КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КИШЕЧНИКА Российский патент 2013 года по МПК C12N5/783 A61K35/14 A61P37/06 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области лечения воспалительного состояния кишечника. Изобретение в частности относится к способам лечения воспалительных заболеваний кишечника и кишечного воспаления, связанного с пищевой непереносимостью или аллергией, с помощью медикамента, включающего человеческие Тr1 клетки, направленные против пищевого антигена из обычного рациона человека.

Уровень техники

Термин «воспалительное состояние кишечника», как применяется здесь, относится к воспалительному заболеванию кишечника и воспалению, связанному с пищевой непереносимостью или аллергией.

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) относится к группе заболеваний, включающей болезнь Крона и язвенный колит. Эти два заболевания часто объединяют вместе из-за сходного патогенеза и клинических проявлений. При отсутствии инвазивных исследований для получения изображения невозможно различить эти два заболевания, которые часто рассматриваются как одно заболевание в ряде публикаций и исследований. Окончательный диагноз того и другого заболевания требует таких исследований для получения изображения, как эндоскопия (сигмоидоскопия или колоноскопия), ирригоскопия с двойным контрастированием и компьютерная томография (КТ), объединенных с лабораторными анализами, включающими полный анализ крови для выявления повышенных уровней лейкоцитов, определение скорости осаждения эритроцитов и концентрации сывороточного альбумина.

Оба заболевания являются хроническими, рецидивирующими/ремитирующими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Участками желудочно-кишечного тракта, наиболее часто поражаемыми при болезни Крона, являются тонкий кишечник и толстый кишечник, также называемый толстой кишкой, включая прямую кишку; однако при болезни Крона может поражаться весь желудочно-кишечный тракт от рта до анального отверстия. Могут присутствовать единичные или множественные участки воспаления. При язвенном колите поражается только толстая кишка. Воспаления и изъязвление при язвенном колите ограничено слизистым и подслизистым слоем, двумя самыми внутренними слоями из четырех слоев толстого кишечника. Воспаление и изъязвление при болезни Крона может распространяться на все слои стенки кишечника, как в тонком, так и в толстом кишечнике. Общие симптомы заболеваний включают диарею, боль в животе, кровотечение из прямой кишки и потерю веса. Осложнения болезни Крона включают кишечные абсцессы, свищи, нарушение прохождения из одной части кишечника в другую с прохождением жидкостей или секретов, и непроходимость кишечника. Обычно течение обоих заболеваний является перемежающимся, с обострениями заболевания, сопровождающимися периодами ремиссии. Однако язвенный колит может быть единичным событием или длительным с неослабевающими симптомами.

Хотя имеется много вариантов выбора для терапевтических вмешательств при ВЗК, многие из них обладают нежелательными побочными эффектами, что делает их менее подходящими для лечения хронического заболевания. При умеренном язвенном колите первой линией лечения типично являются перорально или местно (т.е. клизмой) доставляемые аминосалицилаты. Класс аминосалицилатов состоит из агентов, содержащих 5-аминосалициловую кислоту (5-АСА), одно из самых старых противовоспалительных соединений, применяющихся при ВЗК. Применяемые в высоких дозах 5-АСА могут вызвать ремиссию при острых приступах. Хотя 5-АСА обычно применяют для поддерживающей терапии, не было продемонстрировано, что они являются эффективными для поддержания ремиссии. Обычно применяемые рецептуры 5-АСА включают сульфасалазин, пероральный и местный мезаламин, ольсалазин и балсалазид. Различные рецептуры модифицированы для обеспечения доступного активного лекарственного средства для интересующего участка (например, тонкого или толстого кишечника). Однако побочные эффекты для 5-АСА не являются редкими.

Кортикостероиды относятся к наиболее эффективным агентам для индукции ремиссии при приступах ВЗК и обычно являются вторым терапевтическим вариантом при неудачном лечении с 5-АСА. Соединения доставляют в первую очередь перорально или ректально, с сопутствующим применением 5-АСА или без него. При неудачной пероральной доставке соединения применяют внутривенно. В идеале кортикостероиды применяют только в течение короткого курса лечения и постепенно снижают при ремиссии заболевания. Кортикостероиды, обычно применяемые для лечения ВЗК, включают преднизон, будесонид и гидрокортизон. Применение кортикостероидов ограничено рядом тяжелых и существенных побочных эффектов, связанных с их использованием. Обычные побочные эффекты при кратковременном применении включают бессонницу, ночную испарину, изменения настроения и нарушенный метаболизм глюкозы. Длительная поддерживающая терапия обычно откладывается только для тяжелых, невосприимчивых случаев. Длительная терапия может вести к атрофии надпочечников, в то время как резкое прекращение может вызывать недостаточность надпочечников, гипотензию и даже смерть. Другие побочные эффекты включают угревую сыпь, аномальное отложение жира, избыточный рост волос и остеопороз. При болезни Крона кортикостероиды могут нарушать заживление свища, обостряя болезненное состояние.

Индивидуумам, отвечающим на пероральные или ректальные кортикостероиды, часто назначают поддерживающую дозу 5-АСА. Однако некоторые врачи не обеспечивают фармакологические вмешательства во время периодов ремиссии. Индивидуумы, которым необходима терапия внутривенными кортикостероидами, обычно поддерживаются такими иммуносупрессивными агентами, как 6-меркаптопурин и/или азатиоприн, в комбинации с 5-АСА. При таком тяжелом заболевании обычно назначают парентеральное питание. Когда пациент не отвечает на вышеуказанные виды терапии, может применяться иммуносупрессант циклоспорин, чтобы попытаться избежать хирургического вмешательства для удаления отрезка пораженной кишки. Иммуносупрессивное вмешательство не лишено побочных эффектов. 6-Меркаптопурин и азатиоприн могут вызывать жар, сыпь, тошноту и головную боль, с более тяжелыми побочными эффектами, включающими лейкопению, панкреатит, тяжелые инфекции и супрессию костного мозга. Циклоспорин может оказывать более тяжелые побочные эффекты, включая парестезии (аномальные ощущения, такие как чувство жжения или покалывания), избыточный рост волос, гипертензию, тремор, почечную недостаточность, головную боль и оппортунистические инфекции.

Антибиотики, обычно ципрофлоксацин или метронидазол, применяют в качестве дополнения к терапии 5-АСА или кортикостероидами, особенно у пациентов со свищами или заболеванием толстой кишки. Как и при других видах терапии, при долговременном лечении антибиотиками имеются побочные эффекты.

Инфликсимаб и адалимумаб в настоящее время являются последним средством фармакотерапии воспалительных заболеваний кишечника. Инфликсимаб является химерным моноклональным антителом, состоящим из 75% человеческого и 25% мышиного белка, в то время как адалимумаб является полностью гуманизированным антителом. Инфликсимаб и адалимумаб являются ингибиторами фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), мощного воспалительного цитокина. Лекарство действует как акцептор, связывающий как растворимый, так и мембранно-связанный ФНО-α. Путем ингибирования активатора, высоко активного в воспалительном каскаде, можно ингибировать ряд воспалительных путей. Лекарственное средство применяют внутривенно в начале лечения и далее в качестве поддерживающего лекарственного средства каждые восемь недель, как указано на этикетке продукта. Однако, поскольку он является биологическим агентом, иммунный ответ может ограничивать пользу лекарственного средства.

Таким образом, иммуносупрессивные агенты обычно назначают вместе с поддерживающей терапией инфликсимабом. Как и у всех других видов лечения воспалительных заболеваний кишечника, у инфликсимаба имеются существенные побочные эффекты. ФНО-α играет важную роль в удалении неопластических клеток; таким образом, его супрессия может вести к оппортунистическим инфекциям, новообразованиям и другим осложнениям, в особенности при долговременной стратегии.

Хирургические вмешательства являются способом обработки при воспалительных заболеваниях кишечника, но не способом излечения. Из-за хронической природы ВЗК и относительно раннего возраста проявления, могут требоваться множественные вмешательства на протяжении жизни пациентов, не отвечающих на фармакологические вмешательства. Удаление коротких участков кишечника возможно без существенных побочных эффектов. Однако удаление больших или многочисленных сегментов кишечника может привести к синдрому короткого кишечника, при котором индивидуумы неспособны абсорбировать питательные вещества. Удаление частей толстого кишечника может приводить к необходимости колостомии или других дополнительных хирургических процедур. Таким образом, хирургия не является предпочтительным способом лечения воспалительных заболеваний кишечника. Хирургические вмешательства для лечения воспалительных заболеваний кишечника могут приводить к другому заболеванию. При полном удалении толстой кишки хирургом может быть сконструирован карман подвздошной кишки из тонкого кишечника, чтобы обеспечить выведение кала через анальное отверстие, не требующее постоянной стомы. Паучит является неспецифическим воспалением кармана подвздошной кишки, обычно развивающимся в пределах первых двух лет после реконструкции. Симптомы включают постоянно возрастающую частоту стула, которая может сопровождаться недержанием, кровотечением, жаром и/или ощущением позыва. У тех, кто страдает язвенным колитом, примерно у 20-30 процентов отмечается, по крайней мере, один эпизод. Антибиотики могут быть достаточными для лечения паучита; однако требуются другие более агрессивные виды лечения, подобные применяемым при ВЗК.

