СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ, ВЫДЕЛЕНИЯ, ИСТОЩЕНИЯ И ОБОГАЩЕНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ TR1 КЛЕТОК, ПОПУЛЯЦИИ TR1 КЛЕТОК, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБ МОНИТОРИНГА ЭФФЕКТА ТЕРАПИИ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/577 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам идентификации и/или выделения Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток и/или активированных Tr1 клеток, к популяциям, обогащенным Tr1 клетками, отдыхающими Tr1 клетками и/или активированными Tr1 клетками, к популяциям, истощенным по Tr1 клеткам, отдыхающим Tr1 клеток и/или активированным Tr1 клеткам, а также к способам и наборам для диагностики или лечения хронических воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, аллергических заболеваний, рака и состояний, сопутствующих трансплантации органов.

Уровень техники

Гомеостаз иммунной системы зависит от баланса между иммунным ответом на инвазивный патоген и иммунной толерантностью к собственным антигенам. Как центральная, так и периферическая толерантность являются важными механизмами индукции и поддержания T-клеточной толерантности. В последнее десятилетие уделяется много внимания регуляторным Т-клеткам (Treg), которые играют важную роль в поддержании периферической иммунной толерантности. В настоящее время точно установлено, что Treg клетки могут быть разделены на два различных субтипа: природные Treg (nTreg) и индуцируемые Treg популяции, такие, как TGF-бета-индуцируемые Treg-клетки, Tr1 клетки или Th3 клетки. Популяции Treg играют главную роль в периферической иммунной толерантности, поэтому проблема идентификации, выделения или обогащения указанных различных субпопуляций Treg для облегчения постановки диагноза, оценки и лечения иммунологических состояний, таких, как хронические воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания или аллергические заболевания, приобрела первостепенное значение.

Например, после их идентификации, nTreg стали выявлять по экспрессии CD25. Однако, CD25 представляет собой маркер активации обычных Т-клеток (convT) и, соответственно, не является исключительным маркером Treg клеток. Последние успехи в распознавании nTreg клеток человека касаются идентификации поверхностных клеточных маркеров или внутриклеточных маркеров, таких, как Foxp3, CD 127 (WO 2007140472), CD45RA (WO 2007/117602), CD 134 (WO 2009/036521) и CD49d (WO 2009/047003). Что касается Tr1 клеток, их специфическая идентификация до сих пор затруднена и основывается главным образом на определении секреции IL-10. Таким образом, существует необходимость в создании способов лучшего и более точного распознавания Tr1 клеток. Кроме того, было доказано, что Tr1 клетки могут, применяться для клеточной терапии, поскольку введение Tr1 клеток пациентам с болезнью Крона облегчало их состояние. Поэтому существует необходимость более точной идентификации и выделения Tr1 клеток, поскольку они могут использоваться для клеточной терапии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что Tr1 клетки могут быть специфическим образом идентифицированы при помощи поверхностных клеточных маркеров CD 127 и CD62L. Более того, использование указанных двух маркеров в дополнении к использованию CD4 маркера и, возможно, CD25 маркера, позволяет отличать Tr1 клетки от обычных отдыхающих и активированных Т-клеток, а также среди отдыхающих и активированных nTreg клеток.

Раскрытие изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения является способ идентификации Tr1 клеточной популяции, включающий определение экспрессии CD4, CD127 и CD62L маркеров на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки экспрессирующие CD4, а также экспрессирующие на низком уровне CD127 и CD62L, представляют собой Tr1 клетки.

Другим объектом данного изобретения является способ идентификации популяции отдыхающих Tr1-клеток, включающий определение экспрессии маркеров CD4, CD5 и, по крайней мере, одного из маркеров CD127 или CD62L, на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки, экспрессирующие CD4, а также экспрессирующие на низком уровне, по крайней мере, один из маркеров CD127 или CD62L, и не экспрессирующие CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации популяции отдыхающих Tr1-клеток, включающий определение экспрессии маркеров CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки, экспрессирующие CD4, а также экспрессирующие на низком уровне CD127 и CD62L, и не экспрессирующие CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации популяции активированных Tr1-клеток, включающий определение экспрессии маркеров CD4, CD25, CD 127 и CD62L на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки, экспрессирующие CD4, CD25, а также экспрессирующие на низком уровне CD127 и CD62L, представляют собой активированные Tr1 клетки.

Другим объектом настоящего изобретения является способ выделения популяций отдыхающих или активированных Tr1 клеток, включающий идентификацию популяции отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток при помощи способов, описанных выше, и выделение указанной популяции.

Еще одним объектом настоящего изобретения является выделенная популяция отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток, полученная при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения является выделенная популяция Tr1 клеток, полученная при помощи способа, описанного выше.

Еще одним объектом настоящего изобретения является выделенная популяция отдыхающих Tr1 клеток, полученная при помощи способа, описанного выше.

Еще одним объектом настоящего изобретения является выделенная популяция активированных Tr1 клеток, полученная при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции Tr1 клетками, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, а также экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD26L, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную Tr1 клетками, при этом процент Tr1 клеток, по крайней мере, в два раза превышает процент Tr1 клеток в исходной популяции до обогащения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции отдыхающими Tr1 клетками, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, а также экспресирующих на низком уровне, по крайней мере, один из маркеров CD127 или CD62L, и не экспрессирующих CD25, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную отдыхающими Tr1 клетками, при этом процент отдыхающих Tr1 клеток, по крайней мере, в два раза превышает процент отдыхающих Tr1 клеток в исходной популяции до обогащения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции активированными Tr1 клетками, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, CD25, а также экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD62L, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную активированными Tr1 клетками, при этом процент активированных Tr1 клеток, по крайней мере, в два раза превышает процент активированных Tr1 клеток в исходной популяции до обогащения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции отдыхающими и/или активированными Tr1 клетками, включающий идентификацию отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, как описано выше, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную отдыхающими и/или активированными Tr1 клетками, при этом процент отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, по крайней мере, в два раза превышает процент отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в исходной популяции до обогащения.

Другим объектом настоящего изобретения является популяция, обогащенная Tr1 клетками, отдыхающими или активированными Tr1 клетками, полученная при помощи способов, описанных выше.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ истощения клеточной популяции по Tr1 клеткам, отдыхающим Tr1 клеткам или активированным Tr1 клеткам, включающий идентификацию Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток в соответствии с настоящим изобретением, и элиминацию указанных клеток, что позволяет получить популяцию, истощенную по Tr1 клеткам, отдыхающим Tt1 клеткам или активированным Tr1 клеткам, при этом процент Tr1 клеток, отдыхающих или активированных Tr1 клеток, по крайней мере в 0,5 раз больше процента Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток в исходной популяции до истощения.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ истощения клеточной популяции по отдыхающим Tr1 клеткам и/или активированным Tr1 клеткам, включающий идентификацию отдыхающих Tr1 клеток и/или активированных Tr1 клеток при помощи способов, описанных выше, и элиминацию указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, истощенную по отдыхающим и/или активированным Tr1 клеткам, при этом процент отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, по крайней мере, в 0,75 раз больше процента отдыхающих Tr1 клеток и/или активированных Tr1 клеток в исходной популяции до истощения.

Другим объектом настоящего изобретения является клеточная популяция, истощенная по отдыхающим Tr1 клеткам и/или активированным Tr1 клеткам, полученная при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения являются клеточная популяция, истощенная по Tr1 клеткам, отдыхающим Tr1 клеткам или активированным Tr1 клеткам, полученная при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения является набор для идентификации или выделения Tr1 клеточной популяции, популяции отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток, включающий средства для определения экспрессии маркеров CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности клеток.

Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая выделенную популяцию отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, описанную выше, или популяцию, обогащенную отдыхающими и/или активированными Tr1 клетками, описанную выше, или популяцию, истощенную по отдыхающим и/или активированным Tr1 клеткам, описанную выше.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая выделенную популяцию отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, описанную выше, или популяцию, обогащенную отдыхающими и/или активированными Tr1 клетками, описанную выше, предназначена для профилактики или лечения иммунного ответа, ассоциированного с инфекцией или трансплантацией, или аллергического заболевания, а также для профилактики или лечения воспалительных состояний или аутоиммунных состояний.

Другим объектом настоящего изобретения являются выделенные и/или обогащенные Tr1 клетки, отдыхающие Tr1 клетки или активированные Tr1 клетки, как описано выше, для профилактики или лечения иммунного ответа, ассоциированного с инфекцией или трансплантацией, или аллергического заболевания, а также для профилактики или лечения воспалительных состояний или аутоиммунных состояний.

Другим объектом настоящего изобретения является популяция, истощенная по Tr1 клеткам, отдыхающим или активированным Tr1 клеткам, как описано выше, предназначенная для усиления иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанная клеточная популяция представляет собой специфическую к опухолевому антигену Т-клеточную популяцию.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, фармацевтическая композиция, содержащая популяцию, истощенную по Tr1 клеткам, отдыхающим или активированным Tr1 клеткам, как описано выше, предназначена для лечения рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении. Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанная клеточная популяция представляет собой специфическую к опухолевому антигену T-клеточную популяцию.

Другим объектом настоящего изобретения является способ истощения популяции, как описано выше, который может использоваться для истощения ех vivo Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток, находящихся в крови субъекта, который нуждается в подобной процедуре.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая смесь отдыхающих Tr1 клеток и активированных Tr1 клеток, при этом указанная смесь получена путем размножения in vitro выделенной популяции Tr1 клеток, полученной при помощи способа, описанного выше.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, указанная фармацевтическая композиция предназначена для лечения иммунного ответа, ассоциированного с инфекцией или трансплантацией, или аллергического заболевания, а также для лечения и профилактики воспалительных состояний или аутоиммунных состояний.

Другим объектом настоящего изобретения является способ мониторинга терапевтического эффекта у субъекта in vitro, включающий идентификацию популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в биологическом образце, полученном от субъекта до и после лечения при помощи способа, описанного выше, при этом увеличение популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток после лечения расценивается как ответ на проведенное лечение.

Краткое описание чертежей. Фиг.1. Поверхностная экспрессия CD25 и CD127 и внутриклеточная экспрессия Foxp3 клетками nTreg и Tr1 человека. Результаты выражены через средний % обнаруживающих экспрессию клеток в четырех различных Tr1 и nTreg клеточных популяциях, стимулированных связыванием молекул CD3 и CD28 (Act) или культивированных в отдыхающем состоянии (Res). Фиг.2. Поверхностная экспрессия CD62L клетками nTreg и Tr1 человека. Результаты выражены через средний % обнаруживающих экспрессию клеток в четырех различных Tr1 и nTreg клеточных популяциях, стимулированных связыванием молекул CD3 и CD28 (Act) или культивированных в отдыхающем состоянии (Res).

Фиг.3 (А). Поверхностная экспрессия CD62L, CD25 и CD127 клетками nTreg и Tr1 человека. Результаты выражены через величину средней интенсивности флуоресценции (MFI) популяций nTreg и Tr1 клеток, стимулированных связыванием CD3 и CD26 молекул (Act) или культивированных в отдыхающем состоянии (Res).

Фиг.3 (В). Представлены гистограммы проточного цитометрического окрашивания CD62L, CD25 и CD127 для nTreg и Tr1 клеток человека. Фиг.4. Поверхностная экспрессия CD62L активированными мышиными клетками nTreg и Tr1. Результаты выражены через средний % обнаруживающих экспрессию клеток.

Фиг.5 (А). Поверхностная экспрессия CD62L клетками CD4+Cd25-CD127^lo. Фиг.5 (В). Результаты выражены через процент клеток, экспрессирующих CD62L в популяции CD4⁺CD25-CD127^lo клеток.

