантов осуществления изобретения может быть получен из лиофильно высушенной смеси коллагена и костной крошки, при этом в составе материала использован коллаген 1 типа человека, выделенный из сухожилий тканевых доноров, в количестве 10-12 масс.%, костную крошку с размером частиц 250 - 630 мкм, полученную из тканевых доноров, в количестве 87-89 масс.% (или остальное до 100 масс.% с остаточным содержанием влаги не более 3 масс.%); коллаген и коллагеновые волокна в составе КПМ характеризуются уровнем автофлуоресценции не более 30 фут-кандел (FC). КПМ получен при использовании 0,8% раствора коллагена. КПМ может дополнительно содержать факторы роста в составе лизата бедной или богатой тромбоцитами плазмы с уровнем тромбоцитарного фактора роста PDGF не ниже 150-200 пг/мл из расчета 40-50 мкл на 1 см² поверхности КПМ.

Технический результат достигается способом получения костно-пластического материала (КПМ), включающим смешивание коллагена и костной крошки с последующей лиофилизацией и стерилизацией полученной смеси, при иэтом для смешивания используют 0,8% раствор коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костную крошку диаметром 250-630 мкм, при этом на 100 мл коллагена берут от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки, после лиофилизации получаемый материал подвергают флуоресцентной микроскопии, при получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее полученный КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани.

Лиофилизацию в одном из вариантов осуществления способа проводят под вакуумом при -35°С в течение 20-40 мин, затем температуру постепенно поднимают до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов.

Перед применением КПМ (лиофилизированный трансплантат) вымачивают в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9%) в течение 30-60 мин с последующим заполнением дефекта костной ткани. После вымачивания КПМ осуществляют контроль качества коллагеновых волокон путем регистрации автофлуоресценции коллагена с помощью флуоресцентной микроскопии [например, Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. - 2017. -Т.9, №2. -С. 83-90], при получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее полученный КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани.

Рост-стимулирующие свойства КПМ могут быть повышены посредством добавления лизата бедной или богатой тромбоцитами плазмы, содержащей факторы роста, из расчета 40-50 мкл на 1 см² трансплантата после вымачивания в изотоническом растворе хлорида натрия. Изготовление тромбоцитных препаратов может быть проведено по известной методике [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В., Пономарев И.Н. Ростстимулирующий эффект тромбоцитарных препаратов, полученных разными способами, в культуре фибробластов человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].

Значения перечисленных параметров могут отличаться от указанных выше, на величину погрешности, не более чем на 10%.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг 1 представлены образцы костно-пластического материала, приготовленного с использованием 0,8% раствора коллагена, в виде уплощенной губки (А) и кубической губки (Б); на фиг. 2 представлена автофлуоресценция коллагена в составе костно-пластического материала с высокой (а) и низкой (б) гомогенностью, увеличение х40; на фиг. 3 представлена фотография витально окрашенных (трипафлавином и акридиновым оранжевым) клеток линии М-22 на коллагеновых матрицах, полученных из 0,8% раствора коллагена, через 3 суток культивирования. Увеличение х100. Окраска трипафлавином-акридиновым оранжевым. а - коллагеновая повязка (без костной крошки); б - КПМ из 0,8% коллагена и костной крошки без вымачивания. в - КПМ из 0,8% коллагена и костной крошки, предварительно вымоченный в изотоничном физрастворе в течение 40 минут; на фиг. 4 показана плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования на поверхности предварительно вымоченного костно-пластического материала (КПМ), полученного с использованием 0,8% раствора коллагена (а) и 1,1% коллагена (б); на фиг. 5 показана автофлуоресценция коллагена в составе коллагеновых повязок (а) и костно-пластического материала (КПМ) с разным качеством коллагеновых волокон (б-3). Увеличение х40. а - коллагеновая повязка, полученная из 0,8% раствора коллагена; б - КПМ, полученный из 0,8% раствора коллагена; в, г - КПМ, полученный из 1,1% раствора коллагена (в - нормальное качество волокон, г - высокое содержание деформированных волокон); д - КПМ, полученный из 0,8% раствора коллагена, после экспозиции в культуральной среде в течение 4 недель (химическая деградация волокон слабо выражена); е, ж, з - КПМ, полученный из 1,1% раствора коллагена, после экспозиции в культуральной среде в течение 4 недель (е - химическая деградация волокон слабо выражена, ж - очень сильная деградация волокон, з - декомпактизация волокон); на фиг. 6 показана пролиферативная активность фибробластов линии М-22 в составе костно-пластического материала через 3 суток культивирования. Витальное окрашивание трипафлавином-акридиновым оранжевым. Увеличение х200. а - КПМ без тромбоцитных препаратов; б - КПМ + богатая тромбоцитами плазма; в - КПМ + лизат богатой тромбоцитами плазмы.

