СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ БИОАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И СОСТАВ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/50 G01N33/53 

Настоящее изобретение относится к способу и составу для испытания определенных биоактивных веществ и определения их иммунологической активности по отношению к их способности вызывать образование цитокинов. Цитокины, такие как интерфероны (IFN) и факторы некроза опухоли (TNF), являются гормонально-подобными протеинами, которые играют важную роль фактически во всех иммунологических реакциях, а также в регулировании процессов, отвечающих за поддержание гомеостаза. Образование таких цитокинов может быть индуцировано определенными веществами, которые за счет их биоактивного и иммуномодуляционного действия являются полезными в терапии иммунодефицита и связанных с ним заболеваний.

Поэтому существенно необходимы способы для правильного и легкого испытания иммунологической активности таких биоактивных веществ. Предметом настоящего изобретения и является такой способ.

Согласно настоящему изобретению этот способ позволяет определить, является ли тестируемое соединение способным индуцировать образование различных цитокинов и дает возможность быстро и эффективно проверять свойства определенных веществ, а именно - их иммунологическую активность на каждой стадии образования, разделения, очистки и формулировки в конечные составы. Настоящее изобретение также обеспечивает составы и оборудование, необходимое для выполнения данного способа.

Многочисленные тесты, используемые до настоящего времени для определения иммунологической активности, трудны в исполнении. При клинических испытаниях нового терапевтического состава, имеющего иммунологический эффект, его иммунологическая эффективность оценивается мониторингом многих хорошо известных и аналитически определяемых свойств иммуногенных систем при использовании стандартных способов. Если только активность подтверждается, появляется необходимость в характерных прямых теста, способных быстро проверить состояние пациента с точки зрения его или ее иммунологической реакции.

При клинических испытаниях оценка уровней сыворотки IFN может быть затруднена, неточна и ошибочна. Зачастую интерфероны локально образуются в различных тканях, они являются краткоживущими, их действие является паракринным (только в непосредственной близости) и они сильно связаны с клеточными рецепторами и носителями протеинов.

С другой стороны, технологические процессы производства, очистки и/или разделения иммуноактивных веществ, в частности, таких как экстракты сырого торфа, обычно являются многоступенчатыми процессами, и всегда имеется потребность в обеспечении надежного и быстрого теста, способного полностью контролировать производство. Более того, так как эти вещества часто имеют сложный состав, как это имеет место в случае с торфяным экстрактом, важно иметь сходный тест для определения активности индивидуальных компонентов таких веществ. Необходимо также найти способы для микротестирования, так как анализируемые продукты являются очень дорогостоящим.

Обнаружены следующие четыре основных положения, позволяющие решить вышеописанные проблемы.

1. Некоторые иммуноактивные торфяные экстракты индуцируют образование цитокинов, таких как интерфероны и факторы некроза опухоли в культурах in vitro лейкоцитов периферической крови, причем их образование зависит от дозы.

2. Обработанные иммуноактивным торфяным экстрактом резидентные перитонеальные клетки (RPC) мыши типа BAIB /c образуют интерферон-β(и TNF-α) в значительно большем количестве по сравнению со спонтанным высвобождением цитокинов в необработанных образцах.

3. Некоторые торфяные экстракты при тестировании in vitro, как упоминалось выше, обнаруживают синергетический эффект в сочетании с известными иммуномодуляторами, такими как селенорганические соединения, парахлорофениламид 3-метил-5-бензоиламино-изотиазол-4-карбоновой кислоты и индометацин. Это позволяет использовать намного меньшие количества иммунологически активных веществ для подтверждения их активности.

4. Культуры лейкоцитов периферической крови человека (PBL) здоровых добровольцев, обработанные известным продуктом, получаемые из торфа (TTP), прописанным орально в дозе 5 мг/день, тестируемые на образование определенных цитокинов, IFN-α IFN-γ и TNF-α, теряли способность реагировать на образование цитокинов с раствором TTP после пролонгированного, непрерывного орального приема TTP и восстанавливали эту способность после примерно двухнедельного перерыва.

Согласно настоящему изобретению данный способ состоит из этапа обработки культуры лейкоцитов периферической крови человека (PBL) или суспензии резидентных перитонеальных клеток (PPC) типа BAIB/c раствором тестируемого соединения для индуцирования образования цитокинов и последующего определения упомянутых цитокинов согласно стандартным способам идентификации.

Культура лейкоцитов периферической крови (PBL), используемая по первому варианту либо примеру осуществления настоящего способа, является краткоживущей культурой, приготовленной из свежих лейкоцитов здоровых людей, с подходящей для тканевой культуры питательной средой. Предпочтительная плотность готовой к применению культуры составляет около 8000000 лейкоцитов/мл. Тестируемый раствор предпочтительно используется в концентрации 0,1-200 мкг/мл. Этот способ является, в частности, подходящим для тестирования торфяных экстрактов.

Микроопределение возможно, когда тестируемый раствор, т.е. торфяной экстракт или его фракция смешивается с иммуномодулирующим агентом, таким как нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат, предпочтительно соединением, выбранным из группы, включающей селенорганические соединения, такие как эбселен, определенные производные изотиазола, такие как парахлоро-фениламид 3-метил-5-бензоиламиноизотиазол-4-карбоновой кислоты, и индометацин, а также аналоги, гомологи и метаболиты таких соединений.

Примеры селенорганических соединений, которые могут использоваться для этих целей, представлены соединениями следующих формул 1-3, причем соединение формулы 2 (Эбселен) является предпочтительным:

(1) Бис-[2-(N-фенилкарбоксамидо)]-фенилдиселенид

(2) 2-фенил-1,2-бензисолененозол-3(2H)-он (Эбселен PZ 51)

(3) Бис-/2-(П-(2-пиридил)карбоксамидо)/-фенилдиселенид.

