МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНЫЕ СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕГОРИИ ОПУХОЛИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СРЕДЫ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГИПЕРПОЛЯРИЗОВАННЫЙ C-ПИРУВАТ Российский патент 2013 года по МПК A61B5/55 

Изобретение относится к магнитно-резонансным (МР) способам определения категории опухоли с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак предстательной железы является самым распространенным типом рака у мужчин, за исключением рака кожи, и является второй лидирующей причиной смерти от рака. Факторы риска включают возраст - заболеваемость повышается у мужчин в возрасте старше 65 лет. Рак предстательной железы более распространен в западном мире и в 10% случаев может быть связан с семейным анамнезом. Рак предстательной железы представляет собой континуум, прогрессирующий через локализованную, локально распространенную, распространенную и гормонорезистентную стадии. Как правило, он представляет собой медленнорастущий рак, который обычно находится под гормональным контролем, т.е. под контролем тестостерона. Выбор лечения зависит от стадии заболевания, и в случае раннего обнаружения и соответствующего лечения выживаемость очень хорошая.

Присутствующие признаки и симптомы рака предстательной железы варьируют в зависимости от функционирования места его возникновения в железе и степени его вовлечения в патологический процесс. Большинство раковых заболеваний возникают в периферической зоне и не дают симптомов на ранней стадии развития. Те раковые заболевания, которые возникают в переходной зоне или которые распространяются и захватывают уретру, могут вызывать задержку мочи, ослабление струи мочи, прерывистость мочеиспускания и истечение после опорожнения. Однако все эти симптомы могут иметь место по другим причинам, и диагностических симптомов или характеристик опорожнения, которые могут позитивно характеризовать рак предстательной железы, не существует. Благодаря улучшению информированности населения и методикам скрининга рак предстательной железы диагностируется на более ранних стадиях развития, часто у мужчин, у которых отсутствуют симптомы, или бессимптомных.

В настоящее время используемой методикой скрининга является измерение простата-специфического антигена (ПСА). ПСА представляет собой фермент, секретируемый предстательной железой, и его используют в качестве маркера заболевания предстательной железы. ПСА, если его не используют для скрининга, обычно определяют в процессе идентификации лица, у которого вероятно имеется рак предстательной железы. В частности, опухоли, которые слишком малы для пальпации при пальцевом ректальном исследовании (ПРИ), могут только ожидаться при тестировании ПСА.

Для подтверждения каких-либо результатов исследований ПРИ/ПСА обычно используют трансректальную ультрасонографию (ТРУС) и игольную биопсию под контролем ТРУС. Однако особенно в случаях небольших локализованных опухолей в предстательной железе, эти результаты исследований могут быть ложноотрицательными или ложноположительными: только в 20-25% случаев гипоэхогенных изображений, полученных методом ТРУС, рак предстательной железы подтверждается. С другой стороны, 25% опухолей предстательной железы изоэхогенны. При биопсии обычно берут 5-8 равноотстоящих образцов из разных участков предстательной железы. В случае небольшой опухоли игольная биопсия может просто "пропустить" опухоль.

В WO-A-2006/011810 раскрыт способ МР визуализации in vivo, который позволяет различать здоровую и опухолевую ткань, в частности ткань опухоли предстательной железы. В этом способе используется среда для визуализации, содержащая гиперполяризованный ¹³С-пируват.

Пируват представляет собой эндогенное соединение, которое очень хорошо переносится человеческим организмом, даже в высоких концентрациях. В качестве предшественника в цикле лимонной кислоты пируват играет важную метаболическую роль в организме человека. Пируват превращается в различные соединения: в результате его трансаминирования образуется аланин, в результате окислительного декарбоксилирования пируват превращается в ацетил-СоА и бикарбонат, в результате восстановления пирувата образуется лактат, и в результате его карбоксилирования образуется оксалоацетат.

Метаболическое превращение гиперполяризованного ¹³С-пирувата в его метаболиты гиперполяризованный ¹³С-лактат, гиперполяризованный ¹³С-бикарбонат (только в случае ¹³C₁-пирувата, ¹³С_1,2-пирувата или ¹³С_1,2,3 - пирувата) и гиперполяризованный ¹³С-аланин может быть использовано для МР исследования in vivo метаболических процессов в человеческом организме. ¹³C₁-пируват имеет T₁ релаксации в цельной крови человека при 37°С примерно 42 с, однако было обнаружено, что превращение гиперполяризованного ¹³С-пирувата в гиперполяризованный ¹³С-лактат, гиперполяризованный ¹³С-бикарбонат и гиперполяризованный ¹³С-аланин является достаточно быстрым, чтобы давать возможность детектировать сигналы от родительского соединения ¹³С-пирувата и его метаболитов. Количество аланина, бикарбоната и лактата зависит от метаболического статуса исследуемой ткани. Интенсивность МР сигналов гиперполяризованного ¹³С-лактата, гиперполяризованного ¹³С-бикарбоната и гиперполяризованного ¹³С-аланина связана с количеством этих соединений и степенью поляризации, оставшейся на момент детектирования. Следовательно, осуществляя мониторинг превращения гиперполяризованного ¹³С-пирувата в гиперполяризованный ¹³С-лактат, гиперполяризованный ¹³С-бикарбонат и гиперполяризованный ¹³С-аланин, можно исследовать метаболические процессы in vivo в организме человека или животного, не являющегося человеком, с использованием неинвазивной МР визуализации или МР спектроскопии.

Было обнаружено, что амплитуды МР сигналов от разных метаболитов ¹³С-пирувата и, следовательно, интенсивностей сигналов варьируют в зависимости от типа ткани. Уникальный МР метаболический паттерн интенсивностей сигналов аланина, лактата, бикарбоната и пирувата можно использовать в качестве характерного признака метаболического состояния исследуемой ткани и, следовательно, иметь возможность различать здоровую ткань и опухолевую ткань. На опухолевую ткань в полученных ¹³С-МР изображениях гиперполяризованного ¹³С-пирувата и его метаболитов указывает самый высокий сигнал лактата или высокий взвешенный сигнал лактата относительно пирувата или лактата относительно аланина, как подробно описано в WO-A-2006/011810.

Магнитно-резонансные (МР) методы обнаружения, такие как, например, МР визуализация (МРВ) и МР спектроскопия (МРС), могут быть ценными инструментами обнаружения рака предстательной железы, и эти инструменты стали особенно привлекательными для врачей, поскольку они позволяют получать изображения организма или частей организма пациентов неинвазивным путем и без воздействия на пациента и медицинский персонал потенциально вредного излучения, такого как рентгеновское излучение. МРВ, благодаря ее высокому качеству изображений и хорошему пространственному и временному разрешению, является предпочтительным методом визуализации мягких тканей и органов.

Теперь обнаружено, что МР визуализацию и/или МР спектроскопию in vivo рака предстательной железы с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, можно использовать не только для различения здоровой и опухолевой ткани, но и для оценки агрессивности опухоли предстательной железы, т.е. определения категории опухоли.

Гистологическое определение категории рака предстательной железы является важной частью оценки последствий или прогноза заболевания. Точное определение категории рака предстательной железы может помочь спрогнозировать поведение и агрессивность заболевания и, вероятно, последствия для пациента.

Системы определения категории могут оценивать степень анаплазии (изменение размера, формы и свойств окрашивания) и дифференциации клеток, т.е. насколько хорошо дифференцированы клетки, в опухоли. На ранних стадиях рака клетки обычно хорошо дифференцированы и функционируют подобно клеткам ткани, из которой они возникли. По мере прогрессирования рака клетки становятся менее дифференцированными и начинают выглядеть и вести себя иначе, чем их предшественники.

Стали разрабатываться различные системы определения категории, но одной из наиболее широко используемых для рака предстательной железы является система Глисона. Система определения категории Глисона основана на степени, до которой опухолевые клетки организованы в легко узнаваемые железистые структуры, и на уровне клеточной дифференциации. Система Глисона идентифицирует пять уровней увеличения агрессивности заболевания, при этом степень 1 отражает наименее агрессивный рак и степень 5 отражает наиболее агрессивный рак.

