СПОСОБ ИЗМЕНЕНИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ЧУМНОГО МИКРОБА В УСЛОВИЯХ IN VITRO Российский патент 2013 года по МПК G09B23/26 G01N33/53 C12Q1/06 C12R1/01 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к патогенным свойствам чумного микроба, в частности касается молекулярных механизмов его токсического действия, и может быть использовано в клинической иммунологии, для совершенствования методов лечения чумной инфекции с использованием антитоксических препаратов и специфической иммунотерапии.

Результаты исследований химической структуры липополисахаридов (ЛПС) Yersinia pestis, проведенные в последние годы, свидетельствуют о том, что при низкой температуре выращивания клеток чумного микроба (28°C) липид A ЛПС представлен преимущественно гексаацильной формой, ЛПС28 обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами. ЛПС, выделенный из бактерий Y.pestis, выращенных при температуре тела теплокровного хозяина (ЛПС37), отличается по химическому составу от ЛПС28, его липид A содержит в основном три- и тетраацильные молекулы. ЛПС37 является слабым индуктором провоспалительных цитокинов [1, 2]. В то же время патогенез чумы в любой ее форме представляет собой стадии развития инфекционно-токсического шока, который вызывается действием ЛПС возбудителя.

Известно, что проявление полного токсического эффекта ЛПС зависит не только от определенного химического строения его молекул, но и от их конформации [3]. Модуляторами токсических свойств ЛПС на уровне конформации являются специфические белки микробных клеток, ассоциированные с ЛПС [4], а в условиях in vivo - белки и липопротеины макроорганизма, которые, соединяясь с ЛПС, усиливают или же нейтрализуют их действие [5, 6].

В основу предлагаемого изобретения положено использование разработанного заявителем комплекса специфического белка чумного микроба «мышиного» токсина с разными формами ЛПС Y.pestis (ЛПС-МТ) (см. Соколова Е.П., Тынянова В.И., Демидова Г.В., Зюзина В.П., Плетницкий А.Э., Тынкевич Н.К., Беспалова И.А., Гончаров Е.К. «Образование комплекса "мышиный" токсин - липополисахарид у Yersinia pestis». Журнал Биотехнология, 2000 г, №5, стр.25-30), где подтверждено, что образование физико-химических связей между МТ и ЛПС имеет специфический характер и сопровождается изменением конформации молекул ЛПС [7]. Правильность этого предположения продемонстрирована двумя способами: иммуноблоттингом и гель-фильтрацией. Методом иммуноблоттинга с применением специфических антисывороток к МТ и ЛПС показано связывание их между собой. Метод гель-фильтрации позволил доказать образование комплекса ЛПС-МТ и оценить их количественное соотношение (100:1). Установлено, что соединение МТ и ЛПС приводит к конформационным изменениям молекулы ЛПС и выражается в изменении площадей и перераспределении профилей элюции ЛПС. Динамика их изменений под влиянием МТ описывается логарифмической кривой, аналогичной кривой Михаэлиса.

Интенсивный синтез провоспалительных цитокинов на стадии септического шока и в то же время слабая цитокининдуцирующая активность 37°-ного ЛПС в экспериментах in vitro позволили провести модификацию ЛПС Y.pestis в условиях макроорганизма. В литературе отсутствуют данные об иммуномодулирующем действии ЛПС Y.pestis, модифицированных с помощью МТ. Это обстоятельство позволило сформулировать задачу предлагаемого изобретения - возможность изменения цитокининдуцирующих свойств ЛПС с помощью специфического белка Y.pestis - МТ - и осуществить оценку этого способа с помощью изучения динамики синтеза фактора некроза опухоли (TNF-α) и гамма-интерферона (IFN-γ) моноцитами человека под влиянием исходных и модифицированных форм ЛПС28 и ЛПС37 вакцинного штамма Y. pestis EV76 и вирулентного штамма Y.pestis 231 в условиях in vitro.

