КОСТНО-ПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ С УПРАВЛЯЕМЫМИ СВОЙСТВАМИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61L27/24 A61F2/28 A61K35/32 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, при заполнении диастазов в процессе проведения реконструкции костной ткани.

Уровень техники

В настоящее время ведется активная разработка имплантов и биологических конструкций для стимуляции остеогенеза и регенерации костной ткани. Для обозначения таких изделий часто используют термин «костнопластический материал» (КПМ). По своему химическому составу образцы КПМ разделяют на биоорганические, керамические, синтетические, композиционные, КПМ могут включать диплоидные клетки, а также факторы роста, факторы дифференцировки, цитокины [Кирилова ИА, Подорожная ВТ, Ардашев ИП, Черницов СВ. Различные виды костнопластических материалов для восстановления костной структуры. Политравма. 2008; 4: 60-64]. Показано, что коллаген значительно повышает биокондуктивные свойства трансплантатов, стимулирует миграцию собственных клеток пациента, может быть использован ими в качестве субстрата для формирования собственной кости [Walsh W., Oliver R.A., Christou C., Lovric V., Walsh E.R., Prado G.R., Haider T. Critical Size Bone Defect Healing Using Collagen–Calcium Phosphate Bone Graft Materials. PLoS ONE. 2017; 12(1): e0168883. doi: 10.1371/journal.pone.0168883]. При использовании костного материала в виде дисперсных структур (костной крошки) появляется возможность получения пластичных трансплантатов заданного размера и формы. Раствор коллагена способствует инкорпорированию костных гранул, уменьшая риск их смещения или выдавливания при механических нагрузках [Fan Q., Zeng H., Fan W., Wu T., Sun J., Yan Q., Shi B. Ridge preservation of a novel extraction socket applying Bio-Oss® collagen: An experimental study in dogs. J. Dent. Sci. 2021;16(3): 831–839. doi: 10.1016/j.jds.2021.03.005]. Костная крошка обладает остеогенными и остеоиндуктивными свойствами и широко используется в клинической практике, изделия на основе костной крошки и коллагена считаются очень перспективными при лечении дефектов губчатой и кортикальной кости. Однако при комбинации костной крошки и коллагена с различными характеристиками образуется материал с различными свойствами, как физико-химического, так и биологического характера, которые не учитываются при использовании материала в лечении тканевых дефектов. Эффективность репаративного процесса может зависеть от таких параметров КПМ, как размер костной крошки, концентрация коллагена в исходном растворе, качество коллагеновых волокон, характер распределения гранул костной крошки и др. На сегодняшний день не показано, как биологические параметры КПМ влияют на скорость репарации и регенерации, жизнеспособность клеток, их миграцию, адгезию и пролиферацию. При разных патологиях необходимо стимулировать разные биологические процессы, в связи с чем актуальным является разработка КПМ с определенным набором биологических свойств, наиболее оптимальных для решения той или иной клинической задачи.

Из уровня техники известен костно-пластический материал и способ получения такого материала с регулярной структурой волокон на основе коллагена, стабилизированного 0,25% глутаровым альдегидом, наночастиц гидроксиапатита, который может быть дополнительно стабилизирован микрочастицами магния с целью повышения структурной целостности трансплантата [Antoniac I., Antoniac A., Vasile E., Tecu C., Fosca M., Yankova V., Rau J. In vitro characterization of novel nanostructured collagen-hydroxyapatite composite scaffolds doped with magnesium with improved biodegradation rate for hard tissue regeneration // Bioact Mater. 2021 Mar 19;6(10):3383-3395. doi: 10.1016/j.bioactmat.2021.02.30]. Однако получение КПМ связано с использованием специального инструментария для работы с наночастицами, отсутствует указание на биологический источник используемого коллагена, что затрудняет получение стандартизированного изделия, может вызывать развитие иммунологических реакций у пациента, не указана возможность использования в составе КПМ ростовых факторов. Кроме того, при получении КПМ используют глутаровый альдегид, который является токсичным для клеток.

Известно получение костно-пластического материала Bio-Oss® на основе гранул губчатой кости и коллагена 1 типа, который может быть дополнительно наполнен остеогенными факторами [Li Y., Yang L., Zheng Z., Li Z., Deng T., Ren W., Wu C., Guo L. Bio-Oss® modified by calcitonin gene-related peptide promotes osteogenesis in vitro. Exp Ther Med. 2017 Nov;14(5):4001-4008]. Однако при производстве КПМ используют ксеногенные источники коллагена и кости, при этом в публикации отсутствуют данные об адгезивных свойствах получаемого материала и скорости его биодеградации.

Наиболее близким к заявляемому является костно-пластический материал InterOss® Collagen и способ его получения [Jain G., Blaauw D., Chang S.J. A Comparative Study of Two Bone Graft Substitutes-InterOss® Collagen and OCS-B Collagen® // Funct Biomater. 2022. Vol.13, N 1. P. 28. doi: 10.3390/jfb13010028]. Для изготовления КПМ используют гранулы костной крошки крупного рогатого скота и коллаген 1 типа, выделенный из свиной кожи. В конечном изделии соотношение гранул костной крошки и коллагена составляет 9:1 по массе. Смесь костной крошки и раствора коллагена замораживают при -40°C в течение 4 часов, проводят 2 цикла лиофилизации – 33 часа при −10°C и 4 часа при 10°C, затем отжигают при температуре 120°C для получения композитных каркасов кубовидной формы (называемых блоками) с последующим дегидротермическим сшиванием. Полученный материал является прочным, эластичным и биосовместимым, не вызывает выраженной воспалительной реакции, стимулирует рост костной ткани у экспериментальных животных, замещается собственной костной тканью в процессе регенерации. Однако данный способ использует ксеногенные источники коллагена и костной крошки, способные вызывать воспалительные и иммунологические осложнения, не содержит данных о размере костной крошки, что затрудняет выбор исходных компонентов для получения смеси раствора коллагена и костной крошки, не позволяет прогнозировать механические свойства готового изделия, не указывает оптимальную концентрацию коллагена в исходном растворе, что затрудняет подготовку раствора коллагена для изготовления материала, не содержит данных об адгезивных свойствах материала и возможности его насыщения ростовыми факторами, усиливающими остеогенез, не учитывает возможные деформации коллагена в процессе получения КПМ и не позволяет оценить структурную целостность коллагена в составе готовых изделий.