Поскольку большинство раковых опухолей предстательной железы являются гетерогенными, т.е. имеют смесь клеток с разными категориями по Глисону, две наиболее характерные степени складывают и получают балл Глисона. Этот балл дает полезную прогностическую информацию и вместе с другими параметрами используется для принятия решения по лечению рака предстательной железы. Баллы Глисона выше 4 связаны с риском более быстрого прогрессирования заболевания, повышения потенциальной возможности метастазирования и снижения выживаемости.

Хотя определение категории по Глисону является попыткой объективного количественного определения, гистологическое определение категории по своей природе является субъективным. Из клеток образца биопсии опухоли готовят образцы, которые затем специалист-патолог исследует под микроскопом. Существенной проблемой является степень вариабельности результатов у разных исследователей и вариабельности результатов у одного исследователя при считывании одних и тех же образцов. Может возникнуть необходимость в получении мнения нескольких патологов для достижения консенсуса по оценке категории индивидуальной опухоли. Для определения категории по Глисону также требуются образцы ткани предстательной железы для анализа, которые должны быть получены посредством биопсии (под контролем ТРУС). Как указано выше, результаты биопсии могут быть ложноотрицательными, поскольку, особенно в случае небольшой опухоли, игольная биопсия может просто "пропустить" опухоль.

Следовательно, существует потребность в способе, который позволяет более согласованно оценивать агрессивность рака предстательной железы, чем существующий в настоящее время субъективный патологический анализ биопсийного образца ткани предстательной железы.

Как указано выше, метаболическое состояние ткани предстательной железы может быть оценено методом МР визуализации in vivo предстательной железы с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват. Опухолевая ткань характеризуется более высокой метаболической активностью, чем здоровая ткань, и можно наблюдать увеличение превращения пирувата в лактат, в результате чего наблюдается высокий сигнал ¹³С-лактата в такой опухолевой ткани, что делает возможным отличать опухолевую ткань от здоровой ткани и, следовательно, идентифицировать опухолевую ткань.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что МР сигналы гиперполяризованного ¹³С-пирувата и его метаболитов могут быть использованы для оценки агрессивности рака предстательной железы и степени злокачественности и, следовательно, могут быть использованы для определения категории рака предстательной железы. Однако это не ограничивается раком предстательной железы и может быть перенесено на другие виды рака. Таким образом, методом МР обнаружения с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, можно не только идентифицировать опухолевую ткань, но и сделать прогноз в отношении агрессивности и степени злокачественности указанной опухоли, то есть определить категорию опухоли, используя полностью неинвазивный способ.

Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложен способ определения категории опухоли, включающий

а) магнитно-резонансное (МР) обнаружение опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната;

б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для формирования метаболического профиля опухоли;

в) сравнение метаболического профиля опухоли, сформированного на стадии (б), с известным метаболическим профилем опухоли определенной категории; и

г) определение категории, исходя из сходств и различий между указанным метаболическим профилем опухоли и указанным известным метаболическим профилем.

Авторы изобретения обнаружили, что первичные опухоли ранней стадии (опухоли низкой категории), первичные опухоли поздней стадии (опухоли высокой категории) и метастазы имеют характерные метаболические профили, то есть характеристический паттерн сигналов ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната, при МР обнаружении с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват. Следовательно, можно определить категорию опухоли путем сравнения ее метаболического профиля с известным метаболическим профилем. Когда опухоль прогрессирует от первичной опухоли ранней стадии до первичной опухоли поздней стадии, сигнал лактата, суммарный сигнал углерода (сумма сигнала лактата плюс сигнал аланина плюс сигнал пирувата и возможно плюс сигнал бикарбоната) и в меньшей степени сигнал аланина являются значительно более высокими в опухоли поздней стадии по сравнению с опухолью ранней стадии. Кроме того, скорректированный сигнал лактата, т.е. лактат к пирувату, лактат к аланину и лактат к суммарному углероду, также значительно выше в опухолях поздней стадии, чем в опухолях ранней стадии. Полученные данные по метастазам, исходя из сигнала лактата и суммарного сигнала углерода, находятся где-то между данными, наблюдаемыми в опухолях ранней стадии и опухолях поздней стадии. Благодаря этим полученным характеристическим данным, можно определить категорию опухоли, то есть первичную опухоль ранней стадии, или первичную опухоль поздней стадии, или метастазы, путем сравнения ее метаболического профиля с известным метаболическим профилем опухоли определенной категории, т.е. с известным метаболическим профилем первичной опухоли ранней стадии, с известным метаболическим профилем первичной опухоли поздней стадии или с известным метаболическим профилем метастазов.

Воплощением данного изобретения является также способ одновременно идентификации опухоли и определения ее категории. Этот способ основан на вышеописанном способе и представляет собой исследование субъекта, у которого подозревают опухоль. Сравнивая метаболический профиль подозреваемой опухоли с известным метаболическим профилем опухоли определенной категории можно определить, имеется ли у субъекта опухоль вообще, и если опухоль есть, то категорию указанной опухоли.

Способ по изобретению может быть использован вообще для определения категории опухоли. Для многих типов раковых заболеваний существует установленная система специфического определения категории, и эту категорию обычно оценивают в цифрах и/или описательно. Категории опухолей могут быть определены по шкалам от пятибалльной до двухбалльной и могут быть оценены в цифрах и/или описательно в зависимости от типа рака. В качестве примера, категорию рака молочной железы традиционно определяют по системе Скарффа-Блума-Ричардсона (S-B-R), и патолог, использующий систему S-B-R, рассматривает три структурные характеристики при определении категории опухоли молочной железы: ядерный плеоморфизм (1), митотический индекс (2) и дуктогландулярную дифференциацию (3). Категории опухолей определяют по каждому критерию отдельно, при этом степень I является самой нормальной (дифференцированной), а стадия III является наиболее аберрантной (недифференцированной). Баллы этих трех критериев складывают, получая окончательную категорию опухоли. Таким образом, баллы могут находиться в пределах от 3-5 (хорошо дифференцированная) до 6-7 (средне дифференцированная) и 8-9 (плохо дифференцированная). В качестве другого примера, категорию рака предстательной железы определяют по системе Глисона, как описано выше. Система Глисона идентифицирует пять уровней возрастающей агрессивности заболевания, при этом категория 1 отражает наименее агрессивный, и категория 5 отражает наиболее агрессивный рак. Чтобы компенсировать гетерогенность опухоли, две самые характерные категории опухоли складывают, получая балл Глисона.

Для систем определения категории, которые являются более детализированными по их результатам, чем система определения категории с простой группировкой по двухбалльной (опухоль низкой категории или опухоль высокой категории) или трехбалльной (опухоль либо низкой, либо промежуточной, либо высокой категории), более предпочтительно использовать воплощение настоящего изобретения, которое упрощает стадию сравнения (в) и стадию определения категории (г).

Следовательно, другим аспектом изобретения является способ определения категории опухоли, включающий

а) МР обнаружение опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната; и

б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли.

Этот способ основан на использовании стандартной кривой или нескольких стандартных кривых, которые коррелируются с сигналом гиперполяризованного ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната с гистопатологической оценкой категории опухоли. Указанные стандартная кривая или стандартные кривые представляют собой статистически значимые стандартные кривые, которые могут быть получены от группы пациентов, имеющих определенный тип рака.

В качестве примера, группой пациентов может быть группа пациентов, имеющих рак предстательной железы, т.е. пациентов, имеющих опухоль в предстательной железе, и это опухоли разных степеней агрессивности/злокачественности. Указанная группа пациентов проходит МР исследование предстательной железы, при котором вводят среду для визуализации, содержащую гиперполяризованный ¹³С-пируват, и при котором затем детектируют и регистрируют сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и, возможно, бикарбоната. Категории опухолей в этой группе пациентов также оцениваются патологом гистопатологически с использованием системы Глисона, и две самые характерные категории опухоли складывают с получением балла Глисона. Проводят корреляцию определенного балла Глисона у пациента с результатами его МР исследования. Для выполнения этой корреляции могут быть использованы различные статистические методы, известные в данной области. Чтобы получить статистически значимую стандартную кривую, указанную корреляцию проводят для статистически релевантного количества пациентов, то есть для группы пациентов.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "категория опухоли" в контексте данного изобретения относится к различаемой степени агрессивности и/или злокачественности указанной опухоли.

