Изобретение относится к области логических элементов, а именно логических элементов на основе биомолекул. Изобретение позволяет выполнять преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции. Так, в зависимости от выходного воздействия предложенный комплекс логического элемента может быть использован как для вычислительных целей, так и для различных биомедицинских применений, например для диагностики или терапии заболеваний, направленной доставки вещества к клеткам-мишеням и т.п.
Биологические вычислительные системы представляют большой интерес, как для вычислительной техники, так и для различных областей медицины и биологии. С точки зрения вычислительной техники, эффективность биологических вычислительных систем может быть выше по сравнению с традиционными вычислительными системами за счет возможности реализации не только бинарной, но и многозначной логики (так, например, если переменной является олигонуклеотид, состоящий из 20 оснований, то его многозначность может достигать 420, что соответствует около 1012 разрядам). Кроме того, вычислительная система, способная оперировать с этими олигонуклеотидами, находящимися в одном растворе, по сути, является квантовым компьютером. На данный момент вычислительные системы на основе олигонуклеотидов только начинают развиваться. В других областях, таких как медицина, требуются вычислительные системы иного рода. Например, были бы чрезвычайно полезны системы, состоящие из вычислительного модуля, который бы регистрировал присутствие или отсутствие различных сигналов от окружающей среды, а также из действующего модуля, который, в зависимости от результата работы вычислительного модуля мог бы совершать то или иное биологически-осмысленное воздействие, например, убивать раковую клетку в организме. Такие системы требуют передачи информации между вычислительным и действующим модулями. Понятно, что чем больше спектр возможных сигналов вычислительной системы и больше спектр воздействий действующего модуля, тем лучше. Такие воздействия необязательно должны быть обусловлены присутствием каких-либо молекул - это может быть электромагнитное излучение (в т.ч. свет и низкочастотное поле), изменение рН, температура и т.д.
Существуют и широко распространены биологические вычислительные системы, способные выполнять вышеупомянутые функции при единственном условии относительно одного «входного сигнала», например «убить клетку, если она несет на своей поверхности определенный маркер» (например, такой системой может быть антитело с радиоактивным изотопом). Кроме того, существуют системы, которые воспринимают два воздействия в качестве входных параметров, например, «убить клетку, если в среде пониженный рН и клетка несет на своей поверхности определенный маркер». Однако такие многовходные системы не могут быть легко перестроены для выполнения любой заданной функции от значений переменных. Так, упомянутые системы не могут быть легко перестроены на выполнение отрицания входного сигнала или своего выходного воздействия; «убить клетку, если она НЕ несет на своей поверхности определенный маркер» или «НЕ убивать клетку, если она несет на своей поверхности определенный маркер» (хотя с точки зрения математической логики эти выражения тождественны, с биологической они могут отличаться,, т.к. убийство клетки носит статистически-количественный характер, а не бинарно-качественный - убить/не убить, и вышеупомянутые функции могут существенно различаться нелинейностью воздействия в зависимости от наличия маркера).
Известен способ (Патент США 7,745,594 В2, выдан 29 июня 2010 г.), в котором логический элемент представляет собой набор олигонуклеотидов, в котором логические операции совершаются над входными олигонуклеотидами за счет миграции ветви (branch migration) ДНК в составе логического элемента. С помощью различных комбинаций олигонуклеотидов различного строения реализуются различные логические функции.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных элементов могут быть использованы только олигонуклеотиды или их варианты. Данный подход не применим к молекулам другой природы, например углеводам, белкам, низкомолекулярным органическим соединениям и т.п.
2) Время передачи сигнала чрезвычайно велико за счет низкой скорости вытеснения одним олигонуклеотидом другого.
3) Выходным сигналом может быть только высвобождение из комплекса логического элемента олигонуклеотида.
Известен способ (заявка на патент WO 2011116151 (А2) от 22 сентября 2011 г.), в котором используют набор ферментов для проведения биокатализируемой реакции, представляющей собой логическую булеву функцию от полученных «входных» сигналов биомаркеров. При этом генерируется бинарный выходной сигнал, причем сигнал, равный единице означает наличие заболевания или травмы.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных сигналов могут быть использованы только субстраты, кофакторы или продукты действия используемых ферментов. При этом количество комбинаций при использовании ферментов сильно ограничено.
2) В качестве основы логического элемента используют ферменты, множество которых весьма ограниченно.
Известен наиболее близкий к заявляемому способ (Nanoparticle Self-Assembly Gated by Logical Proteolytic Triggers, G. von Maltzahn, et al., J Am Chem Soc, 2009), в котором две частицы собираются друг с другом при разрывании ферментом связи между частицей и полиэтиленгликолем, маскирующим нейтравидин на одной частице и биотин на другой.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных сигналов используются ферменты.
2) Связь между частицами и маскирующим полиэтиленгликолем ковалентная.
3) Возможна реализация только логических функций И, ИЛИ.
4) Выходной сигнал логического элемента ограничен состояниями агрегации частиц (значение логической функции - ИСТИНА) и их коллоидно-стабильным состоянием (значение функции -ЛОЖЬ).
Таким образом, требуемый технический результат состоит в создании логического элемента, для которого множество входных сигналов и выходных воздействий могло бы быть практически неограниченным и такие сигналы и воздействия могли бы быть разнообразными по своей природе, и кроме того, было бы возможна реализация большого диапазона логических функций над одними и теми же входными сигналами.
Для достижения указанного технического результата предложен комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
A) агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2,
Б) блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия и способной связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 2 упомянутого агента, причем так, что связь упомянутой блокируемой метки с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента определяется, по крайней мере, одним из входных сигналов,
B) блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка, при соответствующих входных сигналах связанная с упомянутым агентом, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
Кроме того, комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
А) агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия,
Б) блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия,
причем упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом и упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем объект отличен от агента или схожего с агентом аналога.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, по крайней мере, один из упомянутых агента или блокирующего вещества представляет собой магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором блокируемая метка - фермент.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое блокирование упомянутой блокируемой метки приводит к подавлению (ослаблению), по крайней мере частичному, упомянутого выходного воздействия.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, по крайней мере, одна из упомянутых зависимостей связывания блокирующего вещества или блокируемой метки и агента от входного сигнала, характеризующегося молекулярной природой, обуславливается тем, что в цепочке связей между упомянутым агентом и упомянутой блокируемой меткой (блокирующим веществом) присутствует связь «рецептор к упомянутому входному сигналу - упомянутый входной сигнал или его аналог».
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутое выходное воздействие производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.), для чего жидкая среда, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по упомянутой твердой фазе или инкубируется в контакте с ней, и упомянутое выходное воздействие определяется количеством связанных с упомянутой дополнительной твердой фазой агентов.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие заключается, по крайней мере, в произведении детектируемого сигнала.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vitro.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vivo.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором выходное воздействие позволяет терапевтически влиять на здоровье или состояние субъекта.
Кроме того, комплекс логического элемента, на основе которого построен фармацевтический препарат.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, по крайней мере, часть упомянутых входных сигналов, определяется состоянием субъекта.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, в котором блокируемая метка - рецептор (антитело к маркеру на мембране клетки, сигнальный пептид ядерной локализации и т.п.) для направленной доставки вещества в необходимую область организма, клетки и т.п.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором выходное воздействие заключается в создании молекул для улучшения здоровья субъекта или диагностики его состояния.
Кроме того, комплекс логического элемента, выполненный предназначенным для введения субъекту (внутривенно, подкожно, и т.п.) для терапии заболевания или диагностики состояния.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором выходное воздействие заключается в доставке вещества к клеткам-мишеням.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, которое не приводит к специфическому связыванию двух агентов.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы (в том числе с поверхностью клеток), не включающими те, которые находятся на других агентах, идентичных или подобных упомянутому (имеющие другие блокируемые метки и/или связующие рецепторы).
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутый объект выбирают отличный от агента и не аналогичный агенту, и на создание упомянутого выходного воздействия существенно влияет количество взаимодействий «блокируемая метка-упомянутый объект», и не существенно влияет то, взаимодействует ли с каждым упомянутым объектом несколько агентов или только один.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие не зависит существенным образом от агрегации агентов друг с другом.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором участие упомянутой блокируемой метки в произведении упомянутого выходного воздействия заключается во взаимодействии с объектом, причем упомянутый объект выбирается отличным от агента и не аналогичным агенту, и на создание упомянутого выходного воздействия существенно влияет количество взаимодействий «блокируемая метка -упомянутый объект», но несущественно влияет то, взаимодействует ли с каждым упомянутым объектом несколько агентов или только один (когда в качестве упомянутого объекта выбрана молекула или частица, а не поверхность твердой фазы и не поверхность клетки).
Все варианты реализации изобретения, приводимые ниже, описаны лишь для иллюстрации многообразия возможных вариантов изобретения, а не для ограничения.
Упомянутым агентом может быть любая молекула, нано- или микро-частица, или поверхность твердой фазы, с которой любым способом можно соединить другие молекулы. Так, например, это может быть молекула белка, гликопротеина, нано- или микро-частица - магнитная, золотая, полимерная, кристаллическая, белковая и т.п.В качестве поверхности твердой фазы может быть использована любая стандартная поверхность, используемая в лабораторной практике, например пластиковые планшеты для проведения иммуноферментного иммуноанализа или иммунохроматографические тест-полоски, или пластиковые пробирки.
Входным сигналом, влияющим на связь блокирующего вещества и связующего рецептора 1 агента, могут быть различные по своей природе воздействия. Кроме того, в одном воплощении изобретения те же воздействия могут влиять на подобные связи блокируемой метки и связующего рецептора 2 агента.