Осуществление изобретения

Способ приготовления заявленного костно-пластического материала включает следующие этапы.

1. Выделение коллагена 1 типа человека из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции в 0,01 М уксусной кислоты, которое может быть реализовано известными из уровня техники способами [Ермолов А.С., Смирнов С.В., Хватов В.Б., Истранов Л.П., Конюшко О.И., Колокольчикова Е.Г. и др. Применение биологически активных раневых покрытий, стимулирующих регенерацию эпителия ожоговых ран IIIа степени. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2008;(3):166-170].

2. Получение костной крошки из губчатой кости тканевых доноров размером 250 - 630 мкм [Хватов В.Б., Свищев А.В., Ваза А.Ю., Боровкова Н.В., Миронов А.С., Похитонов Д.Ю. и др. Способ изготовления лиофилизированного аллотрансплантата кости. Трансплантология. 2016;(1):13-18].

3. Смешивание раствора коллагена, полученного на первом этапе, и костной крошки, полученной на втором этапе, для получения КПМ с заданными свойствами.

Например, при смешивании 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 500-630 мкм можно добиться более высокой гомогенности распределения костной крошки с получением высокоадгезивного материала. Хорошая гомогенность смеси с получением высокоадгезивного материала достигается и при смешивании 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 250-315 мкм. Неудовлетворительные параметры по гомогенности (образуются сгустки, которые не удается размешать) получаются при использовании в составе смеси костной крошки размером менее 180 мкм.

1. Лиофилизация смеси жидкого коллагена и костной крошки: сначала лиофилизацию проводят под вакуумом при -35°С в течение 20-40 мин, после этого температуру постепенно поднимают со скоростью 1°С в минуту до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов до получение конечного продукта с остаточным содержанием влаги по массе не более 4%. Лиофилизация смеси жидкого коллагена и костной крошки может быть выполнена по известной из уровня техники методике [см. например, Патент РФ на изобретение 2721873
«Аллогенный комбинированный костный трансплантат для лечения сложных переломов проксимального отдела плечевой кости, способ его получения»]. Полученный КПМ представляет собой губчатую структуру, которая может производиться в виде гранул, пластин, а также с заданной формой для конкретного применения, например, может иметь уплощенную форму (малая высота относительно длины и ширины), цилиндрическую или кубическую форму. Форма изделия, как правило, зависит от линейных размеров емкости, в которую заливается смесь раствора коллагена и костной крошки перед лиофилизацией.

2. Упаковка готовых КПМ в двойные полипропиленовые пакеты или полиэтиленовую медицинскую упаковывающую пленку, используя электрический запаиватель для вакуумной упаковки. Размер упаковок может варьироваться от 5х5 до 10х20 см.

3. Стерилизация КПМ, например, путем радиационной обработкой с дозой 25кГр.

Подготовка КПМ к клиническому использованию включает следующие этапы:

4. Оценка структурной целостности коллагеновых волокон КПМ путем регистрации автофлуоресценции коллагена. Оценка структурной целостности коллагеновых волокон КПМ может быть приведена с помощью известных методик [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. -2017. -Т.9, №2. -С. 83-90]. В КПМ без дефектных коллагеновых волокон уровень автофлуоресценции составляет не более 30 фут-кандел для КПМ, полученных с использованием 0,8% раствора коллагена.

