СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО АДЕНОИДИТА У ДЕТЕЙ Российский патент 2013 года по МПК A61K31/57 A61K31/58 A61K38/20 A61P11/02 G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при лечении хронического аденоидита у детей.

Наиболее близким техническим решением является способ прогнозирования эффективности лечения интерлейкином-1β, включающий генотипирование, анализ данных по признакам аллельного полиморфизма гена цитокина и по показателям температуры тела пациента в ответ на первое введение препарата - лиофилизата интерлейкина-1β, причем при наличии у пациента гомозиготного по высокопродуцирующему аллелю гена интерлейкина-1β и изменении температуры в сторону повышения прогнозируют низкую эффективность лечения, а при наличии у пациента гомозиготного по низкопродуцирующему аллелю гена цитокина и отсутствии повышения температуры прогнозируют высокую эффективность лечения (Патент RU №2301012, М. кл. A61B 5/01, 2004).

Недостатком известного способа является генотипирование полиморфизма гена интерлейкина-1β анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), который не позволяет проводить высокоэффективную диагностику полиморфизма гена цитокина. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов требует проведения стадии электрофореза, что формирует риск контаминации исследуемого образца, получение ложных положительных результатов и обуславливает его недостаточные специфичность и точность при малых количествах субстрата. Кроме того, недостатком анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов являются дороговизна, связанная с использованием радиоактивной или нерадиоактивной метки и ферментов рестриктаз, методические и технические сложности, в результате чего полученные данные ПДРФ-анализа практически не автоматизируются, что не обеспечивает быстродействие, точность и компьютерную обработку результатов.

Недостатком известного способа является также избирательный анализ полиморфизма генов только семейства интерлейкина-1, которые не в полной мере отражают характер провоспалительного и противовоспалительного ответа у пациента, и не могут осуществлять нормировку «идеальных контрольных генов», поскольку данные варианты генов расположены на одной хромосоме и могут наследоваться совместно.

К недостаткам следует отнести отсутствие варианта лечения пациента при персонализированной диагностике гомозиготного по высокопродуцирующему аллелю гена интерлейкина-1β, когда лечение лиофилизатом интерлейкина-1β является низкоэффективным ввиду усиления патологического процесса за счет увеличения температуры тела, отека и слизисто-гнойного отделяемого. Частота встречаемости генотипов интерлейкина-1β по полиморфному мутантному аллелю С3954 в исследуемых группах наглядно демонстрирует превалирование этой категории в группе пациентов с хроническим аденоидитом - 59,8%, которые практически не могут получать лечение с высокой эффективностью (фиг.1, 2).

В известном способе отсутствует персонализированная диагностика течения воспалительного процесса при ЛОР-патологии, касающаяся тяжести процесса, наличия и длительности обострений, осложнений, что не позволяет провести стратификацию групп риска пациентов, страдающих хроническим аденоидитом, с необходимостью междисциплинарного подхода, определения тактики ведения пациентов и кратности осмотров.

Задачей предлагаемого способа является объективное высокоинформативное персонализированное установление на валидной выборке совокупных диагностических критериев за счет анализа однотипного биологического материала (исключительно образца крови) и повышение эффективности лечения хронического аденоидита у детей при наличии у пациентов гомозиготного по высокопродуцирующему аллелю гена интерлейкина-1β за счет уменьшения числа и длительности обострений и осложнений. Кроме того, предлагаемым способом возможно проведение стратификации групп риска при хроническом аденоидите у детей.

Поставленная задача достигается тем, что в способе лечения хронического аденоидита у детей, включающем диагностику, представляющую собой генотипирование и анализ данных по признакам аллельного полиморфизма гена интерлейкина-1β, новым является то, что дополнительно проводят генотипирование и анализ данных по признакам аллельного полиморфизма гена интерлейкина-4, регулирующего процесс воспаления, в полиморфном локусе 589 путем полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплиментарных исследуемому фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты образца крови больного ребенка, после проведения анализа данных генотипирования по признакам аллельного полиморфизма генов интерлейкина-1β, интерлейкина-4 соответственно в полиморфных локусах 3954 и 589 анализируют совокупность данных генотипирования и показателей уровня экспрессии - концентраций интерлейкина-1β, интерлейкина-4 в сыворотке крови детей с хроническим аденоидитом, при выявлении генотипа гомозиготного по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/С гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гомозиготным или гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю соответственно С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностируют тяжелое течение хронического аденоидита с частыми выраженными обострениями, осложнениями и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50-100 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1-2 раза в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100-400 мкг ежедневно в течение 30 суток, при выявлении гетерозиготного генотипа по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-1(в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гомозиготным или гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю соответственно С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностируют течение средней тяжести хронического аденоидита с обострениями рецидивирующего затяжного характера и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100 мкг ежедневно в течение 21-30 суток, при выявлении генотипа гомозиготного по низкопродуцирующему «дикому» (вариант нормы) аллелю Т/Т гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 или с гомозиготным генотипом по низкопродуцирующему «дикому» аллелю Т/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностируют хронический аденоидит с легким течением и благоприятным исходом и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций лиофилизата интерлейкина-1β в физиологическом растворе в дозе 5-10 нг/мл на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки, увеличивая разовую дозу на 5-10 нг/мл через 1-2 суток, но не более чем 30 нг/мл в течение 5-16 суток.

Особенностью лимфоидной ткани слизистой оболочки носоглотки является наличие мукоза-ассоциированной лимфоидной ткани, ее тесный контакт с эпителием, через который проникают антигены и который участвует в их представлении. Другой ее особенностью является отличие в субпопуляционном составе лимфоцитов с преобладанием тимусзависимых лимфоцитов. Различают тимусзависимые лимфоциты (Т-хелперы/индукторы) двух типов. Т-хелперы первого типа обеспечивают Т-клеточный иммунитет, запускают противовирусный иммунный ответ и секретируют в спектре других цитокинов главный провоспалительный цитокин интерлейкин-1β. Т-хелперы второго типа стимулируют синтез антител, обеспечивают гуморальный иммунитет, запускают противобактериальный иммунный ответ и секретируют в спектре других цитокинов главный противоспалительный цитокин интерлейкин-4. У человека существует относительный антагонизм между Т-хелперами первого типа и Т-хелперами второго типа, а значит относительный антагонизм между разнонаправленными изменениями концентрациями интерлейкина-1β и интерлейкина-4. Суммарный ответ на одинаковый индуктор отражает способность лимфоцитов отвечать на антигенную стимуляцию, а интерлейкин-1β и интерлейкин-4 являются разнонаправленными иммуномедиаторами, регулирующими процесс воспаления.

Известно, что интерлейкин-4 осуществляет контроль пролиферации, дифференцировки и функций В-лимфоцитов - антительного ответа. Оппозитный цитокин по отношению к интерлейкину-1β - интерлейкин-4 - блокирует спонтанную и индуцированную продукцию интерлейкина-1β и играет ключевую роль в развитии аллергии, являясь критическим цитокином аллергических процессов и регулятором гуморального и адаптивного иммунитета. Превентивная персонализированная диагностика вариантов «полярных» сочетаний генов - интерлейкина-4 и интерлейкина-1β - может быть использована в качестве теста критического состояния реализации болезни у конкретного пациента, обеспечивает возможность определения иммунной реакции, ее модулирование и эффективность назначаемого лечения.