Термин "МР обнаружение опухоли […], при котором детектируют сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната" означает, что детектируют сигнал ¹³С-пирувата, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита аланина, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита лактата и возможно детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита бикарбоната. Это означает, что детектируют либо все сигналы, то есть сигнал родительского соединения ¹³С-пирувата и всех его ¹³С-содержащих метаболитов, либо только сигналы одного соединения, то есть либо родительского соединения ¹³С-пирувата, либо одного из его ¹³С-содержащих метаболитов, либо детектируют сигналы более чем одного, но не всех соединений, то есть, например, ¹³С-пирувата и ¹³С-лактата, ¹³С-пирувата и ¹³С-аланина или ¹³С-лактата и ¹³С-аланина. Вышеупомянутый термин охватывает все комбинации сигналов ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов.

Термин "субъект" в контексте данного изобретения относится к любому живому или неживому позвоночному, предпочтительно к живому или неживому млекопитающему, например человеку или млекопитающему, не являющемуся человеком, предпочтительно к живому млекопитающему и наиболее предпочтительно к живому человеку.

Термин "гиперполяризованный" здесь используется взаимозаменяемо с термином "поляризованный", и он означает уровень ядерной поляризации более 0,1%, предпочтительно более 1% и наиболее предпочтительно более 10%.

Термин "сигнал" в контексте данного изобретения относится к амплитуде МР сигнала, или интегралу, или площади пика по отношению к шуму пиков в МР спектре, который представляет ¹³С-пируват и/или его ¹³С-содержащие метаболиты аланин, лактат и возможно бикарбонат. В предпочтительном воплощении интенсивность сигнала представляет собой площадь пика.

Термин "суммарный сигнал углерода" в контексте данного изобретения означает сумму сигналов ¹³С-пирувата, ¹³С-лактата, ¹³С-аланина и возможно ¹³С-бикарбоната.

Термин "метаболический профиль опухоли" в контексте данного изобретения означает характеристический паттерн сигналов ¹³С-пирувата, и/или его ¹³С-содержащего метаболита аланина, и/или его ¹³С-содержащего метаболита лактата и возможно его ¹³С-содержащего метаболита бикарбоната. Это означает, что в одном воплощении все сигналы, то есть сигнал родительского соединения ¹³С-пирувата и всех его ¹³С-содержащих метаболитов, используют для формирования метаболического профиля опухоли, а в другом воплощении только сигналы одного соединения, то есть либо родительского соединения ¹³С-пирувата, либо одного из его ¹³С-содержащих метаболитов, используют для формирования метаболического профиля опухоли. В еще одном воплощении используют два или более сигналов для формирования метаболического профиля опухоли, например сигнал родительского соединения ¹³С-пирувата и сигнал ¹³С-лактата, либо сигналы ¹³С-пирувата и ¹³С-аланина, либо сигналы ¹³С-пирувата, ¹³С-лактата и ¹³С-аланина. Вышеупомянутый метаболический профиль может быть сформирован с использованием всех комбинаций сигналов ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов. "Метаболический профиль опухоли" согласно изобретению может также включать обработанные данные сигналов или может быть сформирован с использованием обработанных данных сигналов, например отношений сигналов, корректированных сигналов, либо информацию о константе скорости динамики или метаболизма, выведенную из паттерна сигналов множества МР обнаружений, т.е. спектров или изображений.

Термин "известный метаболический профиль опухоли определенной категории" в контексте данного изобретения означает характеристический паттерн сигналов ¹³С-пирувата и/или его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната опухоли определенной категории, например первичной опухоли ранней стадии (опухоли низкой категории), первичной опухоли поздней стадии (опухоли высокой категории) или метастазов, и где указанный характеристический паттерн сформирован как описано в предыдущем абзаце в определении термина "метаболический профиль опухоли".

Термин "стадия опухоли" в контексте данного изобретения относится к прогрессированию рака во времени и означает либо первичную опухоль ранней стадии, либо первичную опухоль поздней стадии, либо метастазы. Метастазы могут возникать вблизи первичной опухоли, например в регионарных лимфатических узлах, либо в местах, более отдаленных от первичной опухоли, например в не регионарных лимфатических узлах, костях или других местах.

Термин "гистопатологическая категория опухоли" относится к категории опухоли, установленной патологом в процессе микроскопического исследования части опухоли, полученной, например, из биопсии опухоли.

Термин "стандартная кривая сигналов" относится к статистически значимой стандартной кривой сигналов ¹³С-пирувата и/или его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната в зависимости от категории опухоли. Ее получают, проводя корреляцию сигнала ¹³С-пирувата и/или его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната с гистопатологической категорией опухоли. Хотя этот термин пишется в единственном числе, он может относиться к единственной стандартной кривой или к одной или более стандартным кривым.

Термин "определенная категория опухоли" относится к опухоли, категория которой известна.

Термины "гиперполяризованный ¹³С-пируват", "¹³С-пируват" и "пируват" здесь используются взаимозаменяемо, если не указано иное. Аналогично, термины "гиперполяризованный ¹³С-лактат", "¹³С-лактат" и "лактат", термины "гиперполяризованный ¹³С-аланин", "¹³С-аланин" и "аланин" и термины "гиперполяризованный ¹³С-бикарбонат", "¹³С-бикарбонат" и "бикарбонат" здесь используются взаимозаменяемо, если не указано иное.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указано выше, в первом аспекте настоящего изобретения предложен способ определения категории опухоли, включающий

а) магнитно-резонансное (МР) обнаружение опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната;

б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для формирования метаболического профиля опухоли;

в) сравнение метаболического профиля опухоли, сформированного на стадии (б), с известным метаболическим профилем опухоли определенной категории; и

г) определение категории опухоли, исходя из сходств и различий между указанным метаболическим профилем опухоли и указанным известным метаболическим профилем.

На стадии (а) опухоль у субъекта, предпочтительно у живого млекопитающего, более предпочтительно живого человека или млекопитающего животного, не являющегося человеком, наиболее предпочтительно живого человека, обнаруживают посредством МР.

В одном из воплощений указанное МР обнаружение представляет собой МР визуализацию, либо МР спектроскопию, либо комбинированную МР визуализацию и МР спектроскопию, то есть МР спектроскопическую визуализацию. В другом воплощении указанное МР обнаружение представляет собой МР спектроскопическую визуализацию в различные моменты времени для определения скорости изменения родительского соединения ¹³С-пирувата и/или его ¹³С-содержащих метаболитов. В еще одном воплощении указанное МР обнаружение создано для выведения констант скорости метаболизма, динамики или других характеристик прогрессирования опухоли. В предпочтительном воплощении интегралы спектральной области разрешенных сигналов от лактата, пирувата и аланина получают для каждой пространственной точки в ¹³С-МР спектроскопическом изображении. В другом предпочтительном воплощении интенсивности из изображений конкретных ¹³С-содержащих метаболитов используют для формирования метаболического профиля на стадии (б) способа по изобретению.

В способе МР обнаружения по изобретению используют среду для визуализации, содержащую гиперполяризованный ¹³С-пируват.

Изотопное обогащение гиперполяризованного ¹³С-пирувата в указанной среде для визуализации, используемой в способе по изобретению, предпочтительно составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80% и особенно предпочтительно по меньшей мере 90%, причем наиболее предпочтительно изотопное обогащение более 90%. В идеале обогащение составляет 100%. ¹³С-пируват в указанной среде для визуализации, используемой в способе по изобретению, может быть обогащен изотопом в С1-положении (далее ¹³C₁-пируват), в С2-положении (далее ¹³С₂-пируват), в С3-положении (далее ¹³С₃-пируват), в С1- и С2-положении (далее ¹³С_1,2-пируват), в С1- и С3-положении (далее ¹³С_1,3-пируват), в С2- и С3-положении (далее ¹³С_2,3-пируват) или в С1-, С2- и С3-положении (далее ¹³C_1,2,3-пируват). Изотопное обогащение в C1-положении является предпочтительным, поскольку ¹³C₁-пируват имеет более высокое T₁ релаксации в цельной крови человека при 37°С (примерно 42 с), чем ¹³С-пируват, который обогащен изотопом в других С-положениях.