Так, например, входной сигнал может быть электромагнитным излучением (например, свет), и связь между блокирующим веществом и связующим рецептором 1 может разрушаться (или, наоборот, образовываться) под воздействием этого излучения. При этом интенсивность, при которой большая часть упомянутых связей разрушается, может быть принята за значение переменной, равное 1, а меньшая интенсивность - равное 0. Кроме того, в случае если данная связь разрушается под действием излучения определенной частоты, то тогда лучше говорить о самой связи как о бинарной переменной (связь есть или ее нет - 1 или 0) или считать, что излучение может принимать не только бинарное значение, но и многозначное, например как функцию интенсивности от частоты). Кроме того, можно говорить и о более сложных ситуациях, когда используются сложные оптические эффекты, например, двухфотонное поглощение и подобные, когда появляется дополнительный параметр. Понятно, что такие случаи лишь расширяют возможности системы.
Если входной сигнал - значение рН или температуры, то различные лабильные связи могут быть разорваны при различных рН или температурах, при этом опять же имеет больший смысл говорить о значение переменной относящийся к связи, а не воздействию. С другой стороны, рН и температура имеют лишь одно измерение параметра в отличие от электромагнитного излучения, которое, как указано выше, имеет два параметра - интенсивность и частоту. Исходя из этого, переменные, соответствующие связям, не будут линейно независимы. При этом в определенных случаях удобнее считать рН и температуру не бинарной переменной, а многозначной.
Кроме того, входным сигналом может быть частица, молекула, ион или атом, которые либо способствуют образованию какой-либо связи (в т.ч. опосредуют ее), либо разрушают какую-либо связь, например, связь упомянутого связующего рецептора 1 и упомянутого блокирующего вещества или связь упомянутого связующего рецептора 2 и упомянутой блокируемой метки.
Связующим рецептором может быть, например, любой атом или молекула, имеющая комплементарную ей молекулу (лиганд). При этом парой «связующий рецептор - лиганд» может быть любая пара специфически взаимодействующих молекул. В качестве примера, но не органичения, можно привести следующие пары: антиген-антитело, олигонуклеотид-олигонуклеотид, лектин-углевод, лектин-гликопротеин, стрептавидин-биотин, протеин А-иммуноглобулин, фермент-субстрат, фермент-активатор-зимоген и пр. В приведенных парах лигандом или рецептором, в рамках данного описания, можно считать как первую часть, так и вторую, т.е. например, лиганд может быть антителом, а рецептор - антигеном к упомянутому антителу, лиганд может быть пектином, а рецептор к нему - соответствующим углеводом и т.п. В понятии лиганда для удобства описания подразумевается как сам лиганд, так и его аналоги, т.е. любые молекулы или молекулярные комплексы, и частицы, часть которых гомологична лиганду, в том числе комплексы молекул. Например, понятие "рецептор к лиганду" включает в себя понятие рецептор к аналогу лиганда. В одном из воплощений изобретения лиганд связующего рецептора 1 при этом может выполнять роль входного сигнала, конкурируя с блокирующим веществом за связывание со связующим рецептором 1 (в формате либо вытеснения блокирующего вещества из связи со связующим рецептором 1, либо ингибирования связующего рецептора 1 или блокирующего вещества, чтобы блокирующее вещество не могло связаться со связующим рецептором 1) или осуществляя связь блокирующего вещества со связующим рецептором 1.
Однако для определенной связи входной сигнал может не совпадать с лигандом (или его аналогом) или связующим рецептором 1, например в случае, если связующий рецептор 1 - никель-нитрилотриускусная кислота (или просто ион никеля, координационно связанный с агентом), а блокирующее вещество связывается с ним за счет полигистидиновой метки, то входным сигналом может быть, например, ион никеля или этилендиаминтетрауксусная кислота, вытесняющее блокирующее вещество из связи со связующий рецептором 1.
Кроме того, например, если связующий рецептор 1 - металлозависимый рецептор (например, конканавалин А, которому для связывания глюкозы требуются двухвалентные ионы), а блокирующее вещество несет на себе остатки глюкозы, то входным сигналом может быть этилендиаминтетрауксусная кислота, которая лишит конканавалин ионов металлов, за счет чего связь будет разорвана.
Как отмечалось выше, связь между связующим рецептором 1 и блокирующим веществом может быть и не основана на специфическом молекулярном взаимодействии. Это может быть любая связь, которая может быть либо образована, либо разрушена с помощью внешнего воздействия, примером которого являются электромагнитное излучение (например, фотоактивируемые кросс-сшивающие реакции), рН, температура, ферментативная реакция (сшивание различными ферментами, например, лигазами) и т.п. При этом само воздействие будет являться входным сигналом.
Кроме того, в одном воплощении изобретения упомянутый входной сигнал может разрушать, запрещать или опосредовать не только связь связующего рецептора 1 агента с блокирующим веществом, но и связь связующего рецептора 2 агента с блокируемой меткой так же, как описано выше. Необходимо заметить, что в приводимом ниже описании, иногда для удобства изложения будет упоминаться только связывание связующего рецептора 1 с блокирующим веществом, однако, где уместно, сказанное может также касаться связывания связующего рецептора 2 с блокируемой меткой.
Блокируемой меткой может быть любой атом, молекула или частица, пространственное или пространственно-электростатическое блокирование которой изменяет выходное воздействие. Примером блокируемой метки может служить любая детектируемая метка; флуоресцентная (в т.ч. атомарная или ионная), радиоактивная, магнитная, обладающая поверхностным плазменным резонансом и т.п. В случае флуоресцентной метки ее пространственная заблокированность может заключаться в невозможности тушителя флуоресценции подойти достаточно близко к флуорофору для его тушения или же, наоборот, Блокируемая метка может быть тушителем флуоресценции, а его блокировка может заключаться в невозможности флуорофора подойти к тушителю. Кроме того, блокируемая метка может быть одним флуорофором (или рецептором, меченным таким флуорофором) из пары флуорофоров, между которыми возможен Ферстеровский резонансный перенос энергии. При этом блокировка будет заключаться в невозможности компонентов этой пары сблизиться друг с другом. Кроме того, это может быть фермент, действие которого может быть детектировано. Например, это может быть фермент, в результате работы которого неокрашенный субстрат превращается в окрашенный продукт или нефлуоресцентный субстрат - во флуоресцирующий продукт. Кроме того, это также может быть фермент, запускающий каскадную реакцию, например, его субстратом является зимогенная форма другого фермента, который, будучи активированным, уже производит детектируемый сигнал в результате своей работы и т.п. Кроме того, блокируемая метка может быть любым рецептором, способным связать другую молекулу, причем такую, что факт связывания с этой молекулой может быть зарегистрирован. Например, упомянутая молекула может быть одной из вышеупомянутых детектируемых меток. Кроме того, например, эта молекула может быть иммобилизована на какой-либо поверхности или частице (например, на пластиковом планшете или иммунохроматографической тест-полоске), при этом детекция связывания упомянутой молекулы и блокируемой метки происходит за счет маркера, связанного с блокируемой меткой. В случае иммунохроматографической тест-полоски таким маркером это может быть, например, окрашенная полимерная частица, магнитная или золотая частица. В случае планшета удобным маркером также может быть, например, ферментная или флуоресцентная метка. Кроме того роль такого маркера может выполнять, в том числе, упомянутый агент или упомянутые молекулы на агенте, или молекулы в составе агента).
Кроме того, блокируемая метка может представлять собой несколько разных по своей природе меток, например, из тех, что упомянуты выше. При этом комбинированный сигнал от разных меток может изменять параметры выходного воздействия, например, повышая чувствительность или расширяя динамический рабочий диапазон действия входного сигнала. Приведенные примеры даны лишь для иллюстрации возможной природы блокируемой метки, а не для ограничения вариантов блокируемой метки.
Кроме того, блокируемая метка может создавать выходное воздействие не только заключающееся в создании детектируемого сигнала.
Выходным воздействием может быть любое изменение состояние системы или ее части, в том смысле, что можно отличить состояние системы без воздействия и при воздействии. Примером выходного воздействия может служить, изменение флуоресценции системы, радиоактивности, магнитных свойств системы и т.п.Причем появление радиоактивности может быть осуществлено, например, следующим образом. Пусть блокируемой меткой служит антитело. При разблокировании такой блокируемой метки она может связать радиоактивно-меченный антиген. При отмытии несвязавшегося антигена в системе остается радиоактивность. В случае если антитело не может связать антиген (воздействие заблокировано), после отмытия несвязавшегося антигена радиоактивности в образце будет существенно меньше (за счет недоотмытого антигена).
В одном воплощении метода выходным воздействием может быть любой детектируемый сигнал, создаваемый незаблокированной блокируемой меткой, и не создаваемый (или создаваемый в меньшей степени) заблокированной блокируемой меткой сигнал может детектироваться качественно (есть/нет) или измерен количественно, а затем соотнесен со значением логической функции. Детекция может быть осуществлена любым известным способом: оптическими средствами измерения, магнитными, электрохимическими и т.д.
В одном из воплощений метода выходное воздействие может определяться взаимодействием блокируемой метки с лигандом, иммобилизованным на твердой фазе, например, на иммунохроматографической полоске или планшете иммуноферментного анализа. При этом после добавления к комплексу логического элемента входных сигналов и ожидания нужного времени для срабатывания логического элемента, смесь, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по тест-полоске (как в стандартном методе иммунохроматографии) или инкубируется в планшете. Далее сигнал, пропорциональный количеству задержавшихся на твердой фазе агентов, т.е. агентов, провзаимодействовавших с иммобилизованным лигандом, считывается любым известным способом: либо по оптическому сигналу комплекса логического элемента, либо по магнитному сигналу или же биохимически проявляется (например, с помощью ферментативной реакции) за счет иных рецепторов, которые на себе несет агент.
Кроме того, в случае, когда блокируемая метка связывается с агентом посредством связующего рецептора 2 агента в зависимости от входного сигнала, а также, когда она ассоциирована с агентом без связующего рецептора 2, выходное взаимодействие может приводить к агрегации агентов. Например, в случае, когда к комплексу логического элемента добавляют вещество, взаимодействующее с незаблокированными, но присоединенными к агенту блокируемыми метками, таким образом, что с одной молекулой упомянутого вещества может связаться одновременно, по крайней мере, две блокируемые метки, принадлежащие различным агентам, то происходит агрегация агентов, которую можно детектировать любыми стандартными способами. Другой вариант реализуется следующим способом: используют, по крайней мере, два агента, причем блокируемая метка одного агента комплементарна блокируемой метке второго агента. При этом агрегацию частиц можно измерять любым известным способом: например турбодиметрически, по изменению характеристик плазменного резонанса в случае использования золотых наночастиц в качестве основы для одной или для обеих частиц, по изменению ЯМР-сигнала в случае использования магнитных частиц в качестве основы для одной или для обеих частиц и другими способами.