Технической проблемой, решаемой заявленным изобретением, является разработка состава и способа получения костно-пластического материала (КПМ) на основе аллогенной кости и коллагена с определенными биологическими свойствами (нетоксичность для клеток in vitro, способность стимулировать адгезию и пролиферацию клеток, отсутствие деформированных коллагеновых волокон в составе КПМ), предназначенного для использования в лечении дефектов костной ткани.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение трансплантата КПМ на основе материала тканевых доноров, с возможностью изменения биологических свойств на этапе производства КПМ посредством изменения состава КПМ, а именно, параметров используемых компонентов - размера костной крошки и процентного содержания коллагена 1 типа, с получением высокоадгезивного для клеток человека КПМ, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс. на см² и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой, или низкоадгезивного для клеток человека КПМ, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ не более 2 тыс. на см², отсутствием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой, при этом с заданной гомогенностью распределения костной крошки (высокой, средней или низкой).

Высокоадгезивный КПМ может найти применение при остеоиндуктивном остеогенезе, при лечении дефектов костной ткани с низкой активностью остеобластов, низкой активностью роста сосудов и малым регенеративным потенциалом ткани. Низкоадгезивный КПМ может найти применение при остеокондуктивном остеогенезе, при лечении дефектов костной ткани с высокой активностью остеобластов, высокой активностью роста сосудов и большим регенеративным потенциалом ткани. КПМ с высокой гомогенностью распределения материала может найти применение при лечении дефектов костной ткани с постоянной высокой механической нагрузкой. КПМ с низкой гомогенностью может быть использован при лечении дефектов кости, где постоянная механическая нагрузка отсутствует. КПМ со средней гомогенностью распределения костной крошки является промежуточным вариантом между двумя упомянутыми материалами, который может быть принят в качестве универсального, позволяющего его использовать при лечении дефектов кости как с высокой, так и низкой механической нагрузкой.

Технический результат достигается способом получения костно-пластического материала (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, который включает смешивание раствора коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костной крошки, полученной из кости тканевых доноров, с последующей лиофилизацией и стерилизацией, при этом для получения высокоадгезивного для клеток человека материала (характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс. на см² и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой) с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 500-630 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала со средней гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 250-315 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 80 -180 мкм, для получения низкоадгезивного материала (характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ не более 2 тыс. на см2, отсутствием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой) с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 700-800 мкм или 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 80-180 мкм, для получения низкоадгезивного материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 250-800 мкм. При этом смесь костной крошки и коллагена обладает: низкой гомогенностью в случае, если происходит образование сгустков крошки и коллагена во всем объеме смеси и если полностью размешать сгустки не удается; средней гомогенностью – если при смешивании со скоростью 50-60 оборотов в минуту образуются отдельные сгустки, а при смешивании со скоростью 70-90 оборотов в минуту сгустки исчезают; высокой гомогенностью – если при смешивании со скоростью 50-60 оборотов в минуту сгустки не образуются. Значения перечисленных параметров могут отличаться от указанных выше, на величину погрешности, не более чем на 10%.

Перед применением КПМ (лиофилизированный трансплантат) вымачивают в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9%) в течение 30-60 мин.

Контроль качества коллагеновых волокон проводят посредством регистрации автофлуоресценции коллагена с помощью флуоресцентной микроскопии [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. –2017. –Т.9, №2. С. 83–90]. При получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее для КПМ с использованием 0,8% раствора коллагена, или 40 FC и менее для КПМ с использованием 1,1% раствора коллагена, КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани

Лиофилизация может быть проведена под вакуумом сначала при температуре -35°С в течение 20-40 мин, затем температуру постепенно поднимают до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов.

Перед применением полученный КПМ вымачивают в изотоническом растворе хлорида натрия - 0,9% NaCl, в течение не менее 30 мин.

