СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ЧЕТЫРЕХХЛОРИСТЫМ УГЛЕРОДОМ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2013 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной токсикологии, и может быть использовано для изучения способов формирования и прогрессирования изменений в организме возникающих в эксперименте, под действием токсико-химических повреждающих факторов.

Существуют трудности в экстраполяции экспериментальных данных по изучению механизмов развития патологии печени у человека. В связи с этим для изучения механизмов формирования заболеваний печени, разработки новых подходов в их профилактике и лечении природными факторами, требуются экспериментальные модели, наиболее приближенные к реальным клиническим условиям.

Известен способ моделирования токсического поражения печени в эксперименте путем подкожного инъецирования крысы 50% масляным раствором четыреххлористого углерода (Литвинова Е.С. Фармакологическая коррекция нарушений иммунного гомеостаза при сочетанием воздействии гепатотропных агентов и постоянного магнитного поля: автореферат дис…. канд. мед. наук: 14.00.25 / Литвинова Елена Сергеевна. - Курск, 2005. - 22 с.), а так же поение животного 10% раствором этанола в сочетании с инъекциями 50% масляного раствора четыреххлористого углерода (Скакун Н.П. Эффективность антиоксидантов при комбинированном поражении печени четыреххлористым углеродом и этанолом / Н.П.Скакун, С.Ф.Ковальчук // Фармакология и токсикология. - 1987. - №3. - С.104-107).

Недостатками данных изобретений является введение четыреххлористого углерода в растворителе, подкожно, хотя большинство профессиональных заболеваний формируется при поступлении токсических веществ ингаляторно и per os.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ инициации токсического поражения посредством трехкратного подкожного введения масляного раствора четыреххлористого углерода (ССl₄) с интервалом инъекций в 4 суток, из расчета 0,45 мл раствора на 100 г массы тела животного. Через 4, 9, 14, 44 день после последнего введения токсиканта проводили необходимые исследования (Глушакова Е.С. Функциональное состояние печени в норме при экспериментальном токсическом гепатите и его физиотерапевтической коррекции в разные фазы окологодового цикла: автореферат дис…. канд.биол.наук: 14.00.51, 14.00.16 / Глушакова Елена Сергеевна.- Томск, 2005.- 20 с.).

Недостатками данного способа являются подкожное введение четыреххлористого углерода в растворителе, а также длительность создания экспериментальной патологической модели. При этом следует отметить, что основным временным показателем для создания экспериментальных моделей подострого поражения токсическими веществами является 21 день, что четко соблюдается при нашем варианте моделирования.

Техническим результатом предлагаемого способа является решение задачи, заключающейся в создании модели подострого токсического поражения печени четыреххлористым углеродом марки ХЧ в более короткие сроки и с соответствующими данными поражения картины патогенеза, что позволяет более полно изучить патофизиологические механизмы развития патологии. Преимущества предлагаемой модели в том, что результат достигается за более короткий промежуток времени по сравнению с прототипом, является достаточно информативным, доступным, безопасным, легко воспроизводимым, относительно недорогим и адекватным реальным клиническим условиям способа моделирования подострого токсического поражения.

Указанный технический результат достигается тем что, используют четыреххлористый углерод марки ХЧ (CCl₄), который вводят крысам-самцам перорально, через день, из расчета 0,1 мл на 100 г массы животного, в течение 21 дня, с последующим проведением лабораторных тестов и с исследованием печени.

Для достижения адекватности предлагаемой модели изучено 40 крыс-самцов линии Вистар массой тела 200-220 г, разделенных на группы. Первую группу представляли 10 интактных животных. 20 крысам, представляющим вторую группу, в течение 21 дня, через день, per os вводили четыреххлористый углерод марки ХЧ (CCl₄), из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного. 10 крысам третьей группы инициировалось острое токсическое поражение грехкратным подкожным введением животному 50% маслянного раствора четыреххлористого углерода (ССl₄) по способу прототипа. На 21 день животных декапитировали с последующим проведением лабораторных тестов и с исследованием печени. Изучали содержание в сыворотке крови аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в (Ед/л), креатинина (КР) в (мкмоль/л), щелочной фосфатазы (ЩФ) в (МЕ/л). Способ осуществляется следующим образом.