Однако агрегация агентов не всегда может быть полезным и достаточно чувствительным выходным воздействием. Когда необходимо произведения выходного воздействия, которое может быть зарегистрировано с высокой чувствительностью, выходное воздействие должно быть принципиально иным, нежели агрегация агентов. Так, в одном воплощении изобретения упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, который не приводит к связыванию двух агентов, т.е. не приводит к их агрегации. В другом воплощении метода, упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента за счет прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с упомянутым объектом, который не находится на другом агенте, причем побочное взаимодействие двух агентов с одним упомянутым объектом не вносит существенного вклада в выходное воздействие. Это значит, что в случае, например, связывания с блокируемой меткой (например анти-флуоресцеиновыми антителами) белка, меченного флуоресцеином, выходное воздействие будет обуславливаться флуоресценцией флуоресцеина на агенте. При добавлении не слишком больших избытков упомянутого белка, меченного флуоресцеином, может происходить незначительная агрегация агентов друг с другом, связанная с тем, что упомянутый белок, меченный флуоресцеином, может связаться более, чем с одним агентом. При этом в данном воплощении изобретения, выходное воздействие будет определяться возможностью упомянутого белка, меченного флуоресцеином, связаться с агентом и произвести флуоресцентный сигнал, например, после отмывания несвязавшихся с агентом молекул упомянутого белка, а не за счет агрегации агентов, хотя в данном случае возможна и несущественная агрегация агентов, приводящая к несущественному тушению флуоресценции. Так, например, в другом воплощении изобретения упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом. В другом воплощении изобретения упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем упомянутый объект отличен от агента или схожего с агентом аналога. Это значит, что указанное взаимодействие не подразумевает, что выходное воздействие определяется лишь агрегацией агентов друг с другом. Даже если агрегация и возникает, то выходное воздействие производится за счет другого феномена. Так, например, если блокируемая метка на агенте - поликлональное антитело против бычьего сывороточного альбумина (БСА), а упомянутый объект - бычий сывороточный альбумин, меченный флуоресцеином, то при разблокировании блокируемой метки на агенте, она будет связывать меченный флуоресцеином БСА из раствора. При этом т.к. блокируемая метка представляет из себя поликлональные антитела, то при малой концентрации меченного БСА, несколько агентов может связаться с одной молекулой меченного БСА, при этом может произойти частичная агрегация агентов. Однако в этом случае намного чувствительнее и легче, например, детектировать (если выходное воздействие должно произвести детектируемый сигнал) связавшийся с агентами флуоресцеин по его флуоресценции, нежели определять степень агрегации агентов. Кроме того, при добавлении существенного избытка меченного флуоресцеином БСА, специфическое связывание агентов посредством БСА не будет происходить, и следовательно, уменьшится степень агрегации агентов. В то же время флуоресцентный сигнал, будет все также пропорционален количеству разблокированных блокируемых меток, а не степени агрегации агентов. Необходимо заметить, что неспецифическая агрегация агентов может происходить и происходит практически в любом случае - при наличии входных сигналов или их отсутствии, поэтому не существует процессов, на которые абсолютно не влияет агрегация тех или иных веществ, участвующих в процессе. Кроме того, в вышеприведенном случае специфическая агрегация агентов за счет присоединения нескольких агентов к одной молекуле БСА может изменять флуоресцентный сигнал за счет, например, тушения флуоресценции. Однако если агрегация незначительна и БСА был добавлен в достаточном количестве, тушение флуоресценции будет лишь незначительно влиять на сигнал. В упомянутых случаях упомянутый объект, производящий выходное воздействие, может быть детектируемой меткой (флуоресцентной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом), прямо производящей выходное воздействие в виде детектируемого сигнала, кроме того он может быть, например, ферментной меткой производящей флуоресцирующие молекулы из не флуоресцирующих и т.п. При этом выходное воздействие должно производиться именно упомянутым объектом, а не быть обусловленным взаимодействием с агентом. Кроме того, в тех случаях, когда упомянутый объект изменяет выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, упомянутый объект может быть, например, тушителем флуоресценции блокируемой метки или ингибитором ферментной блокируемой метки. При этом выходное воздействие должно определяться именно блокируемой меткой, а не агентом (в отличие от случая определения агрегации носителей), а требование к упомянутому объекту быть отличным от агента или схожего с агентом аналога означает, что изменение выходного воздействия может быть достигнуто лишь за счет взаимодействия упомянутого объекта с блокируемой меткой безотносительно взаимодействия агентов друг с другом. Кроме того, схожий с агентом аналог подразумевает аналог устроенный подобно агенту, но имеющий другие связующие рецепторы, другие блокируемые метки или другие соответствующие им блокирующие вещества. Кроме того, в другом воплощении метода, когда блокируемая метка связывается с поверхностью твердой фазы агенты могут сами производить выходное воздействие, например, за счет того, что они могут быть зарегистрированы (в случае если они, например, являются окрашенными латексными частицами или золотыми, магнитными частицами, или с ними ассоциированы иные метки, например, ферментные) или могут быть, например, цитотоксичными при доставке в клетку, при этом специфическое связывание агентов с твердой фазой (в том числе с поверхностью клетки) не является как таковой их агрегацией. Хотя с единой твердой фазой и соединяется большое количество частиц, такое взаимодействие следует отнести к специфическому связыванию агентов с не аналогичными им объектами, нежели к агрегации агентов друг с другом в смысле агрегации аналогичных друг другу веществ. В другом воплощении метода, упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы, не включающими те, которые находятся на других агентах, идентичных или подобных упомянутому агенту, т.е. имеющие другие блокируемые метки и/или связующие рецепторы и/или соответствующие им блокирующие вещества.
Кроме того, выходное воздействие может заключаться в произведении, модификации, выводе из среды (в смысле трансформации в другие молекулы или сорбции) каких-либо молекул. Так, например, если блокируемая метка суть фермент, то, взаимодействуя со своим субстратом, она может либо модифицировать его, либо расщеплять и т.п. Кроме того, например, блокируемая метка может быть субстратом, взаимодействуя с которым, фермент будет производить или выводить из среды другие молекулы. Так, например, блокируемая метка может быть одноцепочечным олигонуклеотидом. При этом в состоянии блокировки доступ ДНК-полимеразы (например, иммобилизованной на наночастице) к такой блокируемой метке будет затруднен или невозможен. В случае же разблокирования можно провести полимеразноцепную реакцию (ПЦР) и произвести большое количество данного олигонуклеотида. В другом варианте, в заблокированном состоянии к олигонуклеотидной блокируемой метке не может подойти ДНКаза и не может отщепить часть этого олигонуклеотида, которая затем может быть амплифицирована за счет ПЦР.
В одном из воплощений метода за счет использования для пространственной или пространственно-электростатической блокировки блокирующего вещества и агента, превышающих размеры рецепторов, используемых в системе, а также за счет пространственного разнесения связующего рецептора и блокируемой метки на агенте возможно использовать в качестве блокируемых меток, в том числе, ферменты, способные деградировать рецепторы, посредством которых блокирующее вещество связывается с агентом. За счет использования агента, несущего на себе, например, белковый рецептор и блокируемую метку, представляющую собой протеазу, у протеазы практически нет возможности деградировать рецептор на других агентах из-за ограниченности диффузии, а также степеней свободы, т.е. возможности правильной пространственной ориентации рецептора относительно протеазы для его деградации. При этом протеаза может быть функциональной по отношению к малому молекулярному субстрату, обладающему быстрой диффузией и неограниченностью по всем степеням свободы. То же применимо и к другим ферментам - нуклеазам, гликозидазам и т.п. Например, в одном из воплощений метода на агенте иммобилизованы конканавалин А, связывающий терминальные остатки маннозы и глюкозы, и энтеропептидаза. При этом блокирующим веществом может быть кросс-сшитая пероксидаза хрена, хорошо связываемая конканавалином А и вытесняемая из данной связи глюкозой. В качестве субстрата может быть использован трипсиноген (в том числе иммобилизованный на наночастицах). При этом в случае блокировки взаимодействия энтеропептидазы и трипсиногена за счет связывания агента с блокирующим веществом (при низкой концентрации глюкозы) не происходит активация трипсиногена до трипсина. При повышении концентрации глюкозы происходит разблокировка энтеропептидазы, которая превращает трипсиноген в трипсин. Если в смеси присутствует прокарбоксипептидаза Б, происходит ее превращение трипсином в активный фермент карбоксипептидазу Б, которая совместно с трипсином способна энзиматически превращать проинсулин в активный инсулин (W. Kemmler, J.D. Peterson, D.F. Steiner, Studies on the conversion of proinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B, J. Biol. Chem. 246 (1971) 6786-6791). Таким образом можно добиться выработки инсулина из проинсулина при повышении концентрации глюкозы в среде, что может быть чрезвычайно эффективным лечением диабета.
Необходимо отметить, что, как правило, Блокируемая Метка в случае разблокированности и присутствии на Агенте должна произвести Выходное Воздействие, однако необходимо заметить, что за единицу (ИСТИНУ) значения упомянутых функции Комплекса Логического Элемента может приниматься и обратное - не произведение какого-либо Воздействия Блокируемой Меткой в случае разблокированности и нахождении на Агенте и произведении какого-либо Воздействия заблокированной Блокируемой Меткой или Меткой не связанной с Агентом.