Обогащенный изотопом ¹³С-пируват имеется в продаже, например в виде ¹³С-пирувата натрия. Альтернативно, он может быть синтезирован как описано в S. Anker, J. Bio). Chem. 176, 1948, 133-1335.

Несколько методов гиперполяризации раскрыто в WO-A-99/35508, которая включена в данное описание посредством ссылки, и одним из них является метод динамической поляризации ядер (ДПЯ), который предпочтителен для гиперполяризации ¹³С-пирувата. При ДПЯ поляризацию МР активных ядер в соединении, которое подвергают поляризации, то есть в образце, осуществляют агентом поляризации или так называемым ДПЯ агентом, соединением, содержащим неспаренные электроны. При осуществлении процесса ДПЯ подводят энергию, обычно в форме микроволнового излучения, которая изначально возбуждает ДПЯ агент. При угасании до исходного состояния происходит перенос поляризации от неспаренного электрона ДПЯ агента к ЯМР активным ядрам образца. Как правило, в процессе ДПЯ используют умеренное или высокое магнитное поле и очень низкую температуру, например проводят процесс ДПЯ в жидком гелии и в магнитном поле примерно 1 Тл или выше. Альтернативно, можно использовать умеренное магнитное поле и любую температуру, при которой достигается достаточное усиление поляризации. Метод ДПЯ также описан, например, в WO-А-98/58272 и в WO-A-01/96895, которые включены в данное описание посредством ссылки.

Для поляризации образца методом ДПЯ готовят смесь указанного образца, т.е. соединения, которое требуется поляризовать, и ДПЯ агента, и эту смесь затем замораживают и помещают в ДПЯ поляризатор для поляризации. После поляризации смесь, содержащую гиперполяризованный образец, быстро переводят в жидкое состояние либо путем его плавления, либо путем растворения в подходящей среде растворения. Растворение является предпочтительным, и процесс растворения замороженной смеси, содержащей ДПЯ-поляризованное соединение, а также подходящие устройства для него подробно описаны в WO-A-02/37132. Процесс плавления и подходящие устройства для плавления описаны, например, в WO-A-02/36005.

С целью получения высокополяризованного образца образец и ДПЯ агент в процессе ДПЯ должны находиться в тесном контакте. Этого не происходит, если смесь, содержащая образец и ДПЯ агент, кристаллизуется при замораживании или охлаждении. Чтобы избежать кристаллизации, либо в указанной смеси должны присутствовать стеклообразователи, либо для поляризации следует выбирать соединения, которые не кристаллизуются при замораживании, а образуют стекло.

Для получения гиперполяризованного ¹³С-пирувата методом ДПЯ в качестве исходного вещества удобно использовать ¹³С-пировиноградную кислоту или ¹³С-пируват.

В данной области известно несколько способов синтеза ¹³C₁-пировиноградной кислоты. Кратко, в Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237, описан путь синтеза, который основан на защите и активации карбонилсодержащего исходного вещества, такого как S.S-ацеталь, например 1,3-дитиан или 2-метил-1,3-дитиан. Дитиан металлируют и подвергают взаимодействию с метилсодержащим соединением и/или ¹³CO₂. Используя соответствующий обогащенный изотопом ¹³С-компонент, как изложено в данной ссылке, можно получить ¹³C₁-пируват, ¹³С₂-пируват или ¹³С_1,2-пируват. Затем функциональную карбонильную группу высвобождают общепринятыми способами, описанными в литературе. Другой путь синтеза начинается с уксусной кислоты, которую сначала превращают в ацетилбромид, а затем подвергают взаимодействию с Cu¹³CN. Полученный нитрил превращают в пировиноградную кислоту через амид (см., например, S.H. Anker et al., J. BioL Chem. 176 (1948), 1333 или J.E. Thirkettte, Chem. Commun. (1997), 1025). ¹³С-пировиноградная кислота может быть получена также путем протонирования имеющегося в продаже ¹³С-пирувата натрия, например способом, описанным в патенте США №6232497, или способом, описанным в WO-A-2006/038811. ¹³С-пируват является коммерчески доступным соединением.

Гиперполяризация ¹³С-пировиноградной кислоты методом ДПЯ подробно описана в WO-A1-2006/011809, которая включена в данное описание посредством ссылки. Кратко, непосредственно ¹³С-пировиноградная кислота может быть использована для ДПЯ, поскольку она образует стекло при замораживании. После ДПЯ замороженную гиперполяризованную ¹³С-пировиноградную кислоту нужно превратить в жидкость, например растворить, и нейтрализовать, то есть превратить в ¹³С-пируват. Для этого превращения требуется сильное основание. Кроме того, поскольку ¹³С-пировиноградная кислота является сильной кислотой, необходимо выбрать ДПЯ агент, который стабилен в этой сильной кислоте.

Альтернативно, для ДЛЯ может быть использован ¹³С-пируват, то есть соль ¹³С-пировиноградной кислоты. Предпочтительными солями являются те ¹³С-пируваты, которые содержат неорганический катион из группы, состоящей из NH₄ ⁺, К⁺, Rb⁺, Cs⁺, Са²⁺, Sr²⁺ и Ва²⁺, предпочтительно NH₄ ⁺, K⁺, Rb⁺ или Cs⁺, более предпочтительно К⁺, Rb⁺, Cs⁺ и наиболее предпочтительно Cs⁺, как подробно описано в WO-A2-2007/111515, которая включена в данное описание посредством ссылки. Синтез этих предпочтительных ¹³С-пируватов описан также в WO-A2-2007/111515.

Предпочтительными солями также являются ¹³С-пируваты органического амина или аминосоединения, предпочтительно TRIS-¹³C₁-пируват или меглумин-¹³С₁-пируват, которые подробно описаны в WO-A2-2007/069909 и включены в данное описание посредством ссылки. Синтез этих предпочтительных ¹³С-пируватов раскрыт также в WO-A2-2007/069909.

Уровень гиперполяризации (поляризации ядер) может быть определен, например, путем измерений ЯМР в твердом состоянии ЯМР активного ядра в твердом, например, замороженном, гиперполяризованном образце. Для ¹³С-пирувата ЯМР активным ядром в гиперполяризованном образце является ¹³С, и поэтому могут быть собраны данные ¹³С-ЯМР в твердом состоянии ¹³С-пирувата или ¹³С-пировиноградной кислоты. Измерение ¹³С-ЯМР в твердом состоянии предпочтительно состоит из простого сбора данных импульсной ЯМР последовательности с использованием низкого угла переворота. Интенсивность сигнала гиперполяризованного образца в ЯМР спектре сравнивают с интенсивностью сигнала образца в ЯМР спектре, полученном перед гиперполяризацией этого образца. Затем уровень поляризации вычисляют из соотношения интенсивностей сигналов до и после гиперполяризации.

Подобным образом, уровень поляризации для гиперполяризованного образца в жидком состоянии (либо растворенного, либо представляющего собой жидкость при данной температуре) может быть определен в результате измерений ЯМР в жидком состоянии ЯМР активного ядра в жидком гиперполяризованном образце. Снова интенсивность сигнала растворенного гиперполяризованного образца сравнивают с интенсивностью сигнала растворенного образца перед его гиперполяризацией. Затем уровень поляризации вычисляют из соотношения интенсивностей сигнала до и после гиперполяризации.

Среду для визуализации, содержащую гиперполяризованный ¹³С-пируват, которую используют в способе по изобретению, предпочтительно готовят как описано в WO-A1-2006/011809, где раскрыты также подходящие протоколы введения и дозировки.

