СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для обнаружения псевдотуберкулезного микроба в материале от больных людей, в частности в испражнениях.

Известно много способов обработки проб и экстракции ДНК для исследования в ПЦР. Наиболее простыми методами очистки проб являются фильтрование и центрифугирование. Методики экстракции ДНК варьируют в значительной степени: от простого кипячения до сложных химических (фенолхлороформный и др.) и физических (магнитное разделение и др.) методов. При анализе отечественных и зарубежных данных по псевдотуберкулезу удалось найти специальные методики подготовки проб пищевых продуктов, воды, стерильной почвы. При выборе материала от больных для исследования в ПЦР иностранные авторы предпочитают сыворотку крови и мочу, отказываясь от исследования испражнений вследствие наличия обильной посторонней микрофлоры (Cheong H.I., Park H.W., Koo J.W., Jin D. K., Park M.S., Ha I.S., Lee H.J., Kim B.C., Choi Y. Diagnosis of Yersinia pseudotuberculosis infection by polymerase chain reaction / Pediatr. Infect. Dis. J. - 1996. - Vol. 15, N. 7. - P. 596-599.), хотя испражнения являются наиболее информативным материалом, так как в течение всего заболевания в 1 г содержится от 10² до 10⁸ жизнеспособных клеток возбудителя.

Зарубежные авторы также отмечают недостаточную эффективность иммуномагнитного разделения фекальных образцов, нуждающегося в дальнейшей оптимизации процедур подготовки пробы (Rasmussen H.N., Rasmussen O.F., Christcnsen H. , Olsen J.E. Detection of Yersinia enterocolitica О:З in faecal samples and tonsil swabs from pigs using IMS and PCR // J.Appl.Bacteriol. - 1995. -Vol.78, N. 5. - P. 563-568.).

Поэтому в качестве прототипа выбрана методика подготовки проб испражнений для исследования на псевдотуберкулез в ПЦР (Балахонов С.В. Чеснокова М.В., Бренева Н.В., Марамович А.С., Климов В.Т. Псевдотуберкулез. // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. - Саратов, 1998. - T.I.- С. 144-165.).

Способ-прототип осуществляют следующим образом: 200 мг испражнений суспендируют в 1 мл фосфатного буфера pH 7,4 и центрифугируют на малых оборотах для осаждения крупных частиц. Далее супернатант центрифугируют при 7000 об/мин одну минуту для осаждения бактерий. Осадок дважды отмывают в 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCI и 1 мМ ЭДТА pH 8,0) и ресуспендируют в 75 мкл этого же раствора, содержащего 20% сахарозы (вес/объем), 50 мМ ЭДТД и 100 мкг лизоцима. Инкубируют при 37^oC 30 минут. Затем 300 мкл 50 мМ NaCl, содержащего 1% додецилсульфата натрия (SDS) и 800 мкг протеиназы К, смешивают с пробой и инкубируют 60 минут. ДНК осаждают абсолютным спиртом с последующим центрифугированием и затем ресуспендируют в 100-300 мкл 10 мМ трис-HCI pH 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА. В реакционную смесь для ПЦР вносят 5 мкл образца.

Недостатками способа-прототипа являются:
1)в результате выполнения данного способа получается препарат ДНК всех микроорганизмов, содержащихся в пробе, что значительно снижает чувствительность и специфичность при исследовании в ПЦР, в частности, общее микробное число в 1 г испражнений здорового человека составляет 10¹⁰-10¹¹ м.к.;
2) трудоемкость и многоэтапность способа, требующего приготовления многокомпонентных растворов;
3) длительность способа (3-4 часа);
4) высокая стоимость применяемых реактивов, особенно таких как лизоцим и протеиназа К.

Эти недостатки можно отнести и ко всем другим известным способам.

Цель изобретения - повышение специфичности, ускорение и упрощение способа.

Это достигается тем, что разведенный 1:10 забуференным физиологическим раствором (ЗФР) материал кратковременно обрабатывается щелочным (КОН) раствором, затем добавляется буферный раствор для нейтрализации pH, проводится центрифугирование, при котором осаждаются преимущественно бактерии псевдотуберкулеза, устойчивые к действию щелочи, затем осадок двукратно отмывается дистиллированной водой, ресуспендируется в деионизованной воде, прогревается 10 минут при 100^oC и центрифугируется. Надосадочная жидкость используется для исследования в ПЦР.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что суспензию обрабатывают 0,72% едким калием, при этом щелочь добавляют к суспензии в соотношении 1:1 и выдерживают смесь в течение 30 секунд, затем к полученной смеси добавляют буферный раствор pH 7,2-7,4 в соотношении 2:1 соответственно, полученную смесь центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 2-5 минут, надосадочную жидкость сливают, осадок дважды промывают дистиллированной водой, центрифугируя смесь после каждого промывания, добавляют к полученному осадку деионизованную воду, прогревают смесь при 100^oC в течение 10 минут, центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 1 минуты и полученную надосадочную жидкость используют для диагностики псевдотуберкулеза методом ПЦР.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна".

