СПОСОБ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БАЗАЛЬНОГО ТРАХЕОБРОНХИАЛЬНОГО СЕКРЕТА У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ ПРИ КОРРЕКЦИИ АНТИОКСИДАНТАМИ ВОЗДЕЙСТВИЯ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ОРГАНИЗМ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к пульмонологии и касается морфологического, физиологического исследования, ультраструктурных характеристик суспензий клеток при воздействии на организм здоровых людей антиоксидантов.

Существует необходимость цитологического исследования клеточного состава биологических жидкостей органов дыхания во время профилактических осмотров здоровых лиц. Аптиоксиданты назначаются с целью профилактики развития заболеваний органов дыхания у людей в случае воздействия на организм низкой температуры окружающей среды (2, 4). В настоящее время рекомендуется использовать в качестве антиоксиданта производные биофлавопоидов, например дигидрокверцетин (2, 4, 11), В свою очередь существует необходимость цитологического контроля воздействия антиоксидантов на организм здорового человека (2, 3, 4, 11). Клеточный профиль имеет большое диагностическое значение. Известны способы исследования клеточного состава биологических жидкостей органов дыхания, а именно мокроты, бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), браш-биопсии (7, 8, 9, 10, 12, 14). Недостатком этих способов диагностики является то, что отсутствуют показания для исследования БАЛ, браш-биопсии у здоровых лиц, ввиду того, что они инвазивны, а мокрота у здоровых людей не образуется. Посредством фарингеальной ловушки базального трахеобронхиального секрета достигается низкая инвазивность способа цитологического исследования для трахеи и бронхов обследованных здоровых людей (1) и нативные свойства базального трахеобронхиального секрета. Недостатком известного не инвазивного способа исследования клеточного состава цитологических мазков базального трахеобронхиального секрета полученного с помощью фарингеальной ловушки (1), является то, что он осуществляется без морфометрии клеток и без изучения кристаллограммы биологических жидкостей дыхательных путей. В то же время в настоящий момент доказана диагностическая значимость морфометрии клеток бронхоальвеолярного лаважа, а так же кристаллографии мазков на предметном стекле биологических жидкостей назального секрета (5, 11, 12). Изобретение направлено на исправление недостатков способов цитоморфологического, цитофизиологического, цитохимического исследований клеточных элементов органов дыхания у практически здоровых людей, которым показана коррекция холодового воздействия на организм, с помощью адаптогенов антиоксидантного ряда.

Изобретение отличается тем, что способ оценки эффективности коррекции переохлаждения организма здоровых лиц антиоксидантным препаратом или пищевой добавкой содержащей антиоксиданты, осуществляется путем изучения морфометрических параметров макрофагальных клеток и морфометрических показателей (длина, площадь периметр) ядер макрофагов на мазке нативного базального трахеобронхиального секрета полученного с помощью фарингеальной ловушки. Существо способа заключается в том, что, до и после курса коррекции переохлаждения организма здоровых лиц осуществляемого с помощью антиоксидантного препарата или пищевой добавки содержащей антиоксиданты, проводится цитологическое и кристаллографическое исследование: процентного содержания клеток (клеток плоского и цилиндрического эпителия, лимфоциты, макрофаги, сегментоядерные нейтрофильные лейкоциты, палочкоядерные нейтрофильные лейкоциты, эозинофильные лейкоциты); показателей кристаллограммы мазков, которые обнаруживаются при маленьком увеличении микроскопа 0 баллов (-) - кристаллизация отсутствует, слизь аморфная; 1 балл (+) - кристаллизация со смазанным нечетким рисунком в виде отдельных стеблей и игл кристаллов; 2 балла (++) - четко выраженная структура листа папоротника с тонким и ясным рисунком; 3 балла (+++) - крупные кристаллы, массивные стебли, ветви расходятся под углом 90°); затем изучаются морфометрические параметры макрофагальных клеток (длина, площадь периметр) и морфометрические показатели ядер (длина, площадь периметр) макрофагов содержащихся в нативном базальном трахеобронхиальном секрете полученного с помощью фарингеалыюй ловушки.

Способ осуществляется в два этапа следующих друг за другом:

1. Этап. В начале способа микроскопически исследуется: 1) процентное содержание клеток; 2) показатели кристаллограммы; 3) морфометрические параметры макрофагальных клеток на мазке нативного базального трахеобронхиального секрета полученного с помощью фарингеальной ловушки у здоровых лиц, которые подверглись воздействию низкой температуры окружающей среды на организм до приема антиоксидантного фармакологического препарата или пищевой добавки содержащей антиоксиданты.

