СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА (6-ГИДРОКСИ-2,5,7,8-ТЕТРАМЕТИЛХРОМАН-2-ИЛ)АЦЕТАЛЬДЕГИДА С 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНОМ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИОКСИДАНТНОГО СРЕДСТВА, ИНГИБИРУЮЩЕГО ПРОЦЕСС ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ Российский патент 2013 года по МПК C07D407/06 C07J71/00 A61K31/58 A61P1/16 

Изобретение относится к органической химии и химии природных соединений, конкретно, способу получения нового соединения, производного 20-гидроксиэкдизона, конъюгированного с короткоцепочечным аналогом витамина Е, перспективного для медицины и фармакологии.

Экдистероиды - гормоны линьки и метаморфоза насекомых - составляют распространенный и разнообразный класс стероидных соединений в природе. Обнаружение гормонов насекомых во многих растениях, а в некоторых видах до 2-3% от сухой массы, позволило выделять эти соединения для изучения их свойств и проведения химических трансформаций [Ахрем А.А., Ковганко Н.В. Экдистероиды: химия и биологическая активность II Минск: Наука и техника, 1989, 327 с.].

Установлено, что экдистероиды обладают широким спектром биологических свойств, представляющим практический интерес для медицины, и относятся к малотоксичным соединениям [Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Фармакотерапевтический эффект фитоэкдистероидов и неробола при токсическом поражении почек в эксперименте // Эксперим. и клин. фармакол., 2001, №4, с.56-58; Сыров В.Н., Шахмурова Г.А., Хушбактова З.А. Влияние фитоэкдистероидов и бемитила на функциональные, метаболические и иммунобиологические показатели работоспособности в эксперименте. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, №5, с.40-43; Шахмурова Г.А., Сыров В.Н., Хушбактова З.А. Иммуномодулирующая и стресс-протективная активность фитоэкдистероидов экдистерона и туркестерона при иммобилизационном стрессе у мышей. // Химико-фармацевтический журнал, 2010, т.44, №1, с.9-11]. В ряде модельных экспериментов показано, что 20-гидроксиэкдизон (наиболее распространенный и доступный экдистероид) и его производные проявляет выраженные антиоксидантные свойства, сопоставимые с гидрохиноном и бутилгидрокситолуолом [Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Военно-медиц. журнал., 1999, №3, с.35; Володин В.В., Ширшова Т.И., Бурцева С.А., Мельник М.В. // Раст. Ресурсы., 1999, т. 35, №2, с.76; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Донченко Г.В. // Укр. биохим. журнал., 1999, т.71, №2, с.69; Коновалова Н.П., Митрохин Ю.И., Волкова Л.М., Сидоренко Л.И., Тодоров И.Н. // Изв. АН. Сер. биол., 2002, №6, с.650; Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николаенко И.А., Корнилец Г.В., Холодова Ю.Д. // Биохимия, 1997, т.62, №6, с.712]. Описано использование в практической медицине лекарственного средства, разработанного на основе 20-гидроксиэкдизона («экдистен») в качестве препарата коррекции нарушенных метаболических процессов в организме человека при лечении различных заболеваний [Сыров В.Н., Хушбактова ЗА., Комарин А.С. и др. Экспериментально-клиническая оценка эффективности применения экдистена при лечении гепатита // Эксперим. и клин. фармакол., 2004, №5, с.56-59; Сыров В.Н. Фитоэкдистероиды: биологические эффекты в организме высших животных и перспективы использования в медицине. // Эксперим. и клин. фармакол., 2008, №5, с.40-43].

В последнее время в медицинской химии передовым направлением в создании лекарственных средств является синтез конъюгатов путем химических комбинаций разных молекул с определенными свойствами. Полученные конъюгаты (гибридные молекулы) проявляют либо синергетический эффект, либо обладают эффектом пролонгированного действия в организме, либо строго воздействуют на орган-мишень.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод молекулярной конъюгации витаминов C и аналога витамина E, признанных природных антиоксидантов, взаимодействием вицинальной диольной группы аскорбиновой кислоты с альдегидной функцией хроманильного компонента (аналога витамина E) при катализе n-TsOH. Реакция проводилась в бензоле при нагревании в течение 8 часов, при этом выход образующегося коньюгата составил 55%. Полученный таким образом синтетический конъюгат показал интересные свойства. Обладая антиоксидантной активностью, соизмеримой с природными а-токоферолом или L-аскорбиновой кислотой, он способен улавливать свободные радикалы как в гидрофильной, так и в липофильной тканях организма, повышая иммунный статус [Manfredini S., Vertuani S., Manfredi B., Rossoni G., Calviello G., Palozza P Novel antioxidant agents deriving from molecular combinations of vitamins C and E analogues.// Biorganic and Medicinal Chem., 2000, 8, p.2791-2801].