Предлагаемые режимы способа в предлагаемой последовательности позволяют достичь поставленной цели, а именно:
1) высокой специфичности за счет избирательного выделения ДНК щелочеустойчивых микроорганизмов;
2) минимальных трудовых и материальных затрат, не требующих специальных реактивов и подготовки персонала;
3) экологической безопасности.

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что данный способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежной областях, так как авторами не найден способ подготовки материала для ПЦР, в котором бы использовали щелочную обработку исходного материала.

Предлагаемый способ требует в 6-7 раз меньше времени, более экономичен и прост в постановке, доступен для широкого практического применения, так как обработка щелочью позволяет избавиться от посторонней микрофлоры и заменить сложные методики экстракции ДНК простым кипячением.

Данный способ может быть выполнен в клинических и научно-исследовательских лабораториях и использован в качестве первого этапа в ПЦР-диагностике псевдотуберкулеза.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критериям изобретения "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ выполняется следующим образом:
1) исходный материал (испражнения) разводят ЗФР pH 7,2- 7,4 в 10 раз (1: 10);
2) 0,5 мл суспензии смешивают с 0,5 мл 0,72% раствора КОН (1:1) в 1,5 мл пробирке "Эппендорф" и выдерживают 30 секунд;
3) добавляют 0,5 мл (2: 1) буферного раствора pH 7,2-7,4. В качестве буферного раствора может использоваться фосфатный буфер, бульон Хоттингера, гидролизин и так далее. Смесь центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость сливают,
4) осадок дважды, используя центрифугирование, промывают дистиллированной водой и растворяют в 20 мкл деионизованной воды;
5) прогревают содержимое пробирки при 100^oC в течение 10 минут, образовавшийся конденсат осаждают центрифугированием при 10 тыс. об/мин в течение 1 минуты, надосадочную жидкость в количестве 1-5 мкл используют для исследования в ПЦР.

Выполнение способа занимает не более 30 минут.

Предлагаемый способ был использован при подготовке проб для диагностики псевдотуберкулеза в клиническом материале.

Пример 1. Больной Б. поступил в инфекционную больницу с предположительным диагнозом "псевдотуберкулез". Подготовка пробы испражнений для определения возбудителя псевдотуберкулеза методом ПЦР была проведена, как описано выше, в течение 30 минут: при этом исходный материал (1 г) развели ЗФР (pH 7,4) в соотношении 1:10. 0,5 мл суспензии смешали в пробирке "Эппендорф" с 0,5 мл 0,72% раствора КОН (1:1)и выдержали 30 секунд. Затем добавили 0,5 мл бульона Хоттингера pH 7,2 (2: 1) и центрифугировали при 10 тыс. об/мин в течение 2 минут. Осадок дважды, используя центрифугирование при 10 тыс. об/мин в течение 3 мин, промыли дистиллированной водой. После удаления надосадочной жидкости прилили 20 мкл деионизованной воды, прогрели при 100^oC в течение 10 минут. Центрифугировали при 10 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость в количестве 5 мкл использовали для исследования в ПЦР. Через 2,5 часа был получен положительный результат. При обработке пробы способом-прототипом положительный результат получить не удалось. При серологическом исследовании антитела к Y. pseudotuberculosis не обнаружены. Бактериологическим методом культура Y. pseudotuberculosis от больного была выделена через 13 дней. Диагноз "псевдотуберкулез" подтвержден.