Менее чем через 400 с после введения среды для визуализации, предпочтительно менее чем через 120 с, более предпочтительно менее чем через 60 с после введения, особенно предпочтительно через 20-50 с после введения и наиболее предпочтительно через 30-40 с после введения применяют последовательность МР изображений, которая кодирует интересующий объем, т.е. опухоль, совместным частотно- и пространственно-селективным образом, и снимают прямые ¹³С-МР изображения и/или МР спектры указанного интересующего объема с получением интенсивностей сигналов ¹³С-пирувата и его метаболитов, ¹³С-лактата, ¹³С-аланина и возможно ¹³С-бикарбоната.

В предпочтительном воплощении для МР обнаружения используют специализированные радиочастотные катушки, предпочтительно специализированные ¹³С-катушки. Тип используемых катушек, разумеется, зависит от локализации опухоли/типа рака. В качестве примера, для МР обнаружения опухолей в головном мозге может быть использована катушка "птичья клетка", а для МР обнаружения опухолей в предстательной железе может быть использована эндоректальная катушка.

На стадии (б) способа по изобретению вышеупомянутые сигналы ¹³С-пирувата и его метаболитов, ¹³С-лактата, ¹³С-аланина и, возможно, ¹³С-бикарбоната и, возможно, суммарный сигнал углерода используют для формирования метаболического профиля опухоли.

В одном воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют интенсивности спектральных сигналов ¹³С-пирувата и его метаболитов, ¹³С-лактата, ¹³С-аланина и возможно ¹³С-бикарбоната (далее "¹³С-пирувата и его метаболитов"). В другом воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют интегралы спектральных сигналов ¹³С-пирувата и его метаболитов. В другом воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют интенсивности сигналов из отдельных изображений ¹³С-пирувата и его метаболитов. В еще одном воплощении для вычисления скорости изменения ¹³С-пирувата и/или его метаболитов интенсивности сигналов получают в двух или более временных точках.

В одном из воплощений для формирования метаболического профиля опухоли используют все сигналы, то есть сигнал ¹³С-пирувата, и ¹³С-лактата, и ¹³С-аланина, и возможно ¹³С-бикарбоната. Дополнительно, для формирования метаболического профиля опухоли можно использовать суммарный сигнал углерода, то есть сумму сигналов ¹³С-лактата, ¹³С-аланина, ¹³С-пирувата и возможно ¹³С-бикарбоната. В другом воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют один или более выбранных сигналов. Так, в предпочтительном воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют сигнал лактата и/или сигнал аланина и/или суммарный сигнал углерода. В еще одном предпочтительном воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют сигнал лактата и/или суммарный сигнал углерода.

В другом воплощении метаболический профиль опухоли включает в себя или сформирован с использованием обработанных данных сигналов, например соотношений сигналов, скорректированных сигналов или информации по константам скорости динамики или метаболизма, выведенные из паттерна сигналов множества МР обнаружений, то есть спектров или изображений. Так, в предпочтительном воплощении для формирования метаболического профиля опухоли используют скорректированный сигнал лактата, то есть отношение сигнала лактата к сигналу аланина, и/или сигнала лактата к сигналу пирувата, и/или сигнала лактата к суммарному сигналу углерода. В другом предпочтительном воплощении обработанный сигнал дает в результате число для каждой точки изображения, которое является характеристикой метаболического профиля каждой указанной точки изображения.

На стадии (в) способа по изобретению метаболический профиль опухоли, полученный на стадии (б), сравнивают с известным метаболическим профилем опухоли определенной категории.

Известный профиль опухоли определенной категории предпочтительно основан на МР исследовании статистически значимого количества пациентов, имеющих определенный тип опухоли. В качестве примера, для формирования известного профиля опухоли предстательной железы определенной категории используют статистически значимое количество пациентов, имеющих рак предстательной железы, то есть пациентов, имеющих опухоль в предстательной железе. В одном из воплощений пациентам вводят среду для визуализации, содержащую гиперполяризованный ¹³С-пируват, а затем детектируют и регистрируют МР сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и возможно бикарбоната. Эти сигналы и возможно суммарный сигнал углерода используют для формирования метаболического профиля опухоли каждого пациента способом, описанным в предыдущих абзацах. Категорию опухоли у этих пациентов также гистопатологически определяет патолог с использованием системы Глисона, и две самые характерные категории опухоли складывают с получением балла Глисона. Метаболические профили пациентов, имеющих одинаковый балл Глисона, объединяют, и "средний" метаболический профиль формируют статистическими методами, известными в данной области, из этих объединенных профилей, которые коррелируют с данным баллом Глисона. Такой "средний" метаболический профиль представляет собой известный метаболический профиль опухоли определенной категории.

В одном из воплощений известный метаболический профиль содержит все сигналы, то есть сигнал ¹³С-пирувата, и ¹³С-лактата, и ¹³С-аланина, и, возможно, ¹³С-бикарбоната. Кроме того, он может содержать суммарный сигнал углерода, то есть сумму сигналов лактата, аланина, пирувата и возможно бикарбоната. В другом воплощении известный метаболический профиль содержит один или более выбранных сигналов. Так, в предпочтительном воплощении в указанном известном метаболическом профиле присутствуют сигнал лактата, и/или сигнал аланина, и/или суммарный сигнал углерода. В еще одном предпочтительном воплощении в указанном известном метаболическом профиле присутствуют сигнал лактата и/или суммарный сигнал углерода.

В еще одном предпочтительном воплощении известный метаболический профиль содержит обработанные данные сигналов, например соотношения сигналов, скорректированные сигналы или информацию по константам скорости динамики или метаболизма, выведенную из паттерна сигналов множества МР обнаружений, то есть спектров или изображений. Так, в предпочтительном воплощении известный метаболический профиль содержит скорректированный сигнал лактата, то есть отношение сигнала лактата к сигналу аланина, и/или сигнала лактата к сигналу пирувата, и/или сигнала лактата к суммарному сигналу углерода. В другом предпочтительном воплощении обработанный сигнал дает в результате число для каждой точки изображения, которое является характеристикой метаболического профиля каждой указанной точки изображения.

Известный метаболический профиль может быть представлен в форме таблицы, в которой отражены значения сигналов для одного или более из указанных выше сигналов. В другом воплощении такой известный профиль может быть представлен в форме графика. В еще одном другом воплощении такой известный профиль может быть представлен в форме совокупности данных, и указанная совокупность данных хранится на машиночитаемом носителе.

Сравнение, в его самом простом воплощении, может быть выполнено путем визуального сравнения метаболического профиля опухоли, сформированного на стадии (б) способа по изобретению, и известного метаболического профиля опухоли определенной категории. В другом воплощении сравнение выполняется в автоматическом режиме, например с использованием подходящей компьютерной программы, которая сравнивает два метаболических профиля. В одном из воплощений метаболический профиль опухоли, сформированный на стадии (б), сравнивают с одним известным метаболическим профилем опухоли определенной категории. В качестве примера, метаболический профиль опухоли, например опухоли предстательной железы, сформированный на стадии (б), сравнивают с одним известным метаболическим профилем опухолей предстательной железы, имеющих балл Глисона 4 (2+2). Если метаболический профиль исследуемой опухоли предстательной железы и известный метаболический профиль опухолей предстательной железы с баллом Глисона 4 (2+2) в высокой степени сходны, то нет срочной необходимости сравнивать указанный метаболический профиль с другими известными метаболическими профилями опухолей предстательной железы с другими баллами Глисона, например с баллом Глисона 8 (4+4). Однако обычно метаболический профиль опухоли, сформированный на стадии (б), сравнивают с несколькими известными метаболическими профилями опухоли нескольких определенных степеней злокачественности. В предпочтительном воплощении метаболический профиль, полученный на стадии (б), отображают как наложение параметрического изображения на анатомическое изображение, используя цветовую и/или цифровую корреляцию со стадией опухоли. После того, как это сделано, полученное наложение изображений дает объединенную информацию по категории опухоли и стадии опухоли, т.е. по распространенности и локализации опухоли. В другом предпочтительном воплощении область опухоли определяют в анатомическом изображении, например протонном анатомическом изображении, а затем эта область опухоли с ее метаболическим профилем, полученным на стадии (б), служит основой для автоматического вычисления категории опухоли. Такое определение категории основано на автоматическом поиске стадии в таблице, базе данных и т.п.