Данное изобретение может также быть использовано для диагностических и/или терапевтических целей. В том числе для целей направленной доставки различных агентов к клеткам. При этом это могут быть клетки, выращиваемые in vitro в культуре, или клетки живого организма. Применение данного метода может быть, например, следующим. Пусть для иллюстративных целей требуется доставить магнитные наночастицы (МЧ) к опухолевым клеткам. Данные МЧ могут быть основой агента. Пусть они конъюгированы с двумя рецепторами: первый - блокируемая метка - представляет собой противоопухолевое антитело, имеющее специфичность к онкомаркерам на мембране клеток, например коммерческое антитело трастузумаб, второй связующий рецептор - рецептор к нетоксичному низкомолекулярному соединению (входной сигнал) - например конканавалин А - рецептор к глюкозе. В качестве блокирующего вещества может быть использована наночастица, представляющая кроссшитый белок, распознаваемый конканавалином А. Это может быть белок неживотного происхождения, например, пероксидаза хрена, но предпочтительнее использовать белок из того вида, для которого создается терапевтический или диагностический агент. Существенным преимуществом будет использование в качестве основы блокирующей компоненты белка, выделенного из крови непосредственно того организма, для которого создается агент. Это исключит иммуногенность введенного агента и минимизирует опсонизацию. Кроме того, в случае использования сильно сиалированного блокирующего вещества появляется возможность надежной маскировки агента от органов ретикуло-эндотелиальной системы, удаляющих чужеродные частицы из кровотока.
При смешивании МЧ, конъюгированных с упомянутыми рецепторами, с блокирующим веществом, будет получен собранный агент или комплекс логического элемента, который можно отделить от блокирующего вещества, не связавшегося с конъюгатами МЧ. Однако, не удаляя несвязавшуюся компоненту, можно повысить эффективность доставки агента к опухоли. При введении свободного блокирующего вещества в кровоток (возможно введение блокирующего вещества даже за некоторое время до самого комплекса логического элемента), фильтрующие системы организма (например, купферовские клетки) будут перегружены фильтрацией свободного блокирующего вещества и при введении комплекса логического элемента будут медленнее выводить его из кровотока, что увеличит время для распознавания блокируемой меткой своей мишени.
При введении комплекса логического элемента в организм человека блокируемая метка не будет сразу экспонирована на поверхности агента. Это позволяет избежать возможности опсонизации чужеродной блокируемой метки на агенте и позволит замаскировать поверхность самой частицы белком самого организма, что также ведет к снижению опсонизации. После того, как комплекс логического элемента равномерно распределился по кровотоку и по всему организму, необходимо поднять уровень входного сигнала, в данном примере - глюкозы. Это можно сделать прямой инъекцией глюкозы в кровоток либо перорально, т.е. дав пациенту съесть глюкозу, если это допускают фармакокинетические параметры комплекса логического элемента, т.е. если он циркулирует достаточно долго для усвоения глюкозы в желудке. При этом чем выше уровень глюкозы, тем быстрее произойдет диссоциация блокирующего вещества от МЧ и обнажение блокируемой метки, в данном случае, антитела, способного распознать онкомаркер на раковой клетке, и таким образом доставить МЧ к клетке-мишени. При таком варианте доставки частицы появляется возможность распределить частицы равномерно по кровотоку, пока они защищены белком организма от опсонизации и иммунного ответа, а затем уже «включить» их распознающую компоненту.
Кроме того, возможен случай, что входной сигнал может быть выбран таким образом, что его не надо будет вводить дополнительно в кровоток, а его концентрация в области, куда необходимо доставить агент будет повышена. Например, в очагах воспаления повышена концентрация хемоаттрактантов для привлечения нейтрофилов и моноцитов или рН ниже в области опухоли и т.п.
Кроме того, данный комплекс логического элемента может быть составлен многослойно. Так, например, в качестве первого «слоя» на МЧ могут быть иммобилизованы блокируемая метка и связующий рецептор 1А, связанный с блокирующим веществом А, которая блокирует блокируемую метку А. Такая наночастица может быть основой второго «слоя». Например, на упомянутом блокируемом веществе а иммобилизуют блокируемую метку Б и связующий рецептор 1Б, связанный с блокирующим веществом Б, которая блокирует блокируемую метку Б и т.п. (то же возможно при использовании связующего рецептора 2 для связывания блокируемой метки с агентом, МЧ). Такой вариант может быть использован, например, для последовательной доставки частицы по разным «вложенным» адресам - например, сначала к мембране специфической клетки, затем обеспечивая выход из лизосомы, затем в ядро. При этом «включение» соответствующих блокируемых меток может быть обеспечено различным биохимическим окружением в соответствующих областях (кровоток, лизосома, цитоплазма и т.п.).
За счет того, что комплекс логического элемента может воспринимать не только один входной сигнал, а, например, также «включать/выключать» блокируемые метки в случае присутствия определенных входных сигналов и в случае отсутствия других определенных входных сигналов, можно создать вещество, «включающее» свое действие только при определенном биохимическом «профиле» среды (т.е. определенном количественном соотношении различных молекул в среде). Это может быть полезно для диагностики и лечения сложных заболеваний, таких как рак, для которых на данный момент неизвестны единичные маркеры, высокоспецифичные для данного заболевания, но, в то же время, известны группы маркеров, по отсутствию части которых и присутствию другой части которых можно более точно поставить тот или иной диагноз. В таком случае вещество, способное одновременно почувствовать присутствие одних молекул и отсутствие других, обладает несомненным преимуществом перед современными методами направленной доставки, которые, как правило, оперируют лишь понятием наличия маркера заболевания.
Упомянутой блокируемой меткой может быть не только рецептор для направленной доставки, но и например, фермент, взаимодействие которого со своим субстратом заблокировано блокирующим веществом, или флуоресцентной меткой, которая заблокирована от взаимодействия с тушителем флуоресценции блокирующим веществом, или, наоборот, блокируемая метка может быть тушителем флуоресценции, взаимодействию которого с флуорофором стерически мешает блокирующее вещество.
Так, например, если блокируемая метка - фермент, например рицин (или цепь а рицина), то его цитотоксичность, определяемая расщеплением гликозидных связей в рибосоме, что блокирует синтез белка, может быть пространственно заблокирована блокирующим веществом, которая стерически не допустит подхода крупной рибосомы к рицину на агенте. Если же блокирующее вещество диссоциирует от агента, то рицин «включается» и убивает клетку-мишень. Кроме того, при использовании рицина, состоящего из ферментной части (цепь А) и лектиновой части (цепь Б), которая отвечает за проникновение рицина в цитозоль клетки и связывается с остатками галактозы и N-ацетилгалактозамина, можно в качестве связующего рецептора использовать непосредственно цепь Б самого рицина, а в качестве блокирующей компоненты - частицу, несущую на себе остатки галактозы и N-ацетилгалактозамина.
В качестве упомянутого блокирующего вещества может выступать один из входных сигналов (например, антитело против связующего рецептора 1), или же молекула, частица или поверхность, несущая на себе определенные рецепторы, которые прямо или косвенно связываются со связующим рецептором 1, причем один или несколько входных сигналов влияют на эту связь.
Кроме того, в роли блокирующего вещества может быть и любая другая молекула или частица, способная связываться со связующим рецептором 1 агента с помощью входного сигнала или сама по себе (в этом случае зависимость связи блокирующего вещества и агента от входного сигнала будет определяться тем, что входной сигнал может разрушать эту связь). Так, например, в случае использования молекулярного входного сигнала, блокирующее вещество может быть создано путем кросс-сшивания рецептора к входному сигналу или кросс-сшивания молекул самого входного сигнала или его аналога, а также за счет кросс-сшивания молекулы-носителя, несущего на себе молекулу входного сигнала (в случае низкомолекулярного входного сигнала). Причем, например, в случае, когда входной сигнал - углевод, например глюкоза или манноза, молекула-носитель может естественным образом нести на себе этот входной сигнал, например в случае гликопротеина пероксидазы хрена. Кроме того, входной сигнал может быть иммобилизован на молекуле-носителе искусственным образом, например, с помощью химической конъюгации, например, так же, как принято для иммобилизации гаптенов на белке-носителе для иммунизации животных и наработке антител против данного гаптена. Кроме того, входной сигнал или рецептор к нему могут быть конъюгированы с частицей, образованной кросс-сшиванием иной молекулы. Кросс-сшивание может быть произведено различными известными способами, например, гомобифункциональными кросс-линкерами (глютеральдегидом и т.п.), или гетеробифункциональными. Кроме того, на такой искусственной белковой частице могут быть образованы функциональные группы для удобной и быстрой конъюгации гаптенов, лигандов или рецепторов. Удобство использования такой частицы состоит в том, что, подбирая концентрации кросссшиваемой молекулы и кросссшивающего агента, можно получать частицы разного размера для оптимизации свойств их стерической блокировки поверхности агента. Дисперсию по размерам получаемых блокирующих частиц можно уменьшать, выделяя нужные по размеру фракции, используя гель-фильтрационное хроматографическое разделение кросс-сшитых молекул. При этом можно подбирать размер блокирующих частиц для оптимальной блокировки блокируемых меток. Кроме того, используя разные фракции частиц после гель-фильтрации кросссшитых молекул, можно стерически более полно блокировать блокируемые метки: сначала добавлять к агенту фракции с большими частицами, а затем с меньшими.
Кроме того, за счет использования агентов со многими связующими рецепторами 1 можно добиться, чтобы присоединение блокирующего вещества к агенту было одноточечным или многоточечным. Случай многоточечного связывания выгодно отличается тем, что возможно использовать низкоафинные рецепторы к входному сигналу или рецепторы, отличающиеся большой скоростью диссоциации комплекса с входным сигналом. При этом чувствительность логического элемента и скорость его работы будут выше, чем в случае высокоафинных рецепторов в случае добавлении входного сигнала к уже собранному комплексу частица-блокирующее вещество. За счет высокой скорости диссоциации пар рецептор-эпитоп блокирующего вещества, более вероятно вытеснение блокирующего вещества из взаимодействия при добавлении более низких концентраций свободного детектируемого входного сигнала. Тем не менее, за счет многоточечного связывания связь частицы и блокирующего вещества будет прочной в отсутствие свободного входного сигнала. Данный случай удобен, когда время работы логического элемента критично.