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа изменения иммуномодулирующих свойств липополисахаридов чумного микроба в условиях in vitro.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе изменения иммуномодулирующих свойств липополисахаридов чумного микроба в условиях in vitro, включающем получение препаратов липополисахаридов (ЛПС) и «мышиного» токсина (МТ) Yersinia pestis с последующим образованием их комплекса ЛПС-МТ, модифицированную форму которого используют в качестве индуктора синтеза цитокинов TNF-α и IFN-γ, для этого готовят опытную пробу, в которую добавляют ЛПС в количестве 5 мкг (50 мкл из рабочего разведения 100 мкг/мл) и МТ в количестве 50 нг (5 мкл из рабочего разведения 10 мкг/мл), после этого пробу инкубируют в течение 30 мин при 37°C, а затем объем проб в эппендорфах доводят до 100 мкл стерильным забуференным физиологическим раствором NaCl и полученную смесь вносят в лунку планшета, содержащего культуру клеток моноцитов человека линии U-937 (1×10⁶ клеток в лунке), последние культивируют в среде PRMI 1640 с одновременной постановкой двойного контроля, затем через 1, 4, 20 часов после начала совместной инкубации препаратов ЛПС с моноцитами проводят количественный учет синтезированных цитокинов, при этом по количеству продуцируемых цитокинов и динамике их синтеза регистрируют изменения иммуномодулирующих свойств ЛПС чумного микроба в условиях in vitro. Кроме того, перед внесением готовых препаратов ЛПС-МТ в лунки из последних отбирают старую ростовую среду и вносят 100 мкл свежей среды PRMI, содержащей 4% FCS.

Способ осуществляется следующим образом.

В работе используют препараты ЛПС, выделенные из бактерий Y. pestis, выращенных при 28° и 37°C на агаре LB (Difco, США) в течение 48 ч. Бактериальную массу инактивируют мертиолятом натрия. ЛПС выделяют по методу Westphal. МТ из Y.pestis выделяют и очищают по оригинальной методике В.И. Марченкова, LD₅₀ МТ=5,6 (4,0-7,9) мкг/мышь [8].

ЛПС и МТ растворяют в дистиллированной воде и выдерживают в течение 24 часов при 4°C. Рабочее разведение препарата ЛПС - 100 мкг/мл, МТ - 10 мкг/мл. Пробы готовят в стерильных пробирках «эппендорф». В опытные пробы добавляют ЛПС в количестве 5 мкг (50 мкл), МТ - в количестве 50 нг (5 мкл). Такая доза препаратов ЛПС и МТ позволяет исключать повреждение и гибель культуры клеток моноцитов и вызывать экспрессию цитокинов TNF-α и IFN-γ. Пробы содержат или ЛПС с МТ (предварительно их инкубируют 30 мин при 37°C для получения комплекса ЛПС-МТ), или только ЛПС. Объем проб в эппендорфах доводят до 100 мкл стерильным забуференным физиологическим раствором NaCl. Полученные смеси добавляют в лунки планшета, содержащие культуру клеток.

Иммуномодулирующие свойства ЛПС изучают на модели клеток моноцитов человека линии U-937. Клетки моноцитов человека (1×10⁶ клеток в лунке) культивируют в 96-луночном планшете в среде PRMI 1640, содержащей 8% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 100 мкг/мл гентамицина. Перед внесением готовых препаратов ЛПС (100 мкл приготовленной пробы с забуференным физиологическим раствором) из лунок отбирают пипеткой старую ростовую среду и вносят 100 мкл свежей среды PRMI, содержащей 4% FCS. Ставят два контроля. В первую контрольную лунку вносят МТ в количестве 50 нг, в результате доза не оказывает цитотоксического действия и не стимулирует синтез цитокинов моноцитами. Вторым контролем служит забуференный физиологический раствор, который также не вызывает синтеза цитокинов.

Для оценки динамики синтеза TNF-α и IFN-γ количественный учет цитокинов проводят через 1, 4 и 20 часов после начала совместной инкубации препаратов ЛПС с моноцитами. Количество синтезированных цитокинов определяют методом иммуноферментного анализа, используя коммерческие тест-системы (Вектор-Бест, Новосибирск). Доверительный интервал рассчитывают по Стьюденту-Фишеру (p=0,95).