2. Этап. На этом этапе, микроскопически исследуется 1) процентное содержание клеток; 2) показатели кристаллограммы; 3) морфометрические параметры макрофагальных клеток на мазке нативного базального трахеобронхиального секрета полученного с помощью фарингеальной ловушки после курса коррекции антиоксидантным препаратом или пищевой добавкой содержащей антиоксиданты происходившего во время воздействия низкой температуры окружающей среды на организм здоровых лиц.

Таким образом, способ представляет большое значение для исследования механизма действия антиоксидантов и витаминов на практически здоровых людей.

Пример использования

Под профилактическим наблюдением находились 30 человек, из них 10 мужчин, 20 женщин, в возрасте от 18 до 30 лет. Контрольную группу составили 30 практически здоровых людей, аналогичные по полу и возрасту. Учитывая, что низкая температура окружающей среды вызывает раздражение слизистой оболочки органов дыхания, у части испытуемых (30 человек) предварительно проводилось закаливание в течение одного часа. В целях коррекции холодового стресса 30 человек в течение 14 дней принимали дигидрокверцетин («Лавиокард» - пищевая добавка, которая содержит дигидрокверцитин, Россия) в дозе 0,6 г в сутки. После чего эта группа испытуемых подвергалась закаливающему воздействию низкой температуры окружающей среды (-30 С°) в течение одного часа.

В дополнительных целях контроля эффективности предложенного способа коррекции холодового стресса, мы рекомендовали здоровым лицам, участвующим в исследовании- 30 человек в течение 14 дней в теплое время года (май) принимать дигидрокверцетин («Лавиокард» - пищевая добавка, которая содержит дигидрокверцитин, Россия) в дозе 0,6 г в сутки. Цитологический контроль органов дыхания осуществлялся с помощью фарингеальной ловушки (1) для последующего исследования морфологических, функциональных, цитохимических, морфометрических характеристик клеточных элементов содержащихся в составе биосред базального трахеобронхиального секрета у здоровых людей. Мазки трахеобронхиального секрета окрашивали по Романовскому - Гимза. Статистическая обработка проводилась с помощью критерия Стьюдента, методов непараметрической статистики U-критерий Уилкоксона Мана - Уитни. Морфометрия клеток проводилась с помощью программного обеспечения Optica Vision Pro. Количество кристаллов в назальном секрете оценивали по балам, с учетом рекомендаций для овариального теста [4]. Степень выраженности симптома листа папоротника определяется балами при маленьком увеличении микроскопа <×50: 0 баллов (-) - кристаллизация отсутствует, слизь аморфная; 1 балл (+) - кристаллизация со смазанным нечетким рисунком в виде отдельных стеблей и игл кристаллов; 2 балла (++) - четко выраженная структура листа папоротника с тонким и ясным рисунком; 3 балла (+++) - крупные кристаллы, массивные стебли, ветви расходятся под углом 90°. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью t - критерия Стьюдента.

При микроскопии трахеобронхиального секрета, полученного с помощью фарингеальной ловушки обнаруживаются клеточные маркеры воспаления в виде клеток плоского и цилиндрического эпителия, лимфоциты, макрофаги, сегментоядерные (С/Я) нейтрофильные лейкоциты, палочкоядерные (П/Я) нейтрофильные лейкоциты, эозинофильные лейкоциты парциальный вес, которых представлен в таблице. Мы дополнительно изучали содержание микроорганизмов в препаратах. Нередко у исследуемых здоровых лиц в трахеобронхиальном секрете обнаруживались кристаллы в виде листа папоротника - «симптом листа папоротника». В контрольной группе выраженность кристаллизации трахеобронхиального секрета составляет 1,09±0,23 балла. Нами оценивались морфометрические параметры макрофагальных клеток: длина - 14,048±1,255 мкм, площадь-194,203±23,700 мкм², периметр - 56,419±3,191 мкм. Отдельно оценивались морфометрические параметры ядра макрофагальных клеток: длина- 5,853±0,425 мкм, площадь - 40,907±4,490 мкм², периметр -27,161±1,345 мкм.

