ШТАММ ГРИБА Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom - ПРОДУЦЕНТ ШЕРИНИНОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/14 C07D521/00 C12R1/80 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма гриба - продуцента шерининов D, Е и F, обладающих противораковой активностью.

Известен штамм Penicillium sp., продуцирующий шеринины А, В, С [Belofsky G.N., Gloer J.B., Wicklow D.T., Dowd J.B. Antiinsectan alkaloids: sherinines A-С and a new paxilline derivative from the ascomata of Eupenicillium shearii. II Tetrahedron. 1995. Vol.51. N 14. P.3959-3968]. Недостатком известного штамма является низкий выход целевого продукта.

В качестве прототипа выбран известный продуцент шерининов D - К, обладающих блокирующей активностью кальций активируемых калиевых каналов, штамм гриба Penicillium sp. (strain HKI0459), поскольку этот штамм, как и заявляемый штамм, получают в культуре [Xu М., Gessner G., Groth I., Lange С., Christner А., В. Torsten, e Deng Z., Li X., Heinemann S.H., Grabley S., Bringmann G., Sattlerb I.,* and Lina W. Shearinines D-K, new indole triterpenoids from an endophytic Penicillium sp. (strain HKI0459) with blocking activity on large-conductance calcium-activated potassium channels. // Tetrahedron. 2007. V.63. P.435-444]. К недостаткам известного штамма можно отнести его низкую продуктивность в отношении биологически активных веществ - 0,123 мг/л среды.

В связи с тем, что шеринины, относящиеся к группе индольных алкалоидов, обладают противораковой активностью, и поэтому представляют значительный интерес, как перспективные противораковые препараты, ставится задача получения продукта с более высоким выходом.

Поставленная задача решена выявлением нового штамма гриба Penicillium simplicissimum, продуцирующего шеринины, обладающие противораковой активностью.

Штамм Penicillium simplicissimum выделен из морского грунта, собранного на глубине 11 м Амурского залива (Японское море), и хранится в Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) Учреждения Российской академии наук Тихоокеанский института биоорганической химии ДВО РАН под номером 4635.

Штамм Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ F-4116D.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культуральные и морфологические признаки.

Колонии, выращенные на среде Чапека, 5-7 см в диаметре, слегка войлочные, морщинистые в центре, по краю радиально-складчатые, с широким растущим краем, сначала белые, затем оранжево-красные, в конидиальной зоне зеленовато-серые; экссудат в мелких каплях, оранжевый или красный. Обратная сторона колонии оранжево-красная. Конидиеносцы поднимаются от субстрата 400-500×3,5 мкм, или от воздушных гиф 10-15×2-2,5 мкм, фиалиды 8-10×2 мкм, с длинной конидиогенной шейкой. Конидии эллипсоидные, шероховатые, 3-3,5 мкм длинной, в расходящихся или спутанных цепочках.

Колонии гриба при выращивании на среде «сусло-агар на натуральной морской воде» серые, зеленовато-серые. Реверзум не окрашенный или оранжевый. Микроскопические признаки те же, что и на среде Чапека.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо растет и образует конидии как на агаризованных средах (картофельно-сахарозный (глюкозный), приготовленной на натуральной морской воде агар, агар Чапека), так и на жидких средах того же состава (в стационарной культуре и на качалке). На среде Чапека максимальный рост отмечен на среде с мальтозой, на втором месте по усвояемости находятся сахароза и глюкоза. Из источников азота лучше всего усваиваются нитрат натрия и пептон. Среди источников углерода наибольшая интенсивность конидиобразования (1,6-2,8×10⁵ конидий/см²) отмечена на средах с мальтозой сахарозой и глюкозой (таблица).

Штамм хранится на картофельно-морковной среде (20 г картофеля, 20 г моркови, 1 л натуральной морской воды, 10 г агар-агара) под минеральным маслом [Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник - М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.]. Время пересева - раз в три года.

Новый штамм продуцирует суммарное количество шерининов, обладающих противораковой активностью, с выходом 55±2,4 мг/л питательной среды «жидкое сусло на морской воде» и 36,5±0,12 г на 1 кг питательной «просяной» среды.

Технический результат штамма гриба Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D заключается в его более высокой продуктивности. Продуктивность этого штамма в десять раз превосходит продуктивность известного грибного штамма. Кроме того, преимуществом заявляемого штамма по сравнению с прототипом является то, что для его выращивания требуется среда с меньшим числом компонентов и, что особенно важно, не включает в себя сахаров. Затраты на сахара составляют основную статью расходов на выращивание культур в промышленных масштабах. Таким образом, производство штамма гриба Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D с экономической точки зрения более выгодно по сравнению с производством штамма-прототипа.

Новый штамм может использоваться для промышленного получения шерининов, обладающих противораковой активностью.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D выращивают методом глубинного культивирования на питательной среде «жидкое сусло на морской воде» следующего состава: сусло пивное неохмеленное, разбавленное натуральной морской водой до 4 градусов по Баллингу (в трипликате) (pH 7,8-8,2). Культивирование осуществляют при 22°С в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 часов.

Мицелий с культуральной жидкостью экстрагируют 24 часа этилацетатом. После выпаривания проводят делипидизацию путем приготовления эмульсии в системе вода-этанол (4:1) и последующей переэкстракцией 1:1 последовательно гексаном, затем хлороформом. Хлороформенный экстракт выпаривают и очищают на колонке с силикагелем в градиенте гексан - этилацетат 100:0; 95:5; 90:10; 87:13; 85:15; 80:20. Фракции 2, 4, 5 и 7 содержат шеринины. Суммарный выход шерининов после выпаривания составляет 55 мг/л среды.

Пример 2. Штамм Penicillium simplicissimum ВКМ F-4116D выращивают методом твердофазного культивирования в течение трех недель при температуре 30°С на «просяной» питательной среде следующего состава: пшено 1 кг, натрий виннокислый 0,067 г, КН2Р04 0,067 г, MgSO₄×7H₂O 0,067 г, FeSO₄×7H₂O 0,007 г, натуральная морская вода 134 мл. Выделение шерининов проводят описанным в примере 1 способом. Суммарный выход шерининов составляет 36,5±0,12 г на 1 кг среды.

Полученные шеринины были исследованы на противораковую активность. Шеринины A, D и Е индуцировали апоптоз клеток лейкемии линии HL-60 в концентрации 100 µM на 10%, 39% и 34% соответственно.

Штамм гриба Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom выделен из морского грунта, собранного на глубине 11 м Амурского залива Японского моря и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ F-4116D. Для выращивания штамма используют питательную среду, не содержащую cахаров. Штамм характеризуется высокой продуктивностью шерининов, обладающих противораковой активностью. Суммарный выход шерининов составляет 55 мг/л питательной среды, основанной на жидком пивном сусле и морской воде, и 36,5 г на 1 кг питательной среды, содержащей пшено. 1 табл.

Штамм гриба Penicillium simplicissimum (Oudem.) Thom BKM F-4116D - продуцент шерининов.