Группе животных в течение 21 дня, через день, per os шприцем вводили четыреххлористый углерод, марки ХЧ (CCl₄, из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного. Декапитацию животных осуществляли на 21 день. Воспроизведение модели констатировалось по изменению патоморфологических и гистологических признаков и биохимических показателей: содержание в сыворотке крови аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в (Ед/л), креатинина (КР) в (мкмоль/л), щелочной фосфатазы (ЩФ) в (МЕ/л).

Способ был апробирован в условиях отдела изучения механизмов действия физических факторов (ОИМДФФ) Пятигорского ГНИИ курортологии. Объектом исследований послужили 40 крыс-самцов линии Вистар, разделенные на 3 группы - интактные, с моделью прототипа и с моделью подострой интоксикации четыреххлористым углеродом. По истечении срока эксперимента сравнивали полученную картину как патоморфологических, так и саногенетических реакций в системах, контролирующих метаболические реакции.

Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

Интактная крыса-самец линии Вистар №1, масса тела 215 г дополнительных воздействий не получала. Исследование животного осуществлено одновременно с животными опытной группы. Содержание р крови КР 42,8 мкмоль/л, ЩФ - 369,4 МЕ/л, ACT - 233,2 Ед/л, АЛТ - 60,1 Ед/л. Крыса-самец линии Вистар №11, масса тела - 200 г. Одна подкожная инъекция 50% масляного раствора четыреххлористого углерода 0,45 мл/100 г массы животного. Содержание в крови КР 44,5 мкмоль/л, ЩФ - 696,3 МЕ/л, ACT - 270,6 Ед/л, АЛТ - 130,5 Ед/л. Результат расценен как острое отравление. Крыса-самец №15 линии Вистар, масса тела 210 г. 15 подкожных инъекций 50% масляного раствора четыреххлористого углерода 0,45 мл/100 г массы животного. Содержание в крови КР - 60,5 мкмоль/л, ЩФ - 530,4 МЕ/л, ACT - 374,5 Ед/л, АЛТ - 130,7 Ед/л. Результат расценен как подострое отравление. Крыса-самец №30 линии Вистар, масса тела 190 г. Через день, 1 раз в сутки, в течение 21 дня, перорально шприцем вводили 0,1 мл четыреххлористого углерода марки ХЧ (CCl₄) на 100 г массы животного. Содержание в крови КР - 46,7 мкмоль/л, ЩФ - 590,6 МЕ/л, ACT - 403,5 Ед/л, АЛТ - 138,4 Ед/л. Результат расценен как подострое отравление.

Таблица 1 Показатели аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина, у изученных животных Показатель Группы М m P ACT ИНТАКТНЫЕ(1) 219,4 19,63 1-2<0,001 ПОДОСТРОЕ(2) 405,5 21,11   АЛТ ИНТАКТНЫЕ (1) 79,66 9,15 1-2<0,01 ПОДОСТРОЕ(2) 141,27 11,46   КР ИНТАКТНЫЕ (1) 82,01 9,25 1-2<0,001 ПОДОСТРОЕ(2) 45,9 02,20   ЩФ ИНТАКТНЫЕ (1) 478,2 22,19 1-2<0,001 ПОДОСТРОЕ(2) 581,49 12,20  

Из представленной таблицы следует, что увеличение содержания ACT; АЛТ; (Р<0,001) в сыворотке крови указывают на усиление степени поражения печени и свидетельствует о повреждении гепатоцитов, что также свойственно дегенеративным процессам, происходящим в организме. Из изученных экскреторных ферментов повышение уровня щелочной фосфатазы (Р<0,001), указывает на развитие холестаза. О нарушении функции почек свидетельствуют существенные изменения показателя креатинина (Р<0,001).

Для подтверждения достоверности полученных изменений биохимических показателей дополнительно проведены патоморфологические и гистологические исследования, для чего изучены макро- и микропрепараты.

