КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ВАРИАНТЫ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ СО СНИЖЕННЫМ СРОДСТВОМ К НЕЦЕЛЛЮЛОЗНЫМ МАТЕРИАЛАМ Российский патент 2013 года по МПК C12N9/42 C12P19/02 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к области биохимии. Представлены выделенные варианты целлюлазы, где указанные варианты являются вариантами исходной целлюлазы, аминокислотная последовательность которой идентична, по меньшей мере, на 75% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, при этом один вариант включает замену в положении, выбранном из положения 63, 77, 129, 147, 153, 157, 161, 194, 197, 203, 237, 239, 247, 254, 281, 285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378 или 382, а второй вариант целлюлазы содержит дополнительно к одной из вышеуказанных замен замену в положении 146, 151, 189, 208, 211, 244, 277 или 405, где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью эталонной целлобиогидролазы II (СВН2), представленной в SEQ ID NO: 3, и где замена в одном или более положении является причиной того, что вариант целлюлазы имеет более отрицательный результирующий заряд, чем эталонная СВН2, при этом вариант целлюлазы обладает повышенной целлюлолитической активностью по сравнению с целлюлазами дикого типа. Раскрыты способы преобразования биомассы и продуцирования топлива с использованием указанного варианта целлюлазы. Изобретение позволяет получать целлюлазы с повышенной целлюлолитической активностью по сравнению с целлюлазами дикого типа. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 9 пр.

1. Выделенный вариант целлюлазы, который является зрелой формой, обладающей целлюлазной активностью, и где указанный вариант является вариантом исходной целлюлазы, аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере на 75% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, при этом вариант включает замену в положении, выбранном из положения 63, 77, 129, 147, 153, 157, 161, 194, 197, 203, 237, 239, 247, 254, 281, 285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378 или 382, причем положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью эталонной целлобиогидролазы II (СВН2), представленной в SEQ ID NO: 3, а замена в указанном положении является причиной того, что вариант целлюлазы имеет более отрицательный результирующий заряд, чем эталонная СВН2, при этом вариант целлюлазы обладает повышенной целлюлолитической активностью по сравнению с целлюлазами дикого типа.

2. Выделенный вариант целлюлазы по п.1, в котором замена приводит к удалению одного или более положительных зарядов.

3. Выделенный вариант целлюлазы по п.2, в котором удаление одного или более положительных зарядов включает замену лизина или аргинина нейтральной аминокислотой.

4. Выделенный вариант целлюлазы по п.1, в котором замена приводит к добавлению одного или более отрицательных зарядов.

5. Выделенный вариант целлюлазы по п.4, в котором добавление одного или более отрицательных зарядов включает замену нейтральной аминокислоты отрицательно заряженной аминокислотой.

6. Выделенный вариант целлюлазы по п.1, в котором замена приводит к удалению одного или более положительных зарядов и к добавлению одного или более отрицательных зарядов.

7. Выделенный вариант целлюлазы по п.6, в котором удаление одного или более положительных зарядов и добавление одного или более отрицательных зарядов включает замену лизина или аргинина отрицательно заряженной аминокислотой.

8. Выделенный вариант целлюлазы по п.1, в котором замена представляет собой К129Е, К157Е, К194Е, К288Е, К327Е, К356Е, R63Q, R77Q, R153Q, R203Q, R294Q, R378Q, N161D, N197D, N237D, N247D, N254D, N285D, N289D, N339D, N344D, N382D, Q147E, Q239E или Q281E, причем положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью эталонной целлобиогидролазы II (СВН2), представленной в SEQ ID NO: 3.

9. Выделенный вариант целлюлазы, который является зрелой формой, обладающей целлюлазной активностью, и где указанный вариант является вариантом исходной целлюлазы, аминокислотная последовательность которой идентична по меньшей мере на 75% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, при этом вариант включает первую замену в положении, выбранном из положения 63, 77, 129, 147, 153, 157, 161, 194, 197, 203, 237, 239, 247, 254, 281, 285, 288, 289, 294, 327, 339, 344, 356, 378 или 382, и вариант дополнительно включает вторую замену в положении 146, 151, 189, 208, 211, 244, 277 или 405, где положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью эталонной целлобиогидролазы II (СВН2), представленной в SEQ ID NO: 3, и где замена в одном или более положении является причиной того, что вариант целлюлазы имеет более отрицательный результирующий заряд, чем эталонная СВН2.

10. Выделенный вариант целлюлазы по п.9, в котором дополнительная замена представляет собой замену аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты нейтральной аминокислотой.

11. Выделенный вариант целлюлазы по п.9, в котором дополнительная замена представляет собой D151N, D189N, D21 IN, D277N, D405N, E146Q, E208Q или E244Q, причем положения пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью эталонной целлобиогидролазы II (СВН2), представленной в SEQ ID NO: 3.

12. Выделенный вариант целлюлазы по п.1, который происходит из исходной целлюлазы, выбираемой из группы, состоящей из СВН2 Hypocrea jecorina, CBH2 Hypocrea koningii, CBH2 Humicola insolens, CBH2 Acremonium cellulolyticus, CBH2 Agaricus bisporus, EG Fusarium osysporum, CBH2 Phanerochaete chrysosporium, CBH2 Talaromyces emersonii, CBH2 Thermobifida fusca 6B/E3, EG Thermobifida fusca 6A/E2 и EG CenA Cellulomonas fimi.

13. Выделенный вариант целлюлазы по п.1, в котором более отрицательный результирующий заряд по сравнению с эталонной СВН2 составляет -1 или -2.

14. Способ преобразования биомассы, содержащей целлюлазу, в сахара, включающий приведение указанной биомассы в контакт с вариантом целлюлазы по п.1.

15. Способ продуцирования топлива, включающий
приведение композиции биомассы, содержащей целлюлазу, в контакт с ферментной композицией, включающей вариант целлюлазы по п.1, для получения сахарного раствора и
культивирование ферментирующего микроорганизма в сахарном растворе в условиях, достаточных для продуцирования топлива.