Среди недавних новых терапевтических подходов к лечению воспалительных заболеваний кишечника, W02007/027132 раскрывает способ лечения указанных заболеваний, включающий применение регуляторных CD4+CD25+Т-клеток, собранных из сигнальных лимфоузлов пациента и выращенных in vitro.

Другой тип воспалительного состояния кишечника обусловлен пищевой непереносимостью или аллергией. Люди часто страдают от более или менее тяжелых аллергических реакций или реакций непереносимости после потребления пищевых белков. Распространенность пищевой аллергии или непереносимости составляет примерно 1-2% у взрослых и 6-8% у детей. Пищевая аллергия или непереносимость главным образом связана с ограниченным диапазоном пищевых продуктов, главным образом с арахисом, древесными орехами, куриными яйцами, коровьим молоком, пшеницей (глютеном), соей, рыбой и моллюсками.

На сегодняшний день нет эффективного лечения пищевой аллергии или непереносимости. Большинство индивидуумов, страдающих аллергией или непереносимостью, приспосабливаются к своему положению, избегая потребления продуктов питания, к которым у них развита аллергия или непереносимость. Виды лечения, включающие лекарственные средства, такие как антигистаминные средства, деконгестанты или стероиды, являются доступными, но противодействуют только симптомам непереносимости или аллергической реакции. Они не предотвращают новые аллергические реакции или новые реакции непереносимости при дальнейшем воздействии аллергена или пищевых белков.

Таким образом, в настоящем изобретении Заявитель ставит целью обеспечение лечения воспалительного состояния кишечника на основе применения Тr1 клеток, которые отличаются от регуляторных CD4+CD25+Т-клеток.

Groux et al. (Nature 1997, 389: 737-742) описывает, что перенос антиген(овальбумин)-специфических Тr1 клеток предотвращает развитие воспалительного заболевания кишечника, индуцированного патогенными Т-клетками с высокой экспрессией CD4+CD45RB у мышей, только когда указанные Тr1 клетки стимулированы in vivo антигеном (в данном случае, путем скармливания мышам овальбумина). Кроме того, Foussat et al. (Journal of Immunology 2003, 171: 5018-5026) описывает, что совместное применение антиген(овальбумин)-специфических Тr1 клеток и антигена (овальбумина в питьевой воде) лечит имеющееся воспалительное заболевание кишечника у мышей. Совместное применение антигена было необходимым, чтобы Тr1 клетки были эффективными.

В соответствии с настоящим изобретением изобретатели намереваются обеспечить лечение воспалительного состояния кишечника у субъекта, нуждающегося в лечении, где указанное лечение основано на уникальном применении Тr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека. В частности, изобретатели удивительно установили, что указанные Тr1 клетки, направленные против пищевого антигена из обычного рациона человека, не нуждаются в совместном применении с антигеном, в отношении которого Тr1 клетки являются эффективными.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение направлено на композицию, включающую, по крайней мере, одну популяцию Тr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека.

Указанный пищевой антиген из обычного рациона человека предпочтительно выбран из группы, включающей бычьи антигены, Сa-связывающий S100, альфа-лактальбумин, лактоглобулины, такие как бета-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, казенны, антигены атлантического лосося, куриные антигены, овальбумин, Ag22, кональбумин, лизоцим или куриный сывороточный альбумин, антигены креветки, антигены пшеницы, антигены сельдерея, антигены моркови, антигены яблока, липидпереносящий белок яблока, профилин яблока, антигены груши, изофлавон-редуктазу, антигены авокадо, антигены абрикоса, антигены персика, антигены сои, арахиса, овальбумин, их фрагменты, варианты и смеси. Предпочтительно указанный пищевой антиген является овальбумином, казеином, бета-лактоглобулином, соевым белком, глиадином, антигеном арахиса, их фрагментами, вариантами и смесями.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение медикамента или фармацевтической композиции, включающей композицию изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения воспалительного состояния кишечника у нуждающегося в лечении субъекта, включающему применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента или фармацевтической композиции изобретения.

В предпочтительном воплощении изобретения указанный способ предназначен для лечения воспалительного заболевания кишечника. В одном воплощении изобретения указанное воспалительное заболевание кишечника является болезнью Крона. В другом воплощении изобретения указанное воспалительное заболевание кишечника является язвенным колитом.

В другом предпочтительном воплощении изобретения указанный способ предназначен для лечения воспаления кишечника, связанного с пищевой аллергией или непереносимостью. В одном воплощении указанная пищевая непереносимость является целиакией. В другом воплощении указанная пищевая аллергия является аллергией на молочный белок. В другом воплощении указанная пищевая аллергия является аллергией на арахис. В другом воплощении указанная пищевая аллергия является аллергией на овальбумин.

В предпочтительном воплощении медикамент или фармацевтическая композиция для применения у субъекта, нуждающегося в лечении, включает человеческие Тr1 клетки, аутологичные клеткам указанного субъекта.

В другом воплощении настоящего изобретения способ лечения воспалительного состояния кишечника у субъекта, нуждающегося в лечении, включает применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента или фармацевтической композиции изобретения в комбинации с другим терапевтическим агентом, применяемым для лечения воспалительных состояний кишечника.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Профиль экспрессии цитокинов мышиными Тr1 лимфоцитами против белков рыбы и мышиными Тr1 лимфоцитами против белков сои. (А)

Продукция ИЛ-4, ИЛ-10 и ИФН-γ мышиными Тr1 клетками против белков рыбы. (В) Продукция ИЛ-4, ИЛ-10 и ИФН-γ мышиными Тr1 клетками против белков сои.

Фигура 2: Контроль воспалительного колита у мышей мышиными Тr1 клетками против белков рыбы и против белков сои. (А и В) Анализ потери веса. (С) Продукция ИФН-γ мышиными Тr1 клетками против белков сои.

Фигура 3: Профили цитокинов и профили экспансии овальбумин-специфических Тr1 клонов от здоровых доноров. Пример 2 различных клонов. (А) Выходы экспансии специфичных к овальбумину Тr1 клонов оценивали подсчетом клеток раз в неделю при еженедельной стимуляции с искусственной линией фидерных клеток, полученных от дрозофилы. (В) Тr1 клоны оценивали на их специфичность к овальбумину после специфической активации в течение двух суток в присутствии антиген-презентирующих клеток. Овальбумин-специфическую продукцию ИЛ-10 измеряли в надосадочной жидкости с помощью ИФА на трех клонах, взятых в качестве примера качественного контроля анализа. Результаты выражены в виде дельта-функции продукции ИЛ-10 между условиями стимуляции с овальбумином и без него. (С) Тr1-специфический профиль продукции цитокинов оценивали с помощью ИФА в надосадочной жидкости анти-СВ3+анти СП28-активированных Тr1 клонов.

Фигура 4: Супрессивная активность овальбумин-специфического Тr1 клона. Пример 2 различных клонов. (А) Супрессивная активность ступенчато изменяющейся концентрации альбумин-специфических Тr1 клонов в отношении пролиферации аутологичных CD4+Т-клеток в совместной культуре. (В) Супрессивная активность разбавленных надосад очных жидкостей от культур активированных овальбумином Тr1 клонов в отношении аутологичных CD4+Т-клеток. (С) Блокада Т-клеточной пролиферации, опосредованной надосадочными жидкостями культур Tr1, с помощью моноклональных антител к ИЛ-10 и ТРФ-бета.

Фигура 5: Фенотип овальбумин-специфических Tr1 клонов. Экспрессию поверхностных CD25, GITR и внутриклеточных Fox3 и CTLA-4 оценивали проточной цитометрией овальбумин-специфических Tr1 клонов. (В) Кинетику экспрессии маркеров оценивали после активации (0 сутки) и в течение 14 суток в культуре при отсутствии стимулов.

Фигура 6: Исследование кариотипа овальбумин-специфического Tr1 клона, размноженного in vitro с фидерными клетками, полученными от дрозофилы, после более чем 30 делений.