Осуществление изобретения

Tr1 клетки - это отдельная клеточная популяция, которая характеризуется специфическим профилем секреции цитокинов, который описывается ниже. Tr1 клетки дифференцируются из "необученных" CD4⁺ Т-клеток, которые встретились с антигеном. Tr1 клетки, таким образом, можно обнаружить in vivo в двух состояниях: в активированном состоянии и в отдыхающем состоянии. Как упоминалось выше, распознать Tr1 клетки и, в частности, отдыхающие и активированные Tr1 клетки, при помощи поверхностных маркеров в настоящее время невозможно, поскольку не был установлен специфический поверхностный фенотип для данных популяций. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что отдыхающие Tr1 клетки имеют следующий фенотип CD4⁺CD25^-CD127^lo/-CD62L^lo/-, а активированные Tr1 клетки имеют фенотип CD4⁺CD25⁺CD127^lo/-CD62L^lo/-. Это особенно неожиданно потому, что из области техники хорошо известно, что отдыхающие Т-клетки обычно экспрессируют высокие уровни CD62L.

Настоящее изобретение предлагает способы идентификации, выделения, обогащения и/или истощения Tr1 клеток человека, и, в частности, отдыхающих Tr1 клеток человека и активированных Tr1 клеток человека.

Изобретение также относится к полученным Tr1 клеткам, отдыхающим Tr1 клеткам и активированным Tr1 клеткам, а также к композициям на их основе и способам их применения.

Одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации Tr1 клеточной популяции, включающий определение экспрессии маркеров CD4, CD127 и CD62L на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки, которые экспрессируют CD4, а также экспрессируют на низком уровне CD127 и CD62L, представляют собой Tr1 клетки.

Другим объектом настоящего изобретения является способ идентификации популяции отдыхающих Tr1 клеток, включающий определение экспрессии маркеров CD4, CD25 и, по крайней мере, одного из маркеров CD 127 или CD62L на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки, которые экспрессируют CD4, а также эспрессируют на низком уровне, по крайней мере, один из маркеров CD127 или CD62L, и не экспрессируют CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки.

Другим объектом настоящего изобретения является способ идентификации популяции активированных Tr1 клеток, включающий определение экспрессии маркеров CD4, CD25, CD 127 и CD62L на поверхности клеток в клеточной популяции, при этом клетки, которые экспрессируют CD4, CD25, а также экспрессируют на низком уровне CD 127 и CD62L, представляют собой активированные Tr1 клетки.

Другим объектом настоящего изобретения является способ идентификации популяции отдыхающих Tr1 клеток и/или популяции активированных Tr1 клеток в пределах популяции обычных отдыхающих и активированных Т-клеток и природных регулируемых отдыхающих и активированных Т-клеток, при этом отдыхающие Tr1 клетки имеют фенотип CD4⁺CD25-CD127^lo/-CD62L^lo/-, а активированные Tr1 клетки имеют фенотип CD4⁺CD25⁺CD127^lo/-CD62L^1o/-.

Авторы изобретения, таким образом, демонстрируют, что Tr1 клетки могут быть специфическим образом идентифицированы при помощи маркеров CD4, CD 127 и CD62L. Более точно, авторы изобретения также показывают, что отдыхающие Tr1 клетки можно отличить от активированных Tr1 клеток при помощи маркеров CD4, CD25, CD127 и CD62L. Используемый в тексте термин "маркер" относится к белкам, углеводам или липидам на поверхности клеток, которые могут применяться для распознавания клеточной популяции.

Используемый в тексте термин "экспрессия" относится к экспрессии гена или генного продукта, включая кодируемый полипептид или белок. Экспрессия генного продукта может быть определена, например, при помощи иммуноанализа с использованием одного или более антител, которые связывают полипептид. Альтернативно, экспрессию гена можно определить путем измерения уровней мРНК, например, при помощи RT-PCR, qPCR.

Термин "необученный" хорошо известен из области техники и относится к иммунной клетке или клеточной популяции, которая еще не встречалась со специфическим антигеном. Необученные Т-клетки являются отдыхающими клетками.

Термин "отдыхающий" (находящийся в состояни покоя) также хорошо известен из области техники и относится к иммунной клетке или клеточной популяции, которая не пролиферирует, не продуцирует цитокины и не экспрессирует обычные для иммунных клеток молекулы активации на своей поверхности, такие, как CD25. Отдыхающими Т-клетками могут быть необученные клетки или клетки памяти.

Термин "активированный" также хорошо известен из области техники и относится к иммунной клетке или клеточной популяции, которая пролиферирует и/или продуцирует цитокины и экспрессирует обычные для иммунных клеток молекулы активации на своей поверхности, такие как, CD25.

Что касается Т-лимфоцитов, то переход из состояния покоя в состояние активности опосредуется встречей Т-клетки со специфическим антигеном или запускается активирующими цитокинами или митогенами.

Термин "низкий" или обозначение "low" или "lo/-", используемые в тексте по отношению к CD127^1o, CD62L^1o/- или CD25L^1o/", также хорошо известны из области техники и относятся к уровню экспрессии клеточного маркера, представляющего интерес, при этом уровень экспрессии клеточного маркера является более низким по сравнению с уровнем экспрессии этого клеточного маркера в анализируемой популяции клеток в целом. В частности, обозначение "low" ("lo") относится к отдельной популяции клеток, которая экспрессирует клеточный маркер на более низком уровне, чем одна или более другие отдельные популяции клеток.

Термин "высокий" или обозначение "hi" или термин "яркий" также хорошо известны из области техники и относятся к уровню экспрессии клеточного маркера, представляющего интерес, при этом уровень экспрессии указанного клеточного маркера является более высоким по сравнению с уровнем экспрессии этого клеточного маркера в анализируемой популяции клеток в целом.

Обозначения "+" и "-" хорошо известны из области техники и относятся к уровню экспрессии клеточного маркера, представляющего интерес, при этом уровень экспрессии клеточного маркера, обозначаемый как "+" является высоким или промежуточным, который также может обозначаться как "+/-", а уровень экспрессии обозначаемый знаком "-" является низким или нулевым. В целом, клетки, дающие интенсивность окрашивания 2,3,4 или 5%, обозначаются как "hi", при этом те, которые попадают в верхнюю половину популяции, относят к "+" клеткам. Клетки, интенсивность флуоресценции для которых ниже 50%, обозначаются как "lo"-клетки, а клетки, у которых интенсивность менее 5% обозначаются как "-" клетки.

Используемый здесь термин "CD127" обозначает рецептор интерлейкина-7, который находится на поверхности Tr1 клеток. Альфа цепь рецептора IL-7 описана в литературе (например, Goodwin et al. 1990, Cell, 60:941-951). IL-7R также обозначается в литературе как CD 127. "CD127+" относится к клеткам, которые дают промежуточное или яркое окрашивание при обработке меченым антителом к CD 127. "CD127^lo/-" относится к клеткам, которые дают слабое/тусклое окрашивание или не окрашиваются вовсе при контакте с меченым антителом к CD127. В целом, клетки различают по уровню экспрессии CD127 на основании легко определяемой разницы интенсивности окрашивания, что хорошо известно специалистам в данной области. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, основанием для обозначения клетки как "CD127^lo/-" является распределение интенсивности флуоресценции, наблюдаемое для всех клеток, при этом клетки, демонстрирующие интенсивность флуоресценции ниже 50%, 40%, 30% или 20% обозначаются как "CD127^lO/-" клетки. Клетка обозначается как "CD127-", когда интенсивность ее флуоресценции ниже десятого процентиля. В некоторых случаях, частоту распределения CD127 окрашивания определяют для всех клеток и популяционную кривую строят для популяций с высоким и более низким окрашиванием, а клетки относят к той популяции, к которой они с большей статистической вероятностью должны относиться на основании статистического анализа соответствующих распределений в популяции. Согласно некоторым вариантам, "CD127^lo/-" клетки дают интенсивность окрашивания, которая в два или три раза меньше, чем у CD127 + клеток.

Используемый здесь термин "CD62L" относится к L-селектину, который представляет собой важную молекулу адгезии для миграции лимфоцитов. "CD62L+" обозначают клетки, которые дают промежуточное или яркое окрашивание при обработке меченым антителом к CD62L. "CD26L^lo/-" относится к клеткам, которые дают слабое/тусклое окрашивание или не окрашиваются вовсе при контакте с меченым антителом к CD62L. В-целом, клетки различают по уровню экспрессии CD 12 7 на основании легко определяемой разницы интенсивности окрашивания, что хорошо известно специалистам в данной области. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, основанием для обозначения клетки как “CD62L^lo/-" является распределение интенсивности флуоресценции, наблюдаемое для всех клеток, при этом клетки, демонстрирующие интенсивность флуоресценции ниже 50%, 40%, 30% или 20% обозначаются как "CD62L^lo/-" клетки. Клетка обозначается как "CD62L-", когда интенсивность ее флуоресценции ниже десятого процентиля. В некоторых случаях, частоту распределения CD 127 окрашивания определяют для всех клеток и популяционную кривую строят для популяций с высоким и более низким окрашиванием, а клетки относят к той популяции, к которой они с большей статистической вероятностью должны относиться на основании статистического анализа соответствующих распределений в популяции. Согласно некоторым вариантам, "CD62L^lo/-" клетки дают интенсивность окрашивания, которая в два или три раза меньше, чем у CD62L + клеток.

Используемый здесь термин "CD4" относится к поверхностному клеточному гликопротеину, который обычно обнаруживается на поверхности зрелых Т-хелперов и незрелых тимоцитов, а также на поверхности моноцитов и макрофагов. На Т-клетках, CD4 является ко-рецептором для Т-клеточного рецептора (TCR) и захватывает тирозинкиназу 1 ck. Своим D1-участком, CD4 может прикрепляться к бета 2-домену молекул МНС II класса. Обозначение "CD4+" относится к клеткам, которые дают яркое окрашивание при контакте с меченым анти-CD4-антителом, а обозначение "CD4-" относится к клеткам, которые дают слабое, тусклое окрашивание или не окрашиваются вовсе при контакте с меченым флуоресцентной меткой CD4 антителом. В целом все клетки распределяют в соответствии с их уровнем экспрессии CD4 на основании легко определяемой разницы интенсивности окрашивания, поскольку CD4 окрашивание четко является бимодальным. В некоторых случаях частоту распределения CD4 окрашивания определяют для всех клеток и популяционную кривую строят для популяций с высоким и более низким окрашиванием, а клетки относят к той популяции, к которой они с большей статистической вероятностью должны относиться на основании статистического анализа соответствующих распределений в популяции. Согласно некоторым вариантам, "CD4-" клетки дают интенсивность окрашивания, которая в два или три раза меньше, чем у CD4+клеток.

Используемый здесь термин "CD25" относится к альфа субъединице рецептора интерлейкина-2, одноцепочечному гликопротеину, имеющему молекулярный вес 55 кД. После активации Т-клеток антигеном или митогеном в присутствии монокина интерлейкина-1, интерлейкин-2 (IL-2) начинает быстро синтезироваться и секретироваться. В ответ на это субпопуляция Т-клеток экспрессирует высокоаффинные рецепторы для IL-2. Эти клетки пролиферируют, увеличивая популяцию Т-клеток, которые способны выполнять функции клеток-хелперов, супрессоров и цитотоксические функции. Рецептор к IL-2 обнаруживается не только на Т-клетках. Обозначение "CD25^hi относится к клеткам, которые дают яркое окрашивание при контакте с меченым анти-CD25-антителом. Обозначение "CD25+" относится к клеткам, которые окрашиваются менее ярко при контакте с меченым анти-С025-антителом, а обозначение "CD25^lo/-" относится к клеткам, которые дают слабое, тусклое окрашивание или не окрашиваются вовсе при контакте с меченым CD25 антителом. В целом, клетки различают по уровню экспрессии CD25 на основании легко определяемой разницы интенсивности окрашивания, что хорошо известно специалистам в данной области. В некоторых случаях основанием для отнесения клетки к какой-либо категории на основании уровня экспрессии CD25, а именно hi, +или -, является распределение интенсивности окрашивания, наблюдаемое для всех клеток. В целом, клетки, демонстрирующие интенсивность окрашивания выше 2, 3, 4 или 5% обозначаются как “hi” при этом те, которые попадают в верхнюю половину популяции, относят к "+" клеткам. Клетки интенсивность флуоресценции, для которых ниже 50%, обозначаются как "CB25^lo”-клетки, а клетки, у которых интенсивность менее 5%, обозначаются как CD25-клетки.