Примерами производных изотиазола, которые могут использоваться для вышеупомянутых целей, являются соединения общей формулы I

где R₁ - галофенил, преимущественно хлорфенил, R₂ - фенил и R₃ - низший алкил, преимущественно метил. Атом галогена в галофенильной группе, хлорфенильной группы R₁ преимущественно расположен в параположении фенильного ядра.

Предпочтительным соединением вышеприведенной формулы I является 3-метил-5-бензоиламино-изотиазол-4-карбоновая кислота, т.е. соединение формулы I, где R₁ - парахлорфенил, R₂ - фенил и R₃ - метил. Для кратности на это соединение далее будем ссылаться, как на "соединение ITCL". Это соединение зарегистрировано в Польше под торговой маркой "VRATIZOL IN" (ВРАТИЗОЛИН). Его синтез и свойства описаны в журнале Arch. Immunol. e Ther. Exp. 1973, 21, 891.

У всех вышеуказанных иммуномодулирующих агентов, пригодных для микроопределений, т. е. селенорганических соединений, производных изотиазола и индометацина, общим является то, что они представляют собой нестероидные и противовоспалительные соединения, которые ингибируют синтез простагландинов. Они улучшают результаты теста по способу согласно настоящему изобретению. По этой причине они особенно пригодны для микроопределений. Результаты могут быть улучшены в 5-10 раз.

Из всего разнообразия нестероидных и противовоспалительных соединений, пригодных для целей усиления. Наиболее предпочтительными являются селенорганические соединения (1, 2 и 3) и соединение ITCL, и, в особенности, индометацин.

В настоящем изобретении используются различные антисыворотки, которые распознают индивидуально индуцируемые цитокины. Эти сыворотки известны и используются для тестирования и стандартизации различных цитокинов. Идентификация образующихся цитокинов должна происходить в момент завершения образования цитокина и перед его протеолизом. Среди различных индуцируемых цитокинов некоторые образуются медленно и остаются стабильными в растворе, как например, интерферон γ, в то время, как другие образуются быстро и подвержены протеолизу, как например, факторы некроза опухоли.

Этот способ, как было описано выше, может использоваться также для определения иммунологической реакции человеческих индивидуумов по отношению к определенному иммуноактивному веществу, при условии, что такая иммунологическая реакция не стимулирована другими факторами, такими как, например, вирусной или бактериальной инфекцией. Он может быть использован для мониторинга реакции индивидуальных пациентов на лекарство, для определения оптимальной дозы терапевтических индукторов цитокинов, таких как TTR, а также для установления эффективной схемы приема лекарств. Этот способ основан на оценке гипореактивности состояния к индукции IFN.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу для определения иммунологической реакции человеческого индивидуума к терапии, использующей индуцирующие цитокин иммуномодулирующие вещества. Упомянутый способ характеризуется тем, что культура лейкоцитов периферической крови (PBL) человеческого индивидуума, обработанная таким иммуномодулирующим веществом, через определенные временные интервалы обрабатывается раствором соединения, назначенным для индукции образования цитокинов, который затем тестируется согласно стандартным способам (включая EL ISA пробу на цитокин) для определения момента появления гипореактивности к соединению после пролонгированного приема данного вещества и момента восстановления способности реагировать на дополнительную дозу вещества после определенного периода перерыва. Предпочтительный временной интервал приема составляет около 7-14 дней.

В предпочтительном варианте осуществления вышеназванного способа в качестве индуцирующего цитокин иммуномодулирующего вещества в курсе терапии применяются торфяной экстракт.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения, этот способ применяют в курсе терапии, использующей ТТР в качестве индуцирующего цитокин иммуномодулирующего вещества, причем упомянутый ТТР является иммуноактивный фракцией препарата из торфа (фармакопейная статья) "TOLPA^* TORF PREPARATION", утвержденная 23.05.91).

С точки зрения вышеуказанного, настоящее изобретение также относится к любому использованию ТТР, включая тестирование или определение согласно способам данного изобретения.

Настоящее изобретение также обеспечивает в своем втором варианте способ тестирования, который является пригодным для быстрого мониторинга иммуноактивных веществ при технологических процессах производства, очистки, разделки и тому подобных. Например, когда суспензия резидентных перитонеальных клеток (RPC) мыши типа BALB/c обрабатывается тестируемым раствором, образуются мышиный интерферон-β, а также факторы некроза опухоли. Оба они могут быть зафиксированы и качественно определены согласно стандартным способам идентификации. В этом способе используется суспензия свежих мышиных резидентных перитонеальных клеток (RPC, содержащих примерно 1000000 клеток/мл). Тестируемый раствор готовится в питательной среде по Eagle или в RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Полученные результаты сравнивались с калибровочной кривой, приготовленной с модельным веществом. В качестве модельного вещества может быть использован образец такого же иммуноактивного вещества, тестированного традиционным способом. Поэтому этот способ более всего подходит для мониторинга процесса получения торфяных экстрактов, а также для анализа их фракций.

Настоящий способ является очень простым и эффективным по сравнению с другими известными способами, потому что он основан на прямом индуцировании интерферона β, а не на вторичном эффекте формирования антител, как в ряде общепринятых тестов. До настоящего времени не было возможности найти подходящего способа из-за того, что иммуносистема мыши значительно отличается от иммуносистемы человека, и тесты, признанные показательными для иммунологической реакции человека, такие как наличие интерферона в тканях селезенки или лимфоноидов и т.д., не работают с лучшим лабораторным тестом для животных, т.е. с мышами типа BALB/c.

Сейчас обнаружено, что четкая иммунная реакция у мышей типа BALB/c, может быть получена, тогда, когда биологическим материалом для тестирования выбираются резидентные перитонеальные клетки (RPC), причем используются свежие суспензии таких клеток. Для каждого теста достаточно пожертвовать только тремя животными. Результаты получают в течение нескольких часов. Биологический материал также может быть культивирован и установлен соответствующий ряд микрофагов.