Парциальный вес (%) показателей цитограммы базального трахеобронхиального секрета при коррекции воздействия холода на организм дигидрокверцетином Название группы испытуемых 1 Контроль 2 Закаливание холодом 3 Коррекция закаливания холодом дигидрокверцитином 4 Здоровые лица получавшие дигидрокверцитин в теплое время года % Клеток плоского эпителия 32,33±8,8 45,29±12,25 66,74±11,6 Отрицательный результат % Клеток цилиндрического эпителия 7,67±4,44 0,001±0,001*(1-2 г) U 0,96±0,75 * (2-3 г) U Отрицательный результат % Палочкоядерных нейтрофильных лейкоцитов 0,33±0,2 0,001±0,001*(1-2 г) U 0,09±0,03 *(2-3 г) S Отрицательный результат % Сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов 42,06±7,85 36,91±8,12 25,41±7,48*(2-3 г) U Отрицательный результат % Лимфоцитов 1,33±0,53 0,001±0,001*(1-2 г) S 0,09±0,03 * (2-3 г) S Отрицательный результат % Эозинофильных лейкоцитов 1,76±2,21 0,001±0,001*(1-2 г) U 0,56±2,55 Отрицательный результат % Макрофагов 13,94±7,41 17,81±7,12 6,18±5,21*(2-3 г) U Отрицательный результат Примечания: *р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001 показывает достоверность по критерию Стьюдента - S, U - критерий Уилкоксона-Мана Уитни.

При воздействии холода на организм человека, о раздражении слизистой оболочки свидетельствует статистически достоверное снижение в цитограмме парциального веса лимфоцитов, палочкоядерных нейтрофильных лейкоцитов, эозинофильных лейкоцитов, клеток цилиндрического эпителия (таблица) в сравнении с данными, характеризующими клеточный профиль трахеоброихиального секрета в контроле. В этой группе здоровых лиц выраженность кристаллизации трахеоброихиального секрета составляет 1,0±0,41 балла, что недостоверно отличается от результатов полученных нами при кристаллографическом исследовании трахеобронхиальной цитограммы в контроле.

Морфометрические параметры клеток объективизируют изменение парциального состава трахеобронхиальной цитограммы. Нами обнаружили, что при воздействии низких температур на здоровых людей, достоверно в сравнении с контролем увеличиваются морфометрические параметры макрофагальных клеток: длина - 27,574±1,756 мкм р<0,001, площадь - 631,109±78,030 мкм², р<0,001, периметр - 99,265±5,993 мкм р<0,001. Отдельно оценивались морфометрические параметры ядра: длина - 15,825±1,919 мкм, р<0,001, площадь - 193,755±28,756 мкм², р<0,001, периметр - 57,875±3,573 мкм, р<0,001.

Применение дигидрокверцетина модулирует закаливающее влияние низкой температуры окружающей среды на организм. Об изменении клеточного профиля трахеобронхиального секрета свидетельствует достоверная нормализация клеточного профиля цитограммы, в виде нормализации содержания лимфоцитов (палочкоядерных нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов, клеток цилиндрического эпителия) в сравнении с данными характеризующих клеточный профиль трахеобронхиального секрета в случае воздействия холода на организм (таблица).

В этой группе здоровых лиц подвергнутых воздействию холода и употреблявших адаптогены в пищу выраженность кристаллизации трахеобронхиального секрета составляет 0,7±0,32 балла, что достоверно отличается при непараметрической оценке от результатов полученных нами при кристаллографическом исследовании трахеобронхиальной цитограммы в случае здоровых лиц подвергнутых воздействии холода на организм здоровых лиц р<0,01 (U - критерий Уилкоксона Мана-Уитни). В этой группе здоровых лиц нами оценивались морфометрические параметры макрофагальных клеток: длина - 27,970±1,765 мкм, площадь - 570,727±68,343 мкм², периметр - 93,882±4,782 мкм. Эти данные недостоверно отличаются от морфометрических параметров макрофагов, которые были получены нами при исследовании мазков базального трахеобронхиального секрета, в группе здоровых лиц при воздействии холода на организм. Применение дигидрокверцетина в качестве адпатогена добавленного в пищу, приводит к достоверному изменению площадных морфометрические параметров ядра макрофагов в сравнении с данными, полученными при воздействии холода на организм: площадь - 119,53±9,58 мкм², р<0,05, периметр - 46,843±1,875 мкм, р<0,05, но длина ядра изменяется не достоверно - 15,346±1,904 мкм.

При назначении дигидрокверцитина как добавки в пищу практическим здоровым лицам, в теплое время года (май), мы обнаружили отрицательные результаты наличия клеток и симптома «листа папоротника» в мазках, в группе здоровых лиц при воздействии холода на организм во всех случаях забора базального трахеобронхиального секрета, что отражено в таблице.

Проведенное исследование органов дыхания позволяют сделать заключение об эффективности способа исследования клеточного профиля трахеобазального секрета полученного с помощью фарингеальной ловушки в изучение коррекции антиоксидантами воздействия холода на органы дыхания. Применение дигидрокверцетина в качестве пищевой добавки оказалось эффективным способом, снижающим реакцию органов дыхания в случае реакции организма на холод.