Конъюгаты экдистероидов с аналогами витамина E или другими фармакофорами неизвестны. Задачей изобретения явился способ получения нового гибридного антиоксиданта на основе синтетической комбинации природного экдистероида - 20-гидроксиэкдизона и C₂-аналога α-токоферола.

Решение поставленной задачи было достигнуто взаимодействием 20-гидроксиэкдизона (1) со стехиометрическим количеством (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида (2) в этилацетате в присутствии каталитического количества пара-толулсульфокислоты TsOH (10% от веса экдистероида) при комнатной температуре (~20°C) течение 24 часов. При этом с выходом 62% образуется бис-конъюгированный аддукт (3). Если n-TsOH заменить на другой катализатор, например, фосфорномолибденовую кислоту (ФМК), то время реакции увеличивается.

6-Дебензилирование конъюгата (3) гладко протекает при гидрировании в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C и приводит к соответствующему соединению (4) со свободными фенольными группами.

Соединения 3, 4 являются новыми. Их структура доказана методами ЯМР ¹H и ¹³C. Для соединения 4 был снят масс-спектр MALDI TOF и зарегистрирован ион [M+H]⁺. В спектрах ЯМР ¹H и ¹³C полученных гибридных соединений 3, 4 зарегистрированы сигналы всех атомов углерода и водорода экдистероидного и хроманильного фрагментов молекул.

Полученный экдистероидсодержащий конъюгат с C₂-аналогом витамина E 4 перспективен для использования в качестве адаптогенного и геропротекторного препарата при заболеваниях, связанных с активацией процессов перекисного окисления в организме.

Сущность метода продемонстрирована на следующих примерах.

Пример 1. 2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (3). К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г TsOH, реакционную смесь перемешивали 24 ч при комнатной температуре и упарили. Остаток хроматографировали на колонке (20 г SiO₂, элюент - CHCl₃). Получили 0.29 г (62%) соединения 3, R_f 0.56 (CHCl₃-MeOH, 20:1), т.пл. 128-130°C, [α]_D ²⁰+20.7° (с 2.03, CHCl₃). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д., J, Гц: 0.90 с (3Н, H₃C¹⁸), 1.00 с (3Н, Н₃С¹⁹), 1.17 с (3Н, Н₃С²¹), 1.27 с (3Н, H₃C²⁶), 1.28 с (3Н, H₃C²⁷), 1.37 с (6Н, СН₃-С^2' и CH₃-C^2''), 2.11 с, 2.18 с и 2.24 с (18Н, 6 СН₃-Ar), 2.63 м (4Н, H₂C^4' и H₂C^4''), 3.62 м (1Н, HC²²), 4.10 м (1Н, HC²), 4.14 м (1Н, НС³), 4.71 с (4Н, OCH₂Ph), 5.18 уш.с. (1Н, НС^2'''', w_1/2=13.0 Гц), 5.24 уш.с. (1Н, НС^2''', w_1/2=13.0 Гц), 5.85 с (1Н, НС⁷), 7.35-7.50 м (10Н, Н-Ar). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 11.92, 12.01 и 12.89 (6 Ме-Ar), 17.00 (С¹⁸), 20.56 (С¹⁹), 20.56 (С^4' и С^4''), 21.50 (C¹¹), 23.04 (C¹⁶), 23.61 (C²¹), 24.80 (MeC^2'), 24.97 (MeC^2''), 26.68 (С²³), 29.47 (С²⁶ и С²⁷), 30.86 (С¹⁵), 30.94 (C⁴), 31.74 (С^3'), 31.85 (С^3'') 34.00 (С¹²), 34.71 (С⁹), 37.82 (С¹), 38.40 (С¹⁰), 41.41 (С²⁴), 45.53 (С¹³), 47.36 (С⁵), 49.74 (С^1''', С¹⁷), 50.83 (С^1''''), 70.48 (С²⁵), 73.36 (С^2' и С^2''), 74.75 (OCH₂Ph), 76.75 (С³), 77.07 (C²), 83.55 (С²⁰), 83.85 (С²²), 84.86 (С¹⁴), 101.41 и 101.63 (С^2''''), 102.00 (С^2'''), 117.41 (C^8a'), 117.49 (C^8a''), 121.43 (С⁷), 123.04 (С^8' и С^8''), 126.06 (С^7', С^7''), 127.74, 127.76 и 128.47 (Ph), 128.055 (С^5', С^5''), 137.97 (ОСН₂-С), 147.48 (C^4a'), 147.60 (C^4a''), 148.39 (С^6' и С^6''), 163,23 (С⁸), 202.62 (С⁶).

