СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОРАЗМЕРНОГО АМФОТЕРИЦИНА В Российский патент 2013 года по МПК C07H17/04 C07H17/08 A61K47/48 B82B3/00 

Настоящее изобретение относится к области медицины, фармацевтике и нанотехнологиям и, конкретно, к способу получения наноразмерного, нанесенного на алюмосиликатные нанотрубки, амфотерицина В - малорастворимого полиенового макроциклического антибиотика формулы

,

продуцируемого Streptomyces nodosus, который оказывает фунгицидное или фунгистатическое действие в отношении Candida spp., Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp. и других грибов. Способ может найти применение в производстве лекарственных средств, фармацевтике и медицине.

Открытый более полувека назад амфотерицин В до последнего времени остается ″золотым стандартом″ эмпирической антимикотической терапии, несмотря на тяжелые побочные эффекты. Амфотерицин В представляет собой полиеновый макроциклический антибиотик, продуцируемый грибами Streptomyces nodosus, выделенными впервые из образца почвы на реке Ориноко (Orinoco) в Венесуэле в 1955 году. Действие препарата основано в значительной степени на связывании с эргостеролом мембраны грибов и нарушением ее целостности.

Амфотерицин В - препарат широкого спектра действия, активен в отношении большинства видов Candida (исключая С.lusitaniae), а также Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Fusarium spp., Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Rhodotorula spp., Sporotrix spp. Амфотерицин В также эффективен против возбудителей висцерального и американского кожного лейшманиоза. Кроме того, амфотерицин В в некоторых случаях активен в отношении Aspergillus spp.Trichosporon spp. и Pseudoallescheria boydii резистентны к АмВ [(а) Митрофанов В.С. Системные антифунгальные препараты. Пробл. мед. микол. 2001; 3(2): 6-14; (b) A. Lemke, A.F. Kiderlen, O. Kayser. Amphotericin B. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2005) 68: 151-162; (с) V. Idemyor. Emerging opportunistic fungal infections: where are we heading? J. Natl. Med. Assoc. (2003) 95:1211-1215].

Амфотерицин В используют тремя способами: внутривенно, ингаляционно, перорально и местно (в виде мази). Основная проблема сильно ограничивающая применение этого вещества заключается в его низкой растворимости в большинстве органических растворителей и воде. Частично проблема низкой растворимости амфотерицина В решена за счет применения дорогостоящих лекарственных форм в которых он находится в виде липидных комплексов, липосом и коллоидных дисперсий [(a) Walsh, Thomas J.; Finberg, Robert W.; Arndt, Carola; Hiemenz, John; Schwartz, Cindy; Bodensteiner, David; Pappas, Peter; Seibel, Nita; Greenberg, Richard N.; Dummer, Stephen; Schuster, Mindy; Dismukes, William E.; Holcenberg, John S.; Liposomal Amphotericin B for Empirical Therapy in Patients with Persistent Fever and Neutropenia. New England Journal of Medicine, 1999; 340:764-771; (b) Janknegt, R.; de Marie, S.; Bakker-Woudenberg, I. A.; Crommelin, D. J. Liposomal and lipid formulations of amphotericin B. Clinical pharmacokinetics, 1992, 23(4):279-291; (c) Patricia K. Sharkey, John R. Graybill, Edward S. Johnson, Stephen G. Hausrath, Richard B. Pollard, Antonia Kolokathis, Donna Mildvan, Patty Fan-Havard, Robert H.K. Eng, Thomas F. Patterson, John C. Pottage, Jr., Michael S. Simberkoff, Judith Wolf, Richard D. Meyer, Renu Gupta, Lily W. Lee, and David S. Gordon. Amphotericin В Lipid Complex Compared with Amphotericin В in the Treatment of Cryptococcal Meningitis in Patients with AIDS. din Infect Dis. 1996, 22: 308-314; (d) John W. Hiemenz and Thomas J. Walsh. Lipid Formulations of Amphotericin B: Recent Progress and Future Directions. Clin Infect Dis. 1996, 22 (Supplement 2): S133-S144.]; важно отметить, что все перечисленные лекарственные формы не являются истинными растворами амфотерицина В.