5. Вымачивание КПМ с нормальной структурой коллагеновых волокон (без содержания дефектных волокон) в изотоническом физрастворе (0,9% хлорид натрия) не менее 30 минут.

6. Насыщение КПМ тромбоцитными препаратами при необходимости (богатая и бедная тромбоцитами плазма, лизат богатой и бедной тромбоцитами плазмы) из расчета 40-50 мкл тромбоцитного препарата на 1 см² КПМ. Тромбоцитные препараты могут быть нанесены на поверхность КПМ любыми известными из уровня техники средствами, например, с помощью пипетки или шприца в стерильных условиях непосредственно перед операцией или интраоперационно. Изготовление тромбоцитных препаратов может быть реализовано по известной методике [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В., Пономарев И.Н. Ростстимулирующий эффект тромбоцитарных препаратов, полученных разными способами, в культуре фибробластов человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].

Аутотрансплантат КПМ на основе материала тканевых доноров с перечисленными биологическими свойствами был разработан по результатам проведения исследований.

На первом этапе решения поставленной задачи для оценки биосовместимости готовых изделий in vitro использовали образцы КПМ, изготовленные на основе 0,8% раствора коллагена 1 типа и костной крошки размером 315-630 мкм. Оценку биосовместимости проводили на примере культуры фибробластов человека линии М-22. В лунки 4-луночного планшета с площадью ростовой поверхности 1,9 см² вносили по 10 тыс. клеток в среде ДМЭМ, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В контрольные лунки вносили суспензию клеток без КПМ, в опытные лунки помещали готовые лиофилизированные образцы КПМ, не подвергавшиеся дополнительным обработкам, затем вносили суспензию клеток. Клетки инкубировали 3 суток при температуре 37°С и 5% концентрации СО2 в атмосфере. Оценивали количество клеток на дне лунок, и на поверхности трансплантатов, общую структурную целостность клеток и их морфологию. Для этого клетки окрашивали витальным (прижизненным) флуорохромным красителем на основе трипафлавина-акридинового оранжевого или трипафлавина-родамина С и исследовали в конфокальный люминесцентный микроскоп Nikon 80i (Nikon, Япония). Уже через 1 час после помещения КПМ в культуральную среду отмечалось изменение окраски индикатора питательной среды, смещение pH среды в кислую сторону (ацидогенность), которое не было связано с контаминацией образцов патогенной флорой. Через 3 суток культивирования на дне лунок с КПМ число клеток было очень низким и не превышало в среднем 1 тыс на см². В то же время в контрольных лунках содержание клеток составляло 14-15 тыс. на 1 см². В составе КПМ клетки не выявлялись (Фиг. 3), таким образом, заметное снижение числа клеток на дне лунок не было связано с их миграцией внутрь трансплантата. Одновременно с этим в опытных лунках в культуральной среде отмечали большое количество ошаренных клеток, с характерными апоптотическими изменениями. Таким образом, лиофилизированные образцы КПМ, не подвергавшиеся предварительной подготовке/обработке для работы с клетками, обладали выраженной ацидогенностью и токсичностью, что приводило к массовой гибели клеток в культуре.