Используемый здесь термин "Foxp3" относится к ядерному белку Foxp3, который, как считается, выполняет роль фактора транскрипции (Hori et al., 2003; Yasayko, J. E. et al., Nat. Genet. 27, 68-73, 2001; Fontenot, J.D. et al., Nat. Immunol. 4:330-336, 2003; Khattri, R. et al., Nat. Immunol. 4:337-342, 2003). Поскольку Foxp3 расположен внутри клеток, его экспрессия может быть оценена при помощи внутриклеточной проточной цитометрии с использованием меченого анти-Foxp3-антитела (eBioscience inc or BD biosciences).

Согласно настоящему изобретению, Tr1 клетки обладают способностью секретировать высокие уровни IL-10 и промежуточные уровни TGF-β после активации. Tr1 клетки отличаются, в частности, своим уникальным профилем секреции цитокинов: они продуцируют высокие уровни IL-10, средние уровни TGF-β и средние уровни IFN-γ, но не продуцируют IL-4 или IL-2. Продукцию цитокинов обычно оценивают в культуре клеток после активации при помощи поликлональных активаторов Т-лимфоцитов, таких, как анти-CD3+апти-CD28 антитела или интерлейкин-2, РМА + иономицин. Альтернативно, продукцию цитокинов оценивают в культуре клеток после активации специфическим T-клеточным антигеном, представляемым антиген-презентирующими клетками. Высокие уровни IL-10 соответствуют, по крайней мере, 500 пг/мл, обычно более 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18 или 20 тысячам пг/мл. Средние уровни секреции TGF-β соответствуют, по крайней мере, 100 пг/мл, обычно более 200, 300, 400, 600, 800 или 1000 пг/мл. Средние уровни секреции IFN-γ соответствуют концентрациям, находящимся в пределах от 0,1 пг/мл до, по крайней мере, 400 пг/мл, обычно более 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 пг/мл. Низкие уровни секреции IL-4 или IL-2 или отсутствие секреции соответствуют концентрации приблизительно 500 пг/мл, предпочтительно, менее 250, 100, 75 или 50 пг/мл, или еще меньше.

Tr1 клетки могут дополнительно характеризоваться по поверхностным маркерам. Указанные маркеры поверхности клеток могут распознаваться реагентами, которые специфически связываются с ними. Например, белки, углеводы или липиды на поверхности Tr1 клеток могут иммунологически распознаваться антителами, специфичными для определенного белка или углевода (для более подробной информации об использовании антител к маркерам см. Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; также раздел ПРИМЕРЫ). Набор маркеров, присутствующих и отсутствующих на поверхности Tr1 клеток, является их специфической характеристикой. Таким образом, Tr1 клетки могут быть отобраны при помощи позитивной и негативной селекции с использованием поверхностных клеточных маркеров. Реагент, который связывается с поверхностным клеточным маркером, экспрессируемым Tr1 клетками, "позитивный маркер", может использоваться для позитивной селекции Tr1 клеток (то есть, остающихся клеток, которые экспрессируют поверхностный клеточный маркер). Наоборот, негативная селекция основана на том факте, что определенные поверхностные клеточные маркеры не экспрессируются Tr1 клетками. Следовательно, "негативный маркер" (то есть маркер, отсутствующий на поверхности Tr1 клеток) может использоваться для исключения из популяции тех клеток, которые не являются Tr1 клетками; клетки, связывающие реагент, специфичный для негативного маркера, удаляются.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, распознавание клеток на основании определяемой экспрессии поверхностных клеточных маркеров происходит путем сравнения экспрессии поверхностного клеточного маркера со средней величиной экспрессии этого маркера контрольной популяцией клеток. Например, экспрессия маркера на поверхности Tr1 клеток может сравниваться со средней величиной экспрессии этого маркера другими клетками, выделенными из того же образца, что и Tr1 клетки. Другим способом распознавания клеток на основании экспрессии поверхностных маркеров является исследование клеток при помощи проточной флуометрии с использованием комбинации реагентов (см. Givan A, Flow Cytometry: First Principles. Wiley-Liss, New York, 1992; Owens M A & Loken M R., Flow Cytometry: Principles for Clinical Laboratory Practice, Wiley-Liss, New York, 1995).

Под "комбинацией реагентов" понимаются, по крайней мере, два реагента, которые связываются с поверхностными клеточными маркерами, как присутствующими (позитивный маркер), так и отсутствующими (негативный маркер) на поверхности Tr1 клеток, или реагенты, которые связываются с комбинацией позитивных и негативных маркеров. Например, использование комбинации антител, специфичных для поверхностных маркеров Tr1 клеток, приводит к выделению Tr1 клеток из различных образцов/тканей и/или к их обогащению.

При отборе клеток по фенотипическим характеристикам, полученных из образца, антитела, которые распознают видовые специфические варианты маркеров, используются для обогащения и селекции Tr1 клеток. Термин "обогащенный" в отношении обогащенной популяции клеток может быть определен как увеличение количества клеток, имеющих определенный маркер, во фракционированном наборе клеток по сравнению с количеством клеток, имеющих маркер в нефракционированном наборе клеток. В определенных случаях популяцию обогащают по Tr1 клеткам при помощи реагентов, которые связывают специфические поверхностные маркеры, специфичные для Tr1 клеток, после чего эти клетки отделяют при помощи различных методов сортировки клеток, таких, как флуоресцентная сортировка клеток (FACS, Fluorescence-Activated Cell Sorting), использование твердофазных магнитных шариков и т.д. В некоторых случаях может использоваться комбинация методов сортировки клеток, например, магнитный отбор с последующей FACS. Чтобы усилить обогащение, позитивный отбор комбинируют с негативным для выделения Tr1 клеток на основе клеточных маркеров. Предполагается, что выделение/обогащение Tr1 клеток с использованием клеточных маркеров может осуществляться в любом порядке. Следовательно, этап позитивной селекции может непосредственно предшествовать этапу негативной селекции, или наоборот. Считается также, что выделение/обогащение может осуществляться и при объединении этапов позитивной и негативной селекции. Следовательно, выделение/обогащение осуществляют, выполняя сначала этапы позитивной селекции в соответствии с используемым способом, а затем этапы негативной селекции в соответствии с используемым способом, или наоборот.

Термин "анти Х-антитело" или "X антитело", согласно настоящему изобретению, относится к антителу, которое может специфически связываться с X. В частности, анти-CD127-антитело или CD127 антитело обладает способностью связывать CD127. К антителам, которые используются в соответствии с настоящим изобретением, относятся, без ограничений указанными, рекомбинантные антитела, поликлональные антитела, моноклональные антитела, химерные антитела, человеческие моноклональные антитела, гуманизированные или приматизированные моноклональные антитела, а также фрагменты антител. В настоящее время коммерчески доступно большое количество специфических антител к лимфоцитарным биомаркерам. К ним относятся анти-CD127, анти-CD4, анти-CD62L и анти CD25 антитела. Термин "антитело" относится к полипептиду, содержащему структурную область, кодируемую иммуноглобулиновым геном, или ее фрагменты, которые специфически связываются с антигеном и распознают его. К распознаваемым иммуноглобулиновым генам относятся гены каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, ипсилон и мю константных участков, а также многочисленные гены вариабельных участков. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон, что, в свою очередь, определяет класс иммуноглобулина, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Обычно антиген-связывающий участок антител является наиболее важным участком, определяющим специфичность и аффинность связывания. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) представляет собой тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара включает одну "легкую" (около 25 кД) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кД). N-конец каждой цепи определяет вариабельный участок, включающий, приблизительно, 100-110 аминокислот и, в первую очередь, ответственный за распознавание антитела. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (VH) относятся к указанным легким и тяжелым цепям, соответственно. Антитела существуют, например, в форме интактных иммуноглобулинов, или в виде набора хорошо изученных фрагментов, получаемых при расщеплении целых иммуноглобулинов различными пептидазами. Так, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных мостиков в шарнирной области с образованием фрагмента F(ab)’2, димера Fab, который сам по себе является легкой цепью, соединенной с VH-CH1 дисульфидной связью. F(ab)’2 может быть восстановлен в умеренных условиях для разрушения дисульфидных связей в шарнирной области, что приводит к превращению F(ab)’2 димера в Fab’ мономер. Fab’ мономер по существу представляет собой Fab с частью шарнирной области (см. Fundamental Immunology. Paul ed., 3d ed. 1993). Несмотря на то, что различные антительные фрагменты образуются при расщеплении интактного антитела, любой специалист в данной области понимает, что указанные фрагменты могут быть синтезированы de novo как при помощи химического синтеза, так и при помощи технологий рекомбинантных ДНК. Таким образом, термин «антитело», используемый здесь, также относится к фрагментам антитела, которые могут быть получены как путем модификации целого антитела, синтезированы de novo при помощи рекомбинантных ДНК технологий (например, одноцепочечной Fv), а также идентифицированы с использованием фаговых дисплейных библиотек (см, например, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990). В некоторых случаях высокоаффинный лиганд к мишени может использоваться вместо антитела. Понятие "специфически (или селективно) связывается", используемое по отношению к антителу, или "специфически (или селективно) иммунологически реагирует с", используемое по отношению к белку или пептиду, относится к реакции связывания, которая выявляет присутствие белка, обычно в гетерогенной популяции белков и других биомолекул. Специфическое связывание с антителом при таких условиях требует антитела, которое выбрано по причине своей специфичности к определенному белку. Например, поликлональные антитела могут отбираться таким образом, чтобы остались только те поликлональные антитела, которые специфически реагируют с выбранным антителом и не реагируют с другими белками. Такой отбор может осуществляться путем исключения антител, которые перекрестно реагируют с другими молекулами. Предпочтительно, "метка" или "детектируемое вещество" ковалентно или нековалентно прикрепляется к антителу. Метка может выявляться спектрометрическим, фотохимическим, биохимическим, иммунохимическим, химическим способом или любым другим физическим способом. Особенно полезными метками являются флуоресцентные красители. Способы прикрепления меток к антителам хорошо известны специалистам в данной области. Наиболее предпочтительными являются метки, которые прикрепляются к антителам посредством линкера, который может быть легко отщеплен или отделен или подвержен гидролизу при взаимодействии с заданным ферментом в физиологических условиях. Антитело также может быть конъюгировано с магнитной частицей, такой, как парамагнитная микробусина (Miltenyi Biotec, Germany). Активированная Т-клетка, связанная с антителом, меченным магнитной меткой, может быть выделена при помощи технологий, включающих, без ограничений указанными, магнитную сортировку клеток. Подходящим образом меченные антитела к CD127, CD62L, CD4 и CD25, а также к другим многочисленным кластерам дифференцировки, являются коммерчески доступными и хорошо известны специалистам в данной области. Антитело может быть мечено до или после контакта с образцом, или до или после контакта с CD. CD-антитело может быть мечено путем контактирования с меченым антителом, которое связывается с CD-антителом. Используемый здесь термин "CD" или "кластер дифференцировки" или "общая детерминанта" относится к молекулам на поверхности клеток, которые распознаются антителами.

Согласно данному изобретению, популяция Tr1 клеток может быть идентифицирована путем определения экспрессии CD4, CD 127 и CD62L маркеров на поверхности клеток в клеточной популяции: клетки, экспрессирующие CD4 (то есть CD4⁺ клетки) и экспрессирующие низкие уровни CD 127 и CD62L (то есть, клетки, являющиеся CD127^lo/- и CD62L^lo/-), относятся к Tr1 клеткам.

Согласно данному изобретению, популяция отдыхающих Tr1 клеток может быть идентифицирована путем определения экспрессии на поверхности клеток CD4, CD25 и, по крайней мере, одного из маркеров CD 127 или CD62L в клеточной популяции: клетки, экспрессирующие CD4 (то есть CD4+ клетки) и экспрессирующие низкий уровень, по крайней мере, одного из маркеров CD127 или CD62L (то есть CD127^lo/- и/или CD62L^lo/-), предпочтительно, низкий уровень CD 127 или CD62L, и не экспрессирующие CD25 (то есть, CD25^- клетки) относятся к отдыхающим Tr1 клеткам.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, также оценивается маркер Foxp3, при этом клетки, экспрессирующие CD4 (то есть CD4⁺ клетки) и экспрессирующие на низком уровне, по крайней мере, один из маркеров CD 127 или CD62L (то есть CD127^lo/- и/или CD62L^lo/-), предпочтительно, экспрессирующие на низком уровне CD 127 или CD62L, и не экспрессирующие CD25 (то есть, CD25^- клетки) и, дополнительно, не экспрессирующие Foxp3 (то есть Foxp3-клетки) относятся к отдыхающим Tr1 клеткам.