Способ согласно данному изобретению основан на использовании биологического материала, а именно, согласно приведенной выше информации, культуры лейкоцитов периферической крови (PBL) или суспензии резидентных перитонеальных клеток (RPC) мышей типа BALB/c. Наличие и концентрацию каждого цитокина определяют способом для тестирования и стандартизации интерферонов известным из "Methods in Enzymology", 1986, vol. 119, part C "Interferon", edited by Sidney Pestka. Определение всего спектра индуцированных цитокинов идентифицирует иммунный статус пациента.

Для точной оценки результатов существенно, чтобы биологический материал для осуществления обоих вариантов способа по настоящему изобретению был взят от подходящих доноров. В случае использования лейкоцитов человека из оценки должны быть исключены образцы, взятые от индивидуумов, которые обнаруживают гипореактивность (редкие случаи), т.е. низкий уровень иммунологической реакции. При применении суспензии RPC мышей типа BALB/c, образцы, взятые от дополнительно стимулированных животных (например инфицированных), должны быть также исключены из оценки. В случае использования суспензии RPC мышей типа BALB/c образцы не должны браться от слишком молодых или слишком старых животных, так как у таких мышей имеется зависящая от возраста недостаточность образования цитокина. Следует выбирать здоровых животных 5-8-недельного возраста. Исключаются также образцы, обнаруживающие очень высокое спонтанное образование цитокинов, особенно при тестировании иммунорегулирующих веществ, так как здесь может наблюдаться отсутствие потенциала индукции цитокина, а иногда даже уменьшение такой индукции.

Этот вариант способа по настоящему изобретению, при котором усиление результатов достигается смешением с тестируемым раствором нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата (одного из упомянутых выше соединений, такого как соединение ITCL или селенорганические соединения 1, 2 и 3, а предпочтительно - индометацин) и который представляет собой микротест, особенно подходящий для определения индуцированной активности у TNF и IFN. Этот тест является экономичным, быстрым, и пригодным для оценки большого числа образцов одновременно и может быть стандартизирован и даже частично автоматизирован.

Оба варианта способа по настоящему изобретению подробно описаны в нижеследующих примерах.

Приготовление раствора тестируемого вещества.

Тестируемое вещество, т.е. торфяной экстракт, растворяется в стерильной бидисцилированной воде с концентрацией 10 мг/мл. Образцы стерилизуются фильтрацией через антибактерицидные фильтры 0,45 мкм, 600 кПа max Millipore (R). Затем растворы приготовляют в полной среде RPMI-1640, содержащей неактивную к теплу эмбриональную бычью сыворотку (FBS).

A) PBL - вариант
Индукция цитокинов
Светлые слои кровяных сгустков от доноров со здоровой кровью могут быть получены в региональном центре переливания. Дополнительно лейкоциты периферической крови (PBL) могут быть выделены из гепаринизированной венозной крови здоровых добровольцев и центрифугированы в Ficoll-Hypaque (или Histopaque) с градиентом плотности (g=1,077) и с последующей двойной промывкой клеток. Эритроциты были лизированы обработкой NH₄Cl по Cantell и др. (Cantell, E. , Hirvonen, S., Kauppinen H.L.: Production and Partial Purufication of Humman Immune Interferon Meth.Enzymol 119, 54, 1988). Использовали лейкоциты от одного донора, содержащие приблизительно 8000000 лейкоцитов/мл в среде RPMI 1640, смешанные с 10% сывороткой коровьего эмбриона (FBS), L-глутамином и антибиотиками. Все количество FBS предварительно тестировали. Для культур PBL использовали только немитогенные FBS. Индукторы цитокинов добавляли к объемам 200-1000 мкл культур. В качестве образцовых индукторов цитокинов были использованы фитогемагглютинин (PHA) (Pharmacia Fine Chemicals, Sweden or Sigma, USA). Индуцированные культуры PBL инкубировали в атмосфере 5% CO₂ в воздухе при 37^oC в течение 20 часов и центрифугировали. Супернатанты сохранили при 4^oC и испытывали на IFN - активность в течение одной недели. Супернатанты для определения TNF активности должны храниться при -90^oC либо в жидком азоте, чтобы избежать инактивации, вызываемой протеолизом.

Испытание интерферона
Были приготовлены сливающиеся монослои клеток A549 в микропластинках в среде, модифицированной по Dulbecco [Dulbecco modified Minimum Esseutial Medium (DMEM)] с 10% FBS, L-глутамином и антибиотиками (пенициллин 100 ед. /мл и стрептомицин 100 мкг/мл). Образцы LFN, разбавленные в пластинках, добавляли к монослою клеток и инкубировали при 37^oC 20 часов в 5% CO₂ в воздухе. Затем клетки отмывали и подвергали воздействию вируса энцефаломиокарда (EMCV). Титр IFN был определен как разбавление образцы IFN, которое сокращало цитопатогенный эффект на 50% за 48 часов инкубации. Для измерения гибели клеток в сканере EL ISA был использован способ MTT (3-/4,5-диметилтиазол-2-ил/2,5-дифенилтетразолиум-бромид) (Hansen, M.B., Nielsen, S.E., and Berg, K.: Re-examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Grouth/Cell. Kill., J.Immunol.Meth. 1989, 119, 203-210). Лабораторные стандарты IFN должны быть включены во все испытания, например рекомбинационный человеческий IFN-γ (собственная активность 2000000 ед./мг), естественный человеческий IFN-α (3000000 ед./мл) и IFN-γ (2000000 ед./мл).

Испытание TNF
Цитотоксическая активность TNF измерялась в клетках L929 по Flick and Gifford (Flick, D. E., Gifford, G.E:Comparison. of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor. J. Immunol. Meth. 68, 1667, 1984). Образцы и раствор актиномицина D (5 мкг/мл) были добавлены к монослою клеточных культур. После инкубации при 37^oC в течение 20 часов цитотоксические эффекты TNF определяли либо микроскопическим анализом культур, либо способом ММТ. Количество, вызывающее разрушение приблизительно 50% клеточных культур, приняли за одну единицу активности TRN. Сравнение с препаратом TNF-L (Genentech Inc, USA) показано, что 1 единица в испытаниях была равна 100-200 pg/мл TNF.