Для снижения ацидогенности и токсичности КПМ было предложено два способа. В первой серии экспериментов трансплантаты готовили по указанной выше методике, затем образцы замачивали в 0,9% растворе хлорида натрия (NaCl) в течение 10, 20, 30, 40, 50 или 60 минут, после этого образцы КПМ помещали в культуру клеток. Во второй серии экспериментов смесь раствора коллагена и костной крошки до замораживания отмывали в дистиллированной воде. Один цикл отмывания включал центрифугирование смеси костной крошки и коллагена в пробирке типа Falcon с ускорением 3000 g 20 минут, полное замещение супернатанта эквивалентным объемом стерильной дистиллированной воды, ресуспендирование содержимого в пробирке. Число циклов отмывания варьировало от 1 до 4. После отмывания смесь коллагена и костной крошки замораживали, лиофилизировали, перед помещением в культуру клеток замачивания в физрастворе не проводили. В контрольных лунках (без КПМ) число клеток после 3 суток культивирования на дне лунок составляло 23-24 тыс/см², тогда как в опытах с исходным КПМ этот параметр не превышал 0,9-1,0 тыс/см², на поверхности КПМ клетки полностью отсутствовали (табл. 1). В лунках, где образцы КПМ предварительно вымачивали в изотоничном растворе NaCl, количество клеток на дне составляло от 3,0±0,5 до 17,5±0,8 тыс/см² и увеличивалось по мере роста длительности вымачивания изделия с 10 до 50 минут. Параллельно увеличивалось число клеток на трансплантате: после вымачивания 20 минут их количество составляло 1,0±0,2 тыс/см², а после 50 минут достигало 4,5±0,7 тыс/см². Стоит особо подчеркнуть, что в опытах, где вымачивание КПМ продолжалось 10-20 минут, многие клетки на дне лунок и на поверхности трансплантата имели ошаренный или измененный вид, плохо контактировали с пластиком. Витальное окрашивание клеток показало заметное снижение яркости наружной мембраны, резкое снижение количества секреторных везикул в составе клеток, свидетельствующие о деформации клеток, разрушении их вакуолярных структур, нарушении контактных взаимодействий, что в совокупности можно расценить как токсический эффект. В опытах, где вымачивание составляло 30-50 мин, ошаренные клетки отсутствовали, соответственно, морфология клеток была нормальной или близкой к норме. В случае вымачивания КПМ 60 минут число клеток и их морфология значимо не отличались от опытов, где вымачивание составило 50 мин. В серии экспериментов, где проводили отмывание смеси коллагена и костной крошки до лиофилизации, отмечалось поэтапное изменение ее pH с 3,3 до 6,1 по мере увеличения количества циклов обработки до 4. При исследовании in vitro количество клеток на дне лунок, в которые помещали КПМ, прошедшие разное количество циклов дополнительной обработки, составляло от 5,0 до 7,5 тыс/см² (р>0,05). В то же время плотность клеток на поверхности трансплантата после 3-4 отмываний коллагена была выше, чем после 1-2 отмываний. Однако абсолютные значения были во всех случаях очень низкими, не превышали 2 тыс/см² и были ниже, чем в опытах с вымачиванием трансплантатов в течение 30-60 мин (табл. 1). Таким образом, вымачивание готовых лиофилизированных трансплантатов КПМ в физрастворе более эффективно снижает их токсичность, продолжительность вымачивания должна составлять не менее 30 минут.

Таблица 1. Оценка биосовместимости трансплантатов костно-пластического материала, подготовленных разными способами Вымачивание готового лиофилизированного трансплантата в изотоническом физрастворе (0,9% хлорид натрия) Время экспозиции КПМ
в изотоническом физрастворе Плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования, тыс/см² Дно лунки Поверхность трансплантата Контроль 1. Лунки с клетками без трансплантата 24,1±1,2 - Контроль 2. 0 мин (трансплантат без вымачивания) 1,0±0,2 0 10 мин 3,0±0,5 0 20 мин 5,3±0,4 1,0±0,2 30 мин 11,1±1,0 2,6±0,5 40 мин 13,0±1,0 2,8±0,6 50 мин 17,5±0,8 4,5±0,7 60 мин 17,0±1,0 4,0±0,6 Отмывание смеси жидкого коллагена и костной крошки от кислой среды дистиллированной водой с последующей лиофилизацией Количество отмываний Плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования, тыс/см² Дно лунки Поверхность трансплантата Контроль (лунки с клетками без трансплантата 23,5±1,0 - Контроль 2 (без отмывания) 0,9±0,2 0 1 раз 6,5±1,2 1,0±0,3 2 раза 7,5±1,6 1.0±0,2 3 раза 7,5±1,9 1,6±0,2 4 раза 5,0±0,9 1,8±0,2