Фигура 7: Профили цитокинов и экспансии овальбумин-специфических Tr1 клонов от пациентов с болезнью Крона. (А) Tr1 клоны оценивали на их специфичность к овальбумину после антиген-специфической активации в течение двух суток в присутствии антиген-презентирующих клеток. Овальбумин-специфическую продукцию ИЛ-10 измеряли в надосадочной жидкости с помощью ИФА у трех клонов, взятых в качестве примера качественного контроля анализа. Результаты выражены в виде дельта-функции продукции ИЛ-10 между условиями стимуляции с овальбумином и без него. (В) Tr1-специфический профиль продукции цитокинов оценивали с помощью ИФА в надосадочной жидкости анти-СВ3+анти СВ28-активированных Tr1 клонов. (С) Выходы экспансии двух специфичных к овальбумину Tr1 клонов оценивали путем подсчета клеток раз в неделю после недельной стимуляции с искусственной линией фидерных клеток, полученных от дрозофилы.

Фигура 8: Анализ ремиссии пациентов. Анализ ИАБК (А), боли в животе (В) или частоты жидкого или мягкого стула в неделю (С) и шкалы самочувствия (D).

Осуществление изобретения

Определения

Термин «Tr1 клетки», применяемый здесь, относится к клеткам, имеющим следующий фенотип в состоянии покоя CD4+CD25-FoxP3- и способным секретировать высокие уровни ИЛ-10 и низкие или средние уровни ТРФ-(3 при активации. Tr1 клетки характеризуются, в частности, своим уникальным цитокиновым профилем: они продуцируют высокие уровни ИЛ-10, значительные уровни ТРФ-β и промежуточные уровни ИФН-γ, но продуцируют мало или совсем не продуцируют ИЛ-4 и ИЛ-2,

Продукцию цитокинов обычно оценивают в культурах клеток после активации поликлональными активаторами Т-лимфоцитов, такими как анти-СВ3+анти-СВ28 антитела или интерлейкин-2, ФМА+иономицин. Альтернативно, продукцию цитокнов оценивают в культурах клеток после активации специфическим Т-клеточным антигеном, представленным антиген-презентирующими клетками. Высокие уровни ИЛ-10 соответствуют, по крайней мере, 500 мкг/мл, обычно больше примерно 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 тысяч пкг/мл или больше. Значительные уровни ТРФ-β соответствуют, по крайней мере, примерно 100 пкг/мл, обычно выше примерно 200, 300, 400, 600, 800 или 1000 пкг/мл или больше. Промежуточные уровни ИФН-γ соответствуют концентрациям, включающим между 0 пкг/мл и, по крайней мере, 400 пкг/мл, обычно выше примерно 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 200 пкг/мл или больше. Малые или отсутствующие концентрации ИЛ-4 и ИЛ-2 соответствуют менее чем примерно 500 пкг/мл, предпочтительно меньше примерно 250, 100, 75 или 50 пкг/мл, или меньше.

Термин «антиген», применяемый здесь, относится к белку или пептиду, для модуляции которого применяются клетки данного изобретения, или предназначенному для применения в любом из способов настоящего изобретения. В одном воплощении термин «антиген» может относиться с синтетически полученной молекуле, или к природной молекуле, разделяющей гомологию последовательности с интересующим антигеном, или структурную гомологию с интересующим антигеном, или их комбинацию. В одном воплощении антиген может быть миметопом. «Фрагмент» антигена относится к любой субпопуляции антигена, в виде более короткого пептида. «Вариант» антигена относится к молекуле, по существу подобной целому антигену или его фрагменту. Варианты антигенов могут быть просто приготовлены прямым химическим синтезом варианта пептида, с помощью способов, хорошо известных в данной области техники.

Термин «субъект», применяемый здесь, относится к человеку.

Термин «эффективное количество», применяемый здесь, относится к количеству, достаточному для того, чтобы добиться благоприятного или необходимого клинического результата (например, улучшения клинического состояния).

Термин «клон» или «популяция клона», применяемый здесь, относится к популяции дифференцированных клеток, полученных из одной дифференцированной клетки.

Термин «лечение» или «обработка», применяемый здесь, в целом относится к клиническому вмешательству с целью изменения природного течения болезни у индивидуума, которого лечат, и может выполняться при клинической патологии. Необходимые эффекты включают без ограничения, облегчение симптомов, супрессию, уменьшение или подавление любого прямого или непрямого патологического последствия заболевания, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или смягчение болезненного состояния, и индукцию ремиссии или улучшение прогноза.

Настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного состояния кишечника у нуждающегося субъекта, включающему применение у указанного субъекта композиции, включающей человеческие Tr1 клетки, направленные против пищевого антигена из обычного рациона человека.

В соответствии с изобретением, изобретатели намереваются обеспечить лечение воспалительного состояния кишечника у нуждающегося субъекта, где указанное лечение основано на уникальном применении Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека. В частности, изобретатели удивительно установили, что указанные Tr1 клетки, направленные против пищевого антигена из обычного рациона человека, не нуждаются в совместном применении с антигеном, в отношении которого Tr1 клетки эффективны.

Таким образом, настоящее изобретение представляет преимущество в отсутствии потребности в совместном применении или совместном лечении, которые являются сложными в плане регуляторных вопросов.

Термин «пищевой антиген из обычного рациона человека» относится к иммуногенному пептиду из пищевых продуктов, обычных для человека, таких как пищевые антигены из следующего не-ограничивающего перечня: бычьи антигены, такие как липокаин, Са-связывающий S100, альфа-лактальбумин, лактоглобулины, такие как бета-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, казеины. Пищевыми антигенами могут также быть антигены атлантического лосося, такие как парвальбумин, куриные антигены, такие как овомукоид, овальбумин, Ag22, кональбумин, лизоцим или куриный сывороточный альбумин, антигены арахиса, антигены креветки, такие как тропомиозин, антигены пшеницы, такие как агглютинин или глиадин, антигены сельдерея, такие как профилин сельдерея, антигены моркови, такие как профили моркови, антигены яблока, такие как тауматн, липидпереносящий белок яблока, профилин яблока, антигены груши, такие как профилин груши, изофлавон-редуктаза, антигены авокадо, такие как эндохитиназа, антигены абрикоса, такие как липидпереносящий белок абрикоса, антигены персика, такие как липидпереносящий белок персика или профилин персика, антигены сои, такие как HPS, профилин сои или белок (SAM22) PR-10.

Не желая связываться теорией. Заявитель предполагает, что введенная популяция Tr1 клеток, направленных к пищевому антигену из обычного рациона человека, будет активироваться in vivo пищевым антигеном, присутствующим в ткани кишечника после потребления обычного рациона, и затем будет способна контролировать воспалительные состояния кишечника, такие как воспалительное заболевание кишечника и воспаление, связанное с пищевой аллергией или непереносимостью.

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей, по крайней мере, одну популяцию, направленную против пищевого антигена из обычного рациона человека.

В одном воплощении изобретения человеческие Tr1 могут быть получены путем:

a) выделения популяции клеток-предшественников у субъекта;

b) получения популяции дендритных клеток при культивировании популяции указанных клеток-предшественников в присутствии IL-10;

c) осуществления контакта клеток с этапа b) с популяцией CD4+Т-лимфоцитов, выделенных от указанного субъекта в присутствии пищевого антигена для обеспечения дифференцировки CD4+Т-клеток, направленных к указанному антигену, в популяцию Tr1 клеток, и

d) извлечения популяции Tr1 клеток с этапа с).

На этапе b) ИЛ-10 присутствует в культуральной среде в количестве от 50 до 250 Ед/мл, предпочтительно 100 Ед/мл. Указанный способ получения Tr1 клеток описан Wakkach et al. (Immunity 2003 May; 18(5):605-17).

Указанный способ может также проводиться с применением дексаметазона и витамина D3 или толерогенизованных или незрелых ДК вместо ДК с этапа b).

В другом воплощении настоящего изобретения Tr1 клетки человека могут быть получены путем:

a) культивирования популяции CD4+Т-клеток, направленных к пищевому антигену, выделенному у субъекта, в среде с подходящим количеством IFN-α,

b) извлечения популяции Tr1 клеток.

ИФН-α предпочтительно присутствует в среде в количестве 5 нг/мл. На этапе а) среда может дополнительно включать подходящее количество IL-10, предпочтительно 100 Ед/мл.

На этапе b) популяцию Tr1 клеток культивируют в среде, включающей ИЛ-15 для обеспечения пролиферации, при этом IL-15 содержится в среде предпочтительно в количестве 5 нг/мл. Указанный способ получения Tr1 клеток описан в патенте US6746670.

В еще одном воплощении изобретения Tr1 клетки человека могут быть получены путем:

а) in vitro активации популяции CD4+Т-клеток в присутствии пищевого антигена, представленного клетками, презентирующими искусственный антиген,

b) извлечения активированных CD4+Т-клеток, включающих по крайней мере 10% Tr1 клеток.