Фактически в клинической практике в условиях бактериальной суперинфекции при хроническом аденоидите констатируется парадоксальная и неудобная для организма ситуация, когда требуется одновременное развитие двух оппозитных форм иммунного ответа: противовирусного ответа и противобактериального, что приводит к торможению обеих форм иммунного ответа и угнетению системы иммунитета в целом. Для преодоления этого положения, во-первых, необходимо создать преимущества для развития какой-либо одной формы иммунного ответа - либо противовирусного, либо противобактериального, во-вторых, выбрать тактику ингибирования или потенцирования секреции главных провоспалительного или противовоспалительного цитокинов. Принципиальная возможность связана с применением глюкокортикостероидов, ингибирующих синтез/высвобождение иммуномедиатора интерлейкина-1β. Другой путь предусматривает заместительное лечение с использованием лиофилизата интерлейкина-1β, который, потенцируя иммунную реакцию, усиливает презентацию бактериальных антигенов, провоцируя оппозитную секрецию противовоспалительного цитокина интерлейкина-4, способствуют продуктивному завершению противобактериального гуморального иммунного ответа.

Известно, что синтез интерлейкина-1β, интерлейкина-4 тормозят глюкокортикостероиды, которые вовлечены в локальное и системное воспаление. Глюкокортикостероиды блокируют избыточные сигнальные стимулы цитокинов и ослабляют избыточную иммунную реакцию, реализуя выраженное противовоспалительное действие и оказывая влияние на раннюю и позднюю фазы аллергического ответа.

Интраназальный глюкокортикостероид мометазона фуроат обладает противовоспалительным, противоаллергическим, противозудным и сосудосуживающим действием. Свойства мометазона фуроата обусловлены индуцированием выделения белков, ингибирующих фосфолипазу А2 и известных под общим названием «липокортины» с контролем биосинтеза/высвобождения сильнодействующих медиаторов воспаления - интерлейкина-1β, простагландинов и лейкотриенов. Общепризнано, что соединения, которые могут ингибировать синтез/высвобождение интерлейкина-1β, имеют преимущество перед другими имеющимися в распоряжении препаратами, в особенности, если потенциал их действия позволяет им оставаться эффективными в пониженных дозах.

Известно, что для потенцирования секреции интерлейкина-1β используется заместительное лечение с использованием лиофилизата этого цитокина. Лиофилизат интерлейкина-β повышает функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, индуцирует дифференцировку предшественников тимусзависимых лимфоцитов. Биологические свойства лиофилизата интерлейкина-1β позволяют ему селективно воздействовать на конкретные субпопуляции лимфоидных клеток для целенаправленной коррекции их функций.

Необходимость персонализированного подхода в лечении воспалительных заболеваний, в частности хронического аденоидита, обеспечивает безопасность лечения и его высокую эффективность.

Анализируя результаты клинического использования глюкокортикостероидов, установлено, что они лишены побочного действия лиофилизата интерлейкина-1β и эффект зависит от индивидуальных диагностических критериев у пациента.

Важным диагностическим критерием у пациента, прогностическим индикатором эффективности лечения хронического аденоидита при выборе метода, способного изменять экспрессию цитокина, является определение генетической детерминированности этого цитокина.

Доказано, что генетическое детерминирование приобретенной иммунологической недостаточности при хроническом аденоидите происходит вследствие однонуклеотидных вариаций или полиморфизмов (замена одной аминокислоты тимин (Т) на другую аминокислоту цитозин (С)) генов, кодирующих синтез интерлейкина-1β и интерлейкина-4 в полиморфных локусах.

Ген интерлейкина-1β расположен на хромосоме 2q13-21. Ген интерлейкина-4 расположен на хромосоме 5q31-33. Поскольку данные варианты генов расположены на разных хромосомах, они могут наследоваться раздельно, что важно для совокупного анализа провоспалительной и противовоспалительной активности экспрессируемых цитокинов. Однонуклеотидные вариации высокопродуцирующего варианта гена интерлейкина-4 наследуются чаще сцеплено с полиморфным локусом 589, который встречается по данным литературы чаще других при воспалительных заболеваниях слизистых оболочек верхних дыхательных путей, является наиболее изученным, ответственен за реализацию противовоспалительной активности интерлейкина-4 и обладает доказанным выраженным потенциалом в отношении тяжести течения и оценки эффективности лечения.

Таким образом, для секреции интерлейкина-1β, интерлейкина-4 характерна межиндивидуальная изменчивость, зависящая от паттерна полиморфизмов. Персонализированный выбор лечения, детерминирующий развитие фенотипа на фоне определенного генотипа, обеспечивает его высокую эффективность при хроническом аденоидите.

В качестве материала для генотипирования целесообразно использовать образцы крови пациентов с хроническим аденоидитом. Образцы крови отвечают максимальным асептическим условиям забора и являются предпочтительными, исключая их контаминацию. Наличие хорошо очищенной и гидролизованной матрицы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) приводит к стабильности воспроизводства продуктов реакции и предсказуемым результатам. Прототипность исследуемого клинического материала для выделения геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты исключает преаналитические ошибки, зависящие от выбора метода его обработки с последующим выделением дезоксирибонуклеиновой кислоты, обеспечивая его качество.

Молекулярно-генетическое исследование вариантов генов цитокинов предпочтительно определять методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени - метода амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты in vitro, с помощью которого быстро избирательно размножить интересующий участок дезоксирибонуклеиновой кислоты. Предпочтительной является возможность проведения амплификации небольших фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (увеличение числа копий или клонирование фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты), что повышает разрешающую способность ДНК-диагностики и быстродействие. Вариант использования при выявлении полиморфизма полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в виде амплификации с произвольными праймерами подразумевает знание нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка для подбора соответствующих праймеров к фланкирующим последовательностям, что обеспечивает направленную амплификацию и исключает ложные положительные результаты. Исключая фазу электрофореза, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени обеспечивает чистоту исследуемого образца от чужеродной ДНК. За счет способа генерации репортерной флуоресценции, подразумевающего использование меченых разными флуоресцентными агентами соответствующих разных олигонуклеотидных проб, комплиментарных участку ДНК, свечение каждой флуоресцентной метки, эксклюзивной по колору и локусу, может быть детектировано в момент отделения ее от гасителя при расщеплении пробы за счет 5'-экзонуклеазной активности во время стадии элонгации. Качественное обеспечение детекции в одной постановочной пробе одновременно несколько реакций позволяет осуществлять мультиплексную полимеразную цепную реакцию, автоматизирование генотипирования с компьютерной обработкой данных. Поэтому предлагаемый метод для осуществления генотипирования имеет преимущества при проведении массовой диагностики генетического полиморфизма и пригоден для детального анализа геномов любых организмов.

Предлагаемый способ поясняется чертежами, где:

На фиг.1 изображено

Частота встречаемости генотипов интерлейкина-1β по мутантному полиморфному аллелю С3954 в исследуемых группах (%):

I - группа пробандов-детей с хроническим аденоидитом (N=594)

II - группа родственников пробандов-детей с хроническим аденоидитом (N=250)

III - группа клинически здоровых детей, сформировавших популяционный контроль (N=100)

59,8% - частота гомозиготного генотипа С/С по мутантному полиморфному аллелю 3954*С в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

35,7% - частота гетерозиготного генотипа С/Т по мутантному полиморфному аллелю 3954*С в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

4,5% - частота гомозиготного генотипа Т/Т по дикому полиморфному аллелю 3954*Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

49,2% - частота гомозиготного генотипа С/С по мутантному полиморфному аллелю 3954*С в группе родственников пробандов-детей с хроническим аденоидитом

44,4% - частота гетерозиготного генотипа С/Т по мутантному полиморфному аллелю 3954*С в группе родственников пробандов-детей с хроническим аденоидитом

6,4% - частота гомозиготного генотипа Т/Т по дикому полиморфному аллелю 3954*Т в группе родственников пробандов-детей с хроническим аденоидитом

46,7% - частота гомозиготного генотипа С/С по мутантному полиморфному аллелю 3954*С в группе клинически здоровых детей, сформировавших популяционный контроль

31,7% - частота гетерозиготного генотипа С/Т по мутантному полиморфному аллелю 3954*С в группе клинически здоровых детей, сформировавших популяционный контроль

21,6% - частота гомозиготного генотипа Т/Т по дикому полиморфному аллелю 3954*Т в группе клинически здоровых детей, сформировавших популяционный контроль

* - уровень статистической значимости при сравнении показателей с группой клинически здоровых детей, сформировавших популяционный контроль (р<0,05).