На втором этапе определяли наиболее оптимальное соотношение костной крошки и коллагена для изготовления КПМ, исследовали адгезивные свойства КПМ, полученные с использованием костной крошки разного диаметра и раствора коллагена в двух концентрациях, параллельно исследовали коллагеновые губки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена без использования костной крошки. В процессе разработки КПМ необходимо было добиться максимального насыщения раствора коллагена костной крошкой, чтобы при этом гранулы крошки равномерно распределялись по объему и не высыпались из готового трансплантата после лиофилизации. Экспериментально было установлено, что в 100 мл раствора коллагена удается распределить от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки. Если масса костной крошки была меньше 5,5 грамм, в готовом изделии формировались обширные зоны коллагена без костной крошки. Если масса костной крошки превышала 6,5 грамм, полученная смесь теряла гомогенность, образовывались конгломераты, а после лиофилизации трансплантат фрагментировался. Таким образом, при производстве КПМ было выявлено, что оптимальным соотношением костной крошки с раствором коллагена является 5,5-6,5 грамм на 100 мл. В готовых лиофилизированных КПМ массовая доля коллагена варьирует от 10 до 12%, массовая доля костной крошки - от 87 до 89% (табл. 2).

Таблица 2. Содержание основных компонентов КПМ в готовом материале Объем 0,8% раствора коллагена Масса костной крошки Массовая доля коллагена в КПМ после лиофилизации Массовая доля костной крошки в КПМ после лиофилизации 100 мл 5,5 грамм 12% 87% 100 мл 6,0 грамм 11% 88% 100 мл 6,5 грамм 10% 89%

В работе использовали 8 типов КПМ, полученных из 0,8% или 1,1% раствора коллагена 1 типа человека и костной крошки одного из размеров: 80-180 мкм, 250-315 мкм, 500-630 мкм, 700-800 мкм. После совмещения компонентов оценивали характер распределения костной крошки в коллагене (гомогенность), после лиофилизации оценивали стабильность готового изделия, характер распределения коллагена и структурную целостность волокон. Помимо этого, в культуре клеток оценивали токсичность образцов КПМ и возможность ее редукции путем отмывания в физиологическом растворе хлорида натрия в течение 30 минут. Структурную целостность коллагена оценивали по уровню автофлуоресценции коллагеновых волокон в составе КПМ. Регистрацию автофлуоресценции коллагена в образцах КПМ проводили при синем светофильтре (λвозбуждения=380-420 нм, λэмиссии - от 450 нм, время экспозиции - 1сек). Для количественной характеристики автофлуоресценции коллагена использовали параметр средней интенсивности свечения (в фут-канделах, foot candle, FC). Для сравнения оценивали свечения коллагеновых волокон в составе коллагеновых повязок, приготовленных с использованием того же раствора коллагена по известной методике. Химическая деградация коллагена сопровождается резким увеличением автофлуоресценции волокон и превышает 60 FC [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. -2017. -Т.9, №2. -С. 83-90].