Предпочтительно клетки, презентирующие искусственный антиген, экспрессируют молекулу HLA II системы человеческую LFA-3 молекулу и не экспрессируют ко-стимулирующие молекулы В7-1, В7-2, В7-Н1, CD40, CD23 и ICAM-1.

Указанный процесс получения Tr1 клеток описан в заявке на патент W002/092793.

В еще одном воплощении изобретения человеческие Tri клетки могут быть получены путем:

a) in vitro активации популяции CD4+Т-клеток в присутствии пищевого антигена и подходящего количества ИЛ-10;

b) извлечения популяции Tr1i клеток.

Предпочтительно ИЛ-10 присутствует в среде в концентрации 100 Ед/мл. Указанный способ описан Groux et al. (Nature 1997, 389(6652):737-42).

В еще одном воплощении изобретения человеческие Tr1 клетки могут быть получены путем:

a) стимуляции популяции лейкоцитов или мононуклеарных клеток периферической крови (МНК ПК) пищевым антигеном;

b) извлечения популяции антиген-специфических Tr1 клеток из стимулированной популяции;

c) факультативно размножения указанной популяции антиген-специфических Tr1 клеток.

Лейкоциты охватывают несколько типов клеток, которые характеризуются по своей значимости, своему распределению, своему количеству, своей продолжительности жизни и своему потенциалу. Их типы являются следующими: полинуклеарные или гранулярные лейкоциты, среди которых находятся эозинофильные, нейтрофильные и базофильные лейкоциты и мононуклеарные клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК), которые являются большими белыми клетками крови и составляют типы клеток иммунной системы (лимфоциты и моноциты). Лейкоциты или МНК ПК могут быть отделены от периферической крови любым способом, известным специалистам в данной области техники. Для выделения МНК ПК может выгодно применяться центрифугирование, предпочтительно центрифугирование в градиенте плотности. Альтернативой является применение специфических моноклональных антител. В конкретных воплощениях МНК ПК типично выделяются типично выделяют из цельной крови с помощью Ficoll-Hypaque, с применением стандартных процедур. В других воплощениях МНК ПК выделяют с помощью лейкофереза. Указанный способ описан в заявке на патент W02007/010406.

В еще одном воплощении, человеческие Tr1 клетки могут быть получены путем:

a) культивирования популяции лейкоцитов или популяции мононуклеарных клеток периферической крови (МНК ПК) с мезенхимальными стволовыми клетками в присутствии пищевого антигена,

b) извлечения популяции Tr1 клеток.

Указанный способ может также осуществляться с наивными Т-клетками или Т-клетками памяти вместо МНК ПК или лейкоцитов.

Популяция Tr1 клеток, полученная таким образом, может дополнительно быть размножена в культуре в присутствии цитокинов, таких как интерлейкин-2 и интерлейкин-4. Альтернативно, интерлейкин-15 и интерлейкин-13 также могут применяться в культурах для размножения Tr1 клеток.

В способах, описанных выше, человеческие Tr1 клетки могут быть охарактеризованы путем способа идентификации, описанного в W02005/000344. Указанный способ идентификации Tr1 клеток основан на обнаружении одновременного присутствия продуктов экспрессии генов, кодирующих CD4 молекулу и молекулы из группы, включающей CD 18 и/или CD 11а, и CD49b. Tr1 клетки могут быть идентифицированы и/или очищены путем ИФА, проточной цитометрии, или иммуноаффинными способами с антителами, направленными против указанных маркеров.

Tr1 клетки также могут быть обогащены путем позитивной селекции или негативной селекции с применением проточной цитометрии или магнитных бус. Такие способы также описаны в W02005/000344.

В другом воплощении настоящего изобретения Tr1 клетки, направленные к пищевому антигену из обычного рациона человека, могут быть размножены с помощью in vitro способа, описанного BW02006/108882. Указанный способ включает:

а) культивацию при температуре Т1 ниже 35°С, в культуральной среде Mf, фидерных клеток, таких как фидерные клетки насекомых, где указанная температура Т1 обеспечивает пролиферацию фидерных клеток и где указанные фидерные клетки экспрессируют факторы, взаимодействующие со следующими белками клеточной поверхности:

- CD3/TCR комплекс,

- CD28 белок,

- IL-2 рецептор,

- CD2 белок,

- IL-2 рецептор,

b) осуществления контакта фидерных клеток, полученных на этапе а), отмытых или не отмытых от их культуральной среды Mf, с популяцией Tr1 клеток, содержащейся в культуральной среде Мр, где указанная культуральная среда Мр исходно не содержит факторы, перечисленные на этапе а), чтобы получить смесь, содержащую популяцию Tr1 клеток, фидерных клеток и культуральной среды Мр,

c) культивации смеси, полученной на этапе b), при температуре Т2, составляющей, по крайней мере, 35°С, где указанная температура выбрана так, чтобы популяция Tr1 клеток пролиферировала, а фидерные клетки не пролиферировали,

d) извлечения популяции Tr1 клеток, размноженных таким образом.

Примеры факторов, взаимодействующих с вышеупомянутыми поверхностными клеточными белками, включают:

- модифицированные анти-СВ3 антитела, в которых анти-СВ3 внутрицитоплазматический домен CD3 тяжелой цепи заменен трансмембранным доменом,

- CD80 или CD86 белок,

- IL-2, секретируемый фидерными клетками,

- CD58 белок,

- интерлейкин, выбранный из группы, включающей IL-4 и IL-13.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения указанные Tr1 клетки, направленные к пищевому антигену из обычного рациона человека, могут быть клонированы с применением обычных способов клонирования Т-клеток.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения указанная композиция, включающая, по крайней мере, одну популяцию Tr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, или, по крайней мере, один клон Tr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, может быть заморожена для хранения.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения указанный пищевой антиген из обычного рациона человека выбран из группы, включающей бычьи антигены, Са-связывающий S100, альфа-лактальбумин, лактоглобулины, такие как бета-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, казеины, антигены атлантического лосося, куриные антигены, овальбумин, Ag22, кональбумин, лизоцим или куриный сывороточный альбумин, антигены креветки, антигены пшеницы, такие как глютеновые белки: глиадин, антигены сельдерея, антигены моркови, антигены яблока, липидпереносящий белок яблока, профилин яблока, антигены груши, изофлавон-редуктазу, антигены авокадо, антигены абрикоса, антигены персика, антигены сои, арахиса, их фрагменты, варианты и смеси. Предпочтительно пищевой антиген является рекомбинантньш или синтезированным антигеном. Предпочтительно указанный пищевой антиген из обычного рациона человека не является глиадином.

Предпочтительно указанным пищевым антигеном из обычного рациона человека является овальбумин, казеин, бета-лактоглобулин, соевый белок, глиадин, антиген арахиса, их фрагменты, варианты и смеси.

Более предпочтительно указанным пищевым антигеном из обычного рациона человека является овальбумин, его фрагменты и варианты.

Более предпочтительно указанным пищевым антигеном из обычного рациона человека является глиадин, его фрагменты и варианты.

Более предпочтительно указанным пищевым антигеном из обычного рациона человека является казеин, его фрагменты и варианты.

Более предпочтительно указанным пищевым антигеном из обычного рациона человека является бета-лактоглобулин, его фрагменты и варианты.

Более предпочтительно указанным пищевым антигеном из обычного рациона человека является антиген арахиса, его фрагменты и варианты.

Термин «варианты» пищевого антигена из обычного рациона человека относится здесь к антигену, почти идентичному природному антигену и разделяющему ту же самую биологическую активность. Минимальное различие между природным антигеном и его вариантом может состоять, например, в замещении, удалении и/или добавлении аминокислоты. Такие варианты могут сдержать, например, консервативные замещения аминокислоты, в которых аминокислотные остатки замещены аминокислотными остатками, имеющими подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи, определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение медикамента, включающего композицию, описанную выше.

Настоящее изобретение также направлено на обеспечение фармацевтической композиции, включающей композицию, как описано выше, в комбинации с одним или более фармацевтически пригодным носителем.

Фармацевтически пригодные носители, описанные здесь, являются обычными. Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980) описывает композицию и рецептуры, пригодные для фармацевтической доставки композиции настоящего изобретения. В целом, природа носителя зависит от используемого способа применения. Например, парентеральные рецептуры обычно включают инъецируемые жидкости, которые включают фармацевтически и физиологически пригодные жидкости, такие как вода, физиологический раствор, уравновешенные солевые растворы, водный раствор декстрозы, кунжутное масло, глицерин, этанол, их комбинации или тому подобное, в качестве растворителя. Носитель и композиция могут быть стерильными, а рецептура должна соответствовать способу применения. В дополнение к биологически нейтральным носителям, фармацевтические композиции для применения могут содержать малые количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие и эмульгирующие агенты, консерванты и буферные агенты для регуляции рН и тому подобные, например натрия ацетат или сорбитан монолаурат. Композиция может быть жидким раствором, суспензией, эмульсией.