Известен способ получения наноразмерных суспензий Амфотерицина В для лечения амебных заболеваний мозга [Andreas Lemke, Albrecht F. Kiderlen, Boris Petri, Oliver Kayser. Delivery of amphotericin B nanosuspensions to the brain and determination of activity against Balamuthia mandrillaris amebas Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 6: 597-603 (2010).]. По этому способу суспензия наноразмерных частиц Амфотерицина В была получена гомогенизацией под высоким давлением, с использованием пистолетного гомогенизатора. Амфотерицин В смешивали с различными по структуре поверхностно активными веществами в воде, количество амфотерицина В составляло 2%, а поверхностно активного вещества 1%. Полученную массу многократно - в течение 20 циклов гомогенизировали при давлении 1500 бар (приблизительно 1500 атмосфер) до получения наноразмерной суспензии. В целом метод очень дорогостоящий и малотехнологичный.

Известен и принят нами за прототип способ получения наноразмерного амфотерицина В на носителе - желатине [Manoj Nahar, Dinesh Mishra, Vaibhav Dubey, Narendra Kumar Jain. Development, characterization, and toxicity evaluation of amphotericin B-loaded gelatin nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 4: 252-261 (2008)]. Наноразмерную смесь желатина и амфотерицина В получали следующим образом: 200 мг желатина растворяли в 10 мл дистиллированной воды при 40 градусах по Цельсию, затем добавляли 10 мл ацетона для осаждения высокомолекулярного желатина. Надосадочную жидкость удаляли, а оставшийся высокомолекулярный желатин повторно растворяли добавлением 10 мл дистиллированной воды при перемешивании со скоростью 600 оборотов в минуту при постоянном нагревании. При этом рН желатинового раствора регулировали в промежутке от 2 до 12. Растворенный в 500 мкл диметилсульфоксида амфотерицин В добавляли в водно-полимерную фазу, затем прибавляли 30 мл ацетона, далее прикалывали 25% водный раствор глутарового альдегида, действующий как сшивающий реагент.Раствор перемешивали 12 часов со скоростью 600 оборотов в минуту. Не связавшийся с желатином амфотерицин В удаляли, абсорбируя 10 мл амберлита XAD 16, с последующей фильтрацией (фильтр с размером пор 1-микрон; Whatman Japan KK, Tokyo, Japan). Диметилсульфоксид удаляли многократным промыванием дистиллированной водой. Полученный наноразмерный желатиново-амфотерициновый комплекс подвергали лиофилизации дисахаридом трегалозой (trehalose) с целью получения смеси, содержащей наноразмерные частицы для последующих исследований.

Способ достаточно трудоемкий и предусматривает получение наноразмерного амфотерицина В исключительно для инъекций, так как выделяют его в лиофилизованном виде.

Полученный по этому способу желатиново-амфотерициновый комплекс не может быть использован для нанесения на алюмосиликатные нанотрубки, поскольку значительное количество желатина будет сорбировано нанотрубками и комплекс распадется. Нанотрубки могут агрегировать в значительно более крупные образования при использовании желатина. Кроме того, нерастворимые алюмосиликатные нанотрубки (неорганические по своей природе) не могут быть подвергнуты лиофилизации трегалозой. Также, в случае очистки адсорбцией с участием амберлита значительная часть нанотрубок будет сорбирована.

Задачей настоящего изобретения является разработка удобного и простого в технологическом исполнении способа получения наноразмерного амфотерицина В нанесенного на твердый наноразмерный неактивный носитель с целью использования его в виде другой лекарственной формы, например, для приема внутрь в виде таблеток или для наружного применения и тем самым достичь более высокой биодоступности нерастворимого амфотерицина В, в сравнении с микроразмерными формами его использования.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом получения наноразмерного амфотерицина В с использованием раствора амфотерицина В в диметилсульфоксиде и неактивного носителя, отличительной особенностью которого является то, что в качестве неактивного носителя используют алюмосиликатные нанотрубки и процесс ведут путем смешения раствора амфотерицина В в диметилсульфоксиде при комнатной температуре с алюмосиликатными нанотрубками с последующим осаждением 1-20 мас.% амфотерицина В на алюмосиликатные нанотрубки путем обработки полученной смеси водой при интенсивном перемешивании и скорости подачи воды 10-20 мл/мин.