Рост-стимулирующие свойства КПМ могут быть повышены посредством добавления лизата бедной или богатой тромбоцитами плазмы, содержащей факторы роста, из расчета 40-50 мкл на 1 см² трансплантата после вымачивания в изотоническом растворе хлорида натрия. Изготовление тромбоцитных препаратов может быть проведено по известной методике [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В., Пономарев И.Н. Ростстимулирующий эффект тромбоцитарных препаратов, полученных разными способами, в культуре фибробластов человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг 1 представлены образцы костно-пластического материала, приготовленного с использованием 0,8% раствора коллагена, в виде уплощенной губки (А) и кубической губки (Б); на фиг. 2 представлена автофлуоресценция коллагена в составе костно-пластического материала с высокой (а) и низкой (б) гомогенностью, увеличение х40; на фиг. 3 представлена фотография витально окрашенных (трипафлавином и акридиновым оранжевым) клеток линии М-22 на коллагеновых матрицах, полученных из 0,8% раствора коллагена, через 3 суток культивирования. Увеличение х100. Окраска трипафлавином-акридиновым оранжевым. а – коллагеновая повязка (без костной крошки); б – КПМ из 0,8% коллагена и костной крошки без вымачивания. в – КПМ из 0,8% коллагена и костной крошки, предварительно вымоченный в изотоничном физрастворе в течение 40 минут; на фиг. 4 показана плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования на поверхности предварительно вымоченного костно-пластического материала (КПМ), полученного с использованием 0,8% раствора коллагена (а) и 1,1% коллагена (б); на фиг. 5 показана автофлуоресценция коллагена в составе коллагеновых повязок (а) и костно-пластического материала (КПМ) с разным качеством коллагеновых волокон (б-3). Увеличение х40. а – коллагеновая повязка, полученная из 0,8% раствора коллагена; б – КПМ, полученный из 0,8% раствора коллагена; в, г – КПМ, полученный из 1,1% раствора коллагена (в – нормальное качество волокон, г – высокое содержание деформированных волокон); д – КПМ, полученный из 0,8% раствора коллагена, после экспозиции в культуральной среде в течение 4 недель (химическая деградация волокон слабо выражена); е, ж, з – КПМ, полученный из 1,1% раствора коллагена, после экспозиции в культуральной среде в течение 4 недель (е – химическая деградация волокон слабо выражена, ж – очень сильная деградация волокон, з – декомпактизация волокон); на фиг. 6 показана пролиферативная активность фибробластов линии М-22 в составе костно-пластического материала через 3 суток культивирования. Витальное окрашивание трипафлавином-акридиновым оранжевым. Увеличение х200. а – КПМ без тромбоцитных препаратов; б – КПМ + богатая тромбоцитами плазма; в – КПМ + лизат богатой тромбоцитами плазмы.

Осуществление изобретения

Способ приготовления заявленного костно-пластического материала включает следующие этапы:

1. Выделение коллагена 1 типа человека из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции в 0,01 М уксусной кислоты, которое может быть реализовано известными из уровня техники способами [Ермолов А.С., Смирнов С.В., Хватов В.Б., Истранов Л.П., Конюшко О.И., Колокольчикова Е.Г. и др. Применение биологически активных раневых покрытий, стимулирующих регенерацию эпителия ожоговых ран IIIа степени. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2008;(3):166-170].

2. Получение костной крошки из губчатой кости тканевых доноров размером 80-800 мкм [Хватов В.Б., Свищев А.В., Ваза А.Ю., Боровкова Н.В., Миронов А.С., Похитонов Д.Ю. и др. Способ изготовления лиофилизированного аллотрансплантата кости. Трансплантология. 2016;(1):13-18].

3. Смешивание раствора коллагена, полученного на первом этапе, и костной крошки, полученной на втором этапе, для получения КПМ с заданными свойствами.

3.1. Например, смешивание 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 500-630 мкм для получения высокоадгезивного материала c высокой гомогенностью распределения костной крошки или 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 250-315 мкм для получения высокоадгезивного материала c средней гомогенностью распределения костной крошки или 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 80-180 мкм для получения высокоадгезивного материала низкой гомогенностью распределения костной крошки.

3.2. Смешивание раствора коллагена и костной крошки 100 мл раствора 0,8% коллагена и 6 грамм костной крошки размером 700-800 мкм или 1,1% раствора коллагена и 6 грамм костной крошки диаметром 80-180 мкм для получения низкоадгезивного материала с высокой гомогенностью распределения костной крошки или 1,1% раствора коллагена и 6 грамм костной крошки диаметром 250-800 мкм для получения низкоадгезивного материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки.

4. Лиофилизация смеси жидкого коллагена и костной крошки: сначала лиофилизацию проводят под вакуумом при -35°С в течение 20-40 мин, после этого температуру постепенно поднимают со скоростью 1°С в минуту до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов до получение конечного продукта с остаточным содержанием влаги по массе не более 4%. Лиофилизация смеси жидкого коллагена и костной крошки может быть выполнена по известной из уровня техники методике [см. например, Патент РФ на изобретение 2721873 «Аллогенный комбинированный костный трансплантат для лечения сложных переломов проксимального отдела плечевой кости, способ его получения»]. Полученный КПМ представляет собой губчатую структуру, которая может производиться в виде гранул, пластин, а также с заданной формой для конкретного применения, например, может иметь уплощенную форму (малая высота относительно длины и ширины), цилиндрическую или кубическую форму. Форма изделия, как правило, зависит от линейных размеров емкости, в которую заливается смесь раствора коллагена и костной крошки перед лиофилизацией.

1. Упаковка готовых КПМ в двойные полипропиленовые пакеты или полиэтиленовую медицинскую упаковывающую пленку, используя электрический запаиватель для вакуумной упаковки. Размер упаковок может варьироваться от 5×5 до 10×20 см.

2. Стерилизация КПМ, например, путем радиационной обработкой с дозой 25кГр.

Подготовка КПМ к клиническому использованию включает следующие этапы:

3. Оценка структурной целостности коллагеновых волокон КПМ путем регистрации автофлуоресценции коллагена. Оценка структурной целостности коллагеновых волокон КПМ может быть приведена с помощью известных методик [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. –2017. –Т.9, №2. –С. 83–90]. В КПМ без дефектных коллагеновых волокон уровень автофлуоресценции составляет не более 30 фут-кандел для КПМ, полученных с использованием 0,8% раствора коллагена, и не более 40 фут-кандел для КПМ, полученных с использованием 1,1% раствора коллагена.

4. Вымачивание КПМ с нормальной структурой коллагеновых волокон (без содержания дефектных волокон) в изотоническом физрастворе (0,9% хлорид натрия) не менее 30 минут.