В одном воплощении изобретения указанный медикамент или фармацевтическая композиция, как описано выше, состоит по существу, по крайней мере, из одной популяции Tr1 клеток, направленной против пищевого антигена из обычного рациона человека.

В другом воплощении изобретения указанный медикамент или фармацевтическая композиция, как описано выше, состоит по существу, по крайней мере, из одного клона из популяции Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека.

Как применяется здесь, термин «состоит по существу из» относится к медикаменту или фармацевтической композиции, в которых, по крайней мере, 70%, предпочтительно 75%, 80%, 85% или 90% клеток, присутствующих в медикаменте или фармацевтической композиции, является Tr1 клетками, направленными против пищевого антигена из обычного рациона человека.

В одном воплощении изобретения указанный медикамент или фармацевтическая композиция, как описано выше, включает популяцию Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, за исключением глиадина.

В другом воплощении изобретения указанный медикамент или фармацевтическая композиция, как описано выше, состоит, по крайней мере, из одной популяции Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, или по крайней мер одного клона популяции Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека.

В другом предпочтительном воплощении указанный медикамент или фармацевтическая композиция, как описано выше, состоит, по крайней мере, из одной популяции Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, или, по крайней мере, из одного клона из популяции Tr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, за исключением глиадина.

Настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения воспалительного состояния кишечника.

В соответствии с изобретением фармацевтическая композиция или медикамент, как описано выше, предназначены для лечения воспалительного состояния кишечника.

В соответствии с изобретением фармацевтическая композиция или медикамент, как описано выше, предназначены для применения в лечении воспалительного состояния кишечника.

В соответствии с изобретением указанная фармацевтическая композиция или медикамент не применяются в комбинации с растворимым пищевым антигеном из обычного рациона человека.

В соответствии с изобретением указанная фармацевтическая композиция или медикамент не применяются у субъекта вместе или в комбинации с растворимым пищевым антигеном из обычного рацион человека.

В соответствии с изобретением нет необходимости в совместном применении с растворимым пищевым антигеном из обычного рациона человека, к которому направлены Tr1 клетки.

В одном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения воспалительного состояния кишечника.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения болезни Крона.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения язвенного колита.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения кишечного воспаления, связанного с пищевой аллергией или непереносимостью.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения кишечного воспаления, связанного с аллергией на молочный белок. Предпочтительно указанный медикамент или фармацевтическая композиция для лечения кишечного воспаления, связанного с аллергией на молочный белок, включает человеческие Tr1 клетки, направленные к казеину или бета-лактоглобулину, их фрагментам или вариантам.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения кишечного воспаления, связанного с целиакией. Предпочтительно указанный медикамент или фармацевтическая композиция для лечения кишечного воспаления, связанного с целиакией, включает человеческие Tr1 клетки, направленные к глиадину, его фрагментам и вариантам.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения кишечного воспаления, связанного с аллергией на куриные яйца. Предпочтительно указанный медикамент ли фармацевтическая композиция для лечения кишечного воспаления, связанного с аллергией на куриные яйца, включает человеческие Tr1 клетки, направленные к овальбумину, его фрагментам и вариантам.

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению композиции, как описано выше, для приготовления медикамента или фармацевтической композиции для лечения кишечного воспаления, связанного с аллергией на арахис. Предпочтительно указанный медикамент или фармацевтическая композиция для лечения кишечного воспаления, связанного с аллергией на арахис, включает человеческие Tr1 клетки, направленные к антигену арахиса, его фрагментам или вариантам.

Задачей настоящего изобретения также является способ лечения воспалительных заболеваний кишечника, предпочтительно болезни Крона или язвенного колита, у нуждающегося в лечении субъекта, включающий применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше.

Другой задачей настоящего изобретения является способ лечения кишечного воспаления, связанного с пищевой аллергией или непереносимостью, предпочтительно аллергией на молочный белок, целиакии, аллергии на куриные яйца или аллергии на арахис, у нуждающегося в лечении субъекта, включающий применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента, как описано выше, или фармацевтической композиции, как описано выше.

Композиция может быть составлена для парентерального, внутримышечного, внутривенного, интраперитонеального введения, интраназальной ингаляции, легочной ингаляции, внутрикожного, внтурисуставного, интратекального введения, или через пищеварительный тракт. В другом воплощении композиция может быть составлена для внутритканевого или подслизистого применения эндоскопическим способом, для доставки композиции прямо в толстый или тонкий кишечник.

Предпочтительно медикамент или фармацевтическая композиция изобретения может применяться посредством внутримышечного, интраперитонеального или внутривенного введения или прямым введением в лимфатические узлы пациента, предпочтительно путем внутривенного введения.

Количество Tr1 клеток, направленных к пищевому антигену из обычного рациона человека, эффективное в лечении воспалительного состояния кишечника, такого как воспалительное заболевание кишечника и кишечное воспаление, связанное с пищевой аллергией или непереносимостью, зависит от природы воспаления, и может быть определено стандартными клиническими методиками. Точная доза для применения в рецептуре будет также зависеть от пути применения, и тяжести заболевания или состояния, и должна быть определена в соответствии с заключением практикующего врача и обстоятельствами для каждого индивидуума. Эффективная доза может быть экстраполирована из дозозависимых кривых, полученных из тест-систем in vitro или моделей на животных.

В одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения у субъекта применяют от 10⁴/кг до 10⁹/кг клеток. Предпочтительно у субъекта применяют от 10⁵/кг до 10⁷/кг клеток и более предпочтительно около 10⁷/кг клеток.

В одном воплощении изобретения у субъекта применяют медикамент во время, когда приступ продемонстрирован ухудшением клинического статуса субъекта, или во время, когда воспалительные поражения могут быть визуализированы, например, при эндоскопических исследованиях.

В одном воплощении изобретения у субъекта один раз применяют медикамент или фармацевтическую композиции из настоящего изобретения.

Во втором воплощении изобретения у субъекта применяют один раз в месяц медикамент или фармацевтическую композицию настоящего изобретения.

В третьем воплощении изобретения у субъекта применяют медикамент или фармацевтическую композицию настоящего изобретения один раз в квартал.

В четвертом воплощении изобретения у субъекта применяют медикамент или фармацевтическую композицию настоящего изобретения дважды в год.

В другом воплощении настоящего изобретения медикамент или фармацевтическая композиция, предназначенные для применения у субъекта, нуждающегося в лечении, включает человеческие Tr1 клетки, аутологичные клеткам указанного субъекта.

Это означает, что Tr1 клетки будут применяться у субъекта, от которого он взяты, или что предшественники, использованные для продукции Tr1 клеток, взяты у субъекта, у которого будут применяться Tr1 клетки.

Настоящее изобретение также относится к процессу лечения воспалительного состояния кишечника у нуждающегося в лечении субъекта, включающему этапы:

- взятия образца крови у указанного субъекта;

- получения Tr1 клеток, направленных к избранному пищевому антигену из обычного рациона человека,

- клонирования указанных Tr1 клеток, направленных к избранному пищевому антигену из обычного рациона человека,

- дополнительного размножения Tr1 клонов, полученных на предыдущем этапе,

- повторного введения Tr1 клонов, полученных таким образом у указанного субъекта, предпочтительно внутривенно.

Предпочтительно клонирование и размножение Tr1 клонов, направленных к избранному пищевому антигену из обычного рациона человека, проводят следующим способом:

а) культивирование при Т1 ниже 35°С в культуральной среде Mf фидерных клеток, таких как фидерные клетки насекомого, где указанная температура Т1 обеспечивает пролиферацию фидерных клеток, а указанные фидерные клетки экспрессируют факторы, взаимодействующие со следующими белками клеточной поверхности:

- CD3/TCR комплекс,

- CD28 белок,

- IL-2 рецептор,

- CD2 белок,

- IL-4 рецептор,

b) осуществление контакта клеток, полученных на этапе а), отмытых от их культуральной среды Mf или нет, с популяцией Tr1 клеток, содержащихся в культуральной среде Мр, где указанная культуральная среда Мр исходно не содержит факторов, описанных для этапа а), для получения смеси, содержащей популяцию Tr1 клеток, фидерных клеток и культуральной среды Мр,

c) культивирование смеси, полученной на этапе b), при температуре Т2, составляющей, по крайней мере, 35°С, где указанная температура выбрана так, что популяция Tr1 клеток пролиферирует, а фидерные клетки не пролиферируют,

d) извлечение популяции Tr1 клеток, размноженных таким образом. Примеры факторов, которые взаимодействуют с вышеупомянутыми белками клеточной поверхности, включают:

- модифицированные анти-СВ3 антитела, в которых анти-СП3 внутрицитоплазматический домен CD3 тяжелой цепи заменен трансмембранным доменом,

- CD80 или CD86 белок,

- IL-2, секретируемый фидерными клетками,

- CD58 белок,

- интерлейкин, выбранный из глупы, включающей IL-4 и IL-13.