Пример 2. Больной М. Предположительный диагноз "псевдотуберкулез". Подготовка пробы была проведена так, как описано выше, в течение 30 минут: исходный материал (испражнение) в количестве 1 г развели ЗФР (pH 7,4) в соотношении 1: 10. 0,5 мл суспензии смешали в пробирке "Эппендорф" с 0,5 мл 0,72% раствора КОН (1:1) и выдержали 30 секунд. Затем добавили 0,5 мл гидролизина pH 7,4 (1:2) и центрифугировали при 10 тыс. об/мин 5 минут. Осадок дважды, используя центрифугирование при 10 тыс. об/мин в течение 5 минут, промыли дистиллированной водой. После удаления надосадочной жидкости прилили 20 мкл деионизованной воды, прогрели при 100^oC 10 минут. Центрифугировали при 10 тыс. об/мин 1 минуту. Надосадочную жидкость в количестве 5 мкл использовали для исследования в ПЦР. Через 2,5 часа был получен отрицательный результат. При обработке пробы методом-прототипом результат ПЦР был также отрицательным. Бактериологическим методом на протяжении 21 дня возбудитель не обнаружен. При двукратном серологическом исследовании антитела к Y. pseudotuberculosis не обнаружены. Диагноз "псевдотуберкулез" снят.

Предлагаемые режимы являются необходимыми и достаточными для достижения поставленной цели - подготовки проб для анализа в ПЦР на псевдотуберкулез, а именно:
1) 0,5 мл разведенных ЗФР 1:10 испражнений - оптимальное количество пробы для исследования в ПЦР, которое позволяет параллельно проводить бактериологическое исследование;
2) обработка образца 0,72% раствором КОН 1:1 в течение 30 секунд достаточно для эффективного лизиса посторонней микрофлоры, увеличение концентрации щелочи или времени экспозиции ведет к лизису Y.pseudotuberculosis;
3) добавлением буферного раствора pH 7,2-7,4 в соотношении 2:1 достигается нейтрализация pH и прекращение щелочного лизиса;
4) центрифугирование при 10 тыс. об/мин в течение 2-5 минут достаточно для осаждения бактерий псевдотуберкулеза, лизированные клетки посторонней микрофлоры удаляются вместе с супернатантом;
5) прогревание 10 мин при 100^oC достаточно для разрушения бактериальных клеток и выхода ДНК, а также для инактивации бактериальных ферментов.

Предлагаемый способ был использован при подготовке проб для диагностики псевдотуберкулеза больных из инфекционной больницы. При исследовании испражнений от 56 больных в 28 (50%) получен положительный результат, который был в дальнейшем подтвержден клинически, серологически и бактериологически.

Предлагаемый способ легко воспроизводим, экономичен, так как не требует дорогостоящих реактивов, позволяет быстро (в 6-7 раз быстрее по сравнению с прототипом) подготовить пробы для диагностики псевдотуберкулеза методом ПЦР.

Данный способ может быть применен в качестве первого этапа в ПЦР-диагностике возбудителей псевдотуберкулеза. Способ применим для клинической практики и научно-исследовательской работы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для обнаружения псевдотуберкулезного микроба в материале от больных людей. Для этого исходный материал (испражнения) разводят забуференным физиологическим раствором 1,10, обрабатывают 0,72% едким калием (1:1), добавляют буферный раствор (рН 7,2 - 7,4) для нейтрализации рН в соотношении 1: 2, центрифугируют 2 - 5 мин при 10 тыс. об/мин, двукратно промывают осадок дистиллированной водой, каждый раз центрифугируя, и растворяют осадок в 20 мкл деионизованной воды. Растворенный осадок прогревают при 100^oC 10 мин. После кратковременного центрифугирования проба может быть использована в ПЦР. Способ позволяет быстро и без использования дорогостоящих или агрессивных химических веществ готовить пробы для диагностики псевдотуберкулеза методом ПЦР.

Способ подготовки проб для диагностики псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции, включающий разведение исходного материала физиологическим раствором, получение суспензии, центрифугирование, промывание осадка дистиллированной водой, добавление к осадку деионизованной воды, прогревание, отличающийся тем, что суспензию обрабатывают 0,72% едким кали, при этом щелочь добавляют к суспензии в соотношении 1 : 1 и выдерживают смесь в течение 30 с, затем к полученной смеси добавляют буферный раствор рН 7,2 - 7,4 в соотношении 2 : 1 соответственно, полученную смесь центрифугируют при 10 тыс. об. /мин в течение 2 - 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок дважды промывают дистиллированной водой, центрифугируя смесь после каждого промывания, добавляют к полученному осадку деионизованную воду, прогревают смесь при 100^oC в течение 10 мин, центрифугируют при 10 тыс.об/мин в течение 1 мин и полученную надосадочную жидкость используют для диагностики псевдотуберкулеза методом ПЦР.