5. Насыщение КПМ тромбоцитными препаратами при необходимости (богатая и бедная тромбоцитами плазма, лизат богатой и бедной тромбоцитами плазмы) из расчета 40-50 мкл тромбоцитного препарата на 1 см² КПМ. Тромбоцитные препараты могут быть нанесены на поверхность КПМ любыми известными из уровня техники средствами, например, с помощью пипетки или шприца в стерильных условиях непосредственно перед операцией или интраоперационно. Изготовление тромбоцитных препаратов может быть реализовано по известной методике [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В., Пономарев И.Н. Ростстимулирующий эффект тромбоцитарных препаратов, полученных разными способами, в культуре фибробластов человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2022;(3):183-188. https://doi.org/10.47056/1814-3490-2022-3-183-188].

В зависимости от типа патологии могут быть использованы КПМ с разными биологическими характеристиками (Табл. 1). Линейные размеры КПМ можно задавать с учетом клинических потребностей (Фиг. 1).

Таблица 1. Примеры применения костно-пластического материала в зависимости от заданных биологических характеристик

Концентрация коллагена в исходном растворе и размер костной крошки Биологические характеристики Тип патологии 0,8% раствор коллагена + костная крошка размером 250-630 мкм Высокая гомогенность / средняя гомогенность, высокая адгезивность Дефекты кортикальной кости, дефекты свода черепа, многооскольчатые переломы, остеопороз, аваскулярный остеонекроз, несращивающиеся переломы 1,1% раствор коллагена + костная крошка размером 80-180 мкм Высокая гомогенность, низкая адгезивность Переломы трубчатых костей, переломы голеностопа 0,8% раствор коллагена + костная крошка размером 700-800 мкм или 1,1% раствор коллагена + костная крошка размером 250-800 мкм Низкая гомогенность, низкая адгезивность Переломы трубчатых костей, дефекты и переломы челюсти, экстракция зуба

Аутотрансплантат КПМ на основе материала тканевых доноров с перечисленными биологическими свойствами был разработан по результатам проведения исследований.

На первом этапе решения поставленной задачи по разработке КПМ с заданными свойствами определяли оптимальное соотношение раствора коллагена и костной крошки, а также биосовместимость готовых изделий. В процессе разработки КПМ был получен цельный трансплантат с гомогенным распределением компонентов. Гомогенность распределения крошки влияет на интенсивность контакта гидроксиапатита в составе крошки с карбоксильными и аминогруппами в составе коллагена. При высокой гомогенности распределения формируется упорядоченная внутренняя структура, которая повышает механические характеристики КПМ, сохранность его компонентов и их биосовместимость [Chitosan-collagen-hydroxyapatite membranes for tissue engineering. Becerra J, Rodriguez M, Leal D, Noris-Suarez K, Gonzalez G. J Mater Sci Mater Med. 2022 Jan 24;33(2):18. doi: 10.1007/s10856-022-06643-w]. В процессе разработки КПМ необходимо было добиться максимального насыщения раствора коллагена костной крошкой, чтобы при этом гранулы крошки равномерно распределялись по объему и не высыпались из готового трансплантата после лиофилизации. Экспериментально было установлено, что в 100 мл раствора коллагена удается гомогенно распределить от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки. Если масса костной крошки была меньше 5,5 грамм, в готовом изделии формировались обширные зоны коллагена без костной крошки. Если масса костной крошки превышала 6,5 грамм, полученная смесь теряла гомогенность, образовывались конгломераты, а после лиофилизации трансплантат фрагментировался. Таким образом, при производстве КПМ было выявлено, что оптимальным соотношением костной крошки с раствором коллагена является 5,5-6,5 грамм на 100 мл. При оценке КПМ, полученных с использованием крошки разного размера и двух концентраций коллагена, было показано, что при использовании 0,8% раствора коллагена наиболее гомогенную смесь удается получить в случае замешивания относительно крупной костной крошки (500-800 мкм). В опытах с растворами 1,1% коллагена, напротив, наиболее гомогенная смесь образовывалась с использованием крошки диаметром 80-180 мкм (табл. 2). После лиофилизации все образцы были стабильными и не фрагментировались. В опытах in vitro параллельно оценивали образцы КПМ и коллагеновые повязки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена (0,8% и 1,1%).

Таблица 2. Оценка степени гомогенности смеси костной крошки и раствора коллагена

Параметры Концентрация коллагена в растворе Размер гранул костной крошки, мкм 0,8 % 1,1 % 80-180 Низкая Высокая 250-315 Средняя Низкая 500-630 Высокая Низкая 700-800 Высокая Низкая Низкая гомогенность – происходит образование сгустков крошки и коллагена во всем объеме смеси, полностью размешать сгустки не удается Средняя гомогенность – при смешивании со скоростью 50-60 оборотов в минуту образуются отдельные сгустки, при смешивании со скоростью 70-90 оборотов в минуту сгустки исчезают. Высокая гомогенность – при смешивании со скоростью 50-60 оборотов в минуту сгустки не образуются.
Смешивание может осуществляться с использованием механической мешалки, например, с диаметром лопастей 12-15 см и шириной лопастей 0,5-1 см.

Низкая гомогенность распределения материала в КПМ отчетливо наблюдается в процессе регистрации автофлуоресценции коллагена. При высокой гомогенности в КПМ коллаген равномерно заполняет все пространство изделия, зоны с очень слабым свечением (признак резко сниженной концентрации коллагена) не выявляются или выявляются очень редко, контуры отдельных гранул выявляются нечетко (Фиг. 2а). Напротив, в КПМ с низкой гомогенностью материала видны зоны сгущения коллагеновых волокон, видны участки с очень низким содержанием коллагена, удается четко наблюдать контуры гранул костной крошки на поверхности КПМ (Фиг. 2б). Таким образом, гомогенность готового изделия можно оценить в процессе анализа автофлуоресценции коллагена с помощью флуоресцентной микроскопии.