На стадии (г) способа по изобретению категорию исследуемой опухоли определяют, исходя из сходств и различий между метаболическим профилем опухоли и известным метаболическим профилем опухоли определенной категории. Упрощенно, чем выше сходство между известным метаболическим профилем и метаболическим профилем исследуемой опухоли, тем выше вероятность того, что исследуемая опухоль имеет такую же категорию, что и опухоль с известным метаболическим профилем. Очевидно, что существуют статистические методы, общеизвестные в данной области, для оценки и вычисления степени подобия или различия между метаболическим профилем опухоли и известными метаболическими профилями опухолей определенной категории, и использование таких статистических методов является предпочтительным.

Во втором аспекте изобретения предложен способ определения категории опухоли, включающий:

а) МР обнаружение опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигналы ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов аланина, лактата и, возможно, бикарбоната; и

б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли.

Как упоминалось ранее, приведенный выше способ основан на использовании стандартной кривой или нескольких стандартных кривых, которые коррелируют сигнал ¹³С-пирувата и его ¹³С-содержащих метаболитов с гистопатологической стадией опухоли. Указанная стандартная кривая или стандартные кривые представляют собой статистически значимые стандартные кривые, которые могут быть получены от группы пациентов, имеющих определенный тип рака, способом, который описан выше в данном описании.

Описанный выше способ особенно подходит для типов рака с установленными системами определения категории, которые являются более подробными в смысле результатов, чем просто группировка результатов по двухбалльной (низкая или высокая степень агрессивности/злокачественности опухоли) или трехбалльной (низкая, или промежуточная, или высокая степень агрессивности/злокачественности опухоли) системе определения категории. В предпочтительном воплощении описанный выше способ используют для определения категории рака предстательной железы, т.е. для определения категории опухоли в предстательной железе.

Стадия (а) описанного выше способа идентична стадии (а) способа первого аспекта изобретения и, следовательно, все воплощения и предпочтительные воплощения, описанные для стадии (а) способа первого аспекта изобретения и в ее контексте также применимы к стадии (а) способа второго аспекта изобретения.

На стадии (б) описанного выше способа сигналы ¹³С-пирувата и его метаболитов, ¹³С-лактата, ¹³С-аланина и, возможно, ¹³С-бикарбоната, используют для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли.

Так, в одном из воплощений интенсивности спектральных сигналов ¹³С-пирувата и его метаболитов, ¹³С-лактата, ¹³С-аланин и возможно ¹³С-бикарбоната (далее "¹³С-пирувата и его метаболитов") используют для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли. В другом воплощении используют интегралы спектральных сигналов ¹³С-пирувата и его метаболитов. В другом воплощении используют интенсивности сигналов из отдельных изображений ¹³С-пирувата и его метаболитов. В еще одном воплощении для вычисления скорости изменения ¹³С-пирувата и/или его метаболитов интенсивности сигналов получают в двух или более временных точках.

В одном воплощении для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли используют все сигналы, т.е. сигнал ¹³С-пирувата, и ¹³С-лактата, и ¹³С-аланина, и, возможно, ¹³С-бикарбоната. Кроме того, может быть использован суммарный сигнал углерода, т.е. сумма сигналов лактата, аланина, пирувата и возможно бикарбоната. В другом воплощении для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли используют один или более выбранных сигналов. Так, в предпочтительном воплощении используют сигнал лактата, и/или сигнал аланина, и/или суммарный сигнал углерода. В еще одном предпочтительном воплощении используют сигнал лактата и/или суммарный сигнал углерода.

В другом воплощении для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли используют данные по обработке сигналов, например соотношения сигналов, скорректированные сигналы или информация о константе скорости динамики или метаболизма из паттерна сигналов множества МР обнаружений, то есть спектров или изображений. Так, в предпочтительном воплощении для определения категории опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от категории опухоли используют скорректированный сигнал лактата, то есть отношение сигнала лактата к сигналу аланина, и/или сигнала лактата к сигналу пирувата, и/или сигнала лактата к сигналу суммарного углерода. В другом предпочтительном воплощении обработанный сигнал дает в результате число для каждой точки изображения, которое является характеристикой метаболического профиля каждой указанной точки изображения.

В самом простом воплощении стандартная кривая может представлять собой линейную корреляцию между сигналом и гистопатологической категорией опухоли или баллом, например по системе определения категории Глисона. В таком воплощении определение на стадии (б) может быть выполнено "вручную", используя детектированные сигналы или данные, полученных в результате обработки этих сигналов, и сравнивая их с соответствующими сигналами на стандартной кривой, которые образуют одну ось указанной стандартной кривой. Используя стандартную кривую, можно найти соответствующую категорию или балл опухоли по другой оси.

В другом воплощении допускается представление стандартной кривой в форме алгоритма, который выполняет определение категории опухоли или балла опухоли по сигналам, детектированным на стадии (а). Алгоритм может содержать также другие статистические представления в аналитической форме, которые дают возможность оценивать доверительный уровень определения категории опухоли.

В третьем аспекте изобретения предложен набор, содержащий алгоритм, который описан выше, для определения категории опухоли определенного типа рака и инструкции по применению.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 демонстрирует репрезентативные Т2 взвешенные аксиальные изображения (A), T₂ взвешенные изображения с наложенной сеткой, показывающей 0,135 см³ гиперполяризованные ¹³С спектры, соответствующие выбранной патологии (Б), соответствующие спектры (В) и окрашенный Г и Э (гематоксилином и эозином) гистологический срез (Г), взятый из нормальной предстательной железы мыши.

Фиг.2 демонстрирует репрезентативные Т2 взвешенные аксиальные изображения (А), Т₂ взвешенные изображения с наложенной сеткой, показывающей 0,135 см³ гиперполяризованные ¹³С спектры, соответствующие выбранной патологии (Б), соответствующие спектры (В) и окрашенный Г и Э (гематоксилином и эозином) гистологический срез (Г), взятый из предстательной железы мыши TRAMP с первичной опухолью ранней стадии (опухолью низкой категории).

Фиг.3 демонстрирует репрезентативные T₂ взвешенные аксиальные изображения (А), Т₃ взвешенные изображения с наложенной сеткой, показывающей 0,135 см³ гиперполяризованные ¹³С спектры, соответствующие выбранной патологии (Б), соответствующие спектры (В) и окрашенный Г и Э (гематоксилином и эозином) гистологический срез (Г), взятый из предстательной железы мыши TRAMP с первичной опухолью поздней стадии (опухолью высокой категории).

Фиг.4 демонстрирует репрезентативные T₂ взвешенные аксиальные изображения (А), Т₂ взвешенные изображения с наложенной сеткой, показывающей 0,135 см³ гиперполяризованные ¹³С спектры, соответствующие выбранной патологии (Б), соответствующие спектры (В) и окрашенный Г и Э (гематоксилином и эозином) гистологический срез (Г), взятый из предстательной железы мыши TRAMP с первичной опухолью поздней стадии (опухолью высокой категории) и областью метастазирования лимфатического узла.

Фиг.5 демонстрирует суммированные метаболические и гистологические изменения, которые происходили при развитии и прогрессировании опухоли предстательной железы в модели TRAMP, и сравнение их с метаболическим профилем и гистологией нормальной ткани предстательной железы мыши.

Фиг.6 демонстрирует столбиковую диаграмму отношений сигналов гиперполяризованного ¹³C₁-пирувата к шуму и сигналов его ¹³С-содержащих метаболитов аланина и лактата к шуму для нормальной предстательной железы мыши, опухоли предстательной железы ранней стадии мыши TRAMP, опухоли предстательной железы поздней стадии мыши TRAMP и метастазов лимфатических узлов.

Фиг.7 демонстрирует блочную диаграмму отношения сигнала лактата к шуму в зависимости от типа ткани, то есть ткани нормальной предстательной железы мыши, ткани опухоли предстательной железы ранней стадии мыши TRAMP, ткани опухоли предстательной железы поздней стадии мыши TRAMP и метастазов лимфатических узлов.