Согласно данному изобретению, популяция активированных Tr1 клеток может быть идентифицрована путем определения экспрессии на поверхности клеток CD4, CD25, CD127 и CD62L маркеров в клеточной популяции: клетки, экспрессирующие CD4 и CD25 (то есть, CD4⁺ и CD25⁺ клетки) и экспрессирующие на низком уровне CD127 и CD62L (то есть CD127^lo/- и/или CD62L^lo/- клетки) относятся к активированным Tr1 клеткам.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, также оценивается маркер Foxp3, при этом, клетки, экспрессирующие CD4 и CD25 (то есть, CD4+ и CD25+ клетки) и экспрессирующие низкие уровни CD127 и CD62L (то есть CD127^10/- и/или CD62L^lo/- клетки), и экспрессирующие Foxp3 (то есть Fохр3⁺ клетки) относятся к активированным Tr1 клеткам.

Предпочтительными реагентами, которые связываются с указанными маркерами (CD4, CD25, CD127, CD62L и Foxp3) и используются для идентификации указанных Tr1 клеток, являются антитела. Согласно дополнительному варианту осуществления изобретения, антитела конъюгированы с флуорохромом или магнитной частицей. Согласно другому варианту осуществления изобретения, клеточную селекцию осуществляют при помощи проточной цитометрии, флуоресцентной сортировки клеток, магнитной селекции, аффинной хроматографии или пэннинга, а также при помощи комбинации указанных способов.

Другим объектом изобретения является выделенная популяция Tr1 клеток, полученная при помощи способа идентификации, описанного выше, с последующей селекцией клеток.

Другим объектом настоящего изобретения является выделенная популяция отдыхающих Tr1 клеток, полученная при помощи способа идентификации клеток, описанного выше, с последующей селекцией клеток.

Еще одним объектом настоящего изобретения является выделенная популяция активированных Tr1 клеток, полученная при помощи способа идентификации клеток, описанного выше, с последующей селекцией клеток.

Еще одним объектом настоящего изобретения является популяция отдыхающих и активированных Tr1 клеток, полученная при помощи способа идентификации клеток, описанного выше, с последующей селекцией клеток.

Термин "выделенный" относится к клетке или клеточной популяции, которая изолирована из своего естественного окружения (такого, как периферическая кровь), удалена или отделена и, по крайней мере, на 75%, 80%, 85%, предпочтительно, приблизительно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% свободна от других клеток, которые присутствуют в естественной среде, но не имеют поверхностных клеточных маркеров, на основании экспрессии которых и была выделена клеточная популяция.

Способы выделения или отделения клеточной популяции хорошо известны специалистам в данной области и включают, без ограничений указанными, сортировку клеток при помощи проточной цитометрии, магнитную селекцию, аффинную хроматографию, пэннинг или комбинации указанных способов.

Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая или включающая изолированную популяцию отдыхающих и/или активированных Tr11 клеток, как описано выше. Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемые носители, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, являются стандартными. В источнике Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Osol, A. Ed. (1980) описываются композиции и лекарственные формы, подходящие для фармацевтической доставки композиции, заявленной в соответствии с настоящим изобретением. В целом, природа носителя зависит от используемого способа введения. В частности, лекарственные формы для парентерального введения обычно содержат в качестве носителей инъекционные жидкости, такие, как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водная декстроза, кунжутное масло, глицерол, этанол, комбинации указанных веществ и т.д. Носитель и композиция могут быть стерильными, а лекарственная форма соответствует предполагаемому способу введения. Помимо нейтральных биологических носителей, фармацевтические композиции могут содержать минимальные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких, как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты, рН буферирующие агенты и подобные соединения, например, ацетат натрия или монолаурат сорбитана. Композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию.

Другим объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции Tr1 клетками, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, а также экспрессирующих на низком уровне CD 127 и CD62L, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную Tr1 клетками.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции отдыхающими Tr1 клетками, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, а также экспрессирующих на низком уровне, по крайней мере, один из маркеров CD127 или CD62L, предпочтительно экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD62L, и не экспрессирующих CD25, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную отдыхающими Tr1 клетками.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ обогащения клеточной популяции активированными Tr1 клетками, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, CD25, а также экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD62L, и отбор указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную активированными Tr1 клетками.

Другим объектом настоящего изобретения является популяция, обогащенная Tr1 клетками, полученная при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения является популяция, обогащенная отдыхающими Tr1 клетками, полученная при помощи способа, описанного выше.

Еще однимобъектом настоящего изобретения является популяция, обогащенная активированными Tr1 клетками, полученная при помощи способа, описанного выше.

Предпочтительными реагентами, которые связываются с указанными маркерами (CD4, CD125, CD127 и CD62L) для отбора/обогащения указанных клеток, являются антитела. Согласно дополнительному варианту осуществления изобретения, антитела конъюгированы с флуорохромом или магнитной частицей. Согласно другому варианту осуществления изобретения, селекцию клеток осуществляют при помощи проточной цитометрии, флуоресцентной сортировки клеток, магнитной селекции, аффинной хроматографии, или пэннинга, или при помощи комбинации указанных способов.

Композиция/популяция, обогащенная Tr1-клетками, представляет собой такую композицию/популяцию, в которой процент Tr1 клеток выше, чем процент Tr1 клеток в популяции клеток, образующейся естественным образом. Популяция, обогащенная Tr1 клетками, необязательно может представлять собой гомогенную популяцию Tr1 клеток. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения, по крайней мере, приблизительно, 50%, приблизительно, 55%, приблизительно, 60%, приблизительно, 65%, приблизительно, 70%, приблизительно, 75%, приблизительно, 80%, приблизительно, 85%, приблизительно, 90%, приблизительно, 95%, приблизительно, 98% или, приблизительно, 99% клеток в композиции представляют собой Tr1 клетки. Согласно другим вариантам осуществления изобретения, процент Tr1 клеток в обогащенной композиции/популяции, по крайней мере, в два раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз, в 50 раз, в 60 раз, в 70 раз, в 80 раз, в 90 раз, в 100 раз выше, чем процент Tr1 клеток перед обогащением. Используемый здесь термин "приблизительно", стоящий перед каким-либо числовым значением, означает разброс в пределах 10% от заданного числового значения.

Любой источник клеток, содержащий Tr1 клетки, может использоваться для выделения/обогащения Tr1 клеток. К подходящим источникам относятся, без ограничений указанными, периферическая кровь, синовиальная жидкость, селезенка, тимус, лимфатические узлы, костный мозг, Пейеровы бляшки и миндалины.

Способы обогащения различаются в зависимости от уровня обогащения, ассоциированного с каждым этапом процесса обогащения. Уровень обогащения и процент чистоты Tr1 клеток будет зависеть от множества факторов, включая, без ограничений указанными, природу донора и источника клеток/ткани и характер течения заболевания у донора. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, Tr1 клетки обогащают, по крайней мере, приблизительно, в 2 раза, приблизительно, в 5 раз, приблизительно, в 10 раз, приблизительно, в 15 раз, приблизительно, в 20 раз, приблизительно, в 25 раз, приблизительно, в 30 раз, приблизительно, в 35 раз, приблизительно, в 40 раз, приблизительно, в 45 раз, приблизительно, в 50 раз, приблизительно, в 55 раз, приблизительно, в 60 раз, приблизительно, в 65 раз, приблизительно, в 70 раз, приблизительно, в 75 раз, приблизительно, в 80 раз, приблизительно, в 85 раз, приблизительно, в 90 раз, приблизительно, в 95 раз, приблизительно, в 100 раз, приблизительно, в 105 раз, приблизительно, в 110 раз, приблизительно, в 115 раз, приблизительно, в 120 раз, приблизительно, в 130 раз, приблизительно, в 140 раз, приблизительно, в 150 раз или, приблизительно, в 200 раз.

Способы выделения, изолирования или селекции клеток включают, без ограничений указанными, магнитную сепарацию с использованием магнитных бус с нанесенными антителами (Schwartz, et al., патент США No. 5,759,793) и аффинную хроматографию или "пэннинг" с использованием антитела, прикрепленного к твердой матрице (например, планшету). К другим методикам, позволяющим достичь точной селекции, относятся флуоресцентная сортировка клеток (FACS), которая может иметь различные уровни сложности, например, множественные цветные каналы, каналы, регистрирующие свет под низким углом или приглушенный рассеянный свет, или импедансные каналы. Мертвые клетки могут элиминироваться путем селекции с использованием красителей для мертвых клеток, например (пропидий иодид, LDS). Красные кровяные клетки могут быть удалены, например, при помощи отстаивания, гемолиза или центрифугирования в градиенте фиколл-пак. Может применяться любая методика, если она не оказывает вредного влияния на жизнеспособность отобранных клеток.

Для удобства антитела конъюгируют с различными метками в нескольких целях: например, с магнитными бусами для облегчения выделения Tr1 клеток; с биотином, который связывается с высокой аффинностью с авидином или стрептавидином; флуорохромами, которые могут использоваться в аппарате для флуоресцентной сортировки клеток; гаптенами и т.д. Многоцветный анализ может использоваться вместе с FACS или в комбинации с иммуномагнитной сепарацией и проточной цитометрией. Многоцветный анализ представляет интерес для сепарации клеток и основан на определении многочисленных поверхностных антигенов, например, не CD4⁺ маркеров иммунных клеток (CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR гамма/дельта и гликофорин А), CD4, CD25, CD127 и CD62L. Флуорохромы, которые могут использоваться для такого многоцветного анализа включают, без ограничений указанными, фикобилипротеины, например, фикоэритрин и аллофикоцианины; флуоресцин и техасский красный.

Магнитная сепарация представляет собой методику, которая используется для селективного сохранения магнитных материалов в сосуде, таком, как колонка или пробирка для центрифугирования, в градиенте магнитного поля. Tr1 клетки могут быть мечены путем прикрепления магнитных частиц к поверхности клеток посредством специфических взаимодействий, включая иммунно-аффинные взаимодействия. Суспензию, содержащую Tr1 клетки и находящуюся в подходящем сосуде, затем подвергают воздействию магнитного поля с градиентами достаточной силы для отделения Tr1 клеток от других клеток в суспензии. Затем сосуд отмывают подходящей жидкостью для удаления немеченых клеток и получают очищенную суспензию Tr1 клеток.

Значительная часть магнитных систем для нанесений меток представлена суперпарамагнитными частицами, с поверхностью которых ковалентно связано антитело или стрептавидин. С целью сепарации клеток такие частицы могут использоваться как для позитивной селекции, когда помечаются магнитными метками и сохраняются клетки, представляющие интерес, так и для негативной селекции, когда сохраняется и помечается магнитными метками большинство клеток, не представляющих интереса. Диаметр используемых частиц широко варьирует, приблизительно, от 50-100 нм для частиц MACS (Miltenyi Biotec) и StemSep (ТМ), а также коллоида (StemCell Technologies) до 150-450 нм для EasySep(R) (StemCell technologies) и частиц Imag (BD Biosciences), вплоть до 4,2 мкм для Dynabeads (Dynal Biotech). Тип используемой частицы зависит от используемой магнитной методики сепарации меченых клеток.

Выделяют два важнейших класса методик магнитной сепарации, каждый из которых, для удобства и в силу практических причин подразумевает использованием перманентных магнитов вместо электромагнитов. Первый класс - это высокоградиентная сепарация в магнитном поле на колонке, при которой в качестве меток для интересующих мишеней используются маленькие частицы со слабыми магнитными свойствами, а разделение указанных мишеней происходит на колонке, заполненной намагничиваемой матрицей. Когда магнитное поле воздействует на колонку, создаются очень высокие градиенты в непосредственной близости к поверхности матричных элементов. Такие высокие градиенты необходимы для того, чтобы разделить мишени, меченые указанными частицами, с относительно слабыми магнитными свойствами. Второй класс представлен методикой, осуществляемой в пробирке, которая подразумевает использование в качестве меток для интересующих мишеней частиц с более сильными магнитными свойствами. Указанные мишени, представляющие интерес, затем разделяют в пробирке для центрифугирования при помощи магнитных полей, которые генерируют магнитом, расположенным за пределами пробирки. Указанный метод имеет преимущество, поскольку он не требует использования намагничиваемой матрицы для создания градиентов; и, следовательно, не требует применения дорогой одноразовой колонки или колонки, которая может использоваться многократно, что сопровождается неудобными процедурами очистки и деконтаминации.