Испытания нейтрализации цитокинов
Цитокины, образованные PBL, обработанные исследуемыми препаратами, могут быть идентифицированы нейтрализационными испытаниями специальными антителами (Inglot et. al., Organoselenides as potential immunostimulants and inducers of interferon gamma and other cytokines in human peripherial bloodleukocytes, Experientia 1990, 46, 308-311). Кроме того, для определения иммунной активности указанных цитокинов можно применять различные компоненты типа EL ISA.

Комментарии
В супернатантах, полученных из культурированных лимфоидных клеток, обнаружены цитокины, отличные от TNF и IFN, которые могут быть определены другими стандартными способами, например Interleukins (IL-1-10), GM-CSF, TGF-β и т.д.

b) RPC - вариант: индукция цитокинов
Резидентные перитонеальные клетки мыши (RPC) получали от приблизительно 6-недельной усыпленной с помощью эфира мыши типа BAL B/c инъекцией в брюшную полость 5 мл полной среды RPMI-1640 при комнатной температуре. Промывающую среду, содержащую RPC, собирали в охлаждаемые льдом 50 мл трубки для центрифугирования. RPC не отмывали и не центрифугировали. Число клеток подсчитывали в гемоцитометре Бюркера и суспендировали до плотности 1000000-1500000 клеток/мл. Такая плотность клеток требуется для всех испытаний при изменении влияния различной концентрации препарата (начиная с 0,1-500 мкг/мл). Во все тесты включают отрицательный и положительный контроль. Отрицательный контроль измеряет спонтанное выделение TNF или IFN, инкубированных RPC в полной среде RPMI-1640 без индукторов, а положительный контроль отражает действие стандартного индуктора липополисахарида (LPS from E.coll 055:85, Sigma 1-10 мкг/мл). Все культуры инкубируют при 26^oC в течение 20 часов. Затем культуры центрифугируют при 100 об/мин в течение 10 мин и собирают супернатанты. Супернатанты разбавляют от 1:2 до 1:256 с помощью автоматической пипетки.

Биоиспытание цитокинов
Для определения активности TNF в супернатантах, получаемых из культур RPC, используют монослои клеточных L 929, выдержанные в течение 20 часов.

Фибробластообразные клетки мышиной ткани L929, с концентрацией 20000 клеток на ячейку в 100 мкл полной среды высевают в плоскодонную чашку Петри с 96 лунками и для получения монослоя подвергают инкубации в течение 20 часов при 37^oC.

Переносить супернатанты необходимо очень аккуратно. Инкубация культур L 929 выполняется в течение 24 часов при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ в воздухе.

Методы оценки
1) Наблюдение цитоксических эффектов под отражающим микроскопом
2) ММТ-тест (3-/4,5-диметилтиазол-2-ил/-2,5-дифенилтетрозолин бромид, Sigma)
Для измерения гибели клеток под действием клеточных культур L 929 в каждую лунку микрочашек добавляют 25 мкл окрашенного раствора МТТ с концентрацией 5 мг/мл.

Далее чашки Петри подвергаются инкубации в течение 2 часов при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ в воздухе.

Затем в каждую ячейку добавляют 100 мкл раствора, содержащего 45 мл диметилформамида, 13,5 г SDS (додецилсульфат натрия) и 55 мл дистиллированной воды.

Инкубация проводится в течение 12 часов при 37^oC в инкубаторе с CO₂. Результаты цветового теста МТТ считывались в микросканере типа 340/СС (Labsystem) при использовании фильтра 570 нм. При этом следует использовать образцовый рекомбинант TNF-α.
Биоиспытание интерферона
INF оценивался по ингибированию цитопатического эффекта, вызываемого мышиным вирусом encephalomyocarditis (EMCV в мышиных клетках L 929, образец Mu IFNα/β, включен стандарт из Национального института здоровья Бетесда, США). Цитопатический эффект наблюдали в отражающем микроскопе и также измеряли описанным ниже способом МТТ.

МТТ способ по Berg и др.

Berg K. , Hansen M.B. and Nielsen S.E. (1990): A new sensitive bioassay for preceise qualification of interferon activity as measured via the mitichondrial dehydrogenase function in cells (MTT-method). APMIS, 98, 156-162.

MTT (3/4,5-диметил-тиазол-2-ил/2,5-дифенил тетразолина бромид, Sigma) растворяют в PBS с концентрацией 5 мг/мл. Измерение клеток, погибших под действием культуры L 929, проводится добавлением в каждую лунку микрочашки 25 мкл окрашенного раствора MTT с концентрацией 5 мг/мл. Включают также контрольные образцы TNF или IFN. Затем чашки Петри подвергают инкубации в течение 2 часов при 37^oC в атмосфере 5% CO₂ в воздухе. Далее в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора, содержащего 45 мл диметилформамида. 13,5 г SDS (додециосульфат натрия) и 55 мл дистиллированной воды. После инкубации при 37^oC в течение ночи микросканером Start Fax Awareness Technology Inc. 2100 измеряют оптическую плотность при 570 нм, используя в качестве образца экстракт буферного раствора.

С помощью промышленно производимых комплектов "EL ISA" могут быть также оценены TNF-α, IFN-β и другие цитокины.

Состав для осуществления способа по настоящему изобретению главным образом характеризуется тем, что содержит дважды обработанную воду тканевой культуры, культуральную среду и сыворотку, комплектующую культуральную среду, а также лейкоциты периферической крови человека (PBL) или мышиные RPC.

Диагностический комплект (комплект индуктора цитокинов) для использования по варианту - PBL настоящего способа (для 10-20 ручных исследований) может содержать следующие составляющие:
1) Дважды обработанную воду тканевой культуры, 100 мл.