Пример 2. К раствору 0.20 г (0.42 ммоль) соединения 1 в 3 мл EtOAc прилили раствор 0.28 г (0.83 ммоль) альдегида 2 в 3 мл EtOAc и добавили 0.02 г ФМК, реакционную смесь перемешивали 54 ч при комнатной температуре и упарили. Далее обрабатывали как описано в примере 1. Получили 0.29 г (61%) соединения 3, идентичного полученному в примере 1.

2,3:20,22-Бис-O-[2-(6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)этилиден]-20-гидроксиэкдизон (4). Через суспензию 0.28 г (0.25 ммоль) соединения 3 и 0.07 г катализатора (10% Pd-C) в 5 мл абс. метанола пропускали водород (контроль ТСХ, ~3 ч). Катализатор отфильтровали, фильтрат упарили. Остаток хроматографировали на колонке (15 г SiO₂, элюент - CHCl₃). Получили 0.23 г (96%) соединения 4, т.пл. 130-134°С, [α]_D ²⁰+24.5° (с 1.82, CH₂Cl₂). Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃), δ, м.д., J, Гц: 0.81 с (3Н, H₃C¹⁸), 0.97 с (3Н, H₃C¹⁹), 1.15 с (3Н, Н₃С²¹), 1.26 с (6Н, Н₃С²⁶, Н₃С²⁷), 1.33 с (3Н, СН₃С^2'), 1.34 с (3Н, СН₃С^2''), 2.11 с, 2.16 с и 2.18 с (18Н, 6 СН₃-Ar), 2.62 с (4Н, CH₂ ^4' и CH₂ ^4''), 3.59 м (1Н, С²²), 4.12 м (1Н, HC²), 4.46 м (1Н, HC³), 5.14 уш.с. (1Н, HC^2''''), 5.21 уш.с. (1Н, HC^2'''), 5.82 с (1Н, HC⁷). Спектр ЯМР ¹³С (CDCl₃), δ, м.д.: 11.32, 11.85 и 12.26 (Me-Ar), 16.97 (С¹⁸), 20.63 (С¹⁹), 20.63 (С^4' и С^4''), 21.46 (С¹¹), 23.00 (С¹⁶), 23.53 (С²¹), 24.37 (МеС^2'), 24.64 (МеС^2''), 26.65 (С²³), 29.43 (С²⁶ и С²⁷), 30.82 (С¹⁵), 30.92 (С⁴), 31.65 (С^3'), 31.95 (С^3'') 33.16 (С¹²), 34.69 (С⁹), 37.80 (С¹), 38.37 (С¹⁰.), 41.38 (С²⁴), 45.42 (С¹³), 47.33 (С⁵), 49.71 (С¹⁷), 50.90 (С^1''' и С^1''''), 70.51 (С²⁵), 73.05 (С^2'), 73.32 (С^2''), 76.73 (С³), 77.05 (С²), 83.59 (С²⁰), 83.83 (С²²), 84.80 (С¹⁴), 101.44 и 101.66 (1Н, С^2'''') 102.01 (1Н, С^2'''), 117.10 (C^8a' и C^8a''), 118.71(C^5' и C^5''), 121.38 (С^8', С^8'', С⁷), 122.64 (С^7'и С^7''), 144.81 (C^4a' и C^4a''), 145.11 (С^6'), 163.21 (С⁸), 203.01 (С⁶). MALDI-TOF MS: m/z 942.360 [М+Н]⁺. Вычислено для (C₅₇H₈₀O₁₁+H) 942.248.

Для бисаддукта (4) было изучено влияние на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в экспериментах in vitro на гомогенате печени. В опытах т vivo на интактных животных определяли степень накопления малонового диальдегида (МДА) в печени и активность ферментов антиоксидантной системы - каталазы и супероксиддисмутазы. У животных с острым экспериментальным гепатитом в гомогенате печени определяли содержание диеновых коньюгатов (ДН), малонового диальдегида и восстановленного глютатиона.