Для оценки биосовместимости готовых изделий in vitro использовали образцы КПМ, изготовленные на основе 0,8% раствора коллагена 1 типа и костной крошки размером 315-630 мкм. Оценку биосовместимости проводили на примере культуры фибробластов человека линии М-22. В лунки 4-луночного планшета с площадью ростовой поверхности 1,9 см² вносили по 10 тыс. клеток в среде ДМЭМ, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. В контрольные лунки вносили суспензию клеток без КПМ, в опытные лунки помещали готовые лиофилизированные образцы КПМ, не подвергавшиеся дополнительным обработкам, затем вносили суспензию клеток. Клетки инкубировали 3 суток при температуре 37°С и 5% концентрации СО2 в атмосфере. Оценивали количество клеток на дне лунок, и на поверхности трансплантатов, общую структурную целостность клеток и их морфологию. Для этого клетки окрашивали витальным (прижизненным) флуорохромным красителем на основе трипафлавина-акридинового оранжевого или трипафлавина-родамина С и исследовали в конфокальный люминесцентный микроскоп Nikon 80i (Nikon, Япония). Уже через 1 час после помещения КПМ в культуральную среду отмечалось изменение окраски индикатора питательной среды, смещение pH среды в кислую сторону (ацидогенность), которое не было связано с контаминацией образцов патогенной флорой. Через 3 суток культивирования на дне лунок с КПМ число клеток было очень низким и не превышало в среднем 1 тыс. на см². В то же время в контрольных лунках содержание клеток составляло 14-15 тыс. на 1 см². В составе КПМ клетки не выявлялись (Фиг. 3), таким образом, заметное снижение числа клеток на дне лунок не было связано с их миграцией внутрь трансплантата. Одновременно с этим в опытных лунках в культуральной среде отмечали большое количество ошаренных клеток, с характерными апоптотическими изменениями. Таким образом, лиофилизированные образцы КПМ, не подвергавшиеся предварительной подготовке/обработке для работы с клетками, обладали выраженной ацидогенностью и токсичностью, что приводило к массовой гибели клеток в культуре.

Для снижения ацидогенности и токсичности КПМ было предложено два способа. В первой серии экспериментов трансплантаты готовили по указанной выше методике, затем образцы замачивали в 0,9% растворе хлорида натрия (NaCl) в течение 10, 20, 30, 40, 50 или 60 минут, после этого образцы КПМ помещали в культуру клеток. Во второй серии экспериментов смесь раствора коллагена и костной крошки до замораживания отмывали в дистиллированной воде. Один цикл отмывания включал центрифугирование смеси костной крошки и коллагена в пробирке типа Falcon с ускорением 3000 g 20 минут, полное замещение супернатанта эквивалентным объемом стерильной дистиллированной воды, ресуспендирование содержимого в пробирке. Число циклов отмывания варьировало от 1 до 4. После отмывания смесь коллагена и костной крошки замораживали, лиофилизировали, перед помещением в культуру клеток замачивания в физрастворе не проводили. В контрольных лунках (без КПМ) число клеток после 3 суток культивирования на дне лунок составляло 23-24 тыс./см², тогда как в опытах с исходным КПМ этот параметр не превышал 0,9-1,0 тыс./см², на поверхности КПМ клетки полностью отсутствовали (табл. 3). В лунках, где образцы КПМ предварительно вымачивали в изотоничном растворе NaCl, количество клеток на дне составляло от 3,0±0,5 до 17,5±0,8 тыс./см² и увеличивалось по мере роста длительности вымачивания изделия с 10 до 50 минут. Параллельно увеличивалось число клеток на трансплантате: после вымачивания 20 минут их количество составляло 1,0±0,2 тыс./см², а после 50 минут достигало 4,5±0,7 тыс./см². Стоит особо подчеркнуть, что в опытах, где вымачивание КПМ продолжалось 10-20 минут, многие клетки на дне лунок и на поверхности трансплантата имели ошаренный или измененный вид, плохо контактировали с пластиком. Витальное окрашивание клеток показало заметное снижение яркости наружной мембраны, резкое снижение количества секреторных везикул в составе клеток, свидетельствующие о деформации клеток, разрушении их вакуолярных структур, нарушении контактных взаимодействий, что в совокупности можно расценить как токсический эффект. В опытах, где вымачивание составляло 30-50 мин, ошаренные клетки отсутствовали, соответственно, морфология клеток была нормальной или близкой к норме. В случае вымачивания КПМ 60 минут число клеток и их морфология значимо не отличались от опытов, где вымачивание составило 50 мин. В серии экспериментов, где проводили отмывание смеси коллагена и костной крошки до лиофилизации, отмечалось поэтапное изменение её pH с 3,3 до 6,1 по мере увеличения количества циклов обработки до 4. При исследовании in vitro количество клеток на дне лунок, в которые помещали КПМ, прошедшие разное количество циклов дополнительной обработки, составляло от 5,0 до 7,5 тыс./см² (р>0,05). В то же время плотность клеток на поверхности трансплантата после 3-4 отмываний коллагена была выше, чем после 1-2 отмываний. Однако абсолютные значения были во всех случаях очень низкими, не превышали 2 тыс./см2 и были ниже, чем в опытах с вымачиванием трансплантатов в течение 30-60 мин (табл. 3). Таким образом, вымачивание готовых лиофилизированных трансплантатов КПМ в физрастворе более эффективно снижает их токсичность, продолжительность вымачивания должна составлять не менее 30 минут.