2) Histopaque(R) или FicoII-Hypaque(R)-1077 (градиент плотности среды), 100 мл.

3) Среду RPMI-1640, 2х100 мл (тестированную на эндотоксины, стерильно фильтрованную, с бикарбонатом натрия и L-глутамином).

4) Эмбриональную бычью сыворотку (FBS), 20 мл, с низким содержанием эндотоксина и гемоглобина.

5) Лектин из Phaseolus vulgaris 0,5 мг (фитогемагглютинин-PHA-P).

6) Полипропиленовые стерильные круглодонные пробирки с пробками для тканевых культур 17х100 мм, емкостью 14 мл, 25 штук в коробке.

7) Чашки Петри с крышками для тканевой культуры, 2 чашки Петри, 96 лунок, плоскодонные, стерильные.

Реагенты поставляются Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA или другими компаниями.

Такие комплекты PBL могут быть использованы, в качестве так называемой экранирующей системы второй фазы для подтверждения результатов, полученных с клетками RPC или иногда в качестве прямой экранирующей системы для некоторых веществ, которые могут быть неактивны, таких как иммуномодуляторы у грызунов, например селенорганические соединения.

Диагностический комплект (комплект индуктора цитокинов) для использования в варианте RPC настоящего способа (для 10-20 ручных испытаний) может содержать следующие составляющие:
1) Дважды обработанную воду тканевой культуры, 100 мл.

2) Среду RPMI-1640, 2х100 мл (проверенную на эндотоксины, стерильно фильтрованную, с бикарбонатом натрия и L-глутамином).

3) Эмбриональную бычью сыворотку (FBS), 20 мл, с низким содержанием эндотоксина и гемоглобина.

4) Липополисахарид (LPS) 0,5 мл, из E.coli 0127-B8.

5) Круглодонные пробирки с пробками, стерильные, 25 штук в коробке, из полипропилена, для тканевой культуры, 12х75 мм, емкостью 6 мл.

6) Чашки Петри для тканевой культуры с крышками, 5 чашек, 96 лунок, плоскодонные, стерильные.

Реагенты поставляют Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA или другие компании.

Состав для осуществления способа по настоящему изобретению, обеспечивающий усиление результатов, который наиболее пригоден для проведения микротестов, характеризуется, главным образом, тем, что он содержит как культуры PBL или суспензию RPC, так и нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат, преимущественно вещество, выбранное из группы селенорганических соединений, таких как абселен, индометацин или состав ITCL, а также производные, аналоги, гомологи и продукты метаболизма этих соединений, наиболее предпочтительно - индометацин.

Данную заявку иллюстрируют следующие конкретные примеры. Разумеется, что они никак не ограничивают объем изобретения.

Пример 1
Индивидуальные растворы RPC от 36 особей, усыпленных эфиром 7-8-недельных самок мышей типа BALB/c, были получены посредством инъекции в брюшную полость 5 мл минимально необходимой среды EMEM по Eagle, дополненной 10% термически инактивированной телячьей сыворотки. Очищенные растворы от индивидуальных мышат содержали 1-2•10 в 6 степени клеток на 1 мл. Суспензии индивидуальных мышей содержали 1-2•10 в 6 степени клеток на 1 мл. Суспензии клеток от каждой мыши разделялись на два образца, помещенных в двух пробирках. Один образец обрабатывался 100 мкг/мл TTP, а другой хранился как отрицательная контрольная проба, показывающая спонтанное высвобождение цитокинов.

Все культуры были инкубированы при 26^oC в течение 20 часов и после этого центрифугированы при 1000 оборот/мин в течение 10 минут. Супернатанты собирали и анализировали на IFN-β-активность с помощью биопроб, используя микроспособ ингибирования цитопатического эффекта, вызываемого EMCV (вирус энцефаломиокардии) в мышиных клетках L 929. В каждой пробе использовался внутренний лабораторный стандарт, который был откалиброван по отношению к международному образцу препарата сравнения Mu IFN, G002-904-511, NIH, Bethesda, USA. Цитопатический эффект измерялся с помощью MTT способа согласно Berg и др. , APMIS, 98, 156-162. Были получены следующие результаты: в контрольных образцах уровень IFN-β был 1-8 ед./мл, в среднем - менее 2, для образцов, обработанных TTP, уровень IFN-β был 4-127 ед./мл, в среднем около 16 ед./мл. Полученные результаты представлены графически на фиг. 1 (Сравнение образования IFN-β в RPC, обработанных и необработанных TTP. 1 - предел обнаружения, 2 - медиана. Согласно теста по Медиане P = 0,0000. Каждая точка показывает уровень IFN в RPC, полученный от индивидуальной мыши).

Пример 2
Процедура, описанная в примере 1, была повторена с группой из 7 мышей, однако вместо разделения суспензии RPC от каждой индивидуальной мыши на два образца, только одна суспензия была разделена на четыре образца. Образцы были распределены по 4 пробиркам (по 1 мл в каждой). Один образец представлял собой отрицательный контроль, а остальные три обрабатывали 100, 10 и 1 мкг TTP/мл для определения зависимости от дозы TTP процесса выделения IFN-β. После инкубации всех культур в течение 24 часов при 26^oC пробирки были центрифугированы. В собранных супернатантах, наличие IFN-β определяли аналогично описанному в примере 1. Полученные результаты представлены на фиг. 2. (Зависимость образования IFN от концентрации TTP). Каждая кривая соответствует результатам, полученным с суспензией RPC от одной мыши.