Когда клетки-мишени помещают на магнит, они мигрируют по направлению к участку или участкам с наибольшей силой магнитного поля и остаются в магнитном поле до тех пор, пока клетки, не имеющие метки, не будут удалены. Затем нужные клетки собирают и после удаления из магнитного поля используют. В том случае, когда требуется негативная селекция сохраняют клетки, не имеющие метки, которые затем используют для различных целей. FACS позволяет разделить субпопуляции клеток на основании их способности рассеивать свет при прохождении через лазерный луч. Прямое светорассеивание (FALS) обусловлено размером клеток, а светорассеивание под углом, также известное как боковое светорассеивание (SSC) обусловлено плотностью клеток, клеточным содержимым и ядерно-цитоплазматическим соотношением, то есть комплексностью клетки. Поскольку клетки могут помечаться антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем, они также могут характеризоваться интенсивностью флуоресценции антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, Tr1 клетки, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, выделяют при помощи иммунно-магнитной хроматографии. Например, анти CD4-антитело прикрепляют к магнитным бусинам. Указанные меченные антителом магнитные бусины используют как основу для аффинной очистки. Меченную антителом фракцию Т-клеток помещают на магнитную аффинную колонку. Клетки, которые не прикрепились, удаляют, а прикрепившиеся клетки элюируют с магнитной колонки путем удаления магнитного поля. Согласно другому варианту осуществления изобретения, клетки сначала метят при помощи антитела (например, анти-СВ4), а затем при помощи вторичного антитела, прикрепленного к магнитной бусине или сфере.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, второе антитело, иммунореактивное по отношению к Tr1 клеткам, может использоваться для обогащения популяции Tr1 клетками. Методика использования вторых антител хорошо известна специалистам в данной области. Обычно, вторые антитела представляют собой антитела, иммунореагирующие с константными участками первого антитела. Предпочтительными вторыми антителами являются антитела (иммуноглобулины) кролика, мыши, крысы, козы и лошади, они являются коммерчески доступными. Коммерчески доступные наборы содержат вторые антитела, конъюгированные с метками, такими, как (без ограничений указанными) магнитные частицы или флуорохромы.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, способ обогащения популяции Tr1 клетками, отдыхающими Tr1 клетками или активированными Tr1 клетками может включать:

- взаимодействие клеточной популяции, по крайней мере, с одним реагентом, который связывается с маркером не CD4⁺ клеток, что приводит к истощению не CD4⁺ клеток;

- идентификацию Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток как описано выше, их отбор и выделение. Примерами маркеров, которые связываются с не CD4⁺ клетками являются, без ограничений указанными, CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 и гликофорин А.

Предпочтительными реагентами, которые связываются с указанными маркерами являются антитела. Согласно дополнительному варианту осуществления изобретения, антитела конъюгированы с флуорохромом или магнитной частицей. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, клеточную селекцию осуществляют при помощи проточной цитометрии, флуоресцентной сортировки клеток, магнитной селекции, аффинной хроматографии или пэннинга, а также при помощи комбинации указанных способов.

Согласно одному варианту осуществления изобретения популяция Tr1 клеток, выделенная при помощи способа, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, может быть дополнительно размножена при помощи in vitro способа, описанного в заявке W02006/10882. Указанный способ включает:

а) культивирование при температуре Т1 ниже 35°С в культуральной среде Mf, содержащей питающие клетки, таких, как питающие клетки насекомых;

указанная температура Т1 обеспечивает пролиферацию питающих клеток, при этом указанные питающие клетки экспрессируют факторы, которые взаимодействуют со следующими белками на поверхности клеток:

- комплекс CD3/TCR;

- CD28 белок;

- IL-2 рецептор;

- CD2 белок;

- IL-4 рецептор

б) обеспечение контактирования питающих клеток, полученных на этапе а), очищенных или неочищенных от их культуральной среды Mf, с популяцией Tr1 клеток, содержащейся в культуральной среде Мр, при этом указанная культуральная среда Мр первоначально не содержит факторы, перечисленные при описании этапа а), для того, чтобы получить смесь, содержащую Tr1-клеточную популяцию, питающие клетки и культуральную среду Мр;

в) культивирование смеси, полученной на этапе б) при температуре Т2, которая составляет, по крайней мере, 35°С, причем указанный температурный режим выбран для того, чтобы происходила пролиферация Tr1 клеток, но не происходила пролиферация питающих клеток;

г) получение популяции Tr1 клеток, размноженной описанным выше образом.

Примерами факторов, которые взаимодействуют с указанными выше белками на поверхности клеток, являются:

- анти CD3 моноклональное антитело или модифицированное анти CD3 антитело, причем анти CD3 внутрицитоплазматический домен тяжелой цепи замещен трансмембранным доменом;

- анти CD28 антитело или его фрагмент, или белок CD80 или CD86;

- IL-2, секретируемый питающими клетками;

- CD58 белок;

- интерлейкин, выбранный из группы, включающей IL-4 и IL-13.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, Tr1 клетки, полученные указанным выше способом, могут быть клонированы при помощи стандартных способов клонирования Т-клеток.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, Tr1 клетки, полученные указанным выше способом, или клоны Tr1 клеток могут замораживаться и храниться.

Другим объектом настоящего изобретения является способ истощения клеточной популяции по Tr1 клеткам, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, а также экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD62L, и элиминацию указанных клеток, что позволяет получить/выделить клеточную популяцию, истощенную по Tr1 клеткам.

Другим объектом настоящего изобретения является способ истощения клеточной популяции по отдыхающим Tr1 клеткам, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, а также экспрессирующих на низком уровне, по крайней мере, один из маркеров CD127 или CD62L, предпочтительно, экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD62L, и не экспрессирующих CD25, и элиминацию указанных клеток, что позволяет получить/выделить клеточную популяцию, истощенную по отдыхающим Tr1 клеткам.

Другим объектом настоящего изобретения является способ истощения клеточной популяции по активированным Tr1 клеткам, включающий идентификацию клеток, экспрессирующих CD4, CD25, а такжр экспрессирующих на низком уровне CD127 и CD62L, и элимиацию указанных клеток, что позволяет получить/выделить клеточную популяцию, истощенную по активированным Tr1 клеткам.

Истощенная Tr1-клеточная композиция/популяция представляет собой такую композицию/популяцию Tr11 клеток, в которой процент Tr1 клеток ниже, чем процент Tr1 клеток в исходной популяции.

Другим объектом настоящего изобретения является популяция, истощенная по Tr1 клеткам, полученная при помощи способа, описанного выше.

Другим объектом настоящего изобретения является популяция, истощенная по отдыхающим Tr1 клеток, полученная при помощи способа, описанного выше.

Еще одним объектом настоящего изобретения является популяция, истощенная по активированным Tr1 клеткам, полученная при помощи способа, описанного выше.

Как уже объяснялось выше, к способам выделения клеток относятся, без ограничений указанными, магнитная сепарация с использованием магнитных бус с прикрепленным антителом, аффинная хроматография или "пэннинг" с использованием антитела, присоединенного к твердой матрице (например, планшету) и флуоресцентная сортировка клеток (FACS). Вместо отбора, Tr1 клетки элиминируют.

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, процент Tr1 клеток в истощенной композиции/популяции по крайней мере в 0,75, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1 выше процента Tr1 в исходной популяции/композиции.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая или включающая в себя популяцию, истощенную по отдыхающим и/или активированным Tr1 клеткам, и фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является набор для идентификации и выделения Tr1 клеточной популяции, популяции отдыхающих Tr1 клеток или популяции активированных Tr1 клеток, или набор для обогащения клеточной популяции Tr1 клетками, отдыхающими Tr1 клетками или активированными Tr1 клетками, или набор для истощения клеточной популяции по Tr1 клеткам, отдыхающим Tr1 клеткам или активированным Tr1 клеткам, причем указанный набор содержит реагенты для определения экспрессии CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности клеток.

Предпочтительно, указанные реагенты представляют собой антитела. Согласно другим вариантам осуществления изобретения, указанные антитела конъюгированы с флуорохромом или магнитными частицами.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, указанный набор дополнительно содержит реагент для определения экспрессии Foxp3. Предпочтительно, указанный реагент представляет собой антитело. Более предпочтительно, указанное антитело конъюгировано с флуорохромом.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ ингибирования иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества выделенных или обогащенных Tr1 клеток, отдыхающих или активированных Tr1 клеток, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, указанному субъекту.

Другим объектом настоящего изобретения является способ ингибирования иммунного ответа у субъекта, нуждающегося в этом, включающий выделение отдыхающих Tr1 клеток из биологического образца, согласно способу, описанному выше, размножение популяции Tr1 клеток, и введение размноженной популяции Tr1 клеток субъекту. Соответственно, размноженная популяция Tr1 клеток, введенная субъекту, ингибирует нежелательный иммунный ответ за счет своей супрессивной активности, что позволяет обеспечивает лечение состояний, ассоциированных с нежелательным иммунным ответом.

Одно из преимуществ выделенных отдыхающих Tr1 клеток в свете клеточной терапии заключается в том, что вводимая клеточная популяция является чистой. Другим преимуществом использования отдыхающих Tr1 клеток является их эффективность. В действительности специалистам в данной области известно, что активация ранее активированной популяции Т-клеток индуцирует гибель клеток in vitro, что приводит к меньшей эффективности in vivo. Еще одним преимуществом использования чистой Tr1 клеточной популяции является эффективность относительно цены и времени. Действительно, размножение популяции in vitro до количества, достаточного для адекватной клеточной терапии, занимает всего около 2 недель.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, отдыхающие Tr1 клетки могут быть выделены из крови, например, из периферической крови или пуповинной крови, или из тканевого биопсийного материала, например, ткани лимфатических узлов, ткани кишечника или синовиальной ткани, слизистых оболочек, а также их смывов после бронхоальвеолярного лаважа и из спиномозговой жидкости.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, отдыхающие Tr1 клетки являются аутологичными или аллогенными. Термин "аллогенные клетки", используемый здесь, относится к клеткам, выделенным из организма одного субъекта (донора) и вводимым в организм другого субъекта (реципиента или хозяина). Термин "аутологичные клетки", используемый здесь, обозначает клетки, которые выделены из организма донора и вводятся ему же. Способы размножения популяции отдыхающих Tr1 клеток хорошо известны специалистам в данной области.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, популяцию отдыхающих Tr1 клеток размножают in vitro при помощи способа, описанного в заявке WO 2006/10882. Указанный способ включает:

а) культивирование при температуре Т1 ниже 35°С в культуральной среде Mf питающих клеток, таких, как питающие клетки насекомых; указанная температура Т1 обеспечивает пролиферацию питающих клеток, при этом указанные питающие клетки экспрессируют факторы, которые взаимодействуют со следующими белками на поверхности клеток:

- комплекс CD3/TCR;

- CD28 белок;

- IL-2 рецептор;

- CD2 белок;,

- IL-4 рецептор;

б) обеспечение контактирования питающих клеток, полученных на этапе а), очищенных или неочищенных от культуральной среды Mf, с популяцией Tr1 клеток, содержащейся в культуральной среде Мр, при этом указанная культуральная среда Мр первоначально не содержит факторы, перечисленные при описании этапа а), для того, чтобы получить смесь, содержащую Tr1-клеточную популяцию, питающие клетки и культуральную среду Мр;

в) культивирование смеси, полученной на этапе б) при температуре Т2, которая составляет, по крайней мере, 35°С, указанный температурный режим выбран для того, чтобы происходила пролиферация Tr1 клеток, но не происходила пролиферация питающих клеток;

г) получение популяции Tr1 клеток, размноженной описанным выше образом.