Таблица 3. Оценка биосовместимости трансплантатов костно-пластического материала, подготовленных разными способами

Вымачивание готового лиофилизированного трансплантата в изотоническом физрастворе (0,9% хлорид натрия) Время экспозиции КПМ
в изотоническом физрастворе Плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования, тыс./см² Дно лунки Поверхность трансплантата Контроль 1. Лунки с клетками без трансплантата 24,1±1,2 - Контроль 2. 0 мин (трансплантат без вымачивания) 1,0±0,2 0 10 мин 3,0±0,5 0 20 мин 5,3±0,4 1,0±0,2 30 мин 11,1±1,0 2,6±0,5 40 мин 13,0±1,0 2,8±0,6 50 мин 17,5±0,8 4,5±0,7 60 мин 17,0±1,0 4,0±0,6 Отмывание смеси жидкого коллагена и костной крошки от кислой среды дистиллированной водой с последующей лиофилизацией Количество отмываний Плотность клеток линии М-22 через 3 суток культивирования, тыс./см² Дно лунки Поверхность трансплантата Контроль (лунки с клетками без трансплантата 23,5±1,0 - Контроль 2 (без отмывания) 0,9±0,2 0 1 раз 6,5±1,2 1,0±0,3 2 раза 7,5±1,6 1.0±0,2 3 раза 7,5±1,9 1,6±0,2 4 раза 5,0±0,9 1,8±0,2

На втором этапе исследовали адгезивные свойства КПМ, полученные с использованием костной крошки разного диаметра и раствора коллагена в двух концентрациях, параллельно исследовали коллагеновые губки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена без использования костной крошки. В работе использовали 8 типов КПМ, полученных из 0,8% или 1,1% раствора коллагена 1 типа человека и костной крошки одного из размеров: 80-180 мкм, 250-315 мкм, 500-630 мкм, 700-800 мкм. После совмещения компонентов оценивали характер распределения костной крошки в коллагене (гомогенность), после лиофилизации оценивали стабильность готового изделия, характер распределения коллагена и структурную целостность волокон. Помимо этого, в культуре клеток оценивали токсичность образцов КПМ и возможность ее редукции путем отмывания в физиологическом растворе хлорида натрия в течение 30 минут. Структурную целостность коллагена оценивали по уровню автофлуоресценции коллагеновых волокон в составе КПМ. Регистрацию автофлуоресценции коллагена в образцах КПМ проводили при синем светофильтре (λ возбуждения=380-420 нм, λ эмиссии – от 450 нм, время экспозиции – 1сек). Для количественной характеристики автофлуоресценции коллагена использовали параметр средней интенсивности свечения (в фут-канделах, foot candle, FC). Для сравнения оценивали свечения коллагеновых волокон в составе коллагеновых повязок, приготовленных с использованием того же раствора коллагена по известной методике. Химическая деградация коллагена сопровождается резким увеличением автофлуоресценции волокон и превышает 60 FC [Макаров М.С., Сторожева М.В., Боровкова Н.В. Значение автофлюоресценции коллагеновых волокон для оценки биологических свойств тканевых трансплантатов // Современные технологии в медицине. –2017. –Т.9, №2. –С. 83–90].

После лиофилизации все образцы были стабильными и не фрагментировались. В опытах in vitro параллельно оценивали образцы КПМ и коллагеновые повязки, полученные из раствора с той же концентрацией коллагена (0,8% и 1,1%). В присутствии коллагеновых повязок не наблюдалось деформации клеток на дне лунок и в составе трансплантатов, клетки адгезировали на поверхности повязок (Фиг. 3а). Все образцы КПМ без предварительного вымачивания были токсичными и препятствовали росту клеток (Фиг. 1б). В опытах, где КПМ предварительно вымачивали в изотоническом физрастворе в течение 30-50 минут, не наблюдалось выраженной деформации клеток. В КПМ, полученных из 0,8% раствора коллагена, образцы КПМ с костной крошкой диаметром 80-630 мкм через 3 суток культивирования имели сходную плотность клеток на своей поверхности (Фиг. 3в) и значимо не отличались от коллагеновых трансплантатов без костной крошки, тогда как в КПМ с костной крошкой диаметром 700-800 мкм число клеток было ниже в 3-4 раза (Фиг. 4а). Число клеток на дне лунок было наибольшим в опытах, где диаметр костной крошки составлял 80-180 мкм, что может быть с менее активной миграцией клеток в КПМ из-за низкой гомогенности материала в его составе. В КПМ, полученных из 1,1% раствора коллагена, адгезия клеток на поверхности КПМ была гораздо менее выраженной, чем на коллагене без костной крошки и в КПМ, приготовленном с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-630 мкм и не превышала 2 тыс. на см² (Фиг. 4б). В целом, можно заключить, что 0,8% раствор коллагена более предпочтителен для изготовления КПМ, чем 1,1% раствор. КПМ, приготовленные с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-630 мкм после предварительного вымачивания являются высокоадгезивными для клеток, КПМ, приготовленные с использованием 0,8% раствора коллагена и костной крошки диаметром 700-800 мкм или 1,1% раствора коллагена и костной крошки диаметром 80-800 мкм после предварительного вымачивания являются низкоадгезивными для клеток.