После лиофилизации все образцы были стабильными и не фрагментировались. В опытах in vitro параллельно оценивали образцы КПМ и коллагеновые повязки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена (0,8% и 1,1%). В присутствии коллагеновых повязок не наблюдалось деформации клеток на дне лунок и в составе трансплантатов, клетки адгезировали на поверхности повязок (Фиг. 3а). Все образцы КПМ без предварительного вымачивания были токсичными и препятствовали росту клеток (Фиг. 3б). В опытах, где КПМ предварительно вымачивали в изотоническом физрастворе в течение 30-50 минут, не наблюдалось выраженной деформации клеток. В КПМ, полученных из 0,8% раствора коллагена, образцы КПМ с костной крошкой диаметром 80-630 мкм через 3 суток культивирования имели сходную плотность клеток на своей поверхности (Фиг. 3в) и значимо не отличались от коллагеновых трансплантатов без костной крошки, тогда как в КПМ с костной крошкой диаметром 700-800 мкм число клеток было ниже в 3-4 раза (Фиг. 4а). Число клеток на дне лунок было наибольшим в опытах, где диаметр костной крошки составлял 80-180 мкм, что может быть с менее активной миграцией клеток в КПМ из-за низкой гомогенности материала в его составе. В КПМ, полученных из 1,1% раствора коллагена, адгезия клеток на поверхности КПМ была гораздо менее выраженной, чем на коллагене без костной крошки и в КПМ, приготовленном с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-630 мкм и не превышала 2 тыс на см² (Фиг. 4б). Необходимо отметить, что КПМ, полученные из 0,8% раствора коллагена, имели разную гомогенность распределения материала в зависимости от размера костной крошки. В КПМ с гранулами костной крошки размером от 250 до 630 мкм отмечалась высокая гомогенность распределения материала, тогда как КПМ, изготовленные с использованием крошки диаметром 80-180 мкм, имели очень неравномерное распределение гранул по всему объему, выявлялись обширные области, заполненные только коллагеном и зоны с очень плотными скоплениями гранул костной крошки, гомогенность готовых изделий была низкой. Гомогенность субстрата влияет на миграционную и пролиферативную активность клеток. Поскольку костная крошка сама по себе обладает низкой адгезивностью для клеток, необходимо добиваться полного покрытия гранул крошки коллагеном, в связи с этим для лучшего роста клеток в течение длительного времени поверхность материала должна иметь высокую гомогенность. Таким образом, для получения высокоадгезивных КПМ с высокой гомогенностью следует использовать 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 250-630 мкм.

На третьем этапе оценивали структурную целостность коллагена в готовых трансплантатах, их устойчивость к биодеградации и возможность насыщения ростовыми факторами. Для оценки качества коллагена оценивали автофлуоресценцию коллагеновых волокон в КПМ и в коллагеновых повязках, полученных из раствора с той же концентрацией коллагена, которая использовалась при изготовлении КПМ (0,8%). При анализе автофлуоресценции коллагена в коллагеновых повязках отчетливо выявлялись зоны с диффузным расположением коллагена и зоны с коллагеновыми волокнами (Фиг. 5а). В образцах КПМ коллагеновые волокна выявлялись гораздо реже, основная область была заполнена диффузным слоем коллагена (Фиг. 5б,в). В большинстве случаев средняя интенсивность автофлуоресценции коллагена в повязках и КПМ с 0,8% коллагена значимо не отличалась и составляла в среднем 28±1 FC. Тем не менее, среди образцов КПМ встречались образцы, где уровень автофлуоресценции составлял от 40 до 50 FC из-за высокого содержания дефектных волокон. В таких образах КПМ при малом увеличении (х40) выявляется не меньше 1-2 зон с волокнами яркостью 60 FC и выше в каждом поле зрения (Фиг. 5г). Доля КПМ с высоким уровнем дефектных волокон не превышала 10% от всего числа КПМ, тем не менее, мониторинг качества коллагена является актуальным. КПМ с высоким содержанием дефектных волокон может обладать повышенной токсичностью и склонностью к биодеградации, в связи с этим такие образцы КПМ необходимо элиминировать еще до стадии клинического использования.