Источники информации

1. Добрых В.А., Медведева Е.В., Гнатюк О.П. и др. Неинвазивная технология получения и исследования базального трахеобронхиального секрета в диагностике заболеваний респираторной системы // 2 Национальный конгресс терапевтов. - Сборник материалов // Москва, 2007. - С.64.

2. Доровских В.А., Целуйко С.С. Антиоксидантные препараты различных химических групп в регуляции стрессирующих воздействий. Благовещенск: АГМА, 2004. 268 с.

3. Прокопенко А.В. Дигидрокверцитин как цитопротектор легочного эпителия // 13^th international congress on Circumpolar Health (приложение к Бюлл. СО РАМН). -Новосибирск: 2006. - С.168.

4. Татарчук Т.Ф., Сельский Я.П. Эндокринная гинекология (клинические очерки). Киев: Заповiт, 2003. 300 с.

5. Шатохина С.Н., Зенгер В.Г. Морфология жидких сред организма - новое направление оториноларингологии // Рос. оториноларингол. 2004. №5. С.188-191.

6. DorovskikhV. A., Zinovyev S.V., Lukyantseva L.V., Adaptogen in prophylaxis of cold,s stressing influence // The 6^th Russia-China Pharmaceutical Forum «Modern problems of pharmacology, pharmacnognosies and parmaceuticses» blagoveshensk, 2009. P.215-216.

7. Kazmierczak M., Marczak J., Pekala-Wojciechowska A. et al. Markers of inflammation in exhaled breath condensate and bronchoalveolar lavage fluid // Eur. Respir. J. - 2007. - Vol.30. - P.750.

8. Pinto-Plata V., Toso J., Lee K., Park D. et al. Cell profiling serum biomarkers in patients with COPD: associations with clinical parameters // Thorax. - 2007. - Vol.62. - P.595-601.

9.Starosta V., Ratjen F., Rietschel E., Paul K., and Griese M. Anti-inflammatory cytokines in cystic fibrosis lung disease // Eur. Respir. J. - 2006. - Vol.28. - №3. - P.581-587.

10. Sterclova M., Vasakova M., Dutka J., and Kalanin J. Extrinsic allergic alveolitis: comparative study of the bronchoalveolar lavage profiles and radiological presentation. // Postgrad. Med. J. - 2006. - 82. - №971. - Р.598-601.

12. Tseluyko S.S. Structural changes in the lungs during cooling against the background of the of the introduction of bioflavonoid of digidroqertsetin and correction by the quantum therapy // The 6^th Russia-China Pharmaceutical Forum «Modern problems of pharmacology, pharmacnognosies and pharmaceutics» blagoveshensk, 2009. P.189-190.

13. Zinovev S.V., Tseluyko S.S., Kozlova V.S. Morphology of pulmonary macrophages at action of cold // 13^th Tenth international congress on Circumpolar Health (приложение к Бюллетеню СО РАМН). - Новосибирск. - 2006. - С.233.

14. Welker L., Jörres R.A., Costabel U., Magnussen H. Predictive value of BAL cell differentials in the diagnosis of interstitial lung diseases // Eur. Respr. J. - 2004. - Vol.24. - N.6. - P.1000-1006.

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к пульмонологии, и касается способа морфологического и физиологического исследования ультраструктурных характеристик суспензий клеток при воздействии на организм здоровых людей антиоксидантов. Способ осуществляется с помощью морфометрии макрофагальных клеток и ядер макрофагов и кристаллографического исследования мазка базального трахеобронхиального секрета на предметном стекле. Способ позволяет микроскопическим путем исследовать парциальный состав, морфометрические характеристики клеток: длину, площадь и периметр, показатели кристаллограммы мазков нативного базального трахеобронхиального секрета, полученного с помощью фарингеальной ловушки у здоровых людей в контроле и у здоровых лиц при коррекции антиоксидантами в течение двух недель воздействия низкой температуры окружающей среды на организм. 1 табл., 1 пр.

Способ цитологического исследования базального трахеоброихиального секрета у здоровых лиц при коррекции воздействия низкой температуры окружающей среды на организм антиоксидантами, включающий получение базального трахеоброихиального секрета с помощью фарингеальной ловушки и нанесение секрета на предметное стекло, изготовление цитологического мазка и исследование процентного содержания клеток в мазке, отличающийся тем, что способ осуществляют в два этапа, следующих друг за другом: получают мазки нативного базального трахеобронхиалыюго секрета обследованных здоровых лиц до приема антиоксидантного препарата и после курса коррекции антиоксидантным препаратом в течение 2-х недель и на каждом этапе после высыхания цитологического мазка дополнительно оценивают его кристаллограмму, после чего проводят определение морфометрических показателей макрофагальных клеток и ядер макрофагов: длину, площадь, периметр.