В другом воплощении настоящего изобретения способ лечения воспалительного состояния кишечника, такого как воспалительные заболевания кишечника или кишечное воспаление, связанное с пищевой аллергией или непереносимостью, у нуждающегося в лечении субъекта, включает применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента или фармацевтической композиции изобретения в комбинации с одним или более терапевтическим агентом, применяемым для лечения воспалительного состояния кишечника.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или медикаменту изобретения, где применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента или фармацевтической композиции изобретения осуществляется в комбинации с одним или более терапевтическим агентом, применяемым для лечения воспалительного состояния кишечника.

Примеры терапевтических агентов, обычно применяемых для лечения воспалительного состояния кишечника, являются следующими:

- антитела или антагонисты цитокинов или ростовых факторов человека, в частности анти-ФНО, такие как инфликсимаб, адалимумаб, этанерцепт; анти-IL-l, анти-IL-6, анти-1b-12, анти-IL-n и анти-1b-23; аналоги антагониста рецептора IL-1 (анакинра);

- антитела к молекулам клеточной поверхности, таким как анти-а4-интегрин (натализумаб), CD2, CD3 (визилизумаб), анти-ССК9, анти-LFAl и анти-ICAMl;

- 5-аминосалициловая кислота и ее аналоги, такие как месалазин, сульфазалин, ольсалазин, балсалазид;

- кортикоиды, такие как преднизон, будесонид, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, бедометазон, тиксокортол;

- пробиотики, такие как Saccharomyces boulardii;

- метотрексат, талидомид, лефлуномид, и аналоги пуринов, такие как азатиоприн и 6-меркаптопурин.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения способ лечения воспалительного состояния кишечника у нуждающегося в лечении субъекта включает применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента или фармацевтической композиции изобретения в комбинации с одним или более терапевтическим агентом, выбранным из группы из анти-ФНО, натализумаба, анти-IL-1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23; аналогов антагониста рецептора IL-1 (анакинра); 5-аминосалициловой кислоты и ее аналогов, таких как месалазин, сульфазалин, ольсалазин, балсалазид; кортикоидов, таких как преднизон, будесонид, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, бедометазон, тиксокортол.

Настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции или медикамента изобретения для лечения воспалительного состояния кишечника у субъекта, нуждающегося в лечении, где применение у указанного субъекта эффективного количества медикамента или фармацевтической композиции изобретения осуществляют в комбинации с одним или более терапевтическим агентом, выбранным из группы из анти-ФНО, натализумаба, анти-IL-1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23; аналогов антагониста рецептора IL-1 (анакинра); 5-аминосалициловой кислоты и ее аналогов, таких как месалазин, сульфазалин, ольсалазин, балсалазид; кортикоидов, таких как преднизон, будесонид, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, бедометазон, тиксокортол.

В другом воплощении настоящее изобретение также относится к способу лечения воспалительного состояния кишечника, при котором медикамент или фармацевтическая композиция изобретения предназначены для применения у нуждающегося в лечении субъекта, при котором субъект не отвечает адекватно, или вряд ли адекватно отвечает на один или более терапевтический агент из группы из анти-ФНО, натализумаба, анти-IL-1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23; аналогов антагониста рецептора IL-1 (анакинра); 5-аминосалициловой кислоты и ее аналогов, таких как месалазин, сульфазалин, ольсалазин, балсалазид; кортикоидов, таких как преднизон, будесонид, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, бедометазон, тиксокортол, пробиотиков, таких как Saccharomyces boulardii; метотрексата, азатиоприна, 6-меркаптопурина, талидомида, лефлуномида.

Настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции или медикамента изобретения, в котором указанный субъект не отвечает адекватно, или вряд ли отвечает адекватно на один или более терапевтический агент из группы из анти-ФНО, натализумаба, анти-IL-1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23; аналогов антагониста рецептора IL-1 (анакинра); 5-аминосалициловой кислоты и ее аналогов, таких как месалазин, сульфазалин, ольсалазин, балсалазид; кортикоидов, таких как преднизон, будесонид, гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, бедометазон, тиксокортол; пробиотиков, таких как Saccharomyces boulardii; метотрексата, азатиоприна, 6-меркаптопурина, талидомида, лефлуномида.

«Неадекватный ответ», «не отвечает адекватно на» или «вряд ли отвечает адекватно» относится к действительному или вероятному ответу субъекта, свидетельствующему о том, что терапия является или вероятно является неэффективной, токсичной или плохо переносимой в той мере, в какой это касается субъекта.

Примеры

В следующем описании все эксперименты, для которых не приведен подробный протокол, выполнялись в соответствии со стандартным протоколом.

Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных воплощений изобретения. Специалисту в данной области техники понятно, что методики, раскрытые в примерах, следующие представленным методикам, раскрыты изобретателем для осуществления изобретения на практике и, таким образом, могут рассматриваться как составляющие предпочтительные способы осуществления. Однако специалисту в данной области техники, в свете представленного раскрытия, должно быть понятно, что многие изменения могут быть внесены в конкретные воплощения, раскрытые здесь, с получением такого же или подобного результата, без отделения от сущности и объема изобретения.

Эксперимент 1

Экспериментальные процедуры

Мыши

Самки мышей линии Balb/c в возрасте 7 недель были получены от Janvier (Le Genest-St-Isle, Франция).

Дифференцировка Tr1 клеток

Спленоциты Balb/c вначале культивировали при концентрации 2,5×10⁶ клеток/мл в среде Иссела с добавлением IL-2 (100 МЕ/мл) плюс IL-4 (20 нг/мл) в присутствии белков сои или рыбы, находящихся в обычном рационе для разведения мышей (SAFE). Клетки культивировали при 37°С, 5% CO₂ и разбавляли при необходимости той же самой культуральной средой. Мышиные Т-клетки затем стимулировали раз в неделю в присутствии 4×10⁵ облученных аутологичных спленоцитов в 24-луночных планшетах и в присутствии белков сои или рыбы. Популяции Т-клеток повторно стимулировали один раз в неделю на протяжении двух или пяти недель.

Анализ цитокинов

Сэндвич-ИФА проводили для надосадочных жидкостей популяций Т-клеток спустя 48 часов культивирования (5×10⁵ клеток), при стимуляции специфическим антигеном (белками сои или рыбы) в присутствии или отсутствие облученных аутологичных спленоцитов (4×10⁵). ИФА проводили с применением анти-IL-4 (11В11), анти-IL-10 (А25), анти-ИФН-γ (XGM1.2), биотин анти-IL-4 (24G2), анти-IL-10 (SXC1), анти-ИФН-γ (R4-6А2) (Pharmingen Becton Dickinson).

Индукция колита

Для индукции колита в питьевую воду для мышей с 0 суток по 5 сутки добавляли декстран-сульфат натрия (DSS, ICN, Biomedicals).

Результаты

Применение мышиных Tr1, направленных к пищевому антигену, для лечения колита у мышей

В данных экспериментах применяли мышиные Tr1 клетки, направленные против белков рыбы и белков сои, поскольку белки из рыбной муки и белки сои являются обычными пищевыми антигенами при разведении мышей.

Фигура 1 демонстрирует профиль экспрессии цитокинов Tr1 клетками, специфичными к белкам рыбы (фигура 1А) и белкам сои (фигура 1В).

Мышам давали 5% DSS в воде в течение 5 суток для индукции острого воспалительного колита и измеряли вес мышей на 5, 6 и 7 сутки.

На фигуре 2 первую группу мышей не лечили, а второй группе вводили на 1 сутки 10 мышиных Tr1 клеток, направленных к белкам рыбы.

На фигуре 2 В первую группу мышей не лечили, а второй группе вводили на 1 сутки и 3 сутки по 4×10⁵ мышиных Tr1 клеток, направленных к белкам сои, и на 6 сутки 3×10 мышиных Tr1 клеток, направленных к белкам сои.

Фигура 2С демонстрирует, что продукция ИФН-γ на 8 сутки клетками кишечника также подавляется при введении мышиных Tr1 клеток, направленных против белков сои.