Пример 3
Повторяли процедуру примера 1, за исключением того, что определялся TNF-α вместо IFN-β.
Супернатанты из RPC культур, необработанные и обработанные 100 мкг/мл TTP, были анализированы на TNF активность в биоанализаторе. Мышиные фибропластоподобные L 929 клетки (4•10⁴ клеток на лунку в 100 мкл полного EMEM) были посеяны в 96-луночных плоскодонных чашках Петри (Falcon, Linbro, Flow) и инкубированы в течение 4 часов при 37^oC в атмосфере 5% углекислого газа в воздухе. Образцы разбавляли в EMEM с актиномицином D (конечная концентрация 2,4 мкг/мл) в отдельной чашке. Затем культуральную среду поверх монослоя клеток L 929 удаляли и приготовленные растворы переносили в эту культуру с помощью многоканальной пипетки. После инкубации в течение 20 часов при 37^oC культуры анализировали на гибель клеток посредством MTT способа, описанного выше. Получены следующие результаты: в отрицательных контрольных пробах уровень TNF-α был в диапазоне 1-256 ед./мл со средним значением около 8 ед./мл, и для образцов, обработанных TTP уровень TNF-α также был в диапазоне 2-256, но среднее значение - 64 ед./мл. Полученные результаты представлены на фиг. 3. (Сравнение образованная TNF-α в RPC, обработанной и необработанной TTP. 1-предел обнаружения, 2 - медиана. Согласно тесту по Медиане P = 0,0030. Каждая точка показывает уровень TNF в RPC, полученный от индивидуальной мыши).

Пример 4
Повторяли процедуру, описанную в примере 2, за исключением того, что вместо IFN-β, определяли TNF-α по существу, как описано выше в примере 3. Полученные результаты представлены на фиг. 4 (Зависимость образования TNF от концентрации TTP).

Пример 5
A. Биологический материал.

Для анализов использовали более 115 образцов светлых слоев кровяных сгустков от индивидуальных здоровых доноров крови, полученных из Вроцлавского Регионального центра Переливания Крови. Характеристики доноров представлены в табл. 1.

Большая часть из них были молодые мужчины, которые сдавали кровь многократно. Были обнаружены значительные изменения в реакции PBL от индивидуальных доноров, которые представлены в табл. 2.

Как следует из табл 2, 10-30% культур PBL могли не реагировать на 100 мкг/мл дозу TTP, тогда как только 7% не могли быть стимулированы 10 мкг/мл дозой PHA, и 20% не дали реакции на 10 мкг/мл дозы LPS с образованием IFN, а 50% не реагировали на такую же дозу LPS с образованием TNF. Полученные данные являются существенными для надлежащего выбора биологического материала. Культуры без реакции на PBL определяются посредством оценки отрицательного контроля (необработанный, спонтанное выделение цитокина) и положительного контроля (обработанный с помощью стандартных индукторов, таких как PHA или LPS).

Перед анализами условную среду хранили при 4^oC.

Использовали лейкоциты крови человека от здоровых доноров крови (8•10⁶ клеток/мл).

Б. Проведенные эксперименты.

Образцы торфяного экстракта, взятые из различных партий и пронумерованные, как показано в табл. 3, были протестированы, используя тест PBL, как описано выше. В экспериментах интерферон (IFN) и фактор некроза опухоли (TNE) определяли качественно и в соответствии с вышеописанной стандартной процедурой), их активность определялась в Международных Единицах Активности. Эксперименты повторялись указанное в табл. 3 число раз. Приведены также диапазоны результатов и медианы.

Для иллюстрации, схожий тест был проведен со стандартизованным препаратом торфа. При концентрации 30 мкг/мл, активность интерферона была в диапазоне 30-300 Международных Единиц. Активности, тогда, как при концентрации 100 мкг/мл оно составила 300-1000 Международных Единиц Активности.

Промежуточные концентрации обнаружили линейную зависимость между дозой и реакцией.

Иммуноактивные экстракты торфа, тестированные в указанных выше примерах, являются продуктами, представленными в фармакопейной статье "TOLPA^* TORE PREPARATION", утвержденной 23.05.91 Вроцлав.

Из данных табл. 3 ясно, что отрицательный и положительный контроль в культурах PBL является существенным для оценки результатов.

Дальнейшие эксперименты показывают, что если не применяются во внимание культуры PBL без реакции и проводится статистическая оценка большого числа экспериментов, то эффективность тестов согласно изобретению не ставится под сомнение.

В течение более двух лет посредством биологического анализа определяли активность индуцирования цитокинов более 20 различных партий TTP, включая 1) стандартные промышленные партии лекарственных препаратов, 2) партии, отвергнутые производителем из-за неадекватной биологической активности, определенной на мышах, которая была ни же установленных стандартов и 3) лабораторные экстракты торфа, приготовленные в малых количества. Полученные результаты представлены в табл. 4 в форме средних уровней индуцированных INF и TNF (с рассчитанными стандартными отклонениями - SD и статистической значимостью).

Средние значения вычислены, исходя из всех результатов по титрованию IFN и TNF. Недающие реакции приняты за 0.

^a-c Отличны от "Нет" (спонтанное образование цитокина) при ^a: p < 0,05, ^b: p < 0,01, или ^c: p < 0,001. Значения медианы, соответствующие результатам, представленным в табл. 4, даны в следующей табл. 5, тогда как выборочные данные, представлены в графической форме на фиг. 5 и 6, показывая влияние различных партий TTP на образование IFN и TNF, соответственно.

Значения медианы вычислены, исходя из всех данных по титрованиям IFN или TNF.

Идентификация индуцированных цитокинов была произведена посредством нейтрализации IFN и TNF, индуцированных TTP.

Изложенные результаты экспериментов представлены на фиг. 5 и 6 соответственно.

Влияние различных партий TTP на образование IFN лейкоцитами периферической крови человека (PBL) (фиг. 5).

Использовалось семь различных партий TTP. Каждая точка на фигуре соответствует PBL индивидуального здорового донора крови. Активность IFN выражена в антивирусных единицах. Заштрихованная область показывает границу несущественных данных. Горизонтальные линии показывают средние значения. Образование IFN под воздействием 30 и 100 мкг/мл TTP является статистически значимым (при p < 0,05).

Влияние различных партий TTP на образование TNF лейкоцитами периферической крови человека (PLB). Активность TNF выражена в цитотоксических единицах для мышиных клеток L 929. Реакция на 30, 100 и 200 мкг/мл TTP является существенной (при p < 0,05) (фиг. 6).