Пример 1, иллюстрирующий способность модифицированных форм ЛПС вакцинного штамма Y.pestis EV76 менять цитокиновый ответ клеток культуры человеческих моноцитов

В опытах сравнивают цитокининдуцирующие способности исходных (ЛПС28 и ЛПС37) и модифицированных форм ЛПС (ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ) вакцинного штамма Y.pestis EV76 (см. фиг 1-4). В контрольных лунках с МТ и забуференным физиологическим раствором не наблюдается увеличения содержания цитокинов TNF-α и IFN-γ во время эксперимента.

На фиг.1 показан график динамики синтеза TNF-a клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС28 Ypestis EV76.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Фиг.2 - Динамика синтеза IFN-γ клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС28 Y.pestis EV76.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Фиг.3 - Динамика синтеза TNF-α и клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС37 Ypestis EV76.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Фиг.4 - Динамика синтеза IFN-y клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС37 Ypestis EV76.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл). Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Таким образом, из графиков видно, что количественная оценка синтеза цитокинов, определяемая в динамике, позволяет выявить изменения цитокининдуцирующих свойств ЛПС чумного микроба с помощью МТ и показать различия между исходными и модифицированными формами ЛПС Y.pestis EV76. Динамика синтеза TNF-α под влиянием ЛПС28 характеризуется тем, что происходит накопление данного цитокина в ростовой среде к 4 часам в количестве 50±6,4 пг/мл с последующим уменьшением TNF-α до 8±2,6 пг/мл к 20 часам наблюдения. Активация моноцитов конформационно-измененной формой ЛПС28-МТ выявляет иную закономерность: значительное количество TNF-α регистрируют в опытных образцах в течение первых 60 мин - 22±4,2 пг/мл, через 4 часа его продукция уменьшается до 10±2,8 пг/мл, а к 20 часам уровень синтеза TNF-α вновь увеличивается до 26±4,6 пг/мл. Препарат ЛПС28 активно стимулирует моноциты к синтезу IFN-γ, высокий уровень продукции этого цитокина регистрируется через 4 часа - 90±8,6 пг/мл с последующим снижением его количества до 30±5,0 пг/мл к 20 часам. Синтез IFN-γ под влиянием модифицированной формы ЛПС28-МТ характеризуется достаточной «монотонностью», без резких колебаний во времени, от 10±2,8 пг/мл до 30±5,0 пг/мл.

Цитокининдуцирующая активность препаратов ЛПС37 Y.pestis EV76 по количеству продуцируемых цитокинов TNF-α и IFN-γ и динамике их синтеза существенно отличается от действия ЛПС37-МТ. ЛПС37 так же, как и его конформационно-измененная форма ЛПС37-МТ, оказались слабыми индукторами синтеза TNF-α. Синтез IFN-γ под влиянием ЛПС37 увеличивается пропорционально времени активации моноцитов и достигает своего максимального значения к 20 часам (62±7,0 пг/мл). Модифицированная же форма ЛПС37-МТ подавляет синтез IFN-γ в моноцитах.

Вывод: сравнивая динамику синтеза цитокинов TNF-α и IFN-γ моноцитами человека под действием исходных форм ЛПС (ЛПС28 и ЛПС37) и конформационно-измененных форм (ЛПС28-МТ и ЛПС-МТ), мы четко регистрируем различия в их цитокининдуцирующих свойствах, а соответственно, и иммуномодулирующих. Следовательно, предлагаемый способ изменения цитокининдуцирующих свойств ЛПС чумного микроба с помощью МТ подтвердился на данном примере.

Пример 2, иллюстрирующий способность конформационно-измененного ЛПС вирулентного штамма F.pestis 231 менять цитокиновый ответ клеток культуры человеческих моноцитов

Сравнивают, как и в предыдущем примере, цитокининдуцирующую способность исходных (ЛПС28 и ЛПС37) и модифицированных форм ЛПС (ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ) вирулентного штамма Y.pestis 231. Следует отметить, что ЛПС штамма Y.pestis EV76, использованный в первом примере, отличается по химической структуре липида A и сахаров коровой области от ЛПС природного высоковирулентного штамма Y.pestis 231.