Алюмосиликатные нанотрубки представляют собой неорганический материал соответствующий по своему составу минералу каолинит Al₂O₃·2SiO₂·2H₂O. Внешний диаметр трубок 90-140 нм, внутренний диаметр 10-60 нм, длина 300-2000 нм; основной состав - оксид кремния (43,13%) и оксид алюминия (34,37%). Предлагаемый способ основан на приготовлении истинного раствора амфотерицина В в присутствии нанотрубок, к которому, затем с равномерной скоростью при интенсивном перемешивании добавляют воду. В ходе прибавления воды образуется система растворителей, в которой амфотерицин В не растворим и осаждается на поверхность алюмосиликатных нанотрубок; после осаждения раствор центрифугируют, смесь воды с диметилсульфоксилом декантируют. Для удаления остатков диметилсульфоксида, полученный порошок смешивают с водой и центрифугируют, процедуру повторяют еще два раза. После чего, порошок нанотрубок с нанесенным амфотерицином В сушат в вакуумированном эксикаторе для удаления остатков воды.

На Фиг.1. показаны исходные алюмосиликатные нанотрубки.

На Фиг.2. показаны алюмосиликатные нанотрубки с нанесенным 10% массовым количеством амфотерицина В.

Технический результат - предлагаемый способ прост и удобен в технологическом исполнении и позволяет получать принципиально новую лекарственную форму амфотерицина В, представляющую собой амфотерицин В, нанесенный на твердые неорганические структуры -алюмосиликатные нанотрубки, что позволит в дальнейшем разрабатывать новые мази, гели и болтанки для лечения грибковых заболеваний. Применение наноразмерного носителя способствует равномерному распределению амфотерицина В, а алюмосиликатный тип носителя - хороший сорбент - обеспечивает пролонгированное действие амфотерицина В, при этом носитель (наноразмерные трубки) не разрушается, а также позволяет достичь более высокой биодоступности нерастворимого амфотерицина В, в сравнении с микроразмерными формами его использования.

Изобретение соответствует критерию «новизна», так как в известной научно-технической и патентной литературе отсутствует полная совокупность признаков, характеризующих предлагаемое изобретение.

Из литературы известно, что алюмосиликатные нанотрубки могут являться носителем для органических веществ, в том числе и биологически активных [D. Shchukin, R. Price, G. Sukhorukov, Y. Lvov, Halloysite Nanotubes as Biomimetic Nanoreactors. Small, 1, 510-513 (2005); M. Zhi, W. Jinye, G. Xiang, D. Tong, Q. Yongning. Application of Halloysite Nanotubes Progress in Chemistry, 24: 275-283 (2012)]. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как до настоящего времени амфотерицин В не наносили на алюмосиликатные нанотрубки и не использовали сорастворитель для осаждения амфотерицина В на неорганический носитель и, главное, было неочевидно, что амфотерицин В осядет именно на нанотрубки, а не на стенки реакционного сосуда или выпадет в осадок в не связанном с нанотрубками виде.

Изобретение соответствует условию «промышленная применимость», поскольку амфотерицин В широко используется для лечения грибковых заболеваний. Создание носителей и лекарственных форм с его использованием является решением ключевой проблемы применения этого труднорастворимого лекарственного вещества. Применение амфотерицина В нанесенного на нанотрубки, полученного по предлагаемому способу, позволит разрабатывать новые таблетки, мази, гели и болтанки для лечения грибковых заболеваний.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем.

Пример 1.

К раствору амфотерицина В (0,6 г) в диметилсульфоксиде (50 мл) при перемешивании и температуре 18-20°С прибавляли алюмосиликатные нанотрубки (5 г), перемешивали в течение 15 минут. К полученной смеси добавляли с равномерной скоростью при интенсивном перемешивании 100 мл дистиллированной воды в течение 10 минут.Перемешивание останавливали, с осадка декантировали 120 мл жидкости, добавляли 100 мл воды, взбалтывали, центрифугировали, декантировали 100 мл жидкости. Процедуру повторяли еще два раза. Смесь центрифугировали, декантировали всю жидкую фазу. Осадок сушили в вакуумированном (5-10 мм рт.ст.) эксикаторе при комнатной температуре в течение двух суток. Получали 5,2 г порошка, который анализировали с использованием элементного анализа, содержание углерода соответствовало десятипроцентному массовому количеству амфотерицина В в смеси. Сравнение фотографий, сделанных на электронном микроскопе, для исходных алюмосиликатных нанотрубок (фиг.1) и для конечной смеси (фиг.2), показало, что амфотерицин В сорбирован нанотрубками.

Пример 2.