На третьем этапе оценивали структурную целостность коллагена в готовых трансплантатах, их устойчивость к биодеградации и возможность насыщения ростовыми факторами. Для оценки качества коллагена оценивали автофлуоресценцию коллагеновых волокон в КПМ и в коллагеновых повязках, полученных из раствора с той же концентрацией коллагена, которая использовалась при изготовлении КПМ (0,8% и 1,1%). При анализе автофлуоресценции коллагена в коллагеновых повязках отчетливо выявлялись зоны с диффузным расположением коллагена и зоны с коллагеновыми волокнами (Фиг. 5а). В образцах КПМ коллагеновые волокна выявлялись гораздо реже, основная область была заполнена диффузным слоем коллагена (Фиг. 5б,в). В большинстве случаев средняя интенсивность автофлуоресценции коллагена в повязках и КПМ с 0,8% коллагена значимо не отличалась и составляла в среднем 28±1 FC. Тем не менее, среди образцов КПМ встречались образцы, где уровень автофлуоресценции составлял от 40 до 50 FC из-за высокого содержания дефектных волокон. В таких образах КПМ при малом увеличении (х40) выявляется не меньше 1-2 зон с волокнами яркостью 60 FC и выше в каждом поле зрения (Фиг. 5г). Доля КПМ с высоким уровнем дефектных волокон не превышала 10% от всего числа КПМ, тем не менее, мониторинг качества коллагена является актуальным. КПМ с высоким содержанием дефектных волокон может обладать повышенной токсичностью и склонностью к биодеградации, в связи с этим такие образцы КПМ необходимо элиминировать еще до стадии клинического использования.

Для оценки биодеградации КПМ in vitro изначально отбирали образцы, не содержащие деградирующих волокон (яркостью 60 фут-кандел и выше), с высокой гомогенностью распределения костной крошки. В исходных образцах КПМ, приготовленных с помощью 0,8% раствора коллагена (1 группа), уровень автофлуоресценции коллагеновых волокон составлял 27±1 фут-кандел, в КПМ, приготовленных с помощью 1,1% раствора коллагена (2 группа) – 32±1 фут-кандел. Исследуемые образцы экспонировали в течение 4 недель в культуральной среде ДМЭМ и в изотоническом физрастворе (0,9% NaCl). Экспозицию в среде ДМЭМ проводили без клеток, в присутствии клеток линии М-22, в присутствии клеток с предварительным вымачиванием КПМ в лизате бедной тромбоцитами плазмы. Оценивали структурную целостность волокон коллагена и массу КПМ. Через 2 недели экспозиции уровень автофлуоресценции во всех образах КПМ 2 группы значимо не менялся, в 1 группе уровень автофлуоресценции в образцах, экспонированных в изотоническом физрастворе (0,9% NaCl), был незначительно снижен и достоверно не отличался от исходных образцов, рисунок распределения волокон также не менялся. Напротив, через 4 недели в обеих группах топография волокон заметно изменялась, во многих участках КПМ коллагеновые волокна не выявлялись, вместо них можно было видеть диффузное распределение коллагена с низкой интенсивностью свечения (15-18 фут-кандел), что указывает на деконденсацию коллагена. Одновременно с этим выявлялись участки, где уровень автофлуоресценции превышал 60 фут-кандел. В опытах, где образцы КПМ экспонировались в культуральной среде, фрагменты волокон с яркостью 60 фут-кандел были немногочисленными (Фиг. 5д,е). Напротив, в опытах, где КПМ экспонировали в изотоническом физрастворе, волокна с яркостью 60 фут-кандел занимали обширные зоны, чаще всего были тесно ассоциированы с костной крошкой и давали гомогенную картину свечения (Фиг. 5ж). Стоит отметить, что в КПМ 2 группы (полученные с использованием 1,1% раствора коллагена) химическая деградация волокон была выражен сильнее, чем в КПМ 1 группы. В обеих группах предварительное вымачивание КПМ в лизате бедной тромбоцитами плазмы не влияло на интенсивность изменения топографии волокон через 4 недели. Оценка массы образцов КПМ до и после экспозиции показала, что КПМ, полученные с использованием 1,1% раствора коллагена, теряли больше материала по сравнению с КПМ, приготовленными с использованием 0,8% раствора коллагена, при этом в изотоническом физрастворе процесс биодеградации шел гораздо быстрее, чем в культуральной среде (табл. 4). С учетом того, что условия культуральной среды более приближены к среде организма, можно заключить, что разработанный материал в течение 4 недель будет иметь низкую интенсивность биодеградации, при этом сохранность структуры и объема коллагена является более высокой при использовании КПМ, полученные с использованием 0,8% раствора коллагена.

Таблица 4. Снижение массы образцов КПМ (в % от исходной) после экспозиции в культуральной среде

КПМ, приготовленный с использованием 0,7-0,8%-го раствора коллагена человека 1 типа Тип экспозиции КПМ Экспозиция 2 недели Экспозиция 4 недели В культуральной среде с клетками 4,5 3,8 В культуральной среде с клетками после обработки лизатом бедной тромбоцитами плазмы 2,2 4,4 В культуральной среде без клеток 3,8 3,8 В изотоническом физрастворе (0,9% NaCl) 11,8 34,0 КПМ, приготовленный с использованием 1,1%-го раствора коллагена человека 1 типа Тип экспозиции КПМ Экспозиция 2 недели Экспозиция 4 недели В культуральной среде с клетками 3,9 5,5 В культуральной среде с клетками после обработки лизатом бедной тромбоцитами плазмы 2,5 8,2 В культуральной среде без клеток 2,9 10,7 В изотоническом физрастворе (0,9% NaCl) 14,1 35,4

С учетом полученных данных, для насыщения тромбоцитными препаратами использовали образцы КПМ, предварительно вымоченные в изотоническом физрастворе. Было установлено, что 1 см² КПМ после вымачивания в изотоническом физрастворе нормально адсорбирует 40-50 мл тромбоцитных препаратов. При этом может быть использована богатая и бедная тромбоцитами плазма, а также лизат богатой и бедной тромбоцитами плазмы, полученный путем криодеструкции тромбоцитов.