Результаты этих экспериментов показали, что применение Tr1 клеток, направленных к пищевому антигену из обычного рациона человека, приводит к ингибированию потери веса и обеспечивает контроль воспалительного колита, индуцированного DSS у мышей.

Эксперимент 2

Экспериментальные процедуры

Продукция Tr1 клонов, специфичных к овальбумину

Овальбумин-специфические Tr1 клоны получали из мононуклеарных клеток периферической крови (МНК ПК) здоровых доноров или пациентов, страдающих болезнью Крона. После выделения МНК ПК с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла (GE Healthcare, Упсала, Швеция), клетки культивировали в присутствии нативного облученного овальбумина (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в X-Vivol5 (Cambrex, Ист-Рузерфорд, Нью-Джерси) и обогащенной цитокинами надосадочной жидкости фидерных клеток дрозофилы при 37°С, 5% CO₂. После нескольких суток культивирования клетки клонировали методом лимитирующих разведении на слое фидерных клеток дрозофилы в X-Vivo15 при 37°С, 5% СO₂. Выращенные клоны собирали и анализировали на антигенную специфичность и идентичность Tr1 клеток перед размножением на фидерных клетках дрозофилы до 5 миллиардов.

Фидерные клетки дрозофилы

Фидерные клетки дрозофилы были сконструированы TxCell для улучшения стимуляции и роста клонов Tr1 клеток. Клетки дрозофилы Шнейдера трансфицировали трансмембранной формой мышиного анти-человеческого CD3 антитела, с человеческим CD80, человеческим CD58, человеческим IL-2 и человеческим IL-4. Клетки выращивали в плановом порядке на среде Express five от РАА laboratories (Пашинг, Австрия).

Анализ цитокинов

Для определения антигенной специфичности проводили сэндвич-ИФА надосадочной жидкости после 48 часов культивирования Т-клеточных клонов, стимулированных в присутствии антиген-презентирующих клеток (4×10⁵) и в присутствии или отсутствии специфического антигена (овальбумина). Для определения профиля продукции цитокинов овальбумин-специфические клоны Tr1 клеток стимулировали бусами, покрытыми анти-СВ3+анти-СП28 моноклональными антителами (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), и собирали надосадочную жидкость спустя 48 часов. ИФА проводили с применением коммерчески доступных наборов от Diaclone (Безансон, Франция).

Анализы супрессии

Для изучения супресии в совместной культуре ступенчатые количества овальбумин-специфических клонов Tr1 культивировали совместно с аутологичными CD4+Т-лимфоцитами. Совместные культуры стимулировали бусами, покрытыми анти-CD3+анти-СD28 моноклональными антителами. Спустя 3 суток оценивали общую пролиферацию клеток с применением набора для оценки пролиферации WST-1 Roche (Roche Applied Science, Базель, Швейцария). Супрессию пролиферации аутологичных CD4+Т-клеток также оценивали с применением разбавленных надосадочных жидкостей от Tr1 клеток, активированных бусами, покрытыми анти-СБ3+анти-СВ28 моноклональными антителами, в течение 48 часов. Анти-IL-10 и анти-ТРФ-бета моноклональные антитела, полученные от R&D system, применяли в концентрации 10 мкг/мл.

Токсикологические исследования

Кариотипы Tr1 клонов определяли в «Laboratoire Genazur» (Ницца, Франция). Измерения длины теломер проводились в соответствии со стандартными процедурами (13) группой G.Butler-Brown (Институт миологии, Inserm U787, Париж). Оценку клоногенности проводили путем посева Tr1 клеток по 1 клетке/ячейку в 96-луночных планшетах в среде X-Vivol5 с факторами роста или без них (IL-2, 200 МЕ/мл, и IL-4, 20 нг/мл; полученных от R&D system, Миннеаполис, Миннесота), или по 40000 клеток/мл на сред на основе полутвердого агара с факторами роста или без них. Оценку роста клонов проводили один раз в неделю в течение 8 последовательных недель.

Результаты

Процесс производства анти-овальбумин-специфических Tr1 клеток был вначале разработан с клетками периферической крови от здоровых доноров. Первый этап включал культивирование мононуклеарных клеток периферической крови с нативным овальбумином, IL-2 и IL-4 для обогащения/размножения овальбумин-специфических Т-лимфоцитов. В конце данного этапа клетки клонировали методом лимитирующих разведений. Клонирование Т-клеток и дальнейшее размножение Т-клеточных клонов осуществляли путем посева овальбумин-специфических Т-клеток, обогащенных МНК ПК, на слой фидерных клеток, полученных от дрозофилы (клетки Шнейдера), устойчиво трансфицированных трансмембранной формой анти-СВ3 моноклонального антитела, человеческим CD80, человеческим CD58, человеческим IL-2 и человеческим IL-4. Эта стратегия вела к эффективной пролиферации Т-клеточных клонов (фигура 3а). Данный способ обеспечивает продукцию популяции более чем 5 миллиардов моноклональных Tr1 клеток от 12 до 15 недель. Во время этапа размножения растущие клоны оценивали на их специфичность к овальбумину и специфическую идентичность Tr1. Специфичность к овальбумину наблюдали при продукции IL-10, выявляемой посредством ИФА в надосадочной жидкости клеточных клонов, культивированных в присутствии овальбумина, презентируемого облученными аутологичными МНК ПК. Идентичность Tr1 клеток также наблюдали посредством ИФА после поликлональной активации клонов бусами, покрытыми анти-СВ3+анти-СD28 антителами. Примеры избранных клонов представлены на фигуре 3, панели В и С. Важно, что в данном процессе применение фидерных клеток дрозофилы обеспечивает экспансию Tr1 клеток при полном отсутствии сыворотки животных или человека. Результаты разработки данного процесса на более чем 50 здоровых донорах показали, что овальбумин-специфические Tr1 клетки можно выделить данным способом у основного большинства индивидуумов (более 90%). Это позволяет предположить, что толерантность к овальбумину и в значительной степени к пищевым антигенам, в частности, достигается за счет супрессивного механизма, включающего Tr1 клетки, и таким образом заключить, что супрессорные клетки из данной популяции являются центральными регуляторными эффекторами пероральной толерантности.

Чтобы более глубоко охарактеризовать избранные Tr1 клеточные клоны, мы анализировали их супрессорную функцию in vitro в обычном анализе супрессии. С этой целью очищенные CD4+Т-лимфоциты активировали in vitro бусами, покрытыми анти-CD3 и анти-СВ28 моноклональными антителами, в присутствии ступенчатых количеств Tr1 клонов, взятых к одного и того же донора. На фигуре 4 показано, что в этих экспериментах Tr1 клетки даже в отношении 1 на 16 клеток-мишеней подавляли пролиферацию аутологичных CD4+Т-лимфоцитов (фигура 4, панель А). В то же самой разновидности теста пролиферации надосадочная жидкость культур Tr1 клонов, активированных in vitro бусами, покрытыми aHTH-CD3 и анти-СП28 моноклональными антителами, также проявляла супрессорную активность, которая последовательно наблюдалась, хотя и была более дискретной, чем контакт-опосредованная супрессия (фигура 4, панель В), что позволило предположить, что ингибирующее действие Tr1 клеток в отношении пролиферации Т-клеток частично опосредуется растворимыми факторами. Неудивительно, что супрессорное действие этих надосадочных жидкостей подавлялось антителами к IL-10 и ТРФ-бета (фигура 4, панель С). Эти различные эксперименты показали, что клетки, выделенные в соответствии с нашими процедурами, проявляют супрессорную способность, напоминающую ту, что описана для Tr1 клеток. Действительно, IL-10 и ТРФ-бета, продуцированные активированными Tr1 клонами, способствуют ингибированию пролиферации Т-клеток, а блокада обоих цитокинов полностью блокирует супрессорное действие надосадочной жидкости Tr1 клеток, свидетельствуя, что эти растворимые факторы действуют в синергии для угнетения пролиферации Т-клеток. Для дополнительного подтверждения Tr1 идентичности избранных клонов на основе фенотипа, мы оценили их поверхностную экспрессию регуляторных клеточных маркеров CD25, Foxp3, GITR и CTLA-4. Все эти молекулы экспрессировались большинством активированных Tr1 клеток и негативно регулировались в покоящемся состоянии после оставления клеток в культуре без

стимулов в течение нескольких суток (фигура 5).