Макропрепараты:

Группа 1: При патоморфологическом исследовании печень крыс красно-коричневого цвета; нормальных размеров 2,5+-0,5 на 2,7+-0,3; средней массой 6,85+-0,3. Капсула печени плотная, гладкая, блестящая; консистенция плотная.

У всех крыс печень при разрезе красно-коричневого цвета, без патологических очагов.

Группа 2: При патоморфологическом исследовании печень некоторых крыс имела охряно-красный цвет, светло-коричневая с множественными кровоизлияниями. Орган гипертрофирован, в большинстве случаев рыхлый, в отдельных местах с уплотненными участками; размеры 4,3+-0,4 на 6,6+-0,5; средняя масса 10,23+-0,7. У большинства крыс печень на разрезе сухая, кровь не выступает, в ряде случаев кровь на разрезе выступает умеренно.

Таблица 2 Абсолютная масса печени подопытных животных показатели интактные CCl₄ Р Масса печени, г 6,85+-0,3 10,23+-0,7 <0,001

Подострое поражение четыреххлористым углеродом подтверждается и увеличением в размере печени на 3,8 г (10,23 против 6,85) или на 30%. Гепатотоксическое действие четыреххлористого углерода на печень крыс подтвердилось с достоверной вероятностью Р<0,001.

Микропрепараты:

Группа 1: Микроскопическая картина печени интактных животных без патологии. Балочное строение печени не нарушено. Гапатоциты содержат овальные ядра с хорошо просматриваемыми ядрышками. В единичных гепатоцитах выявлено наличие жировой дистрофии.

Группа 2: При гистологическом исследовании печени 20 отравленных крыс отмечается нарушение структуры печеночной паренхимы, дольчатое строение паренхимы не сохранено, наблюдается четко выраженная дискомплексация печеночных балок. Среди клеток большое количество лейкоцитов, макрофагов. При окраске суданом III в 80% случаев в вакуолях гепатоцитов появляются липиды. Отдельные клетки очень крупные и представляют собой сплошную вакуоль. Гепатоциты набухшие, цитоплазма их мутная, границы клеток не четкие, ядра также набухшие. В 70% случаев обнаружены множественные очаги некрозов разных размеров, в которых структурные элементы клеток не визуализируются, а ткань печени представляет собой гомогенную бесструктурную массу. В 30% случаев наблюдаются обширные некрозы. Кровеносные сосуды (центральные вены, капилляры) в печени этих животных расширены (гиперемия кровеносных сосудов), проницаемость стенок для клеток крови повышена, отмечаются очаговые кровоизлияния. В целом, у подавляющего большинства крыс отмечена картина острого токсического гепатита с достаточно высокой интенсивностью повреждения тканей (альтернативный гепатит). У части животных определяется гепатоз с выраженным некротическим компонентом. Обнаруженные изменения свидетельствуют о развитии у животных типичной токсической дистрофии печени.

Таким образом, получена модель подострого поражения, вызванная пероральным введением четыреххлористого углерода, марки ХЧ (CCl₄);

выражающаяся в усилении дегенеративных процессов в печени, развивающейся креатининемии, повышении уровня трансаминаз, развитии холестаза, и гистологически подтверждающаяся в выраженных дегенеративных повреждениях практически всех участков печени, т.е. предлагаемый способ моделирования является достаточно информативным и показывает эффективность его использования в эксперименте.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к созданию модели подострого отравления четыреххлористым углеродом. Для этого четыреххлористый углерод марки ХЧ (ССl₄) вводят крысам-самцам перорально через день из расчета 0,1 мл на 100 г массы животного в течение 21 дня. Способ, являясь простым, доступным и безопасным, обеспечивает в короткие сроки создание модели подострого токсического поражения печени, адекватной реальным клиническим условиям, что позволяет наиболее полно изучать патофизиологические механизмы развития указанной патологии. 2 табл.

Способ моделирования подострого поражения печени четыреххлористым углеродом, отличающийся тем, что используют четыреххлористый углерод марки ХЧ (CCl₄), который вводят крысам-самцам перорально через день из расчета 0,1 мл на 100 г массы животного в течение 21 дня.