Для оценки биодеградации КПМ in vitro изначально отбирали образцы, не содержащие деградирующих волокон (яркостью 60 фут-кандел и выше), с высокой гомогенностью распределения костной крошки. В исходных образцах КПМ, приготовленных с помощью 0,8% раствора коллагена, уровень автофлуоресценции коллагеновых волокон составлял 27±1 фут-кандел. Исследуемые образцы экспонировали в течение 4 недель в культуральной среде ДМЭМ и в изотоническом физрастворе (0,9% NaCl). Экспозицию в среде ДМЭМ проводили без клеток, в присутствии клеток линии М-22, в присутствии клеток с предварительным вымачиванием КПМ в лизате бедной тромбоцитами плазмы. Оценивали структурную целостность волокон коллагена и массу КПМ. Через 2 недели экспозиции уровень автофлуоресценции во всех образах КПМ значимо не менялся. Напротив, через 4 недели в обеих группах топография волокон заметно изменялась, во многих участках КПМ коллагеновые волокна не выявлялись, вместо них можно было видеть диффузное распределение коллагена с низкой интенсивностью свечения (15-18 фут-кандел), что указывает на деконденсацию коллагена. Одновременно с этим выявлялись участки, где уровень автофлуоресценции превышал 60 фут-кандел. В опытах, где образцы КПМ экспонировались в культуральной среде, фрагменты волокон с яркостью 60 фут-кандел были немногочисленными (Фиг. 5д,е). Напротив, в опытах, где КПМ экспонировали в изотоническом физрастворе, волокна с яркостью 60 фут-кандел занимали обширные зоны, чаще всего были тесно ассоциированы с костной крошкой и давали гомогенную картину свечения (Фиг. 5ж). Предварительное вымачивание КПМ в лизате бедной тромбоцитами плазмы не влияло на интенсивность изменения топографии волокон через 4 недели, при этом в изотоническом физрастворе процесс биодеградации шел гораздо быстрее, чем в культуральной среде (табл. 3). С учетом того, что условия культуральной среды более приближены к среде организма, можно заключить, что разработанный материал в течение 4 недель будет иметь низкую интенсивность биодеградации.

Таблица 3. Снижение массы образцов КПМ (в % от исходной) после экспозиции в культуральной среде КПМ, приготовленный с использованием 0,7-0,8%-го раствора коллагена человека 1 типа Тип экспозиции КПМ Экспозиция 2 недели Экспозиция 4 недели В культуральной среде с клетками 4,5 3,8 В культуральной среде с клетками после обработки лизатом бедной тромбоцитами плазмы 2,2 4,4 В культуральной среде без клеток 3,8 3,8 В изотоническом физрастворе (0,9% NaCl) 11,8 34,0

С учетом полученных данных, для насыщения тромбоцитными препаратами использовали образцы КПМ, предварительно вымоченные в изотоническом физрастворе. Было установлено, что 1 см² КПМ после вымачивания в изотоническом физрастворе нормально адсорбирует 40-50 мл тромбоцитных препаратов. При этом может быть использована богатая и бедная тромбоцитами плазма, а также лизат богатой и бедной тромбоцитами плазмы, полученный путем криодеструкции тромбоцитов.

Были проведены исследования в культуре клеток М-22 с использованием богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) и лизата БоТП. Объем внесенных тромбоцитных препаратов исходно содержал 100-125 млн тромбоцитов с гранулами, содержание тромбоцитарного фактора PDGF составляло 150-200 пг/мл, что является оптимальным в расчете на 100 тыс высеянных клеток. Добавление тромбоцитных препаратов в КПМ с высокой адгезивностью заметно увеличивало пролиферативную активность фибробластов культуры М-22 в их составе: через 3 суток плотность клеток на поверхности КПМ с лизатом БоТП была выше в среднем в 2,1 раза, на поверхности КПМ с БоТП - в 1,6 раз по сравнению с КПМ без тромбоцитных препаратов (Фиг. 6). В составе КПМ с БоТП и лизатом БоТП клетки имели нормальную структуру ядра и цитоплазмы, содержали большое число секреторных везикул. Таким образом, насыщение КПМ тромбоцитными препаратами дополнительно усиливает биокондуктивные свойства этих трансплантатов.

Таким образом, костно-пластический материал (КПМ) на основе костной крошки и коллагена тканевых доноров не вызывает иммунологических реакций в тканях человека, может быть дополнительно насыщен ростовыми факторами, выделенными из собственной крови пациента. В зависимости от поставленной клинической задачи, в рамках предлагаемого способа могут быть получены изделия КПМ с разными биологическими характеристиками. Критически значимым является вымачивание изделий перед клиническим применением в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9% NaCl) с целью снижения их ацидогенности и повышения биосовместимости. КПМ, полученные с использованием 0,8% раствора коллагена, имеют высокую гомогенность и являются высокоадгезивными для клеток человека.