На фиг.2 изображено

Частота встречаемости мутантного полиморфного аллеля 3954*С гена интерлейкина-1β у детей с хроническим аденоидитом (N=594): по оси абсцисс - вариант генотипа по оси ординат - число клинических случаев (%)

1 - гомозиготный генотип С/С по мутантному полиморфному аллелю 3954*С

2 - гетерозиготный генотип С/Т по мутантному полиморфному аллелю 3954*С

3 - гомозиготный генотип Т/Т по дикому полиморфному аллелю 3954*Т

59,8% - частота генотипа С/С в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

35,7% - частота генотипа С/Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

4,5% - частота генотипа Т/Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

- шаблонная штриховая линия в виде овала - суммарная частота генотипа С/С и генотипа С/Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

На фиг.3 изображено

Частота встречаемости дикого и мутантного полиморфных аллелей в локусе 589 гена интерлейкина-4 у детей с хроническим аденоидитом (N=594):

по оси абсцисс - вариант генотипа

по оси ординат - число клинических случаев (%)

1 - гомозиготный генотип С/С по мутантному полиморфному аллелю 589*С

2 - гетерозиготный генотип С/Т по мутантному полиморфному аллелю 589*С

3 - гомозиготный генотип Т/Т по дикому полиморфному аллелю 589*Т

60,00% - частота гомозиготного генотипа С/С по мутантному полиморфному аллелю 589*С в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

30,43% - частота гетерозиготного генотипа С/Т по мутантному полиморфному аллелю 589*С в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

9,57% - частота гомозиготного генотипа Т/Т по дикому полиморфному аллелю 589*Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

- шаблонная крупная штриховая линия в виде овала - суммарная частота генотипа С/С и генотипа С/Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

- шаблонная мелкая штриховая линия в виде овала - суммарная частота генотипа С/Т и генотипа Т/Т в группе пробандов-детей с хроническим аденоидитом

На фиг.4 изображено

Стратификация групп риска затяжного и/или рецидивирующего течения хронического аденоидита у детей:

сопоставлены группы риска затяжного и/или рецидивирующего течения хронического аденоидита у детей с клиническим течением заболевания и молекулярно-генетической характеристикой полиморфизмов гена интерлейкина-1β и интерлейкина-4 у них.

На фиг.5 изображено

Концентрация интерлейкина-1β и интерлейкина-4 в сыворотке крови детей с хроническим аденоидитом в зависимости от генотипа:

сопоставлены концентрации интерлейкина-1β и интерлейкина-4 (высокая, умеренно повышенная и низкая) в сыворотке крови детей с хроническим аденоидитом в зависимости от генотипа, обуславливающим характер течения заболевания, представленные как среднее арифметическое со средним квадратическим отклонением выборки.

На фиг.6 изображено

Получение рабочих растворов лиофилизата интерлейкина-1β заданной концентрации:

для получения рабочих растворов лиофилизата интерлейкина-1β требуемой концентрации представлено необходимое количество физиологического раствора при разведении раствора лиофилизата интерлейкина-1β.

На фиг.7 изображено

Динамика лабораторных показателей у детей с хроническим аденоидитом после персонализированного лечения и без персонализации:

¹ - уровень статистической значимости при сравнении показателей в динамике лечения (р<0,05);

² - уровень статистической значимости при сравнении показателей между группами пациентов после персонализированного лечения и без персонализации (р<0,05).

Показаны достоверное снижение и нормализация исследуемых показателей крови (уровень лейкоцитоза, скорость оседания эритроцитов, характеризующая гуморальную активность, концентраций интерлейкина-1β и интерлейкина-4), отображающие купирование воспалительного процесса и эффективность лечения мометазона фуроатом, лиофилизатом интерлейкина-1β в зависимости от генотипа.

Показано достоверное отсутствие снижения по трем сравниваемым лабораторным показателям из четырех и отсутствие нормализации единственного показателя, имеющего снижение, отображающие манифестацию и активность воспалительного процесса, а также низкую эффективность лечения без учета генотипа.

При сравнении лабораторных показателей между группами пациентов с хроническим аденоидитом после персонализированной диагностики и лечения и без персонализации продемонстрировано достоверное различие эффективности лечения.

На фиг.8 изображено

Персонализированные рекомендации по диспансерному наблюдению и лечению детей с хроническим аденоидитом:

сопоставлены группы риска/степени риска течения заболевания с персонализированными в зависимости от варианта генотипа рекомендациями по диспансерному наблюдению и лечению детей с хроническим аденоидитом, обеспечивающие высокую эффективность лечения с охватом всей исследуемой группы.

Способ осуществляют следующим образом.

Выборка пациентов-детей с хроническим аденоидитом была сформирована из представителей европеоидной расы, русской национальности, проживающих на территории г. Красноярск с рождения. Исследовательскую группу составили лица обоего пола, в количестве 594 человек, в возрасте с 3-х до 10-и лет. Для сопоставления распространения генотипов в выборке и общей популяции была дополнительно сформирована группа популяционного контроля в количестве 100 человек, представленная здоровыми детьми аналогичного возраста и расовой принадлежности.

Были изучены данные анамнеза заболевания, касающиеся частоты, длительности, характера течения обострений, температурной реакции, наличия осложнений. В сыворотке крови каждого пациента с хроническим аденоидитом были исследованы уровни концентраций интерлейкина-1β, интерлейкина-4.

Диагноз хронического аденоидита устанавливали на основании данных анамнеза, клинических, эпидемиологических, эндоскопических, рентгенологических, иммунологических данных.

После верификации клинического диагноза приступали к исследованию однонуклеотидных полиморфизмов гена интерлейкина-1β с заменой тимина (Т) на цитозин (С) в полиморфном локусе 3954 и гена интерлейкина-4 с заменой Т на С в полиморфном локусе 589. С информированного согласия (представителя пациента - родителя) пациентам проводилось молекулярно-генетическое исследование.

Материалом для молекулярно-генетического исследования служила свежая венозная кровь в объеме 2 мл, взятая из локтевой вены пациента в асептических условиях. Взятие венозной крови производили в вакуумные пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор этилендитетрамин (ЭДТА, pH=8,0). Для выделения ДНК применяли комплекты реагентов из набора «ДНК-сорб-В», изготовленным ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва). Выделение ДНК проводили по следующей схеме:

1. В качестве образца брали 100 мкл крови пациента с хроническим аденоидитом. В образец вносили 300 мкл лизирующего раствора.

2. В каждую пробирку добавляли по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Затем перемешивали с помощью центрифуги «Фуга/вортекс Микро-Спин FV-2400» и оставляли в штативе на 2 мин. Затем еще раз перемешивали и оставляли на 5 мин в вертикальном положении для осаждения ДНК на сорбенте.

3. Затем осаждали сорбент в пробирках на центрифуге «MiniSpinplus» (Eppendorf) при скорости вращения 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удаляли надосадочную жидкость из каждой пробирки с помощью отсасывателя медицинского «ОМ-1» (Россия) отдельным наконечником для исключения контаминации образца.

4. Добавляли в каждую пробирку по 300 мкл «Раствора №1» для отмывки, перемешивали с помощью центрифуги-вортекс «MiniSpinplus» (Eppendorf). Затем осаждали сорбент путем центрифугирования при скорости 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Снова удаляли надосадочную жидкость отсасывателем «ОМ-1» с применением отдельных наконечников для исключения контаминации образца.