Примерами факторов, которые взаимодействуют с указанными выше белками на поверхности клеток, являются:

- анти CD3 моноклональное антитело или модифицированное анти CD3 антитело, при этом анти CD3 внутрицитоплазматический домен тяжелой цепи замещен трансмембранным доменом;

- белок CD80 или CD86;

- IL-2, секретируемый питающими клетками;

- CD58 белок;

- интерлейкин, выбранный из группы, включающей IL-4 и IL-13.

Для активации популяции Т-клеток посредством TCR/CD3 комплекса может использоваться анти СО3-моноклональное антитело, предпочтительно, модифицированное анти CD3 антитело, при этом модификация анти-CD3 антитела заключается в замещении внутрицитоплазматического домена трансмембранным доменом, таким образом, что указанное модифицированное анти-CD3 антитело прикрепляется к клеточной мембране питающих клеток и взаимодействует с белковым комплексом CD3/TCR Т-клеток. Фактор, взаимодействующий с CD28 белком, присутствующим на поверхности антиген-специфичных Tr1 клеток и экспрессируемым питающими клетками, может быть представлен анти CD8 моноклональным антителом или его фрагментом, способным перекрестие связываться с молекулой CD28; в таком случае модификация анти CD8 моноклонального антитела заключается в добавлении трансмембранного домена для того, чтобы он прикреплялся к клеточной поверхности питающих клеток. Предпочтительно, вместо анти CD8 моноклонального антитела может использоваться природный лиганд для CD8, а именно, например, член семейства В7 белков, такой как В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86) белок.

Фактор, экспрессируемый питающими клетками, который взаимодействует с CD2, может быть представлен анти CD2 моноклональным антителом или его фрагментом, способным перекрестно связывать молекулу CD2; модификация анти-CD2 моноклонального антитела может быть осуществлена за счет добавления трансмембранного домена для прикрепления к поверхности питающих клеток. Предпочтительно, вместо анти CD2 моноклонального антитела может использоваться природный лиганд, а именно белок CD58. Дополнительно к факторам, которые прикрепляются к мембранам питающих клеток, для размножения антиген-специфической Tr1 клеточной популяции необходимы секретируемые факторы, такие, как интерлейкины. Такими интерлейкинами являются IL-2, который взаимодействует с IL-2 рецептором, присутствующим на поверхности антиген-специфических Tr1 клеток, а также IL-4 или IL-13, которые взаимодействуют с рецептором IL-4 антиген-специфических Tr1 клеток.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, популяцию отдыхающих Tr1 клеток размножают путем культивирования Tr1 клеток с шариками анти-СВ3/28 в присутствии цитокинов, таких, как IL-2, IL-4, IL-13 и/или IL-15. Примером указанного набора для размножения популяции отдыхающих Tr1 клеток является набор Dynabeads ®, выпускаемый компанией Invitrogen (Cat N^o111-4D).

Согласно другому варианту осуществления изобретения, популяцию отдыхающих Tr1 клеток размножают путем культивирования Tr1 клеток с аутологичным PBL, лейкоцитами, РВМС, антиген-презентирующими клетками или искусственно созданными антиген-презентирующими клетками, экспрессирующими МНС класса II, такими, как L клетки, в присутствии антигена.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, отдыхающие Tr1 клетки размножают путем культивирования Tr1 клеток с митогеном, таким, как РНА в присутствии цитокина, такого, как IL-2. '

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, популяция Tr1 клеток, размноженная указанным образом, может клонироваться при помощи стандартных способов клонирования клеток.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, популяция Tr1 клеток, размноженная указанным образом, или клоны Tr1 клеток могут быть заморожены для хранения.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, размноженные Tr1 клетки являются специфичными к антигену или к множеству антигенов.

Примерами антигенов, к которым такие размноженные Tr1 клетки могут быть специфичными, являются, без ограничений указанными, аутоантигены, пищевые антигены из стандартного пищевого рациона человека, воспалительные антигены, такие, как антигены, ассоциированные с рассеянным склерозом или заболеваниями суставов, и аллергены.

Термин "пищевые антигены из стандартного пищевого рациона человека" относится к иммуногенным пептидам, которые попадают в организм из пищевых продуктов, традиционных для человека, таким, как пищевые антигены из следующего перечня (без ограничений указанными): бычьи антигены, такие, как липокалин, Са-связывающий S100, альфа-лактальбумин, лактоглобулины, такие, как бета-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, казенны. К пищевым антигенам также могут относиться антигены атлантической семги, такие, как парвальбумин; куриные антигены, такие, как овомукоид, овальбумин, Ag22, кональбумин, лизоцим или куриный сывороточный альбумин; арахис, антигены креветок, такие, как тропомиозин; антигены пшеницы, такие, как агглютинин или глиадин; антигены сельдерея, такие, как профилин сельдерея; антигены моркови, такие, как профилин моркови; антигены яблок, такие, как тауматин, яблочный белок-переносчик липидов, профилин яблока; антигены груши, такие, как профилин груши, изофлавонредуктаза; антигены авокадо, такие, как эндохитиназа; антигены абрикоса, такие, как абрикосовый белок-переносчик липидов; антигены персика, такие, как персиковый белок-переносчик липидов или персиковый профилин; антигены сои, такие, как HPS, соевый профилин или (SAM22) PR-IO prot.

Термин "аутоантиген" относится к иммуногенному пептиду, полученному из белка, выделенного из организма того же индивидуума. Аутоантигеном может быть, например, аутоантиген из представленного ниже списка (без ограничений указанными): рецептор ацетилхолина, актин, транслокатор нуклеотида аденина, адренорецептор, декарбоксилаза ароматических L-аминокислот, рецептор азиоалогликопротеина, бактерицидный белок, увеличивающий проницаемость клеточной мембраны (BPi), кальцийчувствительный рецептор, фермент, расщепляющий боковые цепи холестерола, коллаген IV типа, цитохром Р450 2D6, десмин, десмоглеин-1, десмоглеин-3, F-актин, GM-ганглиозиды, глутаматдекарбоксилаза, рецептор глутамата, Н/К АТФаза, 17-гидроксилаза, 21 -гидроксилаза, IA-2 (ICAS12), инсулин, рецептор инсулина, фактор Касла I типа, функциональный антиген лейкоцитов I, миелин-ассоциированный гликопротеин, основный миелиновый белок, миелиновый олигодендроцитарный белок, миозин, Р80-коилин, пируватдегидрогеназный комплекс Е2 (PDC-E2), симпортер натрия и йода, SOX-10, общий мышечный белок щитовидной железы и глаза, тиреоглобулин, тиреоид пероксидаза, рецептор тиреотропина, тканевая трансглутаминаза, коактиватор транскрипции р75, триптофан гидроксилаза, тирозиназа, тирозингидроксилаза, АСТН, аминоацил-тРНК-гистидил синтетаза, кардиолипин, карбоновая ангидраза II, цебтромер-ассоциированные белки, ДНК-зависимая стимулируемая нуклеосомами АТФаза, фибрилларин, фибронектин, глюкозо-6-фосфат изомераза, бета 2-гликопротеин I, гоглин [95, 95, 160, 180], белки теплового шока, гемидесмосомальный белок 180, гистоны Н2А, Н2В, кератин, рецептор IgE, Ku-ДНК протеинкиназа, Ки-нуклеопротеин, La фосфопротеин, миелопероксидаза, протеиназа 3, РНК полимераза I-III, белок распознавания сигналов, топоизомераза I, тубулин, вименсцин, миелин-ассоциированный олигодендроцитарный основный белок (МОВР, от англ. Myelin Associated Oligodendrocyte Basic Protein), протеолипидный белок, олигодендроцитарный специфический белок (OSP/Claudin 11), циклическая нуклеотид 3’ фосфодиэстераза (CNPase), ВР антиген 1 (BPAGl-e), трансальдолаза (TAL), человеческие митохондриальные аутоантигены PDC-E2 (Novo 1 и 2), OGDC-E2 (Novo 3) и BCOADC-E2 (Novo 4), буллезный пемфигоид (ВР) 180, ламинин 5 (EN5), DEAD-box белок 48 (DDX48) или ассоциированный с инсулиномой антиген-2.

Термин "антиген, ассоциированный с рассеянным склерозом" относится к миелиновому основному белку (МВР), миелин-ассоциированному гликопротеину (MAG), миелиновому олигодендроцитарному белку (MOG), протеолипидному белку (PLP), олигодендроцитарному миелиновому олигопротеину (OMGP), миелин-ассоциированному олигодендроцитарному основному белку (МОВР), олигодендроцитарному специфическому белку (OSP/Claudin 1), белкам теплового шока, олигодендроцитарным специфическим белкам (OSP), NOGO А,, гликопротеину Ро, периферическому миелиновому белку 22 (РМР22), 2’3’-циклической нуклеотид-3’-фосфодиэстеразе (CNPase), фрагментам, вариантам и комбинациям указанных соединений.

Термин "антиген, ассоциированный с заболеваниями суставов" относится к цитруллин-замещенным циклическим и линейным пептидам филаггрина, пептидам коллагена II типа, пептидам хрящевого гликопротеина 39 (HCgp39) человека, HSP, пептидам гетерогенных ядерных нуклеопротеинов (hnRNP), A2 пептидам, hnRNP B1, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, 65, 70 и 90, BiP, кератину, виментину, фибриногену, пептидам коллагена 1,111 IV и V типов, аннексину V, глюкозо-6-фосфатизомеразе (GPI), ацетил-калпастатину, пируватдегидрогеназе (PDH), альдолазе, топоизомеразе 1, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, фосфолипидным антигенам, включая анионный кардиолипин и фосфатидилсерин, нейтрально заряженный фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин, матричным металлопротеиназам, фибриллину и аггрекану.

Термин "аллерген" относится к вдыхаемым аллергенам, аллергенам, поступающим через пищеварительный тракт и к контактным аллергенам. Примерами аллергенов являются, без ограничений указанными, вдыхаемые аллергены пыльцы растений (Cup, Jun), клещи домашней пыли (Der, Gly, Туг, Lep), собак, кошек и крыс (Can, Fel, Mus, Rat). Примерами контактных аллергенов являются, без ограничений указанными, тяжелые металлы (такие, как никель, хром, золото), латекс, гаптены, такие, как галотан, гидралазин.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, на основе размноженной популяции Tr1 клеток может быть создана лекарственная форма для парентерального, внутримышечного, внутритканевого, внутривенного или интраперитонеального введения, интраназального ингаляционного введения, легочного ингаляционного введения, внутрикожного или внутрисуставного введения.

Предпочтительно, размноженная популяция Tr1 клеток в составе лекарственной формы, вводится внутримышечно, интраперитонеально или внутривенно, либо непосредственно в лимфатические узлы пациента; внутривенное введение является наиболее предпочтительным.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая или включающая размноженную популяцию Tr1 клеток, которая представляет собой смесь отдыхающих Tr1 клеток и активированных Tr1 клеток, и фармацевтически приемлемый носитель.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая смесь отдыхающих Tr1 клеток и активированных Tr1 клеток, при этом указанная смесь получена путем размножения клеточной популяции in vitro с последующим выделением Tr1 клеточной популяции при помощи способа, описанного выше.

Соответственно, фармацевтическая композиция включает отдыхающие Tr1 клетки, имеющие следующий фенотип CD4⁺CD25^-CD127^lo/- CD62L^lo/-, и активированные Tr1 клетки, имеющие следующий фенотип CD4⁺, CD25⁺, CD 127^lo/-, CD62L^lo/-.

Фенотип Tr1 клеток, предназначенных для введения нуждающемуся субъекту, может быть уточнен при помощи проточной цитометрии.

На момент завершения этапа размножения популяции, Tr1 клетки остаются в двух состояниях: в состоянии покоя (отдыха) или в активированном состоянии. Без намерения ограничивать себя какой-либо теорией, авторы изобретения предположили, что композиция, содержащая смесь отдыхающих Tr1 клеток и активированных Tr1 клеток, представляет особый интерес, поскольку активированные Tr1 клетки будут обладать способностью подавлять воспаление сразу после введения композиции, в то время как отдыхающие Tr1 клетки нуждаются в активации in situ для последующей пролиферации in vivo и реализуют свою супрессивную активность в отдаленное время.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанный выше субъект перенес трансплантацию органов, такую, как трансплантация костного мозга или органная трансплантация, либо проходит эту процедуру в настоящее время.