Группа изобретений относится к костно-пластическому материалу (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, представляющему собой материал на основе коллагена и костной крошки, отличающемуся тем, что содержит коллаген 1 типа человека, выделенный из сухожилий тканевых доноров, в количестве 10-12 мас.%, костную крошку с размером частиц 250-630 мкм, полученную из тканевых доноров, в количестве 87-89 мас.%, при этом коллаген и коллагеновые волокна в составе КПМ характеризуются уровнем автофлуоресценции не более 30 фут-кандел (FC), также относится к способу получения костно-пластического материала (КПМ), включающему смешивание коллагена и костной крошки с последующей лиофилизацией и стерилизацией полученной смеси, отличающемуся тем, что для смешивания используют 0,8% раствор коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костную крошку диаметром 250-630 мкм, при этом на 100 мл коллагена берут от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки, после лиофилизации получаемый материал подвергают флуоресцентной микроскопии, при получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее полученный КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, также относится к применению КПМ для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, включающему предварительное вымачивание КПМ в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9% NaCl) в течение не менее 30 мин с последующим заполнением дефекта костной ткани. Группа изобретений обеспечивает получение высокоадгезивного для клеток человека трансплантата КПМ на основе материала тканевых доноров, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс на см² и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой на поверхности КПМ (через 3 суток культивирования in vitro), при обеспечении гомогенности компонентов смеси, характеризующейся отсутствием сгустков крошки и коллагена во всем объеме смеси. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 20 ил., 3 табл.

1. Костно-пластический материал (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, представляющий собой материал на основе коллагена и костной крошки, отличающийся тем, что содержит коллаген 1 типа человека, выделенный из сухожилий тканевых доноров, в количестве 10-12 мас.%, костную крошку с размером частиц 250-630 мкм, полученную из тканевых доноров, в количестве 87-89 мас.%, при этом коллаген и коллагеновые волокна в составе КПМ характеризуются уровнем автофлуоресценции не более 30 фут-кандел (FC).

2. Костно-пластический материал (КПМ), отличающийся тем, что получен при использовании 0,8% раствора коллагена.

3. Костно-пластический материал (КПМ) по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит факторы роста в составе лизата бедной или богатой тромбоцитами плазмы с уровнем тромбоцитарного фактора роста PDGF не ниже 150-200 пг/мл из расчета 40-50 мкл на 1 см² поверхности КПМ.

4. Способ получения костно-пластического материала (КПМ) по п.1, включающий смешивание коллагена и костной крошки с последующей лиофилизацией и стерилизацией полученной смеси, отличающийся тем, что для смешивания используют 0,8% раствор коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костную крошку диаметром 250-630 мкм, при этом на 100 мл коллагена берут от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки, после лиофилизации получаемый материал подвергают флуоресцентной микроскопии, при получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее полученный КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что лиофилизацию сначала проводят под вакуумом при -35°С в течение 20-40 мин, затем температуру постепенно поднимают до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов.

6. Применение КПМ по п.1 для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, включающее предварительное вымачивание КПМ в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9% NaCl) в течение не менее 30 мин с последующим заполнением дефекта костной ткани.

7. Применение КПМ по п.6, отличающееся тем, что после вымачивания КПМ осуществляют контроль качества коллагеновых волокон путем регистрации автофлуоресценции коллагена с помощью флуоресцентной микроскопии, при получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее полученный КПМ используют для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани.

8. Применение КПМ по п.6, отличающееся тем, что после вымачивания в КПМ добавляют лизат бедной или богатой тромбоцитами плазмы, содержащий факторы роста с уровнем тромбоцитарного фактора роста PDGF не ниже 150-200 пг/мл из расчета 40-50 мкл на 1 см² поверхности КПМ.