5. Затем в каждую из проб добавляли по 500 мкл «Раствора №2» для отмывки, перемешивали с помощью центрифуги-вортекс «MiniSpinplus» (Eppendorf) в течение 30 с при скорости вращения 10 тыс. об/мин. После этой манипуляции снова удаляли надосадочную жидкость отсасывателем «ОМ-1» с использованием отдельных наконечников для каждой пробы.

6. Процедуру отмывки, описанную в п.5, повторяли снова.

7. Помещали пробирки с пробами в термостат «Термо 24-15» (Biokom) в вертикальном положении при температуре 65°C на 10 мин для подсушивания сорбента.

8. Добавляли в пробирки по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешивали с помощью центрифуги-вортекс «MiniSpinplus» (Eppendorf), затем помещали в термостат «Термо 24-15» (Biokom) в вертикальном положении при температуре 65°C на 5 мин, периодически встряхивая в центрифуге-вортекс «MiniSpinplus» (Eppendorf).

9. На конечном этапе выделения ДНК пробирки подвергались центрифугированию при скорости вращения 12 тыс.об./мин. в течение 1 мин на микроцентрифуге.

10. Надосадочную жидкость в объеме 40 мкл отбирали с помощью отсасывателя «ОМ-1» с отдельными наконечниками и перемещали в чистую пробирку надосадочную жидкость, содержащую очищенную ДНК.

В результате вышеописанного процесса получали пробы высокомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты пациентов.

Генотипирование проводили методом анализа полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени с использованием меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплиментарных участку ПЦР-продукта (технология TaqMan) - дезоксирибонуклеиновой кислоты образца крови больного ребенка с использованием методов автоматической детекции. Генотипы определяли по наличию или отсутствию продукта амплификации при использовании двух ДНК-зондов (к двум аллелям каждого из исследуемых полиморфизмов), каждый из которых содержал флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. Наличие того или иного полиморфизма определяли по наличию флуоресценции в амплифицированной смеси. В каждый эксперимент включали отрицательный контроль, где ДНК-матрицу для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени заменяли дистилированной водой (dH₂O). Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводили в амплификаторе «Rotor-Gene 6000» (Corbet Life Science, Австралия).

Были получены результаты генотипирования 944 человек.

Сопоставляли результаты генотипирования с показателями уровней интерлейкина-1β и интерлейкина-4.

Для обозначения вариантов генотипов были приняты следующие обозначения: гомозиготный «дикий» (вариант нормы) низкопродуцирующий генотип - Т/Т (тимин/тимин), гетерозиготный генотип по высокопродуцирующему мутантному аллелю - С/Т (цитозин/тимин), гомозиготный генотип по высокопродуцирующему мутантному аллелю - С/С (цитозин/цитозин).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc, USA).

В результате проведенного исследования нами убедительно показано статистически значимое преобладание гомозиготного носительства мутантного полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-4, интерлейкина-1β (генотип С/С) у детей, страдающих хроническим аденоидитом, по сравнению с группой клинически здоровых детей, составивших популяционный контроль (фиг.1). Установлен факт семейной агрегации хронического аденоидита (феномен накопления генетического груза) в отягощенных семьях за счет статистически значимого преобладания мутантной полиморфной аллели *С у родителей детей, страдающих хроническим аденоидитом. При этом выявлена высокая суммарная частота наследования мутантных полиморфных аллельных вариантов гена интерлейкина-4, интерлейкина-1β, включая гомозиготное (С/С) и гетерозиготное (С/Т) носительство, у детей с хроническим аденоидитом, составившая в исследуемой выборке 95,5% (фиг.2, 3). Нормальный генотип по исследуемым аллелям, то есть были гомозиготными носителями «дикого» полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-4, интерлейкина-1β (Т/Т) в группе пациентов имели соответственно 9,6% и 4,5%.

Следует отметить, что совместное носительство гомозиготных вариантов по «диким» аллелям генов интерлейкина-1β и интерлейкина-4 в исследовании не встречалось.

Персонализированная диагностика хронического течения аденоидита у детей позволила стратифицировать группы риска (фиг.4).

При выявлении у пациента с хроническим аденоидитом генотипа гомозиготного по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/С гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гомозиготным или гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю соответственно С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностировали тяжелое течение хронического аденоидита с частыми выраженными обострениями, осложнениями.

Среди пациентов с тяжелым течением хронического аденоидита (N=355) симптомы клинической и эндогенной интоксикации регистрировались в 80% случаев (N=284), наличие осложнений в виде туботита, экссудативного среднего отита - в 75% случаев (N=266). Характерной особенностью группы пациентов являлись частые обострения - 1 раз в 2 месяца или ежемесячно длительностью 14 суток. Мутантные полиморфные аллельные варианты гена интерлейкина-4, интерлейкина-1β приводили к экспрессии усеченных и функционально неполноценных белков интерлейкина-4, интерлейкина-1β. В результате этого при гетерозиготном или гомозиготном носительстве олигонуклеотидной замены тимина на цитозин в позиции 589 гена интерлейкина-4 на хромосоме 5q31-33 в ассоциации с гомозиготным носительством олигонуклеотидной замены тимина на цитозин в позиции 3954 гена интерлейкина-1(на хромосоме 2q13-21 функциональная активность данных цитокинов менялась - повышался их провоспалительный эффект - на 100%. Дети этой группы имели высокие концентрации в сыворотке крови интерлейкина-1β (298,4±8,2) пг/мл (контроль - 65,43 пг/мл), интерлейкина-4 (146,7±4,1) пг/мл (контроль - 58,68 пг/мл) (р<0,001) (фиг.5).

Лечение пациентов с тяжелым течением хронического аденоидита назначали в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50-100 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1-2 раза в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100-400 мкг ежедневно в течение 30 суток. При выборе эффективной и безопасной дозы мометазона фуроата у пациентов с тяжелым течением хронического аденоидита оптимальной оказалась доза 200 мкг в сутки. Длительность курса в течение 30 суток установлена на основе анализа частоты и длительности ремиссии заболевания.

При выявлении гетерозиготного генотипа по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гомозиготным или гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю соответственно С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностировали течение средней тяжести хронического аденоидита с обострениями рецидивирующего затяжного характера.

У пациентов с хроническим аденоидитом средней тяжести (N=212) симптомы клинической и эндогенной интоксикации регистрировались в 50% случаев (N=106), наличие осложнений в виде туботита, экссудативного среднего отита - в 10% случаев (N=21). Характерной особенностью группы пациентов являлись затяжные обострения - 1 раз в 3-4 месяца длительностью 21 сутки. Мутантные полиморфные аллельные варианты генов интерлейкина-4, интерлейкина-1β приводили к изменению функциональной активностью данных цитокинов - повышался их провоспалительный эффект - на 50%. Дети этой группы имели умеренно повышенные концентрации в сыворотке крови интерлейкина-1β (165,4±10,3) пг/мл (контроль - 65,43 пг/мл), интерлейкина-4 (141,3±3,2) пг/мл (контроль - 58,68 пг/мл) (р<0,001) (фиг.5).

Лечение пациентов с течением средней тяжести хронического аденоидита назначали в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100 мкг ежедневно в течение 21-30 суток. При выборе эффективной и безопасной дозы мометазона фуроата у пациентов с хроническим аденоидитом средней тяжести оптимальной оказалась доза 100 мкг в сутки.

Длительность курса была установлена на основе анализа частоты и длительности ремиссии заболевания.

При выявлении генотипа гомозиготного по низкопродуцирующему «дикому» (вариант нормы) аллелю Т/Т гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 или гомозиготным генотипом по низкопродуцирующему «дикому» аллелю Т/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностировали хронический аденоидит с легким течением и благоприятным исходом.