Надо заметить, что блокирующее вещество может взаимодействовать с агентом не только посредством взаимодействия через связующий рецептор 1. Так, например, за счет использования второй связи между агентом и блокирующим веществом можно реализовать многократно обратимую блокировку блокируемой метки на агенте. Если упомянутая вторая связь (ковалентная или нековалентная) происходит с использованием длинного линкера, то блокирующее вещество, например, при вытеснении свободным молекулярным входным сигналом отсоединяется от связующего рецептора 1 на агенте, и отходит на определенное длиной упомянутого линкера расстояние, тем самым разблокирует блокируемую метку для создания выходного воздействия. Когда концентрация входного сигнала в образце снижается, молекулы входного сигнала диссоциируют от связующего рецептора 1 на агенте, с которым теперь может опять соединиться блокирующее вещество и заблокировать блокируемую метку, а следовательно прекратить произведение выходного воздействия. Таким линкером могут быть различные молекулы, тем не менее, предпочтительнее использовать гидрофильные полимеры (полиэтиленгликоль, декстран и т.п.), не препятствующие, а наоборот стимулирующие, удаление блокирующего вещества от агента пока они не связаны через связующий рецептор 1 на агенте.
Способность блокирующего вещества связываться с агентом прямо или косвенно через связующий рецептор 1 на агенте подразумевает широкое разнообразие вариантов блокировки блокирующим веществом блокируемой метки на агенте. Так, например, блокирующее вещество может связываться со связующим рецептором 1 на агенте не напрямую, а через набор взаимодействующих друг с другом молекул, так, например, в случае использования в качестве связующего рецептора 1 мышиных антител против молекулярного входного сигнала, сначала может быть добавлен биотинилированный входной сигнал (или биотинилированный аналог входного сигнала, к которому упомянутое антитело имеет меньшее сродство так чтобы при добавлении входной сигнал с легкостью вытеснял упомянутый биотинилированный аналог), а затем блокирующее вещество, несущее на себе (стрепт)авидин. Это, например, может позволить использовать только один тип блокирующих веществ для многих входных сигналов.
Кроме того, может быть использована и многослойная блокировка, например, в том числе в вышеприведенном случае со стрептавидиновым блокирующим веществом могут быть использованы второе блокирующее вещество, несущее на себе крысиные анти-стрептавидиновые антитела, и третье блокирующее вещество, несущее на себе кроличьи анти-крысиные антитела и т.д. Понятно, что за счет использования такой многослойной блокировки степень блокирования может быть многократно усилена.
В одном из воплощений изобретения, неспецифическое связывание блокирующего вещества с агентом не ухудшает чувствительность комплекса логического элемента к входному сигналу. В известных методах детекции различных молекул, например, в иммуноферментном твердофазном анализе, неспецифическое связывание ферментной метки, взаимодействующей с иммуносендвичем, с твердой фазой планшета, приводит к повышению всех сигналов (для всех образцов), что ухудшает предел детекции метода. В предлагаемом изобретении, например, в воплощении, в котором блокируемая метка для произведения выходного воздействия связывается с молекулой, иммобилизованной на твердой фазе (например, на иммунохроматографической тест-полоске), неспецифическое связывание блокирующего вещества с агентом, наоборот, приводит к уменьшению сигнала, а не к его увеличению, что не приводит к ухудшению чувствительности ко входному сигналу. В одном из воплощений изобретения, неспецифическое связывание агентов с твердой фазой, опосредованное неспецифически связанным с агентом блокирующим веществом, как правило, не будет происходить, т.к. в основном с твердой фазой неспецифически будет связываться свободное блокирующее вещество, как правило, находящееся в смеси в существенно большем количестве, чем количество агентов. Кроме того, подобрав блокирующее вещество, обладающее минимальным неспецифическим связыванием с твердой фазой (но не обязательно с агентом), возможно свести вредные эффекты неспецифического связывания в системе практически к абсолютному минимуму. Для этого в одном из воплощений метода, выгодно использовать блокирующее вещество, созданное на основе сильно-гидрофильных незаряженных соединений, которые, как правило, обладают минимальным неспецифическим связыванием. Это, например, могут быть частицы, покрытые молекулами полиэтиленгликоля, или созданные с содержанием большого количества углеводов - например, на основе декстрана или гликопротеинов. Кроме того, в приведенных примерах, неспецифическое связывание за счет рецепторов на блокирующем веществе, прямо или косвенно распознающих связующий рецептор 1 на агенте, может не ухудшать предел детекции. Т.е. как было отмечено, такое неспецифическое связывание с агентом не повышает сигнал, и неспецифическое связывание свободного блокирующего вещества с твердой фазой также не повышает сигнал. Таким образом, в одном из воплощений метода, можно практически полностью не зависеть от неспецифического связывания блокирующего вещества с агентом, специфическая связь которых зависит от входного сигнала.
Чувствительность метода к входному сигналу (т.е. пороговая сила сигнала, когда его значение меняется с нуля до единицы) может быть сдвинута в нужный диапазон, например, концентрационный (в случае молекулярного входного сигнала) с помощью регулирования плотности, как правило, связующих рецепторов (1 или 2) на агенте, хотя вариант регулирования плотности блокируемой метки на агенте также реализуем. Например, возможен следующий вариант. В случае повышенных требований к чувствительности комплекса логического элемента (т.е. требования разрушения или образования связи между блокирующим веществом и агентом), преимущественнее использовать редкое расположение связующих рецепторов 1 на агенте, но так чтобы блокирующее вещество могло заблокировать блокируемые метки, связанные с агентом. При этом при добавлении малого количества молекул входного сигнала и ингибировании хотя бы одного связующего рецептора 1 на агенте, соответствующее блокирующее вещество не сможет присоединиться в этом месте к агенту, за счет чего останутся незаблокированными в этом месте агента блокируемые метки, которые могли бы, например, связаться с комплементарным лигандом, иммобилизованным на иммунохроматографической тест-полоске. В случае плотной посадки связующих рецепторов 1 на агенте, возможность не допустить связывания блокирующего вещества с агентом в определенном месте агента потребует большего количества молекул входного сигнала, во-первых, из-за большей концентрации связующих рецепторов, а во-вторых, из-за возможности многоточечного связывания блокирующего вещества и агента.
Кроме того, плотность блокирующих меток на агенте или количество связующих рецепторов 2, которые способны связать блокируемые метки определяет сложность полной блокировки блокируемых меток, соединенных с агентом, что также влияет на чувствительность комплекса логического элемента по отношению ко входному сигналу.
Чем дальше в пространстве разнесены связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2 (или блокируемая метка) на агенте, тем сложнее пространственно или пространственно-электростатически заблокировать блокируемую метку. При этом, например, в случае если в качестве блокирующего вещества выбран сам молекулярный входной сигнал, метод ограничен возможностью использования крайне больших по размерам входных сигналов. Тем не менее, при использовании дополнительного блокирующего вещества для блокировки блокируемой метки можно заблокировать блокируемые метки существенно удаленные от связующих рецепторов, причем удаление может быть порядка размеров блокирующего вещества. При этом учитывая, что блокирующее вещество может быть существенно больше, чем любые молекулярные рецепторы - вплоть до нескольких десятков микрон и более, данное изобретение никоим образом не ограничено размерами молекул входных сигналов или пространственным разнесением связующего рецептора 1 и связующего рецептора 2 (или блокируемой метки).
Изменение выходного воздействия зависит от связывания или не связывания блокирующего вещества с агентом. При этом входной сигнал может влиять на образование или разрушение связи блокирующего вещества и агента разными способами. Так, например, связывание блокирующего вещества со связующим рецептором на агенте может происходить, в том числе следующими двумя способами. В первом - упомянутая связь может осуществляться за счет распознавания связующим рецептором 1 молекул входного сигнала на блокирующем веществе или за счет распознавания молекул входного сигнала на другой молекуле, с которой прямо или косвенно связывается блокирующее вещество. При этом в данном случае входной сигнал конкурирует за связывание с упомянутым связующим рецептором 1, за счет чего количество связанного с агентом блокирующего вещества зависит от количества входного сигнала. Второй вариант реализуется иначе. Связывание блокирующего вещества со связующим рецептором 1 происходит за счет распознавания рецептором на блокирующем веществе связующего рецептора 1 на агенте или за счет связывания блокирующего вещества прямо или косвенно с рецептором, связавшимся со связующим рецептором. При этом связывание упомянутого рецептора на блокирующем веществе со связующим рецептором 1 становится затрудненным или невозможным в случае прямого или косвенного связывания связующего рецептора 1 с молекулами входного сигнала.
Пространственная или электростатически-пространственная блокировка блокируемой метки - затрудненность блокируемой метки взаимодействовать прямо или косвенно с определенными другими молекулами из-за стерических и/или электростатических факторов. Т.е. при таком блокировании за счет нахождения вблизи блокируемой метки блокирующего вещества, упомянутые определенные молекулы не могут приблизиться к блокируемой метке, за счет чего и происходит «блокировка». При этом невозможность приблизиться может быть обусловлена как объемом блокирующего вещества, так и ее сильным зарядом. Например, в случае одинакового знака заряда блокирующего вещества и упомянутых молекул, упомянутые молекулы будут отталкиваться от блокирующего вещества и не приблизятся к блокируемой метке. В случае же разных знаков зарядов упомянутые молекулы могут притягиваться к блокируемому веществу за счет чего их взаимодействие с блокируемой меткой будет конкурировать с притяжением к блокирующему веществу, и, следовательно, будет наблюдаться эффективная «блокировка».
Кроме того, улучшение блокировки может быть достигнуто следующим способом, если блокирующее вещество имеет в том числе слабое сродство к блокируемой метке, то по сравнению со случаем когда такого сродства нет, может быть достигнута существенно более сильная блокировка при отсутствии входного сигнала и несущественно измененная остаточная блокировка в присутствии входного сигнала и упомянутых молекул, взаимодействующих с блокируемой меткой.
Т.к. все обратимые биохимические реакции взаимодействия подразумевают наличие, как связанных молекул, так и свободных, то и все использованные выше понятия такие как «блокировка», «невозможность приближения» и т.п. имеются в виду в их статистическом смысле, т.е. например, о блокировке можно говорить и в том случае, если не все блокируемые метки «заблокированы», важно лишь то, что в случае блокировки «заблокированных меток» больше, чем «не заблокированных».