Фиг.8 демонстрирует график отношения сигнал лактата к шуму в зависимости от суммарного гиперполяризованного углерода для различных типов ткани, то есть ткани нормальной предстательной железы мыши, ткани опухоли предстательной железы ранней стадии мыши TRAMP и ткани опухоли предстательной железы поздней стадии мыши TRAMP.

Примеры

Модель трансгенной аденокарциномы предстательной железы мыши (Transgenic Adenocarcinoma of Mouse Prostate, TRAMP) особенно полезна для исследования метаболических изменений, которые происходят при развитии и прогрессировании рака предстательной железы, поскольку мыши TRAMP демонстрируют гистопатологическое прогрессирование заболевания и ассоциированные метаболические изменения, которые имитируют заболевание у человека. Приведенное ниже исследование показывает количественное определение изменений в метаболизме гиперполяризованного ¹³C₁-пирувата при прогрессировании рака предстательной железы у мышей TRAMP с использованием гистопатологии резецированной злокачественной ткани в качестве стандарта сравнения.

МР обнаружение

Все исследования на нормальных мышах (N=5) и мышах TRAMP (N=4 с первичной опухолью ранней стадии (опухолью низкой стадии), N=5 с первичной опухолью поздней стадии (опухолью высокой стадии)) проводили в соответствии с протоколом, одобренным Институционным комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Сан-Франциско (1). Для всех мышей, включенных в это исследование, в одну из их яремных вен хирургическим путем имплантировали 28 г катетер, который располагали в направлении от спинной поверхности их шеи, по меньшей мере за сутки до гиперполяризованного МР исследования. В момент МР эксперимента мышей анестезировали 1-1,5% изофлураном, и удлинительную трубку длиной 90 см, 24 г, соединяли с катетером яремной вены, используя твердый пластмассовый соединитель (Strategic Applications, Libertyville, IL). Эта специальная удлинительная трубка давала возможность быстро инъецировать гиперполяризованный агент внутри сканера МР для человека, одновременно поддерживая при этом низкий мертвый объем в трубке. Затем мышей помещали на заполненную водой с контролируемой температурой подушку, которая была нагрета примерно до 37°С циркулирующей водой и расположена внутри изготовленной на заказ двойной протон-углеродной T/R катушки. Конструкция катушки состояла из квадратурной ¹³С катушки внутри ¹Н квадратурной катушки с внутренним диаметром 5 см, длиной 8 см и открытыми пазами на верхней поверхности, дающими возможность визуально наблюдать мышь, пока она находится внутри катушки. Вся установка была помещена на стол для пациентов и расположена в отверстии 3 Т сканера GE для человека, оснащенного пакетом для многоядерной спектроскопии.

¹Н-МР изображения получали в сагиттальном, аксиальном и корональном виде, используя 12-взвешенную быструю последовательность спинового эха с FOV (поле обзора) 6 см, матрица 128 × 128, толщиной срезов 1,5 мм без промежутков между срезами, и ТЕ=102 мс/TR=4 с.Сразу после гиперполяризации ¹³C₁-пирувата (21,7±2,0%) и растворения (7,9±0,2), как описано в WO-A-2006/011809, этот раствор быстро переносили в МР сканер, и 350±50 мкл 79 мМ гиперполяризованного пирувата инъецировали мыши с 12-секундным интервалом. Сразу после инъекции выполняли промывку 150 мкл физиологического раствора, чтобы смыть гиперполяризованный пируват из катетера яремной вены и трубок. Двойную последовательность импульсов спин-эха с возбуждением с малым углом переворота, адиабатическим рефокусированием и обратной эхо-планарной траекторией считывания использовали для получения данных in vivo 3D гиперполяризованного ¹³С-МРСИ (магнитно-резонансного спектроскопического исследования) через 35 секунд после начала инъецирования пирувата в яремную вену шести мышам TRAMP (3 с ранней и 3 с поздней стадией опухоли) (1-2). Данные 3D-MPCH снимали с брюшной полости мыши, используя TE/TR 140/215, матрица 8×8×16, FOV 40 мм × 40 мм × 86,4 мм (разрешение 0,135 см³) и время снятия данных 14 секунд.

Для корреляции патологии с протонными изображениями мышей TRAMP сагиттальные, корональные и аксиальные изображения выводили на дисплей портативного компьютера во время вскрытия. Во время вскрытия снимали цифровые фото и видеоизображения, и иссеченные ткани сразу фиксировали в 10% забуференном формалине. После этого фиксированные образцы ткани переносили в 70% этанол и препарировали в парафиновых блоках. Срезы тканевых блоков толщиной 5 микрон получали на микротоме Leica. Срезы высушивали на покровных стеклах и окрашивали, используя стандартный протокол для гематоксилина и эозина. % нормальных, хорошо дифференцированных (ХД), умеренно хорошо дифференцированных (УХД) и плохо дифференцированных (ПД) клеток использовали для классификации опухолей по категориям ранней стадии (категория низкой степени злокачественности) и поздней стадии (категория высокой степени злокачественности) (Таблица 1). Также регистрировали % некроза (Таблица 1).

Таблица 1 TRAMP Макроскопическое определение категории опухоли Гистологическое определение категории % предстательной железы/опухоли или LN (некроза) по категории --- --- Нормальные ХД УХД ПД   MS36 опухоль ранней 1 33 1 65     стадии, низкая степень злокачественности           MS44 опухоль ранней стадии, низкая степень злокачественности 1 94 5 0   MS54 опухоль ранней стадии, низкая степень злокачественности 2 35 35 30   MS72 опухоль ранней стадии, низкая степень злокачественности 15 78 7 0   MS51 опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности 0 0 1 99   MS53 опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности 0 0 0 100   MS61 опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности 0 0 0 100 % некроза LN-MS51R опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности, метастазы в лимфоузлах 2   98 100 ->20 LN-MS51L опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности, метастазы в лимфоузлах 0       ->50 LN-MS53R опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности, метастазы в лимфоузлах 2     98 ->5 LN-MS61 опухоль поздней стадии, опухоль ранней стадии, высокая степень злокачественности, метастазы в лимфоузлах 2     98 ->н/о

Анализ данных и создание метаболических профилей опухоли

Данные МРВ/¹³С МРСИ обрабатывали и выравнивали, используя специальное программное обеспечение. Первичные и метастатические области рака предстательной железы, идентифицированные при патологическом исследовании, отслеживали на соответствующих анатомических изображениях с высоким пространственным разрешением. Каждый объемный элемент изображения, ассоциированный с интересующим типом ткани, интегрировали по заданному частотному диапазону для каждого метаболита. Все интегралы нормировали по шуму, вычисленному для области спектра, которая не содержала никаких метаболитов. Нормированные интегралы для каждого метаболита и типа ткани усредняли вместе для каждого исследования с получением в результате одного метаболического профиля, то есть группы чисел лактата, аланина и пирувата для каждого исследования. Средние значения из различных исследований статистически сравнивали, используя программу JMP для выполнения дисперсионного анализа по этим данным. Если обнаруживали статистически значимое различие, то четыре типа ткани сравнивали попарно, используя t-критерий с коррекцией Тьюки для множественных сравнений. Кроме того, во все статистические критерии была включена модель случайных эффектов для коррекции по какой-либо корреляции, которая могла быть введена в данные в результате включения множественных исследований одного и того же животного.

Результаты

Фиг.1-4 демонстрируют репрезентативные Т2 взвешенные аксиальные изображения (А), Т2 взвешенные изображения с наложенной сеткой, показывающей 0,135 см³ гиперполяризованные ¹³С спектры, соответствующие выбранной патологии (Б), соответствующие спектры (В) и окрашенный Г и Э гистологический срез (Г), взятый из нормальной предстательной железы мыши (Фиг.1), первичной опухоли ранней стадии в предстательной железе мыши TRAMP (Фиг.2), первичной опухоли поздней стадии (Фиг.3) и области метастазирования лимфатического узла (Фиг.4). На Фиг.1 можно видеть, что нормальная предстательная железа мыши является очень маленьким (примерно 0,022 см³) органом, и необходимо было уделять внимание тому, чтобы выбрать объемный элемент изображения, который охватывает предстательную железу мыши, и при этом минимизировать спектральный вклад от окружающей ткани. Этого добивались при последующей обработке воксел-сдвигом обнуленных спектральных данных (пунктирный прямоугольник, реальное разрешение - это сплошная линия) до максимального перекрывания с предстательной железой мыши (1Б). Соответствующие гиперполяризованные ¹³С спектры (1 В) продемонстрировали резонансы для пирувата (173 млн^-1) и продуктов его метаболизма лактата (185 млн^-1) и аланина (178 млн^-1). Резонанс пирувата был самым большим, за ним следовали резонансы лактата, аланина и небольшой резонанс для гидрата пирувата. Подобно здоровой предстательной железе человека, предстательная железа мыши является железистым органом с железистыми эпителиальными клетками, окружающими протоки, удерживаемыми вместе стромальной тканью, как показано на окрашенном Г и Э срезе (1Г).