У пациентов с хроническим аденоидитом легкой тяжести (N=27) симптомы клинической и эндогенной интоксикации и наличие осложнений не регистрировались. Характерной особенностью группы пациентов являлись обострения - 1 раз в 4-6 месяца длительностью до 10 суток. Повышение концентрации в сыворотке крови интерлейкина-1β и интерлейкина-4 у детей этой группы составило соответственно (81,4±6,3) пг/мл и (95,3±7,2) пг/мл (р<0,001) (фиг.5).

Лечение пациентов с легким течением хронического аденоидита назначали в виде интраназальных ингаляций лиофилизата интерлейкина-1β в физиологическом растворе в дозе 5-10 нг/мл на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки, увеличивая разовую дозу на 5-10 нг/мл через 1-2 суток, но не более чем 30 нг/мл в течение 5-16 суток.

Методика применения лиофилизата интерлейкина-1β заключались в следующем. Содержимое ампулы (1 мкг лиофилизата интерлейкина-1β) растворяли в 1 мл стерильного 0,9% хлорида натрия и дополнительно разводили физиологическим раствором до конечной концентрации (10-40 нг/мл) непосредственно перед применением. Получение рабочих растворов лиофилизата интерлейкина-1β приведено на фиг.6.

При выборе эффективной и безопасной разовой дозы лиофилизата интерлейкина-1β (оценивались 5, 10, 20, 30 нг/мл) у пациентов с хроническим аденоидитом оптимальной оказалась доза 10 нг/мл. В ходе лечения установлены два варианта динамики воспалительного процесса. Первый вариант протекал с усилением симптомов гнойного воспаления аденоидной ткани в начале лечения с последующим его купированием на 9-16 сутки. Второй вариант протекал с уменьшением симптомов гнойного воспаления аденоидной ткани без первоначального усиления воспалительного процесса и его полным купированием на 5-7 сутки.

Анализ корреляций показателей концентраций цитокинов сыворотки крови с показателями эффективности лечения мометазона фуроатом, лиофилизатом интерлейкина-1β в зависимости от генотипа (клинические симптомы, температура, лейкоцитоз, СОЭ) при хроническом аденоидите у пациентов продемонстрировал купирование воспалительного процесса к окончанию курса лечения в 100% случаях, что характеризует лечение с высокой эффективностью всех групп пациентов. Достоверность лабораторных показателей у пациентов с хроническим аденоидитом после персонализированной диагностики и лечения и без персонализации продемонстрирована на фиг.7.

С целью сохранения эффекта лечения были разработаны персонализированные рекомендации по диспансерному наблюдению и лечению детей с хроническим аденоидитом (фиг.8).

При проспективном наблюдении пациентов с хроническим аденоидитом в течение года после курса лечения на основе персонализированной диагностики констатировано достоверное снижение частоты обострений заболевания в 3 раза. Продолжительность ремиссии составила 9 месяцев. Кроме того, применяя стратификационный подход и выполняя персонализированные рекомендации, в течение периода наблюдения, составившим 9-12 месяцев, отмечена стойкая нормализация лабораторных показателей (концентрация цитокинов в сыворотке крови, лейкоцитоз, СОЭ).

Примеры осуществления способа.

Пример 1.

Пациентка М., возраст - 4 года 2 месяца (протокол исследования №273), обратилась на прием в консультативную поликлинику Краевого бюджетного учреждения здравоохранения «Краевая клиническая больница №1» г. Красноярска 20 ноября 2010 г. с жалобами на выраженное затруднение носового дыхания за счет заложенности и отделяемого из носа, периодическое утреннее покашливание, храп во время ночного сна, заложенность в обоих ушах без потери слуха, снижение аппетита, быструю утомляемость и общую слабость, беспокойный сон с ночными страхами, длительный до 2-х недель субфебрилитет - 37,7°С, частые острые респираторно-вирусные инфекции каждые 2 месяца с осложнениями в виде туботита.

Анамнез заболевания: жалобы предъявляет в течение 12 месяцев. Связывает с поступлением в детское дошкольное учреждение. Острые респираторные вирусные заболевания ежемесячно, с затяжным течением - длительностью более 7 дней. Их течение осложняется слизисто-гнойным насморком, туботитом. Обострения до 8 раз в год. Периоды обострения протекают на фоне высоких цифр температуры до 39°С. Амбулаторно трижды получала лечение у педиатра и оториноларинголога по общепринятой методике, последний раз - месяц назад курсом в течение 20 дней: системные антибиотики широкого спектра действия, на которые стало появляться транзиторное нарушение пищеварения в виде неустойчивого стула и болей в животе, сосудосуживающие капли в нос, раствор протаргола интраназально, антигистаминные препараты внутрь, иммунные препараты, а также лазеротерапию. В результате проведенного лечения отмечалось некоторое улучшение в течение 10 дней: уменьшились выделения из носа и выраженность заложенности. Причиной обращения на повторный амбулаторный прием послужили сохраняющиеся выделения из носа, храп, присоединение гнусавости, прерывистый сон с длительным засыпанием и ночными страхами, отсутствие купирования симптомов туботита клинически и по данным импедансометрии.

Аллергологический личный и семейный анамнез не отягощен.

При эндоскопии полости носа и носоглотки отмечен умеренно выраженный отек слизистой оболочки, преимущественно в области нижних носовых раковин, их синюшность, а также скудное слизистое отделяемое в общем носовом ходе, гиперплазия глоточной миндалины II степени с преимущественным расположением в области купола носоглотки и тубарно с недифференциацией борозд, гиперемией. Носовая перегородка по средней линии.

Со стороны других ЛОР-органов - барабанные перепонки справа и слева серые, несколько втянутые, подвижные, опознавательные пункты мало дифференцируются, световой рефлекс укорочен. Шепотная речь воспринимается на расстоянии 4 м (норма 6 м), а обычная разговорная речь - на расстоянии 6 м (норма >6 м), с погрешностями на басовых частотах. Лимфоузлы передне-шейной, задне-шейной группы увеличены до 0,7×0,7 см в диаметре, плотно-эластичной консистенции, неспаянные, безболезненные.

Акустическая импедансометрия: справа - тип С, объем слухового прохода 0,79 мл, комплианс 0,32 мл, прессура -122 даПа, градиент 0,11 мл; слева - тип С, объем слухового прохода 0,72 мл, комплианс 0,22 мл, прессура -162 даПа, градиент 0,09 мл. Заключение: справа и слева умеренно выражена дисфункция слуховой трубы, ограничение подвижности барабанной перепонки. Факт сохранения патологических изменений в слуховой трубе в период ремиссии воспалительного процесса констатирует наличие осложнения у пациентки.

Рентгенография околоносовых пазух: пневматизация верхнечелюстных пазух и клеток решетчатого лабиринта достаточная пазух.

Клинический анализ крови выявил слабовыраженный абсолютный лейкоцитоз без изменений лейкоцитарной формулы (9,2×10⁹/л), слабо ускоренную СОЭ (15 мм/час), которые являются лабораторными показателями эндогенной интоксикации и свидетельствуют о воспалительном процессе.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови: концентрация интерлейкин-1β - 311,4 пг/мл (контроль - 65,43 пг/мл), интерлейкин-4 - 151,2 пг/мл (контроль - 58,68 пг/мл). Интерлейкин-1β является основным провоспалительным цитокином, определяющим остроту процесса, повышение его концентрации связано с активацией иммунного ответа по Т-хелперному пути 1 типа и взаимосвязано с развитием процессов воспаления. Высокодостоверное повышение концентрации интерлейкин-1β до начала терапии по сравнению с аналогичными показателями здоровых детей в 4,8 раза указывает на активность воспаления и массивное поступление антигена (р<0,001), развитие системного воспалительного ответа. Исходный уровень интерлейкина-4 также высокодостоверно превышает аналогичный показатель у здоровых детей (р<0,001) в 2,6 раза, что обусловлено имеющейся преактивацией Т-хелперов 2 типа антигенами in vivo. Таким образом, у данной пациентки с воспалительным процессом выражен иммуно-воспалительный процесс, так как в равной степени активизированы механизмы регуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа с возникновением в определенной степени конкуренции за переход на Т-хелперный путь 1 типа или Т-хелперный путь 2 типа.

