ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS DELHIENSIS - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400, который может быть использован для очистки воды и почвы, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

В настоящее время резко увеличились объемы добычи и транспортировки нефти. Нефть и нефтепродукты являются самым распространенным источником топлива и энергии в мире и в связи с этим наиболее крупномасштабными загрязнителями окружающей среды. При существующих масштабах загрязнений и скорости естественного восстановления окружающей среды ауторемедиация может продолжаться до 30 лет, а в районах с холодным климатом гораздо дольше [Экологические проблемы загрязнения нефтью почв сельскохозяйственного назначения [Текст] / Ульянова О.В., Нечкина М.А., Мохонько Ю.М., Данилова С.А., Калмыков С.И. // Фундаментальные исследования. - 2007. - №12. - С. 192-193.; Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus [Текст] / Филонов А.Е. и др. // Биотехнология. - 2008. - №6. - С. 80-85].

Существуют различные способы переработки и утилизации отходов нефтеперерабатывающей промышленности. К ним относятся механические, физико-химические, химические и биологические методы. При выборе способа утилизации приоритет в основном отдается способам, направленным на извлечение из нефтешламов углеводородного сырья. Однако не решена проблема доочистки образовавшихся в результате переработки твердых отходов и водной фазы. Наиболее перспективным способом очистки нефтешламов представляется комплекс мер, сочетающих различные методы очистки [Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rodococcus [Текст] / Филонов А.Е. и др. // Биотехнология. - 2008. - №6. - С. 80-85].

Основную роль в ремедиации in situ (на месте загрязнения) играет биологический фактор - активность микроорганизмов, участвующих в процессах деградации углеводородов нефти [Биотехнология защиты окружающей среды: Учебное пособие [Текст] / Решетилов А.Н., Решетилова Т.А., Шкидченко А.Н., Кошелева И.А., Иванова Е.С., Блохин И.В. - ТулГУ Тула, 2006. - 114 с.; Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биремедиации почв и водной среды [Текст] / Андреева И.С., Емельянова Е.К., Загребельный С.Н., Олькин С.Е., Резникова И.К., Репин В.Е. // Биотехнология. - 2006. - №1. - С. 43-52]. Поэтому для наиболее эффективной ремедиации территорий, загрязненных углеводородами нефти, применяют микробиологические методы очистки. Соединения, которые подвергаются полной деградации, могут использоваться микроорганизмами в качестве источника углерода, а также источника энергии или в процессах метаболизма. Разрушение стойких органических соединений в природе происходит, как правило, в результате совместного действия микроорганизмов и абиотических факторов. Микробиологическая минерализация является наиболее эффективным и экологически приемлемым способом удаления поллютантов из окружающей среды [Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus [Текст] / Филонов А.Е. и др. // Биотехнология. - 2008. - №6. - С. 80-85].

Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную очистку, приводящую к уменьшению концентрации как отдельного загрязнителя, так и смеси поллютантов. Одним из методов биологической очистки является использование биопрепаратов, содержащих активные штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов [Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rodococcus [Текст] / Филонов А.Е. и др. // Биотехнология. - 2008. - №6. - С. 80-85].

Уровень техники

Известны штаммы: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus [Клюшникова T.M., Смирнова Г.Ф., Куберская СЛ., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С А.с. SU 1493666-А1. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. Заявка 4280617, 09.07.1987. Опубл. 15.07.1989]; Flavobacterium tirrennicum [Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И. А.с. SU 1409594. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланцевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. Заявка 4066152, 24.03.1986. Опубл. 15.07.1988], которые могут разлагать углеводороды нефти.

Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы: Acinetobacter species SN-2 [Ильинская Н.В., Ушков СБ. Штамм бактерий ACINETOBACTER SPECIES, очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений. Заявка 93009595, 23.02.1993. Опубл. 20.07.1996]; Pseudomonas alcaligenes Е7 [Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Штамм бактерий PSEUDOMONAS ALCALIGENES Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2134723. Заявка 98105707, 25.03.1998. Опубл. 20.08.1999] и Pseudomonas alcaligenes В-1 [Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. Штамм бактерий PSEUDOMONAS ALCALIGENES В-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2133770. Заявка 98105709, 25.03.1998. Опубл. 27.07.1999]. Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.

Наиболее близким к заявляемому является штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ream 01139 [Рогозина Е.А., Орлова Н.А., Свечина P.M., Переходова Л.С., Тимергазина И.Ф. Штамм pseudomonas aeruginosa ream 01139 для разложения нефти и дизельного топлива. Патент РФ №2489482]. Недостатком данного штамма является то, что снижение содержания нефтепродуктов в нефтезагрязненной почве происходит на 62,1÷67,8% только через 13 недель, а утилизация дизельного топлива в почве наблюдается только с 6 недели.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры штаммов, обладающих утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам.

Осуществление изобретения

Предлагаемый штамм Pseudomonas delhiensis KT-13 выделен методом накопительных культур из почвы Кировской области в течение длительного времени загрязняемой сырой нефтью, идентифицирован на основании анализа первичной нуклеотидной последовательности генов 16 S рибосомальной РНК и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1). Коллекционный номер штамма ВКПМ В-11400.

Штамм бактерий Pseudomonas delhiensis KT-13 В-11400 утилизирует нефть и нефтепродукты (дизельное топливо и керосин) из жидких сред и почвы, используя загрязнители в качестве единственного источника углерода. Деструкция сырой нефти в жидкой среде при ее исходной концентрации 15 г/л составляет 28,6% через 14 суток при температуре 27÷29°С, а в почве при таких же условиях - 35,3% за тот же период. Биодеградация нефтепродуктов (дизельное топливо или керосин) в жидкой среде при их исходной концентрации 15 г/л и температуре 27÷29°С на 14 сутки составляет 34,9 или 37,3%, а в почве при тех же условиях: 35,8 или 37,5% в зависимости от типа загрязнителя.

Предлагаемый штамм бактерий Pseudomonas delhiensis KT-13 В-11400 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

При росте на мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) через 48 ч формируются колонии округлые, выпуклые, блестящие, прозрачные, с ровными краями, диаметром 2,0÷2,5 мм; на агаре Эндо следующего состава (масс.%: пептона - 1, лактозы - 1, двузамещенного фосфорнокислого калия (K₂HPO₄) - 0,35, агар-агара - 1,5) с лактозой и фуксином - бледно-розовые, под цвет среды колонии, что свидетельствует об отсутствии у них способности ферментировать лактозу, в мясопептонном бульоне (масс.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная -остальное; pH 7,0-7,2) - рост в виде равномерного помутнения бульона со слизистым осадком, микроскопия окрашенных по Граму мазков - грамотрицательные палочки с закругленными концами, длиной 1,3÷1,5 мкм и шириной 0,7÷0,9 мкм, расположенные одиночно под углом друг к другу или цепочками, спор не образуют.

На минеральной среде Ворошиловой-Диановой следующего состава, масс.%: (г/л) (NH₄NO₃ - 1,0; K₂HPO₄ - 1,0; KH₂O₄ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; FeCl₃×6H₂O (насыщ. раствор) - 2 капли; CaCl₂×6H₂O - 1,0, нефть и нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH 7,0÷7,4 ед.) рост в виде округлых колоний с ровными краями, конусообразные, вязкие, гладкие, глянцевые колонии кремового цвета, d=1,04÷1,5 мм.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм бактерий Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 является аэробом, растет при температурах от плюс шести до плюс тридцати трех градусов по Цельсию в диапазоне pH 6,0÷8,0 ед. Температурный оптимум 27÷29°С, оптимум pH 6,5÷7,5 ед., в качестве источника углерода потребляет глюкозу, не использует сахарозу, прототроф, в дополнительных факторах роста не нуждается. Аэробный и анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный. Обладает оксидазной и каталазной активностью, пигмент не образует, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует.