Поскольку целью разработки данного производственного процесса является продукция клеток для введения пациентам, были проведены эксперименты для демонстрации отсутствия генетических аберраций или прекращения регуляции характеристик выживания/пролиферации клеток в продуцированных Т-клеточных клонах. Кариотипы определяли в 4 клонах от различных доноров, и они всегда демонстрировали нормальные профили (фигура 6). Мы также анализировали способность Tr1 клонов к выживанию при хронической стимуляции фидерными клетками дрозофилы, посредством оценки максимума делений, осуществленных до старения, и посредством оценки потенциала клоногенности клонов в жидкой и полутвердой среде (таблица 1). Наконец, сравнивали время деления и длину теломер между клонами после 30 делений (эквивалент 10⁹ клеток) и клеток, делившихся более 10 раз (таблица 1). Все эти эксперименты продемонстрировали нормальную регуляцию пролиферации и старение клонов Tr1 клеток, размножавшихся приемлемым образом для применения этих регуляторных Tr1 лимфоцитов для клеточной терапии.

Таблица 1 Характеристика овальбумин-специфических Tr1 клонов по потенциалу деления, клоногенности и регуляции длины теломер Анализ Условия Результаты Максимальное число делений до старения 41,4±4,5 Клоногенность на полутвердой среде Клетки Jurkat 60% слияния спустя 6 недель Tr1 клоны 0% слияния спустя 6 недель Клоногенность на жидкой среде Клетки Jurkat 78 растущих клонов на 3168 посеянных клеток Tr1 клоны 1 растущий клон на 3456 посеянных клеток Время деления (час/цикл) n=5 До 30 делений 76,8±12,7 Между 30 и 40 делениями 90,4±12,3 Длина теломер (Кб) n=4 После 30 делений От 2,5 до 20 Кб После 40 делений От 2,5 до 5 Кб

Наконец, чтобы продемонстрировать осуществимость производственного процесса и клетками крови пациента, овальбумин-специфические клоны Tr1 клеток были успешно получены и размножены до 1 миллиарда из МНК ПК пациентов, страдающих болезнью Крона (фигура 7).

В заключение, мы разработали производственный процесс, обеспечивающий продукцию до 1 миллиарда овальбумин-специфических клонов Tr1 клеток для лечения пациентов, страдающих тяжелой невосприимчивой к лечению болезнью Крона. Мы предположили, что эти клетки будут заселять воспаленный кишечник и высвобождать воспалительные цитокины после встречи со своим специфическим антигеном овальбумином.

Фаза I/IIa клинических испытаний для проверки этой гипотезы и оценки переносимости данного лечения была начата в марте 2008 у пациентов, страдающих тяжелой, невосприимчивой к лечению болезнью Крона.

Возрастает число пациентов с болезнью Крона, невосприимчивых к обычному лечению, такому как нестероидные противовоспалительные средства (НПВС, например, пентаза), кортикоиды (солупред, преднизолон), иммуносупрессанты (азатиоприн, метотрексат) и медикаменты на основе анти-ФНО (ремикад, хумира, цимзиа). Этих пациентов можно выделить в группу пациентов с хронически активной болезнью Крона (ХАБК) из-за стойкого воспалительного статуса пищеварительного тракта, приводящего к нарушению качества жизни и самочувствия. Пациенты с ХАБК имеют историю индекса активности болезни Крона (ИАБК), больше или равного 220 в течение, по крайней мере, 6 месяцев.

Индекс активности болезни Крона или ИАБК является исследовательским инструментом для количественной оценки симптомов пациентов, страдающих болезнью Крона. Он является важным при исследованиях медикаментов, используемых для лечения болезни Крона; большинство основных исследований по новейшим медикаментам применяют ИАБК для определения ответа или ремиссии заболевания. Значения по шкале более 220 указывают на активную патологию у пациента, ИАБК ниже или равный 150 указывает на ремиссию заболевания у пациента.

Расчет ИАБК Клиническая или лабораторная переменная Весовой множитель Число эпизодов жидкого или мягкого стула в течение 7 суток Х2 Боль в животе (по шкале тяжести от 0-3) каждый день в течение 7 суток Х5 Общее самочувствие, субъективно оцениваемое от 0 (хорошее) до 4
(ужасное) каждый день в течение семи суток Х7 Наличие осложнений* Х20 Прием ломитила или опиатов для лечения диареи Х30 Наличие абдоминальной массы (0 как отсутствие, 2 как спорное, 5 как определенное) Х10 Абсолютное отклонение гематокрита от 47% у мужчин 42% у женщин Х6 Процентное отклонение от стандартного веса X1 * Осложнения: артралгия, увеит, узловая эритема, афтозные язвы, гангренозная пиодермия, трещина заднего прохода, новая фистула, абсцесс (по 1 пункту шкалы на каждое осложнение).

Пациентам с устойчивой к лечению ХАБК внутривенно вводили клоны Tr1 клеток, специфичных к антигену овальбумину.

Фигура 8 демонстрирует индукцию ремиссии при снижении ИАБК (панель А) у больных ХАБК спустя 5 недель после лечения овальбумин-специфическими Tr1 клетками. Снижение ИАБК достигалось отчасти путем уменьшения боли в животе (панель В), числа эпизодов жидкого или мягкого стула в неделю (панель С) и значения по шкале общего самочувствия (панель D).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, и может быть использовано в медицине. Выделяют популяцию Tr1 клеток, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека и имеющих в состоянии покоя фенотип CD4+CD25-FoxP3-. Полученную популяцию Tr1 клеток в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, либо в комбинации с одним или более фармацевтическим средством, применяемым для лечения воспалительных состояний кишечника и выбираемым из группы, включающей анти-TNF, натализумаб, анти-IL1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23, аналоги антагониста рецептора IL-1,5 аминосалициловую кислоту и ее аналоги, кортикоиды, пробиотики, метотрексат, азатиоприн, 6-меркаптопурин, талидомид, лефлуномид, используют в составе фармацевтических композиций для лечения воспалительных состояний кишечника. Изобретение позволяет получить эффективное средство для лечения воспалительных состояний кишечника. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Популяция клеток Тr1 человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека и имеющих в состоянии покоя фенотип CD4⁺CD25^- FoxP3^-.

2. Популяция клеток Тr1 по п.1, отличающаяся тем, что пищевой антиген выбирают из группы, включающей овальбумин, казеин, бета-лактоглобулин, белок сои, глиадин, антиген арахиса и их фрагмены, варианты и смеси.

3. Популяция клеток Тr1 по п.1, отличающаяся тем, что пищевой антиген представляет овальбумин, его фрагмены, варианты и смеси.

4. Фармацевтическая композиция, включающая популяцию клеток Тr1 человека по п.1 в эффективном количестве в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемым носителем для лечения воспалительных состояний кишечника.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что пищевой антиген выбирают из группы, включающей овальбумин, казеин, бета-лактоглобулин, белок сои, глиадин, антиген арахиса и их фрагмены, варианты и смеси.

6. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что воспалительное состояние является болезнью Крона.

7. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что клетки Тr1 представляют популяцию одного клона, и пищевой антиген выбирают из группы, включающей овальбумин, казеин, бета-лактоглобулин, белок сои, глиадин, антиген арахиса и их фрагмены, варианты и смеси, и воспалительное состояние является болезнью Крона.

8. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что воспалительное состояние является язвенным колитом.

9. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что клетки Тr1 представляют популяцию одного клона, пищевой антиген выбирают из группы, включающей овальбумин, казеин, бета-лактоглобулин, белок сои, глиадин, антиген арахиса и их фрагмены, варианты и смеси, и воспалительное состояние является язвенным колитом.

10. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что воспалительное состояние связано с пищевой аллергией или непереносимостью.

11. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что воспалительное состояние связано с аллергией на молоко, куриные яйца или арахис или с целиакией.

12. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что клетки Тr1 являются аутологичными клеткам пациента.

13. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что пациенту вводят клетки Тr1 в количестве от 10⁴/кг до 10⁹/кг.

14. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных состояний кишечника, включающая популяцию клеток Тr1 человека по п.1 в эффективном количестве в комбинации с одним или более фармацевтическим средством, применяемым для лечения воспалительных состояний кишечника и выбираемым из группы, включающей анти-TNF, натализумаб, анти-IL1, анти-IL-6, анти-IL-12, анти-IL-17 и анти-IL-23, аналоги антагониста рецептора IL-1,5 аминосалициловую кислоту и ее аналоги, кортикоиды, пробиотики, метотрексат, азатиоприн, 6-меркаптопурин, талидомид, лефлуномид.

15. Фармацевтическая композиция по п.4, где субъект, получающий лечение, не отвечает адекватно или маловероятно, что ответит адекватно на одно или несколько фармацевтических средств из группы, включающей анти-TNF, натализумаб, анти-IL1, анти-IL-6, анти-IL-12, aнти-IL-17 и анти-IL-23, аналоги антагониста рецептора IL-1,5 аминосалициловую кислоту и ее аналоги, кортикоиды, пробиотики, метотрексат, азатиоприн, 6-меркаптопурин, талидомид, лефлуномид.