С развитием опухоли предстательной железы ранней стадии у мыши TRAMP (Фиг.2) размер предстательной железы значительно увеличен, что дает возможность поместить два или более чем два объемных элемента 0,135 см³ полностью внутри опухоли (2Б). В соответствующих гиперполяризованных ¹³С спектрах было резкое возрастание лактата до уровней, которые равны или больше по сравнению с пируватом, а также увеличение отношения площади пика к шуму резонансов пирувата и аланина относительно нормальной предстательной железы мыши. Соответствующая гистопатология (2 В) демонстрирует характерное увеличение числа железистых клеток меньшего размера и потерю объема протоков, а также утолщение стромы, ассоциированное с раком предстательной железы.

При первичном заболевании поздней стадии (Фиг.3) опухоли стали очень большими и по патологии выглядящими как анапластические пласты плеоморфных клеток с неправильными ядрами и очень маленькой цитоплазмой, окружающей ядра, а также с почти полной потерей морфологии протоков и участками некроза (3Г). С этих опухолей можно было получить набор спектров гиперполяризованного ¹³С, и эти спектры показали очень высокие уровни лактата, причем отношения лактата к пирувату значительно выше, чем для ранней стадии (3,4 против 1,2) заболевания. Имела место также метаболическая гетерогенность в этих больших опухолях с вариабельностью отношения лактат/пируват, а также значительно сниженные уровни метаболитов в некротических участках (3 В).

Фиг.4 демонстрирует репрезентативный случай метастазов в лимфатических узлах при опухоли поздней стадии. Гиперполяризованные метаболические данные для метастазов в лимфатических узлах, выраженные в уровнях гиперполяризованного лактата, аланина и пирувата, находились где-то между уровнями, наблюдаемыми в опухолях ранней и поздней стадии. Это могло быть следствием большой гетерогенности метастазов лимфатических узлов по сравнению с первичными опухолями поздней стадии (Таблица 1).

На Фиг.5 суммированы метаболические и гистологические изменения, которые произошли с развитием и прогрессированием рака в модели TRAMP. Фиг.6 представляет собой столбиковую диаграмму отношений гиперполяризованный метаболит/шум между нормальной, ранней стадией, поздней стадией и метастазами в лимфатических узлах. Опухоли ранней стадии показали значительное увеличение сигнала лактата и увеличение сигнала суммарного гиперполяризованного углерода (суммы гиперполяризованного лактата, аланина и пирувата). При прогрессировании опухоли от первичной опухоли ранней стадии до первичной опухоли поздней стадии отношение сигнал гиперполяризованного лактата/шум и суммарный сигнал гиперполяризованного углерода снова значительно повышались. Более важно, что на блочной диаграмме отношение сигнал лактата/шум (лактат SNR) против типа ткани на Фиг.7 продемонстрировано минимальное перекрывание индивидуальных значений для лактата между нормальными тканями, тканями ранней стадии и поздней стадии, хотя имело место перекрывание между ранней стадией и метастазами в лимфатических узлах. Наилучшее разделение нормальной ткани, опухолей ранней стадии и опухолей поздней стадии было получено путем построения графика зависимости гиперполяризованного лактата против суммарного гиперполяризованного углерода (Фиг.8). Только одно нормальное исследование перекрывалось с опухолями ранней стадии, и это нормальное исследование показало более высокий уровень как лактата, так и суммарного гиперполяризованного углерода по сравнению с другими исследованиями нормальной ткани.

Группа изобретений относится к медицине, диагностике, магнитно-резонансным (МР) способам определения степени активности опухоли с применением среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват. При этом детектируют сигнал ¹³С-пирувата и/или сигнал его ¹³C-содержащих метаболитов, выбранных из группы: аланин, лактат, бикарбоната. Используют эти сигналы и, возможно, суммарного углеродного сигнала для формирования метаболического профиля опухоли, который сравнивают с известным метаболическим профилем опухоли определенной степени активности, определяя ее степень активности исходя из сходств и различий между указанным метаболическим профилем опухоли и указанным известным метаболическим профилем. Вариантом способа является определение степени активности опухоли из стандартной кривой зависимости указанных сигналов от степени активности опухоли. Группа изобретений обеспечивает определение степени агрессивности, злокачественности опухоли в зависимости от степени дифференциации ее клеток, степени отличия клеток опухоли от клеток нормальной ткани, из которой они произошли. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 пр., 1 табл.

1. Способ определения степени активности опухоли, включающий
а) магнитно-резонансное (МР) обнаружение опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигнал ¹³С-пирувата, и/или детектируют сигнал его ¹³C-содержащего метаболита аланина, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита лактата, и возможно детектируют сигнал его ¹³C-содержащего метаболита бикарбоната;
б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для формирования метаболического профиля опухоли;
в) сравнение метаболического профиля опухоли, сформированного на стадии (б), с известным метаболическим профилем опухоли определенной степени активности; и
г) определение степени активности опухоли, исходя из сходств и различий между указанным метаболическим профилем опухоли и указанным известным метаболическим профилем.

2. Способ по п.1, при котором на стадии (б) используют сигналы лактата и/или суммарный сигнал углерода.

3. Способ по п.1 или 2, при котором известный метаболический профиль получен путем МР обнаружения опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, где детектируют сигнал ¹³С-пирувата, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита аланина, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита лактата, и возможно детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита бикарбоната; и использования указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для формирования метаболического профиля опухоли.

4. Способ определения степени активности опухоли, включающий
а) МР обнаружение опухоли у субъекта с использованием среды для визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигнал ¹³С-пирувата, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита аланина, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита лактата, и возможно детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита бикарбоната; и
б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для определения степени активности опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от степени активности опухоли.

5. Способ по п.4, при котором на стадии (б) используют сигналы лактата и/или суммарный сигнал углерода.

6. Способ по п.1 или 4, который представляет собой способ определения степени активности опухоли предстательной железы.

7. Применение гиперполяризованного ¹³С-пирувата для изготовления среды для МР визуализации, используемой в способе определения степени активности опухоли, включающем стадии:
а) МР обнаружение опухоли у субъекта с использованием указанной среды для МР визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигнал ¹³С-пирувата, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита аланина, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита лактата, и возможно детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита бикарбоната;
б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для формирования метаболического профиля опухоли;
в) сравнение метаболического профиля опухоли, сформированного на стадии (б), с известным метаболическим профилем опухоли определенной степени активности; и
г) определение степени активности опухоли, исходя из сходств и различий между указанным метаболическим профилем опухоли и указанным известным метаболическим профилем.

8. Применение гиперполяризованного ¹³С-пирувата для изготовления среды для МР визуализации, используемой в способе определения степени активности опухоли, включающем стадии:
а) МР обнаружение опухоли у субъекта с использованием указанной среды для МР визуализации, содержащей гиперполяризованный ¹³С-пируват, при котором детектируют сигнал ¹³С-пирувата, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита аланина, и/или детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита лактата, и возможно детектируют сигнал его ¹³С-содержащего метаболита бикарбоната;
б) использование указанных сигналов и возможно суммарного сигнала углерода для определения степени активности опухоли из стандартной кривой зависимости таких сигналов от степени активности опухоли.

9. Применение по п.7 или 8, где указанный способ представляет собой способ определения степени активности опухоли предстательной железы.