Обладает биодеструкционной активностью в отношении С-С связей нефти и нефтепродуктов, используя образующиеся при расщеплении соединений углерода для роста клеток.

Штамм непатогенен, не обладает вирулентностью, токсичностью, токсигенностью и способностью к диссеминации во внутренних органах подопытных животных.

Культура штамма хранится в пробирках на агаризованной среде Ворошиловой-Диановой (агар-агар 18 г/л) под слоем вазелинового масла при температуре 6÷8°С и в лиофильно высушенном состоянии.

Изобретение поясняется следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Выделение штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400

Штамм Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 выделен из нефтезагрязненной почвы Кировской области в мае 2012 года следующим образом:

1,0 г нефтезагрязненной почвы вносили в колбы объемом 250 мл, содержащие 20 мл жидкой минеральной среды Ворошиловой-Диановой следующего состава: (г/л) (NH₄NO₃ - 1,0; K₂HPO₄ - 1,0; KH₂O₄ - 1,0; MgSO₄×7H₂O - 0,2; FeCl₃×6H₂O (насыщ. раствор) - 2 капли; CaCl2×6H₂O - 1,0), pH среды 7,0÷7,2. В качестве единственного углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду в количестве 1÷2% (г/г).

Колбы помещали на щейкер-инкубатор (Biosan ES-20/60,). Культивирование проводили при 180 об/мин и температуре 27÷28 С° в течение 72 ч. О характере роста судили по образованию мутной беловатой эмульсии и исчезновению нефтяной пленки на поверхности среды.

Чистую культуру бактерий получали из накопительной путем многократных пассажей (более 10) изолятов на чашках Петри с мясопептонным агаром (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0÷7,2). Посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при температуре 27÷29°С в течение 48 ч. По окончании культивирования на поверхности агара наблюдали появление колоний округлых, выпуклых, блестящих, прозрачных, с ровными краями, диаметром 2,0÷2,5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также на основании изучения фенотипических признаков в соответствии с Определителем Берджи (11. Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact; July 1997, p. 408) и no результатам анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК идентифицированы как штамм Pseudomonas delhiensis KT-13.

Пример 2. Оценка эффективности биодеградации штаммом Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 нефти, керосина и дизельного топлива в жидкой среде

Клетки штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 со скошенного мясо-пептонного агара смывали 0,9% раствором натрия хлорида, готовили микробную суспензию с концентрацией микробных клеток 10⁹ в мл по оптическому стандарту МакФарланда. Микробную суспензию вносили в колбы объемом 250 мл, содержащие 20 мл жидкой минеральной среды Ворошиловой-Диановой (состав указан в примере 1), добавляли в среду 1÷2% (г/г) сырой нефти или керосина и дизельного топлива в таких же концентрациях. Колбы помещали на щейкер-инкубатор (Biosan, ES-20/60). Культивирование проводили при 180 об/мин и температуре 27÷29С°С в течение 72 ч. В качестве контроля использовали среду без нефти и нефтепродуктов. Опыт проводили в трех повторностях.

Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяли спектрофотометрическим методом с использованием анализатора нефти АН-2 (ФР. 1.31.2011.11313 «Методика измерений массовой концентрации нефтепродуктов в воде на анализаторе АН-2»).

Эффективность биодеградации углеводородов нефти определяли по степени их деструкции, анализируя исходное и конечное содержание поллютанта в среде культивирования.

Данные эксперимента (см. таблицу 1) показывают, что в жидкой минеральной среде предлагаемый штамм уже через 72 ч утилизирует 28,6% нефти или 34,9% дизельного топлива или 37,3% керосина.