С учетом жалоб, анамнеза, данных объективного осмотра и комплексного клинико-лабораторно-инструментального исследования оториноларингологом и аллергологом верифицирован диагноз хронического аденоидита, гнойной формы, ремиссии, осложненного двусторонним туботитом.

С информированного согласия (представителя пациентки - родителя) пациентке проведено молекулярно-генетическое исследование.

Иммуногенетика: гомозиготный носитель мутантного полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-1β (3954 С/С), гомозиготный носитель мутантного полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-4 (589 С/С). Таким образом, у пациентки объективно определено совокупное наличие гомозиготных по высокопродуцирующему аллелю генов исследуемых цитокинов и персонализированно диагностировано тяжелое течение хронического аденоидита с частыми выраженными обострениями, осложнениями.

С учетом полученных данных обследования проведена стратификация по группе риска при хроническом аденоидите у детей и пациентка отнесена к группе высокого риска.

Пациентке назначено лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 2 раза в сутки эквивалентному общей суточной дозе 200 мкг ежедневно в течение 30 суток.

При визите к окончанию курса терапии на 30 сутки установлено достоверное клиническое улучшение: жалобы общего характера не беспокоили, самочувствие и эмоциональный тонус хорошие, ребенок активен. Аппетит удовлетворительный, сон и температура нормализовались. Объективно отмечалась положительная динамика: носовое дыхание восстановлено, храп, гнусавость купированы. При видеоэндоскопии слизистая полости носа и носоглотки розовая, чистая, купирована отечность и слизистое отделяемое в области хоан и полости носа, глоточная миндалина I степени за счет гиперплазии, с четким рельефом ткани за счет дифференциации борозд, сужение борозд, с нормализацией трофики ткани. Барабанные перепонки справа и слева серые, подвижные, опознавательные пункты четко дифференцируются, световой рефлекс с четкими контурами, полный. Шепотная речь воспринимается на расстоянии 6 м (норма 6 м), а разговорная речь - на расстоянии более 6 м (норма >6 м). Регионарные лимфоузлы вдоль грудинно-ключично-сосцевидной мышцы 0,5×0,5 см в диаметре, эластичной консистенции, безболезненные.

Акустическая импедансометрия: справа - тип А, объем слухового прохода 0,80 мл, комплианс 0,62 мл, прессура -21 даПа, градиент 0,31 мл; слева - тип А, объем слухового прохода 0,73 мл, комплианс 0,52 мл, прессура -39 даПа, градиент 0,20 мл. Заключение: справа и слева патологии слуховой трубы не выявлено. Факт отсутствия патологических изменений в слуховой трубе на фоне назначенного лечения констатирует купирование осложнения у пациентки.

В клиническом анализе крови нормализовалось количество лейкоцитов (7,3×10⁹/л), СОЭ (6 мм/час), что свидетельствует о купировании эндогенной интоксикации и воспалительных процессов в носоглотке, слуховой трубе.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови отмечалось снижение выраженности системного воспалительного ответа и начальный этап развития специфического иммунного ответа: уменьшение концентрации интерлейкин-1β - 94,5 пг/мл, интерлейкин-4 - 81,7 пг/мл.

Пациентка по окончании курса лечения в дополнительном лечении не нуждалась. Оценка эффективности лечения высокая. Плановый контрольный осмотр рекомендовался через 1, 3, 6 и 9 месяцев.

При анализе результатов терапии через 1, 3, 6 и 9 месяцев у пациентки диагностирована стойкая ремиссия: обострений не наблюдалось, ОРВИ не переносила. Лабораторные показатели без отрицательной динамики.

План реабилитации пациентки предусматривал повторные этапные курсы интраназального глюкокортикоидного лечения 1 раз в шесть месяцев, междисциплинарное диспансерное наблюдение у оториноларинголога и иммунолога с частотой осмотров 1 раз в квартал.

К настоящему времени длительность ремиссии один год. За период наблюдения отсутствовали осложнения: со стороны ушей - формирование хронического туботита, экссудативного отита с нарушением функции слуха, нарушение челюстно-лицевого скелета, вегетативные дисфункции. Заболеваемость ОРВИ снизилась в 5,2 раза. Течение ОРВИ типичное: выздоровление в срок до 7 дней без применения антибиотикотерапии и при отсутствии осложнений острыми воспалительными заболеваниями со стороны ЛОР-органов.

Пример 2.

Пациент Ш., возраст - 4 года 1 месяц (протокол исследования №381), обратился на прием в консультативную поликлинику Краевого бюджетного учреждения здравоохранения «Краевая клиническая больница №1» г. Красноярска 28 января 2011 г. с жалобами на умеренно выраженное затруднение носового дыхания за счет заложенности и слизисто-гнойного отделяемого из носа, храп во время ночного сна, периодическое утреннее покашливание, на фоне быстрой утомляемости, снижения аппетита, периодического повышения температуры вечером (t=37,3°C) в течение более 1 месяца.

Анамнез заболевания: со слов родителя болен более 1 года, рецидивы до 4 раз в год. Связывает с последствиями перенесенной острой респираторной вирусной инфекции затяжного характера. Острые респираторные вирусные заболевания 1 раз в 3 месяца, с затяжным течением - длительностью более 7 дней. Их течение сопровождается дисфункцией слуховой трубы, купирующейся после выздоровления. На фоне заболеваний температура тела не повышается выше 37,5°C. Получал лечение у оториноларинголога по месту жительства по общепринятой методике - раствор протаргола интраназально. Эффект лечения кратковременный 2 недели, что послужило поводом для обращения.

Аллергологический личный и семейный анамнез не отягощен.

При эндоскопии полости носа и носоглотки отмечен умеренно выраженный отек слизистой оболочки, преимущественно в области нижних носовых раковин, их синюшность, а также скудное слизисто-гнойное отделяемое на поверхности аденоидных вегетации, гиперплазия глоточной миндалины II степени с преимущественным расположением в области купола носоглотки и тубарно с недифференциацией борозд, гиперемией. Носовая перегородка по средней линии.

Со стороны других ЛОР-органов - барабанные перепонки справа и слева серые, несколько втянутые, подвижные, опознавательные пункты дифференцируются. Шепотная речь воспринимается на расстоянии 6 м (норма 6 м), а обычная разговорная речь - на расстоянии 6 м (норма >6 м). Лимфоузлы передне-шейной, задне-шейной группы увеличены до 0,5×0,5 см в диаметре, плотно-эластичной консистенции, неспаянные, безболезненные.

Акустическая импедансометрия: справа - тип А, объем слухового прохода 0,68 мл, комплианс 0,47 мл, прессура -50 даПа, градиент 0,23 мл; слева - тип А, объем слухового прохода 0,67 мл, комплианс 0,52 мл, прессура -42 даПа, градиент 0,39 мл. Заключение: патологии слуховой трубы не выявлено. Факт отсутствия патологических изменений в слуховой трубе в период гнойно-воспалительного процесса в носоглотке констатирует отсутствие осложнения у пациента.

Рентгенография околоносовых пазух: пневматизация верхнечелюстных пазух и клеток решетчатого лабиринта достаточная пазух.