Кроме того, для простоты объяснения в примерах приводимых 6 данном описании полагается, что блокируемая метка должна быть одинакова для упомянутых агентов. Однако это необязательно - блокируемые метки могут быть и различными, при этом надо понимать, что понятие значения логической функции тогда стоит воспринимать в ином смысле, например, что оно равно единице (истине), в случае если хотя бы одна блокируемая метка произвела соответствующее ей выходное воздействие. Так, например, удобно использовать в качестве такого набора разных блокируемых меток различные олигонуклеотиды за счет большого многообразия специфически взиамодействующих пар. При этом можно не только получать интегральную информацию о значении функции комплекса логического элемента, но и подробную информацию о состоянии каждого агента в составе комплекса логического элемента.
В одном из воплощений изобретения выбирают агент, представляющий собой нано- или микрочастицу или поверхность твердой фазы и несущий на себе, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующий прямо или косвенно в произведении выходного воздействия, а также используется блокирующее вещество, способное связываться прямо или косвенно со связующим рецептором 1 на агенте. При этом, например, блокирующее вещество может связываться со связующим рецептором 1 из-за того, что она состоит из молекул входного сигнала или его аналога или несет на себе такие молекулы ил и аналогичные им. При этом расположение связующего рецептора 1 на таком агенте выгодно с той точки зрения, что при этом для недопущения блокировки блокируемых меток блокирующим веществом надо малое количество входного сигнала, в отличие от случая, когда на агенте находятся, напрмер, молекулы входного сигнала, а рецепторы к ним расположены на блокирующем веществе, т.к. в последнем случае самого блокирующего вещества и рецепторов к входному сигналу на них должно быть существенно больше, чем молекул входного сигнала на агенте.
Кроме того, блокирующее вещество может связываться со связующим рецептором 1 различными косвенными путями, например, оно может взаимодействовать с цепочкой молекул или частиц, одна из которых несет на себе или состоит из молекул входного сигнала, или же блокирующее вещество может нести на себе или состоять из рецептора к молекулам входного сигнала, тогда молекулы входного сигнала связываются со связующим рецептором 1 (тоже являющимся рецептором к молекулам входного сигнала) на агенте, а затем со связанными молекулами входного сигнала связывается упомянутое блокирующее вещество. Кроме того, в цепочке связей между агентом и блокирующим веществом могут участвовать различные другие молекулы, например, биотин-стрептавидин и т.п.
Кроме того, в одном из воплощений изобретения, используется агент, несущий на себе связующий рецептор 1 и блокируемую метку. Преимущества такого подхода заключаются, во-первых, в том, что такой агент-носитель одновременно несет большое количество связующих рецепторов 1, а также блокируемых меток, производящих выходное воздействие.
Во-вторых, использование такого агента, а не прямое соединение связующего рецептора 1 с блокируемой меткой позволяет пространственно разнести связующий рецептор 1 и блокируемую метку и, хотя это существенно усложняет блокировку, тем не менее, может помочь иммобилизовать большее количество блокируемых меток в активном состоянии. А именно, за счет того, что упомянутые связующие рецепторы 1 и блокируемые метки связаны не напрямую, они не блокируют и не нарушают активности друг друга. Т.е., например, при конъюгации большого количества флуорофоров с антителом (т.е. если блокируемая метка, флуорофор, напрямую конъюгирована со связующим рецептором 1, антителом) может происходить инсолюбилизация антитела за счет того, что большинство используемых флуорофоров плохо растворимы в воде. Кроме того, флуорофор обычно присоединяется химически, а потому хаотично, за счет чего часть флуорофора может присоединиться к распознающему участку антитела, что не позволит ему распознать лиганд, являющийся входным сигналом, и кроме того, при большом количестве флуорофора на антителе возникает перекрестное тушение флуорофора.
В-третьих, упомянутое пространственное разнесение связующего рецептора 1 и блокируемой метки, а также использование блокирующего вещества (а не самих молекул входных сигналов) для пространственной блокировки блокируемых меток, позволяет использовать в качестве связующего рецептора 1 и блокируемой метки молекулы или вещества практически любого размера - вплоть до нескольких микрометров и более. Кроме того, за счет использования больших агентов, существенно превышающих размер упомянутых молекул, появляется возможность принципиально иной (по сравнению со случаем, если связующий рецептор 1 напрямую связан с блокируемой меткой) пространственной или пространственно-блокировки блокируемых меток, а именно блокировки слоистого типа, в том числе многослойной с использованием нескольких типов блокирующих веществ). При этом можно сделать практически независимой эффективность блокировки блокируемых меток от их количества на агенте, т.е. эффективность будет блокировки зависеть лишь от количества связующих рецепторов 1 на агенте. Так, в случае наличия минимально достаточного количества связующих рецепторов 1 для образования «полного блокирующего слоя» все блокируемые метки на носителе будут заблокированы. В случае же прямого соединения (например, конъюгации) связующих рецепторов 1 и блокируемой метки эффективность блокировки существенно зависит от количественного соотношения этих веществ. Причем при большем количестве связующих рецепторов 1 эффективность блокировки выше, но при этом выходное воздействие от блокируемых меток слабее, что накладывает существенные ограничения на применимость изобретения.
В-четвертых, упомянутый агент позволяет использовать себя как твердую фазу, т.е. обеспечивает легкую сепарацию (например, если агент - магнитная нано- или микрочастица) и другие преимущества использования нано- и микрочастиц в качестве твердой фазы.
Кроме того, в одном из воплощений при использовании агента, несущего на себе, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующую прямо или косвенно в произведении выходного воздействия, пространственная или пространственно-электростатическая блокировка упомянутой блокируемой метки, приводящая к изменению упомянутого выходного воздействия может происходить за счет молекул входного сигнала, связывающихся со связующим рецептором 1. В таком случае блокирующей частицей является сам входной сигнал. В этом случае, также возможно вышеупомянутая «слоистая» блокировка со всеми вышеперечисленными преимуществами.
Кроме того, в одном из воплощений изобретения используют агент, имеющий, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующую прямо или косвенно в произведении выходного воздействия. Причем агент создается таким что упомянутое выходное воздействие производится в большей степени в случае не связывания блокирующего вещества и агента и производится в меньшей степени в случае связывания блокирующего вещества и агента. Обратный вариант также возможен.
Кроме того, в другом воплощении изобретения, любой входной сигнал влияющий на связь блокирующего вещества и агента не влияет на связь блокируемой метки и агента, и наоборот, любой входной сигнал влияющий на связь блокируемой метки и агента не влияет на связь блокирующего вещества и агента.
Наряду с простыми комлексами логических элементов в рамках данного изобретение возможно создание существенно более сложных комплексов логических элементов, а также соединение нескольких таких комплексов логических элементов в логические схемы.
Выходное воздействие одного комплекса логического элемента (КЛЭ) может являться входным сигналом для другого комплекса логического элемента, т.е. сигнал от одного агента может быть передан другому. Так, например, если выходное воздействие первого КЛЭ выражается произведением какой-либо молекулы - то, как уже было описано ранее, повышенная концентрация этой молекулы может, например, разрывать связь агента и блокирующего вещества второго КЛЭ. Таким образом, может осуществляться создание логической схемы, состоящей из нескольких КЛЭ, причем выходы одного КЛЭ могут быть входами других.
Кроме того, выходное воздействие КЛЭ может выражаться, например, произведением в том числе. молекул идентичных или аналогичных входному сигналу данного КЛЭ, за счет чего будет реализован КЛЭ соответствующий нелинейному КЛЭ, усилителю входного сигнала.
Кроме того, выходное воздействие КЛЭ может выражаться, например, произведением в том числе молекул ингибирующих, нейтрализующих или преобразующихвходной сигнал данного КЛЭ, за счет чего будет реализован КЛЭ соответствующий нелинейному КЛЭ, тушителю входного сигнала.
Кроме того, упомянутая схема, да и единичные КЛЭ, могут быть существенно усложнены за счет нескольких факторов:
1) у каждого КЛЭ может быть много различных выходов в том смысле, что «включенное» состояние может выражаться выходным воздействием, заключающемся в произведении нескольких разных молекул или иных воздействий. При этом каждая произведенная молекула или воздействие может быть входным сигналом для другого или этого же КЛЭ.
2) один и тот же КЛЭ может «включать» произведение различных молекул (или иных выходных воздействий) при количественно различной разблокированности блокируемой метки. Так, например, если произведение упомянутых молекул происходит за счет ферментных блокируемых меток, и процесс произведения упомянутых молекул заключается в деградации данными ферментами своих субстратов. При этом для разных ферментов (например, глюкозидаза и днказа) размеры субстратов могут быть существенно различными. За счет этого, можно реализовать вариант многозначной логики, в котором многозначность реализовывается переведением количественной степени заблокированности блокируемой метки в качественно разные выходные воздействия, например, «нет никакой модификации субстратов», «модификация только малого субстрата», «модификация малого и большого субстрата».
Работа предлагаемого Комплекса Логического элемента иллюстрируется чертежами фиг.1-3.
Список фигур чертежей.
Фиг.1. Комплекс логического элемента для реализации логической функции ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ.
Фиг.2. Комплекс логического элемента для реализации логической функции НЕ.
Фиг.3. Комплекс Логического Элемента для реализации логической функции (A&B&C&(HE i)&(HE ii)&(HE iii)) от переменных А, В, С, l, ii, iii.
ПРИМЕРЫ
Нижеприведенные примеры даны в качестве иллюстрации данного изобретения и не ограничивают его применения.
Варианты выполнения логических функций с помощью комплекса логического элемента (КЛЭ) разнообразны. Приведем различные примеры выполнения таких функций.
Пусть часть входных сигналов определяет связывание блокируемой метки с агентом, и, по крайней мере, другая часть определяет связывание блокирующего вещества с Агентом. Тогда можно реализовать набор функций ЗНАЧЕНИЕ ФУНКЦИИ, НЕ, И, ИЛИ - базис для выражения любой логической функции следующими вариантами.