Результаты этого примера представлены на фиг.5-8. На фиг.5 показан график динамики синтеза TNF-a клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС28 Ypestis 231.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Фиг.6 - Динамика синтеза IFN-γ клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС28 Ypestis 231.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Фиг.7 - Динамика синтеза TNF-α и клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС37 Ypestis 231.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Фиг.8 - Динамика синтеза IFN-γ клетками моноцитарной линии человека U-937 под действием различных форм ЛПС37 Y.pestis 231.

По оси абсцисс - время культивирования моноцитов с препаратами ЛПС, по оси ординат - количества синтезированных цитокинов (пг/мл).

Цитокиновая активность нестимулированных моноцитов равняется нулю.

Из графиков видно, что ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ отличаются от своих исходных форм по динамике синтеза цитокина TNF-α. Конформационно-измененная форма ЛПС28-МТ вызывает наибольший синтез TNF-α через 4 час (20±4,3 пг/мл), а ЛПС28 через 1 час (12±3,4 пг/мл). Модифицированная форма ЛПС37-МТ, как выяснилось, оказывается самым сильным индуктором синтеза провоспалительного цитокина TNF-α. Максимальное количество продуцируемого TNF-α через 4 час равняется 68±8,2 пг/мл, что почти в 3 раза больше по сравнению с уровнем активности исходного препарата ЛПС37 (28±5,2 пг/мл).

Динамика синтеза IFN-γ под влиянием модифицированных форм ЛПС также различна. Если ЛПС28 индуцирует быстрый ответ клеток и приводит к синтезу наибольшего количества данного цитокина (170±13,0 пг/мл) через один час, то его модифицированная форма полностью подавляет его выработку моноцитами. Этой же особенностью обладает и конформационно-модифицированная форма ЛПС37-МТ. Наибольший синтез IFN-γ наблюдается только через один час инкубации (40±6,2 пг/мл), а через 4 часа IFN-γ полностью отсутствует в ростовой среде, что сохранялось до конца наблюдения (20 час). ЛПС37 в отличие от модифицированной формы ЛПС37-МТ индуцирует синтез IFN-γ моноцитами на всем протяжении эксперимента и его максимальное количество регистрируют при 20 час (55±7,2 пг/мл).

Таким образом, создавая с помощью специфического белка Y.pestis МТ комплекс ЛПС-МТ, можно изменять цитокининдуцирующие свойства ЛПС чумного микроба в условиях in vitro.

Использование предлагаемого изобретения позволяет изучить динамику синтеза провоспалительных цитокинов моноцитами человека исходных и модифицированных форм ЛПС Y.pestis в условиях in vitro.

Полученные результаты подтверждают, что конформационные перестройки в молекулах ЛПС чумного микроба оказывают влияние на их иммуностимулирующие свойства и изменение токсичности этих препаратов. Специфичность иммуномодулирующего действия ЛПС чумного микроба проявляется на разных стадиях развития инфекционного процесса у человека, что и обусловливает сильнейшее нарушение врожденного иммунитета.

Модель конформационных модификаций ЛПС позволит в дальнейшем разработать приемы специфического антитоксического лечения чумы, которые могут быть применены в клинике одновременно с антибактериальными препаратами.

Источники информации

1. Kawahara К., Tsukano Н., Watanabe H. et al. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature. Infect. Immun. 2002, 70 (8): 4092-4098.

2. Montminy S., Khan N., McGrath S. et al. Virulence factors of Yersinia pestis are overcome by a strong lipopolysaccharide response. Nature Immun. 2006, 7(10): 1066-1073.

3. Schromm A., Brandenburg K., Loppnow H. et al. J. Immunol. The charge of endotoxin molecules influences their conformation and IL-6-inducing capacity. 1998; 161: 5464-5471.

4. Mayer K.R., Truchot A.T., Ward J et al. Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions. Amsterdam: Elsevier. 1990; 145-156.

5. Bauer M.E. et Welch R.A. Pleiotropic effects of a mutation in rfacon Escherichia coli hemolisin. Infect. Immun. 1997; 65(6): 2218-2224.