В эксперименте использовалась сильнодействующая поликлональная антисыворотка, именно: анти-натуральный IFN-α, анти-лимфобластоидный (Namalwa) IFN-α и анти-натуральный IFN-γ для нейтрализации антивирусной активности в супернатантах культур PBL, обработанных в течение 20 часов тремя различными партиями TIP. Результаты, как показано на фиг. 7 (Результаты по нейтрализации IFNов поликлональной анти-IFNовой сывороткой), показывают, что порции IFN типа α и γ, продуцируемые PBL от индивидуальных доноров крови, значительно различаются. Можно заключить, что образец IFN от каждого PBL донора есть индивидуальная характеристика донора.

Анализ на нейтрализацию, проведенный с сильнодействующей поликлональной кроличьей анти-TNF-α сывороткой (Genzyme Inc.), показал, что TNF, индуцированный с TTP является, главным образом, TNF типа α. Это подтверждено результатами подобных нейтрализаций, проведенных с кроличьей поликлональной анти-TNF-β сывороткой (Genzyme Inc.), которая не нейтрализует активность TNF, индуцированную TTP.

Фиг. 7 показывает результаты по нейтрализации IFNов поликлональной анти-IFNовой сывороткой. IFN-содержащая среда из культур PBL, инкубированная с TTP (были использованы три различных партий TTP и семь различных PBL), обрабатывалась указанной анти-IFN-сывороткой.

1 - необработанные препараты, 2 - обработанные анти-HuIFN-α, 3 - обработанные анти-HuIFN-Ly, 4 - обработанные анти-HuIFN-γ.
Пример 6. Повторялась процедура, описанная в примере 5 для того, чтобы показать эффект усиления в присутствии усилителя, именно индометацина, согласно настоящему изобретению.

Каждая культура PBL разделялась на несколько образцов. Один из них был отрицательным контрольным, показывающим спонтанное выделение цитокина, другой был положительным контрольным, обработанным стандартным сильнодействующим индуктором цитокина указанной ниже природы и оставшиеся образцы обрабатывались 1 - 100 мкг/мл TTP, партия 010391 или 020391, а также TTP I и TTP II, указанными в табл. 6b и 6c соответственно, и 5 мкг/мл индометацина + TIP тех же партий (табл. 6a) или 10 мкг/мл смеси ITCL + TTP тех же партий (табл. 6b), или также 10 или 20 мкг/мл селенорганических соединений (1), (2) или (3) как обозначено выше + TTP тех же самых партий. В супернатантах инкубированных культур определяли IFN и TNF.

Полученные результаты приведены в табл. 6a, b и c.

Пример 7.

Согласно изложенным ниже характеристикам проведен диагностический тест, отражающий влияние орального приема TTP в дневных дозах по 5 мг в форме промышленно выпускаемых таблеток, на реакцию культуры PBL in vitro на дополнительную дозу индукции цитокинов под влиянием TTP.

Тест проведен с 4 здоровыми добровольцами женского пола 43 - 58 лет, которые сдавали 20 мл венозной крови, забираемой еженедельно из вены, до, во время и после приема TTP в таблетках в дневной дозе 5 мг. Использовано два различных режима приема. Двух добровольцев (в дальнейшем обозначенных как В. К. и JZJ) подвергли лечению с TTP в три семидневных цикла; лекарство назначали внутрь, по одной 5 мг таблетке ежедневно в течение одной недели, с семидневным перерывом и последующим семидневным периодом орального приема TTP. Общая доза составляла 21 таблетку. Два других добровольца (обозначенных как A.D.I. и W.F.) принимали по одной 5 мг таблетке TTP внутрь ежедневно в течение трех недель. Общая доза была также 21 таблетка. После двухнедельного перерыва процедура повторялась.

Использовавшиеся 5 мг таблетки TTP представляли собой стандартный лекарственный препарат производства TORF CORPORATION Pharnaceutical Factory во Вроцлаве, Польша. Каждая таблетка содержала 5 мг TTP, 43 мг лактозы и 2 мг MYVATEX. Для индукции цитокинов в культурах in vitro использовали порошкообразный TTP, как чистое вещество в форме запасного раствора, содержащего 20 мг/мл TTP в свободной от пирогена бидистиллированной воде, хранящегося при 4^oС.

Образцы крови, взятые от добровольцев, были гепаринизированны с использованием раствора Heparin POL FA без консервантов в конечной концентрации 10 ед. /мл и обработаны, как описано выше, для получения культуры PBL in vitro, которая затем была обработана индукторами цитокинов PHA, LPS и TTP в соответствии с описанными ранее примерами. Для каждого эксперимента было использовано 200 мкг культур. Супернатанты сохраняли при 4^oC и испытывали на IFN в течение одной недели и соответственно сохраняли при 20^oC и испытывали на TNF для исключения дезактивации, вызываемой спонтанным протеолизом.

IFN и TNP испытывались тем же самым способом, как описано выше. Полученные результаты представлены на приложенных фиг. 8 - 13 (реакция культур PBL различных пациентов на индукторы IFN и TNF в течение орального приема TTP).

Как видно из данных, представленных на фиг. 8, 9, отражающих реакцию по IFN у первой группы добровольцев в течение цикла приема, реакция снижалась и возвращалась к начальному значению после двухнедельного перерыва. Напротив, реакция TNF, приведенная на фиг. 10 и 11, увеличивалась в течение приема TTP и возвращалась к нормальному уровню после двухнедельного перерыва.

Данные, приведенные на фиг. 12 и 13 и отражающие реакцию на индукцию цитокина при ином способе назначения приема для добровольца A.D.I., доказывают, что состояние гипореактивности по отношению к индукции IFN, достигается после 3 недель непрерывного приема TTP орально. Состояние гипореактивности, показанное как потеря способности культур PBL отвечать на индукцию IFN с раствором TTP, исчезает после двухнедельного перерыва. Напротив, в течение 3 недель приема TTP гипореактивность к индукции TNF не развивалась (фиг. 12).