Клинический анализ крови выявил слабовыраженный лейкоцитоз без изменений лейкоцитарной формулы (8,5×10⁹/л) слабую ускоренную СОЭ (12 мм/час), которые являются лабораторными показателями слабой выраженной эндогенной интоксикации и свидетельствуют о воспалительном процессе.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови: концентрация интерлейкин-1β - 177,8 пг/мл (контроль - 65,43 пг/мл), интерлейкин-4 - 146,4 пг/мл (контроль -58,68 пг/мл). Интерлейкин-1β является основным провоспалительным цитокином, определяющим остроту процесса, повышение его концентрации в 2,7 раза связано с активацией иммунного ответа по Т-хелперному пути 1 типа и взаимосвязано с развитием процессов воспаления. Исходный уровень интерлейкина-4 также высокодостоверно превышает аналогичный показатель у здоровых детей (р<0,001) в 2,5 раза, что обусловлено имеющейся преактивацией Т-хелперов 2 типа антигенами in vivo. Таким образом, у данного пациента с воспалительным процессом умеренно выражен иммуно-воспалительный процесс и в равной степени активизированы механизмы регуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа с возникновением в определенной степени конкуренции за переход на Т-хелперный путь 1 типа или Т-хелперный путь 2 типа.

С учетом жалоб, анамнеза, данных объективного осмотра и комплексного клинико-лабораторно-инструментального исследования оториноларингологом и аллергологом верифицирован диагноз хронического аденоидита, гнойной формы, ремиссии.

С информированного согласия (представителя пациентки - родителя) пациентке проведено молекулярно-генетическое исследование.

Иммуногенетика: гетерозиготный носитель мутантного полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-1β (3954 С/Т), гетерозиготный носитель мутантного полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-4 (589 С/Т). Таким образом, у пациента объективно определено совокупное наличие гетерозиготных по высокопродуцирующим аллелям генов исследуемых цитокинов и персонализированно диагностировано средней тяжести течение хронического аденоидита с рецидивирующим затяжным характером.

С учетом полученных данных обследования проведена стратификация по группе риска при хроническом аденоидите у детей и пациент отнесен к группе среднего риска.

Пациенту назначено лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100 мкг ежедневно в течение 30 суток.

При визите к окончанию курса терапии на 30 сутки установлено достоверное купирование клинических симптомов: носовое дыхание восстановлено, отсутствие храпа, температура тела 36,7°C. При видеоэндоскопии слизистая полости носа и носоглотки розовая, чистая, купирована отечность и слизистое отделяемое в области хоан и полости носа, глоточная миндалина I степени за счет гиперплазии, с четким рельефом ткани за счет дифференциации борозд, сужение борозд, с нормализацией трофики ткани. Барабанные перепонки справа и слева серые, подвижные, опознавательные пункты четко дифференцируются, световой рефлекс с четкими контурами, полный. Шепотная речь воспринимается на расстоянии 6 м (норма 6 м), а разговорная речь - на расстоянии более 6 м (норма >6 м). Регионарные лимфоузлы вдоль грудинно-ключично-сосцевидной мышцы 0,5×0,5 см в диаметре, эластичной консистенции, безболезненные.

В клиническом анализе крови нормализовалось количество лейкоцитов (6,9×10⁹/л), СОЭ (8 мм/час), что свидетельствует о купировании эндогенной интоксикации и воспалительных процессов в носоглотке, слуховой трубе.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови отмечалось снижение выраженности системного воспалительного ответа и начальный этап развития специфического иммунного ответа: уменьшение концентрации интерлейкин-1β - 65,5 пг/мл, интерлейкин-4 - 61,2 пг/мл.

Пациентка по окончании курса лечения в дополнительном лечении не нуждалась.

При анализе результатов терапии через 1, 3, 6 и 9 месяцев у пациентки диагностирована стойкая ремиссия: обострений не наблюдалось. Лабораторные показатели без отрицательной динамики.

План реабилитации пациентки предусматривал повторные этапные курсы интраназального глюкокортикоидного лечения 1 раз в шесть месяцев, междисциплинарное диспансерное наблюдение у оториноларинголога и иммунолога с частотой осмотров 1 раз в 3 месяца.

К настоящему времени длительность ремиссии 9 месяцев.

Пример 3.

Пациентка Ш., возраст - 6 лет (протокол исследования №358), обратилась на прием в консультативную поликлинику Краевого бюджетного учреждения здравоохранения «Краевая клиническая больница №1» г. Красноярска 21 января 2011 г. с жалобами на выраженное затруднение носового дыхания за счет слизисто-гнойного отделяемого из носа, с продуктивным частым отсмаркиванием, приносящим облегчение носового дыхания, преходящее сопение носом во время ночного сна, запах изо рта, периодическое утреннее покашливание, на фоне практически удовлетворительного самочувствия и отсутствия повышения температуры (t=36,9°C).

Анамнез заболевания: пациентка больна в течение 3 лет. Ежегодно повторные гнойно-воспалительные заболевания носа и носоглотки до 3-4 раз в год. Периоды обострения протекают на фоне субфебрильных цифр температуры не более 37,5°C. Неоднократно лечилась амбулаторно у оториноларинголога. При каждом случае заболевания получала системную антибактериальную терапию аугментином в обычной дозе, антисептические капли в нос (диоксидин, октенисепт, мирамистин). Но эффективность терапии была низкой, так как не сокращала сроки купирования заболевания, не обеспечивала длительной ремиссии и полного купирования всех симптомов. Сохранялись скудное слизисто-гнойное отделяемое постназально, стекающее в носоглотку.

Аллергологический личный и семейный анамнез не отягощен.

При эндоскопии полости носа и носоглотки отмечен слабо выраженный отек слизистой оболочки, преимущественно в области нижних носовых раковин, их синюшность, а также умеренное слизисто-гнойное отделяемое в общем носовом ходе, гиперплазия глоточной миндалины II степени с преимущественным расположением в области купола, хоан с недифференциацией борозд, наличием гнойного отделяемого на ее поверхности, стекающее постназально, на фоне умеренной гиперемии аденоидной ткани. Носовая перегородка по средней линии.

Со стороны других ЛОР-органов - признаков патологии не выявлено. Лимфоузлы передне-шейной, задне-шейной группы увеличены до 0,7×0,7 см в диаметре, эластичной консистенции, неспаянные, безболезненные.

Акустическая импедансометрия: справа - тип А, объем слухового прохода 0,92 мл, комплианс 0,69 мл, прессура -12 даПа, градиент 0,37 мл; слева - тип А, объем слухового прохода 0,96 мл, комплианс 0,72 мл, прессура -12 даПа, градиент 0,41 мл. Заключение: патологии слуховой трубы справа и слева не выявлено. Факт отсутствия патологических изменений в слуховой трубе в период гнойно-воспалительного процесса в носоглотке констатирует отсутствие осложнения у пациентки.

Рентгенография околоносовых пазух: пневматизация верхнечелюстных пазух и клеток решетчатого лабиринта достаточная пазух.

В это время в клиническом анализе крови выявлен слабовыраженный относительный лейкоцитоз за счет лимфоцитов (соответственно 7,4*10⁹/л и 58%), нормальная СОЭ (8 мм/час), что свидетельствует об отсутствии эндогенной интоксикации и системного гнойно-воспалительного процесса в организме.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови достоверное повышение противовоспалительного цитокина свидетельствует о наличии воспалительного ответа: концентрация интерлейкин-1β - 105,4 пг/мл (контроль - 65,43 пг/мл), интерлейкин-4 - 131,2 пг/мл (контроль - 58,68 пг/мл). При этом приоритетное достоверное повышение противовоспалительного цитокина интерлейкина-4 свидетельствует о преимущественно гуморальном иммунном ответе с формированием адаптивного иммунитета.

С учетом жалоб, анамнеза, данных объективного осмотра и комплексного клинико-лабораторно-инструментального исследования оториноларингологом и аллергологом верифицирован диагноз хронического аденоидита, гнойной формы, ремиссии.

С информированного согласия (представителя пациентки - родителя) пациентке проведено молекулярно-генетическое исследование.