Итак, рассмотрим два краевых варианта реализации логических функций с помощью изобретения: в первом - все входные сигналы разрывают какую-то связь, во втором - все входные сигналы опосредуют образование какую-то связь.
Пример 1. В данном примере используются входные сигналы, разрушающие какую-либо связь.
Реализация функции «ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ» осуществляется КЛЭ (Фиг.1), в котором со связующим рецептором 1 агента, несущего на себе связующий рецептор 1 и блокируемую метку, связано блокирующее вещество, причем связь блокирующего вещества и агента зависит от входного сигнала. В случае если входной сигнал способен разрывать упомянутую связь, то с помощью данного КЛЭ реализуется логическая функция «ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ». Действительно, если входной сигнал разрывает упомянутую связь, то блокируемая метка на агенте разблокируется и выходное воздействие производится.
Реализация функции «НЕ» осуществляется КЛЭ (Фиг.2), в котором агент, несущий на себе связующий рецептор 2, связан посредством связующего рецептора 2 с блокируемой меткой, это связь агента и блокируемой метки зависит от входного сигнала. В случае если входной сигнал разрывает упомянутую связь, то данный КЛЭ реализует логическую функцию «НЕ». Так, например, если входной сигнал разорвал упомянутую связь, то блокируемая метка диссоциирует от агента и на агенте нет активной блокируемой метки, способной произвести выходное воздействие (например, связать агент с поверхностью твердой фазы).
Реализация функции конъюнкция значений переменных (А И Б) осуществляется КЛЭ, в котором агент несет на себе одновременно набор связующих рецепторов для всех входных сигналов, при этом блокирующее вещество связано или способно связываться со всеми упомянутыми связующими рецепторами. При этом в случае если входные сигналы разрушают соответствующие связи связующего рецептора и блокирующего вещества, то при отсутствии хотя бы одного входного сигнала связывание агента и блокирующего вещества не будет нарушаться, при этом блокируемая метка будет заблокирована.
Реализация функции дизъюнкции значений переменных (А ИЛИ Б) осуществляется КЛЭ, включающим различные агенты для каждого входного сигнала, причем все агенты несут на себе одну и ту же блокируемую метку и каждый из которых несет на себе связующий рецептор 1 соответствующий только одному входному сигналу, при этом с каждым связующим рецептором 1 агента связано, по крайней мере, одно блокирующее вещество или набор блокирующих веществ, таких чтобы с каждым связующим рецептором могло связаться хотя бы одно блокирующее вещество. При этом в случае если входные сигналы, разрушают соответствующие связи связующего рецептора 1 и блокирующего вещества, то только при отсутствии всех входных сигналов связывание агентов и соответствующего блокирующего вещества не будет нарушаться, и блокируемая метка на всех агентах будет заблокирована. При этом в случае присутствии хотя бы одного входного сигнала, блокируемая метка на соответствующем ему агенте будет разблокирована и будет произведено выходное воздействие.
Реализация функции конъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» И «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором блокируемая метка связана со связующим рецептором 2 агента посредством набора последовательных связей, включающего связи, разрушаемые всеми входными сигналами, причем при разрушении любым из входных сигналов соответствующей ему связи, блокируемая метка диссоциирует от агента. Такой набор последовательных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связывается с молекулой 1, так что их связь разрушается входным сигналом 1, с упомянутой молекулой 1 связана молекула 2, несущая на себе блокируемую метку, причем связь молекулы 1 и молекулы 2 разрушается входным сигналом 2. В случае большего количества входных сигналов КЛЭ - используемый набор молекул 1, 2, …, n увеличивается, включая молекулы, связи которых с предыдущими разрушаются соответствующими входными сигналами. При этом молекула n несет на себе, в том числе блокируемую метку.
Реализация функции дизъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 агента посредством набора параллельных связей, разрушаемыми входными сигналами, причем при разрушении входным сигналом соответствующей ему связи, соответствующая блокируемая метка диссоциирует от агента. Такой набор параллельных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 1, кроме того, связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 2, и т.п.
Иная реализация функции дизъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором идентичные блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 набора различных агентов, однозначно соответствующих входным сигналам, посредством связей, разрушаемыми входными сигналами, причем при разрушении входным сигналом соответствующей ему связи, блокируемая метка диссоциирует от соответствующего агента. Такой набор связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента 1 связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 1; связующий рецептор 2 агента 2 связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 2, и т.п.
Пример 2. В данном примере используют входные сигналы, опосредующие какую-либо связь.
Реализация функции «ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ» осуществляется КЛЭ, в котором к агенту, несущему на себе связующий рецептор 2, но не активную блокируемую метку, посредством входного сигнала, присоединяющегося к связующему рецептору 2, присоединяется блокируемая метка. При этом агент начинает нести на себе активную блокируемую метку, способную произвести выходное воздействие.
Реализация функции «НЕ» осуществляется КЛЭ, в котором к агенту, несущему на себе связующий рецептор 1 и активную блокируемую метку, посредством входного сигнала, присоединяющегося к связующему рецептору 1, присоединяется блокирующее вещество, пространственно или пространственно-электростатически блокирующее блокируемую метку, так что она не может произвести выходное воздействие.
Реализация функции конъюнкции отрицаний переменных («НЕ А» И «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором агент несет на себе набор связующих рецепторов 1, соответствующих входным сигналам, и активную блокируемую метку. Кроме того, КЛЭ включает в себя набор блокирующих веществ, таких что для каждого входного сигнала есть блокирующее вещество, способное связаться с соответствующим связующим рецептором 1 агента посредством данного входного сигнала и заблокировать блокируемую метку. При этом, при наличии хотя бы одного из входных сигналов к агенту присоединяется блокирующее вещество, пространственно или пространственно-электростатически блокирующее блокируемую метку, так что она не может произвести выходное воздействие.
Реализация функции дизъюнкции отрицаний переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, который включает в себя набор агентов, которые несут на себе идентичные активные блокируемые метки, а также каждый из которых несет на себе связующий рецептор 1, однозначно соответствующий входному сигналу. Причем для каждого входного сигнала в КЛЭ есть соответствующий ему агент. Кроме того, КЛЭ включает в себя набор блокирующих веществ, таких что для каждого входного сигнала есть блокирующее вещество, способное связаться со связующим рецептором 1 соответствующего агента посредством данного входного сигнала и заблокировать блокируемую метку на данном агенте. При этом для блокировки всех блокируемых меток на всех агентах обязательно наличие всех входных сигналов.
Реализация функции конъюнкции значений переменных (А И Б) осуществляется КЛЭ, в котором блокируемая метка связывается со связующим рецептором 2 агента посредством набора последовательных связей, включающего связи, опосредуемые всеми входными сигналами, причем только при наличии всех входных сигналов блокируемая метка способна присоединиться к агенту. Такой набор последовательных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связывается с молекулой 1, так что их связь опосредуется входным сигналом 1, с упомянутой молекулой 1 посредством входного сигнала 2 связывается молекула 2, несущая на себе блокируемую метку. В случае большего количества входных сигналов КЛЭ - используемый набор молекул 1, 2, …, n увеличивается, включая молекулы, связи которых с предыдущими опосредуются соответствующими входными сигналами. При этом молекула n несет на себе, в том числе блокируемую метку.
Реализация функции дизъюнкции значений переменных (А ИЛИ Б) осуществляется КЛЭ, в котором блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 агента набором параллельных связей, опосредуемых входными сигналами, причем при отсутствии какого-либо из входных сигналов соответствующая блокируемая метка не может присоединиться к агенту. Такой набор параллельных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор2 агента связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 1, кроме того, связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 2, и т.п.
Иная реализация функции дизъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором идентичные блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 набора различных агентов, однозначно соответствующих входным сигналам, посредством входных сигналов, причем при отсутствии какого-либо входного сигнала, соответствующая блокируемая метка не может присоединиться к соответствующему агенту. Такой набор связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента 1 связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 1; связующий рецептор 2 агента 2 связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 2, и т.п.
Таким образом, перечисленные варианты позволяют осуществить набор функций «значение переменной, не, или, и, не или (конъюнкция отрицаний), не и (дизъюнкция отрицаний)», как в случае входных сигналов разрушающих связи (пример 1), так и в случае входных сигналов, опосредующих связи (пример 2). Данные наборы позволяют выразить любую логическую функцию через члены каждого набора.
Сложные функции на основе базиса конъюнкции и дизъюнкции от значений переменных и их отрицаний в случае входных сигналов, разрывающих соответствующие связи.
Пример 3. Реализация КЛЭ, выполняющего логическую функцию, представляющую собой комбинацию логических функций ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ, НЕ, И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний), осуществляется следующим образом (Фиг.3). КЛЭ состоит в том числе из агента, с которым блокируемая метка связана посредством связей, которые разрушаются теми входными сигналами, которые входят в упомянутую сложную логическую функцию с отрицанием. Кроме того, агент несет на себе набор связующих рецепторов 1, которые связываются с блокирующим веществом КЛЭ, причем для каждого входного сигнала, входящего в упомянутую сложную логическую функцию как значение переменной (а не ее отрицание), существует, по крайней мере, один связующий рецептор, связь которого с блокирующим веществом разрушается данным входным сигналом, и кроме того, для каждого связующего рецептора существует входной сигнал, входящий в упомянутую сложную логическую функцию как значение переменной (а не ее отрицание), который разрушает связь данного связующего рецептора с блокирующим веществом.
Пример 4. С помощью КЛЭ приведенного в Примере 3 реализации комбинации логических функций значение переменной, НЕ и И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний) для входных сигналов, разрушающих упомянутые связи, реализуется практически любая логическая функция. Действительно, любая логическая функция представима в качестве совершенной дизъюнктивной нормальной формы, т.е. дизъюнкции конъюнкций переменных и их отрицаний. При этом для реализации представленной таким образом логической функции, используют КЛЭ, включающий в себе агенты для всех «конъюнкций», причем с идентичными блокируемыми метками. При этом данный КЛЭ реализует дизъюнкцию функций, реализующихся данными агентами, т.е. если хотя бы на одном из агентов КЛЭ есть незаблокированная блокируемая метка, то производится выходное воздействие.