Приведенные выше результаты показывают, что оптимальная доза иммуномодулятора, являющегося индуктором цитокина, может быть установлена индивидуально для каждого подвергаемого лечению пациента с помощью обычного теста PBL согласно настоящему изобретению.

Подписи к фигурам 8-13.

Фиг. 8. Реакция культур PBL пациента B.K. на индуктор IFN в течение орального приема TIP
Фиг. 9. Реакция культур PBL пациента J.Z.J. на индуктор IFN в течение орального приема TTP
Фиг. 10. Реакция культур PBL пациента B.K. на индуктор IFN в течение орального приема TTP
Фиг. 11. Реакция культур PBL пациента J.J.J. на индуктор IFN в течение орального приема TTP
Фиг. 12. Реакция культур PBL пациента A.D.I. на индуктор IFN в течение орального приема TTP
Фиг. 13. Реакция культур PBL пациента A.D.I. на индуктор IFN в течение орального приема TTPе

Изобретение относится к медицине и касается нового способа определения иммунологической активности биоактивных веществ путем обработки культуры лейкоцитов периферической крови человека (PBL) или суспензии резидентных перитонеальных клеток (RPC) мыши типа BAL В/с раствором тестируемого вещества. Этот раствор при соблюдении вышеперечисленных условий может индуцировать продукцию цитокинов, которые определяются по стандартным способам идентификации. Улучшение результатов может быть достигнуто при добавлении к тестируемому раствору нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата, преимущественно индометацина. Способ также применим для определения иммунологической реакции индивидуумов человека на терапию с использованием веществ, индуцирующих цитокины. Изобретение расширит арсенал способов скрининга иммуномодулирующих соединений. 3 с. и 10 з.п.ф-лы., 6 табл., 13 ил.

1. Способ определения иммунологической активности биологически активных, цитокин-индуцирующих иммуномодулирующих веществ, включающий стадии приготовления клеточной культуры в присутствии подходящей питательной среды путем воздействия на указанную клеточную культуру цитокин-индуцирующим соединением, и анализ продуцирования цитокинов в указанной клеточной культуре, отличающийся тем, что клеточная культура включает лейкоциты периферической крови человека (ЛПК), полученные от доноров, не являющихся гипореактивными к индукции интерферона, или клеточная культура представляет собой суспензию резидентных перитональных клеток (РПК), полученных от BALB/с мышей, предпочтительно в возрасте 5 - 8 недель, не подвергнутых иммунологической стимуляции и не проявляющих склонности к очень высокому спонтанному продуцированию цитокинов, причем положительным или отрицательным контролем оценивают отсутствие гипореактивности или отсутствие иммунологической стимуляции, либо отсутствие очень высокого спонтанного продуцирования цитокинов, после чего указанную клеточную культуру обрабатывают раствором цитокин-индуцирующего вещества и продуцирование цитокинов определяют в соответствии со стандартными методами идентификации. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор подлежащий тестированию, используют с концентрацией 0,1 - 200 мкг/мл. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в случае ЛПК варианта плотность клеток готовой к использованию культуры составляет примерно 8 • 10⁶ лейкоцитов/мл, а в случае варианта РПК плотность клеток составляет около 1 - 2 • 10⁶ клеток/мл. 4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что питательную среду готовят, предпочтительно, с помощью стерильно отфильтрованной и эндотоксин-тестированной RPM1 1640 среды или EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium - орлиная минимальная существенная среда), дополненной 10% немитогенной сыворотки бычьего плода (FBC) и не5обязательно другими ингредиентами, в питательной среде Eagle или RPM1-1640 при добавлении 10% сыворотки бычьего плода. 5. Способ по пп.1 - 4, отличающийся тем, что полученные выше результаты оценивают по калибровочной кривой или предпочтительном положительном или отрицательном контроле. 6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что испытанию подвергают такие торфяные экстракты, как ТТР или их фракции. 7. Способ по пп.1 - 6, отличающийся тем, что к используемому раствору для улучшения результатов добавляют иммуномодулирующий агент, выбранный из группы нестероидных противовоспалительных лекарств, которые ингибируют синтез простагландина, предпочтительно производных изотиазола, или селеноорганических соединений, или индометацина, или аналогов, гомологов метаболитов таких соединений. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что агент усиления выбирают из группы, состоящей из бис-[-2-(N-фенилкарбоксамидо)]-фенилдиселинида, 2-фенил-1,2-бензисоселеназол-3(2Н)-она (ЭБСЕЛЕН PZ 51), бис-[2-(П-(2-пиридил) карбоксамидо)] -фенилдиселинида, п-хлорфениламида 3-метил-5-бензоиламино-изотиазол-4-карбоновой кислоты и индометацина. 9. Способ определения иммунологической реакции пациента на терапию, связанную с использованием цитокининдуцирующих иммуномодуляторных лекарств, отличающийся тем, что образцы крови от указанных пациентов берут через определенные интервалы времени, затем из этих образцов готовят культуры лейкоцитов периферической крови (ЛПК) согласно п.1 и указанные ЛПК культуры подвергают испытанию с целью продуцирования цитокинов, предпочтительно интерферона и факторов некроза опухолей, затем указанные цитокины определяют стандартными методами с целью оценки развития или исчезновения гипореактивности указанных ЛПК культур в отношении индукции интерферона. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанные интервалы времени представляют собой интервалы в неделю. 11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что его используют в ходе терапии с применением торфяного экстракта, особенно ТТР, или их фракций в качестве цитокининдуцирующего иммуномодуляторного вещества. 12. Набор для индуцирования цитокина отличающийся тем, что предназначен для реализации способа по пп.1 - 11 и содержит, с одной стороны, ЛПК культуру или РПК суспензию согласно п.1, а с другой стороны, усилитель согласно п.7 или 8.