Были проведены исследования в культуре клеток М-22 с использованием богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) и лизата БоТП. Объем внесенных тромбоцитных препаратов исходно содержал 100-125 млн тромбоцитов с гранулами, содержание тромбоцитарного фактора PDGF составляло 150-200 пг/мл, что является оптимальным в расчете на 100 тыс. высеянных клеток. Добавление тромбоцитных препаратов в КПМ с высокой адгезивностью заметно увеличивало пролиферативную активность фибробластов культуры М-22 в их составе: через 3 суток плотность клеток на поверхности КПМ с лизатом БоТП была выше в среднем в 2,1 раза, на поверхности КПМ с БоТП – в 1,6 раз по сравнению с КПМ без тромбоцитных препаратов (Фиг. 6). В составе КПМ с БоТП и лизатом БоТП клетки имели нормальную структуру ядра и цитоплазмы, содержали большое число секреторных везикул. Таким образом, насыщение КПМ тромбоцитными препаратами дополнительно усиливает биокондуктивные свойства этих трансплантатов.

Таким образом, костно-пластический материал (КПМ) на основе костной крошки и коллагена тканевых доноров не вызывает иммунологических реакций в тканях человека, может быть дополнительно насыщен ростовыми факторами, выделенными из собственной крови пациента. В зависимости от поставленной клинической задачи, в рамках предлагаемого способа могут быть получены изделия КПМ с разными биологическими характеристиками. Критически значимым является вымачивание изделий перед клиническим применением в изотоническом растворе хлорида натрия (0,9% NaCl) с целью снижения их ацидогенности и повышения биосовместимости. КПМ, полученные с использованием 0,8% раствора коллагена, более удобны для получения высокоадгезивного материала с гомогенным распределением костной крошки, менее подвержены биодеградации. КПМ, полученные с использованием 1,1% раствора коллагена, могут быть использованы для стимуляции остеокондуктивного остеогенеза в тканях с высокой репаративной активностью, КПМ с низкой адгезивностью и высокой гомогенностью могут быть использованы при лечении дефектов костной ткани с постоянной высокой механической нагрузкой, КПМ с низкой адгезивностью и с низкой гомогенностью могут быть использованы при лечении дефектов кости, где постоянная механическая нагрузка отсутствует.

Настоящее изобретение относится к способу получения костно-пластического материала (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, представляющего собой губку уплощенной, цилиндрической или кубической формы, включающему смешивание коллагена и костной крошки с последующей лиофилизацией и стерилизацией полученной смеси, отличающемуся тем, что для смешивания используют раствор коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костную крошку, полученную из тканевых доноров, где на 100 мл коллагена берут от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки, при этом для получения высокоадгезивного для клеток человека материала с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 500-630 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала со средней гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 250-315 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 80-180 мкм, для получения низкоадгезивного материала с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 700-800 мкм или 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 80-180 мкм, для получения низкоадгезивного материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 250-800 мкм. Настоящее изобретение обеспечивает получение трансплантата КПМ на основе материала тканевых доноров, с возможностью изменения биологических свойств на этапе производства КПМ посредством изменения состава КПМ, а именно параметров используемых компонентов - размера костной крошки и процентного содержания коллагена 1 типа, с получением высокоадгезивного для клеток человека КПМ, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ 4 тыс. на см² и выше, наличием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой, или низкоадгезивного для клеток человека КПМ, характеризующегося плотностью клеток на поверхности КПМ не более 2 тыс. на см², отсутствием распластанных клеток и клеток с широкой ламеллой, при этом с заданной гомогенностью распределения костной крошки (высокой, средней или низкой). 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.

1. Способ получения костно-пластического материала (КПМ) для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани, представляющего собой губку уплощенной, цилиндрической или кубической формы, включающий смешивание коллагена и костной крошки с последующей лиофилизацией и стерилизацией полученной смеси, отличающийся тем, что для смешивания используют раствор коллагена 1 типа человека, выделенного из сухожилий тканевых доноров путем кислотной экстракции, и костную крошку, полученную из тканевых доноров, где на 100 мл коллагена берут от 5,5 до 6,5 грамм костной крошки, при этом для получения высокоадгезивного для клеток человека материала с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 500-630 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала со средней гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 250-315 мкм, для получения высокоадгезивного для клеток человека материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 80-180 мкм, для получения низкоадгезивного материала с высокой гомогенностью распределения костной крошки используют 0,8% раствор коллагена и костную крошку размером 700-800 мкм или 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 80-180 мкм, для получения низкоадгезивного материала с низкой гомогенностью распределения костной крошки используют 1,1% раствор коллагена и костную крошку размером 250-800 мкм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после лиофилизации осуществляют проверку качества получаемого КПМ с помощью флуоресцентной микроскопии, при получении значения уровня автофлуоресценции 30 FC и менее для КПМ с использованием 0,8% раствора коллагена или 40 FC и менее для КПМ с использованием 1,1% раствора коллагена полученный КПМ считают пригодным для последующего использования для стимуляции репаративных процессов в дефектах костной ткани.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофилизацию сначала проводят под вакуумом при -35°С в течение 20-40 мин, затем температуру постепенно поднимают до +36°С и лиофилизируют КПМ в течение 18-24 часов.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед применением полученный КПМ вымачивают в изотоническом растворе хлорида натрия - 0,9% NaCl в течение не менее 30 мин.