Другим объектом изобретения является способ профилактики или лечения воспалительных состояний у субъекта, нуждающегося в этом, заключающийся во введении субъекту эффективного количество выделенных и обогащенных Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток, в соответствии с настоящим изобретением.

Другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики или лечения аутоиммунного заболевания у субъекта, нуждающегося в подобном лечении, заключающийся во введении субъекту эффективного количества выделенных и обогащенных Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток, в соответствии с настоящим изобретением.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, популяция клеток может быть получена из организма субъекта, которому затем будет вводиться композиция, обогащенная по Tr1 клеткам.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения для субъекта является желательным подавление иммунного ответа.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, субъектом является человек, страдающий от воспалительного состояния и/или заболевания/нарушения, включая, без ограничений указанными, неаутоимунные воспалительные заболевания пищеварительного тракта, послеоперационную спаечную болезнь, заболевание коронарных артерий, фиброз печени, острый респираторный дистресс синдром, острый воспалительный панкреатит, панкреатит, индуцированный эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографией, ожоги, атеросклероз коронарных, церебральных и периферических артерий, аппендицит, холецистит, дивертикулит, висцеральные фиброзные болезни, заживление ран, рубцовые изменения кожи (келоиды, гнойный гидраденит), гранулематозные заболевания (саркоидоз, первичный билиарный цирроз), астму, гангренозную пиодермию, синдром Свита, болезнь Бехчета, первичный склерозирующий холангит и абсцессы.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, субъектом является человек, страдающий от аутоиммунного состояния и/или заболевания/нарушения, включая, без ограничений укаказанными, системную красную волчанку, вульгарную пузырчатку, тиреоидит, тромбоцитопеническую пурпуру, болезнь Грейвса, сахарный диабет, ювенильный диабет, спонтанный аутоиммунный диабет, миастению гравис, болезнь Аддисона, артритические состояния, такие, как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, рассеянный склероз, псориаз, увеит, аутоиммунную гемолитическую анемию, склеродермию, воспалительные заболевания кишечника, такие, как аутоиммунные воспалительные заболевания пищеварительного тракта, болезнь Крона, колит, воспаление кишечника, обусловленное пищевой аллергией, синдром Шегрена, болезнь Хашимото, миастению гравис, аутоиммунные полиэндокринопатические синдромы, сахарный диабет I типа (TIDM), аутоиммунный гастрит, аутоиммунный увеоретинит, полимиозит и тиреоидит, встречающиеся также при генерализованных аутоиммунных заболеваниях, характерных примером которых у человека является системная красная волчанка. Термин "аутоантиген" или "собственный антиген", используемый здесь, относится к антигену или эпитопу, который является нативным антигеном млекопитающего и при этом иммуногенным при определенном заболевании млекопитающего.

Клетки, используемые в соответствии с изобретением, могут применяться для предотвращения или лечения трансплантационных реакций, таких, как реакция трансплантат против хозяина (GVHD), отторжение трансплантата и при пересадках гематопоэтических стволовых клеток.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, субъект страдает от аллергического или астматического состояния. Примерами аллергических или астматических состояний являются, без ограничений указанными, астма, атопический дерматит, аллергический ринит, конъюктивит, экзема, контактная аллергия, респираторная аллергия, пищевая аллергия и анафилаксия.

Введение Tr1 клеток пациенту осуществляют при помощи способов, хорошо известных из области техники, таких, как адоптивный перенос клеток. Вкратце, смешанную популяцию клеток выделяют из организма потенциального донора. В зависимости от назначения, клетки могут быть выделены в период ремиссии заболевания или во время активной фазы заболевания. Обычно это осуществляют путем забора цельной крови и выделения гранулоцитов при помощи лейкафереза (лейкоцитоферез). Например, было показано, что лейкаферез больших объемов (LVL) позволяет получить максимальное количество лейкоцитов из крови. Собранные лимфоциты могут быть разделены при помощи технологий сепарации клеток, основанных на выявлении Tr1-специфических клеточных маркеров, таких, как здесь описанные; после чего полученные клетки вводят пациенту, донору клеток (за исключением GCHD, когда донор и реципиент различаются), для адоптивной иммунной супрессии. Пациенту вводят, приблизительно от 10³ до 10¹¹, предпочтительно от 10⁴ до 10⁹, предпочтительно, 10⁵ до 10⁹, предпочтительно, от 10⁶ до 10⁹, более предпочтительно, 10⁶ до 10⁸ Trl клеток.

Используемый здесь термин "эффективное количество" означает количество терапевтического вещества или композиции, которое является достаточным для подавления (на некоторое время) или уменьшения тяжести и/или продолжительности течения заболевания или одного или нескольких симптомов заболевания; профилактики прогрессирования заболевания; регрессии заболевания; профилактики рецидивов заболевания; развития, возникновения или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием; детекции заболевания или усиления или улучшения профилактического или лечебного эффекта(ов) другой терапии (например, профилактического или лекарственного агента). Эффективное количество будет меняться в зависимости от возраста, пола, расы, видовых признаков, общего состояния пациента и т.д., тяжести заболевания, против которого направлено лечение, природы вводимого агента, продолжительности лечения, наличия любого сопутствующего лечения, используемого фармацевтически приемлемого носителя и подобных факторов, которые находятся в компетенции специалиста в данной области. В зависимости от ситуации, "эффективное количество" в каждом конкретном случае может определяться специалистом на основании, соответствующих описаний и литературных источников и/или путем рутинных экспериментальных исследований (например, см. Gennaro et al., Eds. Remington’s The Science and Practise of Pharmacy, 20^th edition, 2000; Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore MD; Braunwald et al., Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15^th edition, 2001; McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1992; Merck Research Laboratories, Rahway NJ).

Термины "предотвращать", "профилактика" и "превентивный", используемые здесь, обозначают предупреждение развития или возникновения заболевания или предупреждение рецидива, возникновения или развития одного или нескольких симптомов заболевания у субъекта, которое достигается за счет введения лекарственного агента (например, профилактического или лечебного агента), или введения комбинации лекарственных агентов (например, комбинации профилактических или лечебных агентов). Под термином "лечение" подразумевается, что достигается, по крайней мере, улучшение симптомов, ассоциированных с заболеванием у пациента; при этом термин "улучшение" используется в широком смысле и относится, по крайней мере, к уменьшению величины какого-либо параметра, например, симптома, ассоциированного с заболеванием, по поводу которого проводится лечение. Таким образом, термин "лечение" также включает ситуации, при которых патологическое состояние или, по крайней мере, ассоциированные с ним симптомы, полностью подавляются, например, предотвращается их появление, останавливается их развитие или они исчезают и, таким образом, пациент больше не страдает от патологического состояния или, по крайней мере, от симптомов, характерных для этой патологии. Используемый здесь термин "субъект" относится к животному, предпочтительно, млекопитающему, наиболее предпочтительно, к человеку.

Другим объектом изобретения является способ усиления иммунного ответа трансплантированной клеточной популяцией у субъекта, нуждающегося в этом, заключающийся во введении указанному субъекту эффективного количества клеточной популяции, истощенной по Tr1 клеткам, отдыхающим Tr1 клеткам или активированным Tr1 клеткам, как описано выше.

Другим объектом настоящего изобретения является способ усиления иммунного ответа трансплантированной клеточной популяции у субъекта, нуждающегося в этом, заключающийся во введении указанному субъекту эффективного количества клеточной популяции, истощенной по отдыхающим Tr1 клеткам и/или активированным Tr1 клеткам, как описано выше.

Соответственно, отсутствие Tr1 клеток в трансплантированной клеточной популяции обеспечивает усиление желаемого иммунного ответа, поскольку Tr1 клетки не осуществляют своего супрессивного действия.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, указанный способ предназначен для лечения субъекта, проходящего противоопухолевую терапию.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, трансплантируемая клеточная популяция представляет собой популяцию антиген-специфичных эффекторных Т-клеток. Предпочтительно, указанная Т-клеточная популяция является специфичной для опухолевого антигена, такого, как антиген MART-1 (Melan А) меланомы или MAGE 1, 2, 3 меланомы, медуллярного рака щитовидной железы, мелкоклеточного рака легких, плоскоклеточного рака толстого кишечника и/или бронхов. В указанных вариантах осуществления изобретения клеточная популяция, предназначенная для трансплантации, истощена по отдыхающим и/или активированным Tr1 клеткам in vitro перед введением пациенту, проходящему лечение.

Было показано, что истощение регуляторных Т-клеток усиливает опосредованный вакцинами иммунный ответ у пациентов с раком (Dannull et al., 2005, 115(12):3623-3633). Следовательно, согласно другому варианту осуществления изобретения, предполагается, что истощение Tr1 клеток, отдыхающих Tr1 клеток и/или активированных Tr1 клеток, может использоваться для клеточной терапии при лечении раковых или инфекционных заболеваний, поскольку указанные Tr1 клетки могут неблагоприятно влиять на лечение. Например, в случае противоопухолевой терапии, временное истощение Tr1 клеток может представлять интерес перед началом протокола вакцинации/иммунотерапии; указанное временное истощение достигается за счет истощения крови пациента ex vivo при помощи специального аппарата в соответствии со способом истощения, заявленным в настоящем изобретении;

после истощения кровь немедленно возвращается обратно пациенту. Таким образом, в соответствии с данным вариантом осуществления изобретения, истощение отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в крови пациента осуществляется ех vivo посредством специального аппарата.

Другим объектом настоящего изобретения является способ мониторинга in vitro эффекта терапии у субъекта, заключающийся в идентификации популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в биологическом образце до и после лечения; при этом увеличение популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток после лечения означает наличие ответа на проводимую терапию.

Хорошо известно, что количество Tr1 клеток уменьшается у субъектов, страдающих от аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких, как рассеянный склероз, астма, вульгарная пузырчатка и ревматоидный артрит. Таким образом, субъект, у которого после лечения наблюдается увеличение популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, считается пациентом, отвечающим на проводимую терапию. В соответствии с настоящим изобретением, идентификация популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток осуществляется при помощи способа, описанного выше. Согласно одному варианту осуществления изобретения, биологические образцы получают от субъекта перед началом лечения и в различное время после начала лечения, например, каждую неделю или каждый месяц во время лечения.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.

Экспериментальные примеры

Пример 1. Выделение Tr1 клеток

Tr1 клетки были выделены как описано у Brun et al. (International Immunopharmacology, 2009). Вкратце, клетки из периферической крови выделяли при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла и культивировали с плотностью 2×10⁶ клеток на мл в присутствии пищевого антигена, для того, чтобы обеспечить пролиферацию антиген-специфичных Tr1 клеток. Через 13 дней культивирования клетки клонировали при помощи метода серийных разведении в течение 3-х недель. Выращенные клоны затем размножали при помощи CD3/CD28 стимулирующих агентов и цитокинов (IL-2 и IL-4). Целостность клонов Tr1 клеток оценивали на основании профиля продукции цитокинов клетками; при этом клетки демонстрировали высокую продукцию IL-10, средний уровень продукции IFN-γ и низкую продукцию IL-4 (см. Brun et al., International Immunopharmacology, 2009). Для получения мышиных Tr1 клеток, спленоциты активировали анти-CD3 и анти-CD28 моноклональными антителами в течение 7 дней в присутствии IL-10, анти-IL-12 и анти-IL-4. Полученную клеточную популяцию клонировали на облученных сингенных спленоцитах и анти-CD3 антителах в течение 3-х недель. Оценивали профиль секреции цитокинов выращенных клонов. Клоны, которые показывали высокую продукцию IL-10, средний уровень продукции IFN-γ и низкую продукцию IL-4, были идентифицированы как Tr1 клетки.