Пример 3. Приготовление препарата на основе клеток штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400

Суспензию бактерийного штамма, полученную путем смыва со скошенного мясо-пептонного агара, переносят в колбы объемом 250 мл, содержащие 20 мл жидкой минеральной среды Ворошиловой-Диановой (состав указан в примере 1), добавляют в среду 1÷2% (г/г) сырой нефти. Колбы помещали на щейкер-инкубатор (Biosan ES 20/60).

Культивирование проводили при 180 об/мин и температуре 27÷29 С° в течение 72 ч. По истечении данного времени отбирали пробы культуральной жидкости, в которых определяли содержание микробных клеток по оптическому стандарту МакФарланда и типичность морфологии микробов в препаратах, окрашенных по Граму.

Кондиционную культуру переносили в матрацы, содержащие мясо-пептонный агар в количестве 5 мл на матрац. Культивирование проводили при температуре 27÷29°С в течение 72 ч, после чего в матрацы вносили 10 мл стабилизирующей среды, содержащей 10% сахарозы и 1,5% желатина, добавляли стеклянные бусы, проводили смыв культуры с поверхности агара.

Приготовленная таким образом суспензия представляет собой жидкий препарат, содержащий живые микробные клетки штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 в стабилизирующей среде, которая необходима для поддержания в течение определенного времени физиологически активного состояния микробов.

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что препарат на основе штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 характеризуется высокой (49,9×10⁹ KОЕ/мл) концентрацией типичных по биологическим свойствам микробов, обладающих деградирующей активностью в отношении углеводородов нефти. Использование в составе препарата стабилизирующей среды обеспечивает сохранение физиологически активного состояния микробов при температуре хранения 6÷8°С до 56 сут., что позволяет в течение данного времени применять его для обработки почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Пример 4. Биодеградация нефти в почве, в лабораторных условиях

Просеянную воздушно-сухую дерново-подзолистую почву помещают в чашки Петри по 20 г, увлажняют ее до 20÷25%.

Жидкий биопрепарат, полученный по примеру 3, содержащий культуру клеток штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400, вносят из расчета 1 мл/см в нефтезагрязненную (1-2% по массе) почву до конечной концентрации микробов 1×10⁸ клеток/см³. Почву тщательно перемешивают и экспонируют при температуре 20÷22°С в течение 14 суток. Содержание нефти в почве определяют по методу, указанному в примере 2.

Полученные результаты (таблица 3) свидетельствуют о том, что предлагаемый штамм через 14 суток осуществил деградацию сырой нефти на 35,3%, в то время как естественные потери нефти за счет активизации аборигенной микрофлоры составили 3,91%.

Пример 5. Очистка почвы от керосина или дизельного топлива препаратом на основе штамма Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400

Эксперимент по очистке почвы, загрязненной керосином или дизельным топливом, проводили по аналогии с примером 4. Содержание нефтепродукта (керосин или дизельное топливо) в почве составляло 1,5%. Очистку почвы от нефтепродуктов проводили в течение 14 суток.

Результаты исследования, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что в отношении нефтепродукта клетки Pseudomonas delhiensis KT-13 ВКПМ В-11400 обладают выраженной утилизирующей активностью. Деструкция керосина через 14 сут составила 37,5%, а дизельного топлива - 35,8%. В то же время в почве, не обработанной препаратом, деструкция составила 2,5% и 1,9%, соответственно.

Таким образом, заявляемый штамм быстро и эффективно утилизирует нефть и нефтепродукты, такие как керосин и дизельное топливо, в воде и в почве.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен новый бактериальный штамм Pseudomonas delhiensis KТ-13 ВКПМ В-11400 - деструктор нефти и нефтепродуктов. Штамм обладает способностью осуществлять эффективную деградацию нефти и нефтепродуктов, таких как дизельное топливо и керосин, в воде и почве и может быть использован для биоремедиации окружающей среды от данных поллютантов. 4 табл., 5 пр.

Штамм бактерий Pseudomonas delhiensis ВКПМ В-11400 - деструктор нефти и нефтепродуктов.