Иммуногенетика: гомозиготный носитель «дикого» (вариант нормы) полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-1β (3954 Т/Т), гетерозиготный носитель мутантного полиморфного аллельного варианта гена интерлейкина-4 (589 С/Т). Таким образом, у пациентки объективно определено совокупное наличие гомозиготного генотипа по низкопродуцирующему «дикому» (вариант нормы) аллелю Т/Т гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 и персонализированно диагностировано легкое течение хронического аденоидита с благоприятным исходом.

С учетом полученных данных обследования проведена стратификация по группе риска при хроническом аденоидите у детей и пациентка отнесена к группе низкого риска.

Пациентке назначено лечение в виде интраназальных ингаляций лиофилизата интерлейкина-1β в физиологическом растворе в дозе 10 нг/мл на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки в течение 5 суток.

После первого ведения лиофилизата интерлейкина-1β температура тела не изменилась в сторону повышения и составила 36,9°C.

В динамике лечения отмечалось уменьшение симптомов гнойного воспаления аденоидной ткани без первоначального усиления воспалительного процесса и его полное купирование на 5 сутки. Жалобы на гнойное отделяемое из носа, вызывающее покашливание, запах изо рта купированы, носовое дыхание восстановлено. Самочувствие хорошее. При видеоэндоскопии слизистая полости носа и носоглотки розовая, чистая, купирована отечность и слизистое-гнойное отделяемое в области хоан и носоглотке, глоточная миндалина I степени за счет гиперплазии, с четким рельефом ткани за счет дифференциации борозд, сужение борозд, с нормализацией трофики ткани. Регионарные лимфоузлы вдоль грудинно-ключично-сосцевидной мышцы 0,5×0,5 см в диаметре, эластичной консистенции, безболезненные.

В клиническом анализе крови - стабильность показателей без патологических изменений.

При иммунологическом исследовании сыворотки крови отмечалось уменьшение концентрации провоспалительных и противовоспалительного цитокинов: концентрация интерлейкин-1β - 62,4 пг/мл, интерлейкин-4 - 79,3 пг/мл.

Оценка эффективности лечения высокая. С учетом удовлетворительного состояния пациентки, плановый контрольный осмотр рекомендовался через 1, 3, 6 и 9 месяцев.

При повторном осмотре через 1, 3, 6 и 9 месяцев у пациентки диагностирована стойкая ремиссия: обострений хронического аденоидита не наблюдалось, ОРВИ не переносила. Лабораторные показатели в пределах нормы.

План реабилитации пациентки предусматривал повторные этапные курсы местной цитокинотерапии 1 раз в 6 месяцев, диспансерное наблюдение у оториноларинголога с частотой 1 раз в 6 месяцев.

В настоящее время пациентка продолжает наблюдаться. За период наблюдения не отмечалось обострений. Продолжительность ремиссии составляет 10 месяцев.

Технический результат предлагаемого изобретения состоит в обоснованном с высокой эффективностью лечении, ранжированного с учетом варианта аллельного полиморфизма генов интерлейкина-4, интерлейкина-1β, регулирующих процесс воспаления, на основе объективной высокоинформативной персонализированной диагностики характера течения и степени тяжести хронического аденоидита у детей за счет анализа однотипного биологического материала (исключительно образца крови). Способ исключает побочные действия лечения - усиление патологического процесса за счет увеличения температуры тела, отека и слизисто-гнойного отделяемого. Предлагаемый способ осуществляет в 100% случаев охват пациентов лечением с учетом всех вариантов генотипов, включая группу гомозиготных по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/С гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 пациентов, результат лечение которых лиофилизатом интерлейкина-1β является с низкой эффективностью. Предлагаемый способ позволяет провести стратификацию групп риска пациентов с хроническим аденоидитом, обеспечивая пролонгированный период клинической ремиссии.

Проведение молекулярно-генетического исследования вариантов генов цитокинов методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени расширяет методические и технические возможности диагностики хронического аденоидита у детей, обуславливая автоматизацию и компьютерную обработку результатов, обеспечивая повышение быстродействия и точность результатов.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ лечения хронического аденоидита у детей. Путем полимеразной цепной реакции в режиме реального времени анализируют концентрацию интерлейкина-1β и интерлейкина-4 в сыворотке крови. При выявлении генотипа С/С гена интерлейкина-1β в локусе 3954 в совокупности с генотипом С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в локусе 589 диагностируют тяжелое течение хронического аденоидита с частыми выраженными обострениями, осложнениями и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50-100 мкг на процедуру в каждый носовой ход 1-2 раза в сутки 100-400 мкг ежедневно в течение 30 суток. При выявлении генотипа С/Т гена интерлейкина-1β в локусе 3954 в совокупности с генотипом С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в локусе 589 диагностируют течение средней тяжести хронического аденоидита с обострениями рецидивирующего затяжного характера и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50 мкг на процедуру в каждый носовой ход 1 раз в сутки 100 мкг ежедневно в течение 21-30 суток. При выявлении генотипа Т/Т гена интерлейкина-1β в локусе 3954 в совокупности с генотипом С/Т или Т/Т гена интерлейкина-4 в локусе 589 диагностируют хронический аденоидит с легким течением и благоприятным исходом и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций лиофилизата интерлейкина-1β в физиологическом растворе в дозе 5-10 нг/мл на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки, увеличивая разовую дозу на 5-10 нг/мл через 1-2 суток, но не более чем 30 нг/мл в течение 5-16 суток. Изобретение позволяет провести стратификацию групп риска с хроническим аденоидитом и обеспечивает эффективный способ лечения хронического аденоидита у детей. 8 ил., 3 пр.

Способ лечения хронического аденоидита у детей, включающий диагностику, представляющую собой генотипирование и анализ данных по признакам аллельного полиморфизма гена интерлейкина-1β, отличающийся тем, что дополнительно проводят генотипирование и анализ данных по признакам аллельного полиморфизма гена интерлейкина-4, регулирующего процесс воспаления, в полиморфном локусе 589 путем полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплиментарных исследуемому фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты образца крови больного ребенка, после проведения анализа данных генотипирования по признакам аллельного полиморфизма генов интерлейкина-1β, интерлейкина-4 соответственно в полиморфных локусах 3954 и 589 анализируют совокупность данных генотипирования и показателей уровня экспрессии - концентраций интерлейкина-1β, интерлейкина-4 в сыворотке крови детей с хроническим аденоидитом, при выявлении генотипа гомозиготного по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/С гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гомозиготным или гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю соответственно С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностируют тяжелое течение хронического аденоидита с частыми выраженными обострениями, осложнениями и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50-100 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1-2 раза в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100-400 мкг ежедневно в течение 30 суток, при выявлении гетерозиготного генотипа по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гомозиготным или гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю соответственно С/С или С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностируют течение средней тяжести хронического аденоидита с обострениями рецидивирующего затяжного характера и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций суспензии мометазона фуроата по 50 мкг на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки эквивалентному общей суточной дозе 100 мкг ежедневно в течение 21-30 суток, при выявлении генотипа гомозиготного по низкопродуцирующему «дикому» (вариант нормы) аллелю Т/Т гена интерлейкина-1β в полиморфном локусе 3954 в совокупности с гетерозиготным генотипом по высокопродуцирующему мутантному аллелю С/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 или с гомозиготным генотипом по низкопродуцирующему «дикому» аллелю Т/Т гена интерлейкина-4 в полиморфном локусе 589 персонализированно диагностируют хронический аденоидит с легким течением и благоприятным исходом и назначают лечение в виде интраназальных ингаляций лиофилизага интерлейкина-1β в физиологическом растворе в дозе 5-10 нг/мл на процедуру в каждый общий носовой ход 1 раз в сутки, увеличивая разовую дозу на 5-10 нг/мл через 1-2 суток, но не более чем 30 нг/мл в течение 5-16 суток.