К раствору амфотерицина В (1,2 г) в диметилсульфоксиде (100 мл) при перемешивании и температуре 25°С прибавляли алюмосиликатные нанотрубки (10 г), перемешивали в течение 15 минут. К полученной смеси добавляли с равномерной скоростью при интенсивном перемешивании 200 мл дистиллированной воды в течение 10 минут. Перемешивание останавливали, с осадка декантировали 240 мл жидкости, добавляли 200 мл воды, взбалтывали, центрифугировали, декантировали 200 мл жидкости. Процедуру повторяли еще два раза. Смесь центрифугировали, декантировали всю жидкую фазу. Осадок сушили в вакуумированном (5-10 мм рт.ст.) эксикаторе при комнатной температуре в течение двух суток. Получали 10,4 г порошка, который анализировали с использованием элементного анализа, содержание углерода соответствовало десяти процентному массовому количеству амфотерицина В в смеси.

Пример 3.

К раствору амфотерицина В (2,5 г) в диметилсульфоксиде (100 мл) при перемешивании и температуре 25°С прибавляли алюмосиликатные нанотрубки (10 г), перемешивали в течение 15 минут. К полученной смеси добавляли с равномерной скоростью при интенсивном перемешивании 200 мл дистиллированной воды в течение 10 минут. Перемешивание останавливали, с осадка декантировали 240 мл жидкости, добавляли 200 мл воды, взбалтывали, центрифугировали, декантировали 200 мл жидкости. Процедуру повторяли еще два раза. Смесь центрифугировали, декантировали всю жидкую фазу. Осадок сушили в вакуумированном (5-10 мм рт.ст.) эксикаторе при комнатной температуре в течение двух суток. Получали 12 г порошка, который анализировали с использованием элементного анализа, содержание углерода соответствовало двадцати процентному массовому количеству амфотерицина В в смеси.

Пример 4.

К раствору амфотерицина В (0,2 г) в диметилсульфоксиде (100 мл) при перемешивании и температуре 25°С прибавляли алюмосиликатные нанотрубки (10 г), перемешивали в течение 15 минут. К полученной смеси добавляли с равномерной скоростью при интенсивном перемешивании 200 мл дистиллированной воды в течение 10 минут. Перемешивание останавливали, с осадка декантировали 240 мл жидкости, добавляли 200 мл воды, взбалтывали, центрифугировали, декантировали 200 мл жидкости. Процедуру повторяли еще два раза. Смесь центрифугировали, декантировали всю жидкую фазу. Осадок сушили в вакуумированном (5-10 мм рт.ст.) эксикаторе при комнатной температуре в течение двух суток. Получали 9,6 г порошка, который анализировали с использованием элементного анализа, содержание углерода соответствовало одно процентному массовому количеству амфотерицина В в смеси.

Настоящее изобретение относится к области медицины, фармацевтике и нанотехнологиям и, конкретно, к способу получения наноразмерного, нанесенного на алюмосиликатные нанотрубки, амфотерицина В - малорастворимого полиенового макроциклического антибиотика, который широко используется для лечения грибковых заболеваний. Предложен способ получения наноразмерного амфотерицина В путем смешения раствора амфотерицина В в диметилсульфоксиде при комнатной температуре с алюмосиликатными нанотрубками с последующим осаждением 1-20 мас.% амфотерицина В на алюмосиликатные нанотрубки путем обработки полученной смеси водой при интенсивном перемешивании и скорости подачи воды 10 мл/мин. Технический результат - предлагаемый способ прост и удобен в технологическом исполнении и позволяет получать принципиально новую лекарственную форму амфотерицина В, представляющую собой амфотерицин В, нанесенный на твердые неорганические структуры - алюмосиликатные нанотрубки, что позволит в дальнейшем разрабатывать новые мази, гели и болтанки для лечения грибковых заболеваний. Применение наноразмерного носителя способствует равномерному распределению амфотерицина В, а алюмосиликатный тип носителя - хороший сорбент - обеспечивает пролонгированное действие амфотерицина В, при этом носитель (наноразмерные трубки) не разрушается, а также позволяет достичь более высокой биодоступности нерастворимого амфотерицина В, в сравнении с микроразмерными формами его использования. 4 пр., 2 ил.

Способ получения наноразмерного амфотерицина В с использованием раствора амфотерицина В в диметилсульфоксиде и неактивного носителя, отличающаяся тем, что в качестве неактивного носителя используют алюмосиликатные нанотрубки и процесс ведут путем смешения раствора амфотерицина В в диметилсульфоксиде при комнатной температуре с алюмосиликатными нанотрубками с последующим осаждением 1-20 мас.% амфотерицина В на алюмосиликатные нанотрубки путем обработки полученной смеси водой при интенсивном перемешивании и скорости подачи воды 10 мл/мин.