Биологическая активность препарата (4) продемонстрирована следующими примерами.

Пример 1. Опыты проводили в системе in vitro на гомогенатах печени нормальных животных (крысы-самцы - 160-180 г). Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) активировали путем добавления сульфата железа (II) (1·10^-4 М) и аскорбиновой кислоты (2·10^-4 М). Один из конечных продуктов ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Проведенные эксперименты показали выраженное ингибирующее влияние соединения 4 на процессы ПОЛ, что проявляется подавлением реакции образования МДА на 94.2%. Соответствующий эффект витамина Е (использовали аптечный препарат токоферола в конечной концентрации 1·10^-4 г/мл) и экдистерона составлял 83.3 и 27.8% соответственно (табл.1).

Таблица 1 Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на содержание МДА в гомогенате печени крыс в опытах in vitro (M±m, n=6). Испытуемое вещество МДА в пробе, нмоль/мг белка Эффект, в % Соединение 4 0.107±0.017^1,2,3 -94.2 Экдистерон 1.320±0.042¹ -27.8 Витамин Е 0.306±0,024¹ -83.3 Контроль 1.826±0.079   Примечание. Концентрация всех образцов составляла 1·10^-4 г/мг (именно в этой концентрации в условиях нашего опыта проявлялась их максимально выраженное антиоксидантное действие). ¹ - достоверно по отношению к контролю, ² - по отношению к результатам пробы с экдистероном, ³ - по отношению к результатам пробы с витамином Е.

Пример 2. Крысам самцам (160-180 г) орально в течение 7 дней вводили соединение 4 (5 мг/кг), экдистерон (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг). (Дозы предварительно определили как наиболее оптимальные). После окончания эксперимента животных забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). В печени животных определяли содержания МДА [Стальная И.Д., Гариашвили Т.Г. Методы определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.66-68] и активность ферментов антиоксидантной системы: каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) по методам [Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Т. и др. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело, 1988, №1, с.16-19] и [Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека // Лаб. дело, 1983, №10, с.30-33].

Проведенные исследования показали, что как и в опытах in vitro, введение соединения 4 в организм животных приводит к угнетению процессов ПОЛ, о чем свидетельствовало понижение содержания в печени МДА на 42% по сравнению с показателями интактной группы. При введении экдистерона и витамина Е содержание МДА в печени понижалось только на 17.9 и 30% (табл.2). При этом в случае введения соединения 4 отмечено также более выраженное повышение активности ферментов, определяющих состояние антиоксидантной защиты организма (табл.2).

Таблица 2 Сравнительное действие соединения 4, экдистерона и витамина Е на некоторые показатели антиоксидантной системы, уровень МДА в печени крыс (М±m, n=8). Испытуемое вещество Каталаза, ммоль/мин/г белка Эффект, в % СОД, УЕ/мин/мг белка Эффект, в % МДА, нмоль/мг белка Эффект, в % Витамин Е 16.8±0.74 +6.3 1.78±0.16 +12.6 0.562±0.028¹ -30 Соединение 4 19.4±1.04¹ +22.07 2.10±0.20¹ +32.9 0.424±0.022^1,2,3 -42 Экдистерон 17.11±0.98 +8.3 1.91±0.18 +20.9 0.600±0.030¹ -17,9 Контроль 15.8±0.98 - 1.58±0.12 - 0.731±0.04 - Примечание. Обозначения достоверности те же, что и в таблице 1.

Пример 3. Опыты проводили на крысах-самцах массой 180-200 г. Поражение печени у них вызывали путем введения ССЦ (по 0.4 мл 50% масляного раствора на 100 г массы ежедневно в течение 4-х дней) [Левшин Б.И, Экспериментальная фармакотерапия препаратами селена и тиазолидина токсического повреждения печени: Автореф. дис. д-ра мед. наук., Харьков, 1973]. Известно, что CCl₄ является сильным прооксидантом. Начиная со 2-го дня введения CCl₄, крысам орально при помощи специального зонда вводили внутрь экдистерон (5 мг/кг), соединение 4 (5 мг/кг) и витамин Е (50 мг/кг) (дозы подобрали как наиболее эффективные в предварительных экспериментах).