Пример 5. Реализация КЛЭ, выполняющего логическую функцию, представляющую собой комбинацию логических функций ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ, НЕ, И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний), для входных сигналов, опосредующих связи, осуществляется следующим образом. КЛЭ состоит, в том числе, из агента, с которым блокируемая метка связывается посредством связей, которые опосредуются теми входными сигналами, которые входят в упомянутую сложную логическую функцию как значение переменной (а не ее отрицание). Кроме того, агент несет на себе набор связующих рецепторов 1, которые связываются с блокирующим веществом, причем для каждого входного сигнала, входящего в упомянутую сложную логическую функцию с отрицанием, существует, по крайней мере, один связующий рецептор 1, связь которого с блокирующим веществом опосредуется данным входным сигналом, и кроме того, для каждого связующего рецептора 1 существует входной сигнал, входящий в упомянутую сложную логическую функцию с отрицанием, который опосредует связь данного связующего рецептора 1 с блокирующим веществом.
Пример 6. С помощью КЛЭ приведенного в Примере 6 реализации комбинации логических функций значение переменной, НЕ и И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний) для входных сигналов, опосредующих упомянутые связи, реализуется практически любая логическая функция. Действительно, любая логическая функция представима в качестве совершенной дизъюнктивной нормальной формы, т.е. дизъюнкции конъюнкций переменных и их отрицаний. При этом для реализации представленной таким образом логической функции, используют КЛЭ, включающий в себе агенты для всех «конъюнкций», причем с идентичными блокируемыми метками. При этом данный КЛЭ реализует дизъюнкцию функций, реализующихся данными агентами, т.е. если хотя бы на одном из агентов КЛЭ есть незаблокированная блокируемая метка, то производится выходное воздействие. При этом входные сигналы могут быть добавлены как до, так и после смешения упомянутых агентов. Кроме того, упомянутые агенты могут быть не смешаны друг с другом, а выходное воздействие считается произведенным, если его произвел хотя бы один упомянутый агент после добавления входных сигналов. Случай входных сигналов, опосредующих упомянутые связи, как правило, более требователен к порядку действий при вычислении значения логической функции, чем случай входных сигналов, разрушающих упомянутые связи. Так, например, для осуществления КЛЭ предпочтительнее добавление всех входных сигналов к каждому агенту по отдельности, затем добавление блокируемых меток и блокирующих веществ, относящихся к данному агенту, а затем смешение всех агентов для получения итогового выходного воздействия. Кроме того, добавление блокируемых меток и блокирующих веществ к агенту может быть как до, так и после добавления входных сигналов.
Описанные выше примеры КЛЭ, реализующих логические функции, не ограничены случаями, когда все входные сигналы разрушают упомянутые связи, или все опосредуют. Приведенные примеры даны лишь для простоты и наглядности описания изобретения, также возможна реализация различных логических функций при различных комбинациях входных сигналов, часть которых разрушает, а часть опосредует упомянутые связи при этом реализация базисного набора функций, хотя и может отличаться от приведенных примеров, остается в рамках изобретения.
Изобретение относится к области логических элементов, а именно логических элементов на основе биомолекул. Технический результат заключается в возможности осуществления большого диапазона логических функций над одними и теми же входными сигналами. Элемент состоит из агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2; блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия и способной связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 2 упомянутого агента, причем так, что связь упомянутой блокируемой метки с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента определяется, по крайней мере, одним из входных сигналов; блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка, при соответствующих входных сигналах связанная с упомянутым агентом, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия. 2 н. и 37 з.п. ф-лы, 3 ил.
1. Комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2,
блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия и способной связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 2 упомянутого агента, причем так, что связь упомянутой блокируемой метки с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента определяется, по крайней мере, одним из входных сигналов,
блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка, при соответствующих входных сигналах связанная с упомянутым агентом, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия.
2. Комплекс логического элемента по п.1, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
3. Комплекс логического элемента по п.1, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем объект отличен от агента или схожего с агентом аналога.
4. Комплекс логического элемента по п.1, в котором, по крайней мере, один из упомянутых агента или блокирующего вещества представляет собой магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.
5. Комплекс логического элемента по п.1, в котором блокируемая метка - фермент.
6. Комплекс логического элемента по п.1, в котором упомянутое блокирование упомянутой блокируемой метки приводит к подавлению (ослаблению), по крайней мере, частичному, упомянутого выходного воздействия.
7. Комплекс логического элемента по п.1, в котором, по крайней мере, одна из упомянутых зависимостей связывания блокирующего вещества или блокируемой метки и агента от входного сигнала, характеризующегося молекулярной природой, обуславливается тем, что в цепочке связей между упомянутым агентом и упомянутой блокируемой меткой (блокирующим веществом) присутствует связь «рецептор к упомянутому входному сигналу - упомянутый входной сигнал или его аналог».
8. Комплекс логического элемента по п.1, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.
9. Комплекс логического элемента по п.8, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутое выходное воздействие производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.
10. Комплекс логического элемента по п.8, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете и т.п.), для чего жидкая среда, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по упомянутой твердой фазе или инкубируется в контакте с ней, и упомянутое выходное воздействие определяется количеством связанных с упомянутой дополнительной твердой фазой агентов.
11. Комплекс логического элемента по п.1, в котором упомянутое выходное воздействие заключается, по крайней мере, в произведении детектируемого сигнала.
12. Комплекс логического элемента по п.1, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vitro.
13. Комплекс логического элемента по п.1, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vivo.
14. Комплекс логического элемента по п.1, в котором выходное воздействие позволяет терапевтически влиять на здоровье или состояние субъекта.
15. Комплекс логического элемента по пп.1-14, на основе которого построен фармацевтический препарат.
16. Комплекс логического элемента по одному из пп.12-14, в котором, по крайней мере, часть упомянутых входных сигналов определяется состоянием субъекта.
17. Комплекс логического элемента по одному из пп.12-14, в котором блокируемая метка - рецептор (антитело к маркеру на мембране клетки, сигнальный пептид ядерной локализации и т.п.) для направленной доставки вещества в необходимую область организма, клетки и т.п.
18. Комплекс логического элемента по одному из пп.12-14, в котором выходное воздействие заключается в создании молекул для улучшения здоровья субъекта или диагностики его состояния.
19. Комплекс логического элемента по одному из пп.12-14, выполненный предназначенным для введения субъекту (внутривенно, подкожно, и т.п.) для терапии заболевания или диагностики состояния.
20. Комплекс логического элемента по одному из пп.12-14, в котором выходное воздействие заключается в доставке вещества к клеткам-мишеням.
21. Комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующую прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия,
блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия,
причем упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом и упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
22. Комплекс логического элемента по п.21, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем объект отличен от агента или схожего с агентом аналога.
23. Комплекс логического элемента по п.20, в котором, по крайней мере, один из упомянутых агента или блокирующего вещества представляет собой магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.
24. Комплекс логического элемента по п.21, в котором блокируемая метка - фермент.
25. Комплекс логического элемента по п.21, в котором упомянутое блокирование упомянутой блокируемой метки приводит к подавлению (ослаблению), по крайней мере, частичному, упомянутого выходного воздействия.
26. Комплекс логического элемента по п.21, в котором, по крайней мере, одна из упомянутых зависимостей связывания блокирующего вещества или блокируемой метки и агента от входного сигнала, характеризующегося молекулярной природой, обуславливается тем, что в цепочке связей между упомянутым агентом и упомянутой блокируемой меткой (блокирующим веществом) присутствует связь «рецептор к упомянутому входному сигналу - упомянутый входной сигнал или его аналог».
27. Комплекс логического элемента по п.21, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.
28. Комплекс логического элемента по п.27, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутое выходное воздействие производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.
29. Комплекс логического элемента по п.28, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.), для чего жидкая среда, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по упомянутой твердой фазе или инкубируется в контакте с ней, и упомянутое выходное воздействие определяется количеством связанных с упомянутой дополнительной твердой фазой агентов.
30. Комплекс логического элемента по п.21, в котором упомянутое выходное воздействие заключается, по крайней мере, в произведении детектируемого сигнала.
31. Комплекс логического элемента по п.21, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vitro.
32. Комплекс логического элемента по п.21, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vivo.
33. Комплекс логического элемента по п.21, в котором выходное воздействие позволяет терапевтически влиять на здоровье или состояние субъекта.
34. Комплекс логического элемента по пп.21-33, на основе которого построен фармацевтический препарат.
35. Комплекс логического элемента по одному из пп.31-33, в котором, по крайней мере, часть упомянутых входных сигналов определяется состоянием субъекта.
36. Комплекс логического элемента по одному из пп.31-33, в котором блокируемая метка - рецептор (антитело к маркеру на мембране клетки, сигнальный пептид ядерной локализации и т.п.) для направленной доставки вещества в необходимую область организма, клетки и т.п.
37. Комплекс логического элемента по одному из пп.31-33, в котором выходное воздействие заключается в создании молекул для улучшения здоровья субъекта или диагностики его состояния.
38. Комплекс логического элемента по одному из пп.31-33, выполненный предназначенным для введения субъекту (внутривенно, подкожно, и т.п.) для терапии заболевания или диагностики состояния.
39. Комплекс логического элемента по одному из пп.31-33, в котором выходное воздействие заключается в доставке вещества к клеткам-мишеням.
| Колонный флотационный аппарат | 1982 |
|
SU1057118A1 |
| Способ приготовления лака | 1924 |
|
SU2011A1 |
| Способ приготовления лака | 1924 |
|
SU2011A1 |
| Приспособление для суммирования отрезков прямых линий | 1923 |
|
SU2010A1 |
| ЭЛЕКТРОННАЯ СЕТЬ, СОДЕРЖАЩАЯ НУКЛЕОТИДНЫЕ ВОЛОКНА, СПОСОБ ЕЁ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ЭЛЕКТРОННАЯ СХЕМА, ВКЛЮЧАЮЩАЯ УКАЗАННУЮ СЕТЬ | 1998 |
|
RU2213393C2 |