6. Li J., Clinkenbeard K.L. Lipopolysaccharide complex with Pasteurella haemolytica leukotoxin. Infect. Immun. 1999; 67 (6):2920 - 2927.

7. Соколова E.П., Тынянова В.И., Демидова Г.В., Зюзина В.П., Плетницкий А.Э., Тынкевич Н.К., Беспалова И.А., Гончаров Е.К. Образование комплекса "мышиный" токсин - липополисахарид у Yersinia pestis. Биотехнология. 2000;(5):25-30.

8. Соколова Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба: Автореф. дис…, канд. биол. наук, Ростов-на-Дону, 2002. - 18 с.

9. Зюзина В.П., Тынянова В.И., Демидова Г.В., Соколова Е.П., Писанов Р.В., Беспалова И.А., Бородина Т.Н., Анисимов Б.И., Мишанькин Б.Н. Токсичность препаратов липополисахаридов, выделенных из 28 и 37°C-ных культур Yersinia pestis. Биотехнология. 2003; (6):20-24.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу изменения иммуномодулирующих свойств липополисахаридов чумного микроба в условиях in vitro, который включает получение препаратов липополисахаридов (ЛПС) и «мышиного» токсина (МТ) Yersinia pestis с последующим образованием их комплекса ЛПС-МТ. При этом модифицированную форму ЛПС-МТ используют в качестве индуктора синтеза цитокинов TNF-α и IFN-γ. Для этого готовят опытную пробу, в которую добавляют ЛПС в количестве 5 мкг (50 мкл из рабочего разведения 100 мкг/мл) и МТ - в количестве 50 нг (5 мкл из рабочего разведения 10 мкг/мл), после этого пробу инкубируют в течение 30 мин при 37°C, а затем объем проб в эппендорфах доводят до 100 мкл стерильным забуференным физиологическим раствором NaCl и полученную смесь вносят в лунку планшета, содержащего культуру клеток моноцитов человека линии U-937 (1×10⁶ клеток в лунке), последние культивируют в среде PRMI 1640 с одновременной постановкой двойного контроля, затем через 1, 4, 20 часов после начала совместной инкубации препаратов ЛПС с моноцитами проводят количественный учет синтезированных цитокинов, при этом по количеству продуцируемых цитокинов и динамике их синтеза регистрируют изменения иммуномодулирующих свойств ЛПС чумного микроба в условиях in vitro. Изобретение позволяет изменить иммуномодулирующие свойства липополисахаридов чумного микроба, что способствует реализации токсического потенциала эндотоксина чумного микроба. 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

1. Способ изменения иммуномодулирующих свойств липополисахаридов чумного микроба в условиях in vitro, включающий получение препаратов липополисахаридов (ЛПС) и «мышиного» токсина (МТ) Yersinia pestis с последующим образованием их комплекса ЛПС-МТ, отличающийся тем, что модифицированную форму ЛПС-МТ используют в качестве индуктора синтеза цитокинов TNF-α и IFN-γ, для этого готовят опытную пробу, в которую добавляют ЛПС в количестве 5 мкг (50 мкл из рабочего разведения 100 мкг/мл) и МТ - в количестве 50 нг (5 мкл из рабочего разведения 10 мкг/мл), после этого пробу инкубируют в течение 30 мин при 37°C, а затем объем проб в эппендорфах доводят до 100 мкл стерильным забуференным физиологическим раствором NaCl и полученную смесь вносят в лунку планшета, содержащего культуру клеток моноцитов человека линии U-937 (1×10⁶ клеток в лунке), последние культивируют в среде PRMI 1640 с одновременной постановкой двойного контроля, затем через 1, 4, 20 часов после начала совместной инкубации препаратов ЛПС с моноцитами проводят количественный учет синтезированных цитокинов, при этом по количеству продуцируемых цитокинов и динамике их синтеза регистрируют изменения иммуномодулирующих свойств ЛПС чумного микроба в условиях in vitro.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед внесением готовых препаратов ЛПС-МТ в лунки из последних отбирают старую ростовую среду и вносят 100 мкл свежей среды PRMI, содержащей 4% FCS.