По истечении 3-х дней после повторного введения препаратов животным (через 2 часа после последнего введения) крыс забивали декапитацией (под легким эфирным наркозом). О выраженности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и восстановленного глютатиона в гомогенате печени. Содержание диеновых коньюгатов и восстановленного глютатиона определяли по методу [Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии, под ред. В.Н. Ореховича, М., 1977, с.63-64] и [Смирнов В.В. Глютатион - зависимая антиоксидантная система головного мозга при черепно-мозговой травме // Дис. канд. мед. наук., СПб, 1995, 153 с.]. Проведенные эксперименты показали, что введение крысам CCl₄ приводило к резкой активации ПОЛ, о чем свидетельствовало увеличение количества ДК, МДА (на 164.8-69.7%) и снижение восстановленного глютатиона (на 51.4%) в гомогенатах печени. Соединение 4 и в этих опытах проявило выраженное антиоксидантное действие, заметно более превосходящее действие экдистерона и витамина Е. Под действием соединения 4 содержание ДК и МДА в печени крыс с CCl₄ - гепатитом было ниже на 53.5 и 36.9% и всего на 23.1 и 7.1% (p>0.05) выше, чем у интактных животных. Экдистерон понижал содержание ДК и МДА только на 29.5 и 20.9%. Витамин Е оказывал тоже выраженный эффект, но и в этом случае содержание ДК и МДА снизилось только на 41.5 и 26.8%. Соединение 4 проявило также выраженный глютатионстабилизирующий эффект. И в этом случае соединение 4 действовало более выражено, чем собственно экдистерон и витамин Е (табл.3).

Таким образом, соединение 4 обладает выраженным антиоксидантным действием, что открывает перспективу его использования при целом ряде заболеваний, в основе которых лежит активация процессов перекисного окисления липидов.

Таблица 3 Антиоксидантная активность соединения 4 в сравнении с экдистероном и витамином Е при поражении печени крыс CCl₄ (М±m, n=8). Условия эксперимента ДК, мкмоль/г Эффект, в % МДА, нмоль/мг белка Эффект, в % Глютатион-SH, мкмоль/мг Эффект, в % Интактные животные 0.182±0.012   0.700±0.032   8.76±0.32   Контроль (CCl₄ - гепатит) 0.482±0.036¹   1.188±0.094¹   4.26±0.22¹   CCl₄ + препарат (4) 0.224±0.014^1,2 -53.5 0.750±0.034² -36.9 8.24±0.30² +93.4 CCl₄ + экдистерон 0.340±0.020^1,2,3 -29.5 0.940±0.052^1,2,3 -20.9 6,94±0.32 ^1,2,3 +62-9 CCl₄ + витамин Е 0.282±0.018^1,2,3 -41.5 0.870±0.038 ^1,2,3 -26.8 6.30±0.24^1,2,3 +47.8 Примечание. ¹ - достоверно по отношению к интактным животным, ² - по отношению к контролю, ³ - по отношению к группе животных получавших на фоне CCl₄ соединение 4 (p>0.05).

В результате проведенного тестирования соединение 4 показало более высокую антиоксидантную активность в сравнении с витамином Е и 20-гидроксиэкдизоном (экдистерон).

Изобретение относится к органической химии и химии природных соединений, конкретно к способу получения нового соединения, производного 20-гидроксиэкдизона, конъюгированного с короткоцепочечным аналогом витамина E, перспективного для медицины и фармакологии, а именно к способу получения конъюгата 20-гидроксиэкдизона путем его взаимодействия с (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегидом в этилацетате при комнатной температуре в присутствии кислотного катализатора (TsOH или ФМК) в течение 24 ч, с последующим дебензилированием полученного промежуточного конъюгата в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C. Изобретение также относится к применению этого соединения в качестве антиоксидантного средства, ингибирующего процесс перекисного окисления липидов. Полученные гибридные соединения перспективны в медицине и фармакологии как новые геропротекторные антиоксиданты. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Способ получения конъюгата (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида с 20-гидроксиэкдизоном, отличающийся тем, что 20-гидроксиэкдизон взаимодействует со стехиометрическим количеством 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегидом в этилацетате в присутствии кислотного катализатора при температуре ~20°C в течение 24 ч, с последующим дебензилированием полученного промежуточного конъюгата в растворе этанола в присутствии катализатора Pd-C.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве кислотного катализатора использовали пара-толуолсульфокислоту (TsOH) или фосфорномолибденовую кислоту (ФМК) в количестве 10% от веса экдистероида.

3. Применение конъюгата (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил)ацетальдегида с 20-гидроксиэкдизоном в качестве антиоксидантного средства, ингибирующего процесс перекисного окисления липидов.