Пример 2. Выделение CD4⁺ Т-лимфоцитов и Treg клеток

РВМС выделяли из лейкоцитарной пленки, полученной из цельной крови здоровых волонтеров, при помощи седиментации в градиенте плотности на фиколл-пак PLUS (GE healthcare). Клетки, собранные с поверхности градиента, дважды отмывали средой RPMI 1640, подсчитывали и сразу же использовали для MACS и окрашивания. Вкратце, CD4⁺ Т-клетки выделяли негативной селекцией из общей РВМС при помощи CD4 набора (Dynal) с получением популяции CD4⁺ клеток со степенью очистки 92-98%. Размножение популяции очищенных CD4⁺ Treg клеток in vitro осуществляли, как описано у Battaglia et al (The journal of Immunology, 2006). Вкратце, выделенные CD4⁺ T-клетки активировали при помощи анти-CD3/анти-CD28 покрытых магнитных бус (Dynabeads для увеличения популяции CD3/CD28 Т-клеток, Dynal Invitrogen). Клетки культивировали в присутствии среды X-vivo 15 с добавлением 5% смешанной АВ человеческой сыворотки (Sigma), 1% пенициллина/стрептомицина в присутствии 100 мкМ рапамицина. Осуществляли три раунда стимуляции, каждый продолжительностью 7 дней, начиная со 2-го раунда добавляли IL-2 (100 Ед/мл).

Пример 3. Проточная цитометрия

Для анализа клеток человека при помощи проточной цитометрии использовали следующие антитела: РЕ-конъюгированное анти-СШ27 антитело (клон R 34.34 компании Beckman Coulter), FITC-меченое анти-С04 антитело компании Becton Dickinson (клон #RP4-T4), РеСу5-меченное анти-CD62L антитело (клон Dreg56 компании Becton Dickinson) и аллофикоцианин-конъюгированное анти-СВ25 антитело (клон М-А251 компании Becton Dickinson). Внутрицитоплазматическое окрашивание на Foxp3 человека осуществляли при помощи РЕ-конъюгированного анти Foxp3 антитела (клон 259 D/C7 компании BD) и набора для внутрицитоплазматического окрашивания (BD) в соответствии с инструкциями производителя. Для проточной цитометрии мышиных клеток использовали РЕСу7-конъюгированные анти CD4 антитела (клон RM4-15), АРС-конъюгированные анти-CD25 антитела (клон РС61), РЕ-конъюгированные анти-FoxP3 антитела (клон MF23) и РЕ-конъюгированные анти CD62E антитела (клон Ме114). Все антимышиные антитела были получены в компании Becton Dickinson.

Пример 4. Анализ генной экспрессии

Анализ генной экспрессии осуществляли при помощи ДНК-микрочипов, как описано у Dayem et al (Comp Funct Genom, 2003). Для этой цели клеточные образцы лизировали, а РНК стабилизировали реагентом Trizol (Invitrogen). РНК очищали при помощи мининабора RNeasy фирмы Qiagen, а остаточные количества ДНК удаляли при помощи ДНК-азы лаборатории Ambion (DNA-free). Концентрацию и количество выделенной РНК определяли при помощи аппаратов NanoDrop (Thermo) и Agilent Bioanalyzer 2100. РНК подвергали гибридизации на человеческих микрочипах Affymetrix (Affymetrix-HuGene-1_0-st-vl).

Результаты экспериментов

Природные CD4⁺ регуляторные клетки (n Treg клетки) впервые были описаны по конститутивной экспрессии молекулы CD25. Кроме того, CD25 также является маркером активации для всех типов Т-клеток и, следовательно, с его помощью можно различить n Treg клетки и активированные обычные Т-клетки (conv T-клетки). Те же правила правомерны и для экспрессии основного регуляторного гена Foxp3, чья экспрессия является конститутивной для n Treg клеток и подвергается повышенной регуляции на активированных convT-клетках. Через несколько лет после открытия Foxp3 и CD25 как конститутивных маркеров n Treg клеток, было обнаружено, что экспрессия молекулы CD 127 является конститутивно низкой на поверхности n Treg клеток, но относительно конститутивно высокой на поверхности обычных Т-клеток, что позволяет различить две указанные популяции клеток даже в активированном состоянии:

CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺CD127^lo = n Treg клетки (отдыхающие и активированные),

CD3+CD4⁺Foxp3+CD25⁺CD127^lo - активированные conv Т-клетки,

CD3⁺CD4⁺Foxp3-CD25^-CD127^hi = отдыхающие conv Т-клетки.

Помимо n Treg клеток, другая хорошо изученная регуляторная клеточная популяция задействована в иммунной толерантности. Эта популяция обозначается как Tr1 лимфоциты и также была фенотипирована по экспрессии указанных выше молекул. Ниже представлены результаты:

CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25+CD127^lo - активированные Tr1 клетки;

CD3+CD4+Foxp3^-CD25^-CD127^lo = отдыхающие Tr1 клетки.

Представленные результаты показывают, что отдыхающие Tr1 клетки можно отличить от n Treg клеток путем определения экспрессии CD25 и CD127, или путем определения экспрессии Foxp3, CD25 и CD127. Однако, активированные Tr1 клетки демонстрируют тот же фенотип, что и nTreg клетки (Фиг.1).

Для того, чтобы проверить, можно ли различить указанные две популяции при помощи другой поверхностной молекулы, авторы проанализировали ряд клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD62L, из n Treg и Tr1 популяций. Большое количество, как отдыхающих, так и активированных Treg клеток экспрессируют CD62L, в то время как экспрессия CD62L на поверхности, как отдыхающих, так и активированных Tr1 клеток была низкой (Фиг.2). Важно, что средняя интенсивность флуоресценции (MFI) при окрашивании на CD62L, CD127 и CD25 подтверждает, что n Treg клетки конститутивно экспрессируют CD62L, о чем и говорилось выше. Наоборот, CD62L конститутивно отсутствует у Tr1 клеток (Фиг.3). Таким образом, фенотипирование по CD62L позволяет различить активированные Tr1 клетки и n Treg клетки, если включить его в представленную выше панель маркеров. MFI при окрашивании на CD 127 является низкой для всех четырех клеточных популяций. MFI при окрашивании на CD25 является конститутивно высокой для n Treg клеток, высокой для активированных Tr1 клеток, а у отдыхающих Tr1 клеток CD25 подвергается даун-регуляции и MFI является низкой. Это наблюдение также подтверждается результатами RT-PCR (Фиг.4):

CD3⁺CD4⁺Foxp3-CD25-CD127^loCD62L^lo = отдыхающие Tr1 клетки;

CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25+CD127^loCD62L^lo = активированные Tr1 клетки;

CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺CD127^loCD62L^lo = n Treg клетки.

На Фиг.4 показано, что путем определения поверхностной экспрессии CD62L можно различить популяции активированных Tr1 клеток и nTreg клеток не только у человека, но и у мыши.

Лейкоциты периферической крови, полученные от двух здоровых людей, окрашивали специфическими антителами к CD4, CD25, CD127 и CD62L, меченными флуоресцентными метками. Процент клеток, экспрессирующих CD62L, определяли в субпопуляции клеток, характеризующейся фенотипом CD4⁺CD25-CD127^lo.

На фиг.5А и 5В показано, что для популяции с фенотипом CD4⁺CD25^-CD127^lo, определение маркера CD62L позволяет различить популяцию CD62L^lo и популяцию CD62L^hi. Таким образом, определение маркеров CD4, CD25 и CD127 не достаточно для выявления отдыхающих Tr1 клеток в клеточной популяции. В таблице 1 показано, как отличить каждую клеточную популяцию на основании маркеров.

Таблица 1 Отдыхающие conv Т-клетки Актив. conv Т-клетки. Отдых, и актив. nTreg клетки Отдыхающие Tr1 клетки Активированные Tr1 клетки CD4 + + + + + CD25 - + + - + CD127 + + низкий низкий низкий CD62L + - высокий низкий низкий

Дополнительно для распознавания клеточных популяций может использоваться маркер Foxp3

Таблица 2 Отдыхающие conv Т-клетки Актив. conv Т-клетки. Отдых, и актив. n Treg клетки Отдыхающие Tr1 клетки Активированные Tr1 клетки FOXP3 - + + - +

Группа изобретений относится к медицине и иммунологии и может быть использована для выделения, обогащения или истощения популяции отдыхающих Tr1 клеток и/или активированных Tr1 клеток. Способы по изобретению касаются идентификации, выделения, обогащения, истощения популяции отдыхающих Tr1 клеток и/или активированных Tr1 клеток, а также мониторинга in vitro эффекта терапии. Фармацевтические композиции по изобретению содержат клетки, экспрессирующие маркеры CD4,CD25,CD127 и CD62L. Набор по изобретению включает средства для определения экспрессии маркеров CD4,CD25,CD127 и CD62L на поверхности клеток. Использование изобретения позволяет идентифицировать отдыхающие Tr1 клетки как имеющие фенотип CD4⁺CD25^-CD127^lo/-CD62L^lo/-, а активированные Tr1 клетки как имеющие фенотип CD4⁺CD25⁺CD127^lo/-CD62L^lo/-. 14 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 ил., 4 пр.

1. Способ идентификации популяции отдыхающих Tr1 клеток, отличающийся тем, что определяют экспрессию маркеров CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности клеток, при этом клетки, экспрессирующие CD4, а также экспрессирующие на низком уровне CD127, CD62L, и не экспрессирующие CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки.

2. Способ идентификации популяции активированных Tr1 клеток, отличающийся тем, что определяют экспрессию маркеров CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности клеток, при этом клетки, экспрессирующие CD4, CD25, а также экспрессирующие на низком уровне CD127 и CD62L, представляют собой активированные Tr1 клетки.

3. Способ выделения популяции активированных или отдыхающих Tr1 клеток, отличающийся тем, что идентифицируют популяции отдыхающих Tr1 клеток или популяции активированных Tr1 клеток по п. 1 или 2, и выделяют указанные популяции.

4. Выделенная популяция отдыхающих или активированных Tr1 клеток, полученная способом по п. 3.

5. Способ обогащения клеточной популяции отдыхающими и/или активированными Tr1 клетками, отличающийся тем, что идентифицируют отдыхающие и/или активированные Tr1 клетки по п. 1 или 2, и осуществляют селекцию указанных клеток, что позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную отдыхающими и/или активированными Tr1 клетками, при этом процент отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, по крайней мере, в два раза превышает процент отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в исходной популяции до обогащения.

6. Клеточная популяция, обогащенная отдыхающими или активированными Tr1 клетками, полученная способом по п. 5.

7. Способ истощения клеточной популяции по отдыхающим Tr1 клеткам и/или активированным Tr1 клеткам, отличающийся тем, что идентифицируют отдыхающие Tr1 клетки, как указано в п. 1, и/или активированные Tr1 клеток, как указано в п. 2, и удаляют указанные клетки, что позволяет получить клеточную популяцию, истощенную по отдыхающим и/или активированным Tr1 клеткам, при этом процент отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в 0,75 больше процента отдыхающих Tr1 клеток или активированных Tr1 клеток в исходной популяции до истощения.

8. Клеточная популяция, истощенная по отдыхающим или активированным Tr1 клеткам, полученная способом по п. 7.

9. Набор для идентификации или выделения популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, включающий средства для определения экспрессии маркеров CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности клеток.

10. Фармацевтическая композиция отдыхающих или активированных Tr1 клеток, отличающаяся тем, что содержит клетки, экспрессирующие маркеры CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности, причем клетки с пониженной экспрессией CD127 и CD62L, экспрессирующие CD4 и не экспрессирующие CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки; клетки с пониженной экспрессией CD127 и CD62L и экспрессирующие маркеры CD4, CD25 представляют собой активированные Tr1 клетки.

11. Фармацевтическая композиция обогащенных отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, отличающаяся тем, что содержит клетки, экспрессирующие маркеры CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности, причем клетки с пониженной экспрессией CD127 и CD62L, экспрессирующие CD4 и не экспрессирующие CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки; клетки с пониженной экспрессией CD127 и CD62L и экспрессирующие маркеры CD4, CD25 представляют собой активированные Tr1 клетки.

12. Фармацевтическая композиция истощенных отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток, отличающаяся тем, что содержит клетки, экспрессирующие маркеры CD4, CD25, CD127 и CD62L на поверхности, причем клетки с пониженной экспрессией CD127 и CD62L, экспрессирующие CD4 и не экспрессирующие CD25, представляют собой отдыхающие Tr1 клетки; клетки с пониженной экспрессией CD127 и CD62L и экспрессирующие маркеры CD4, CD25 представляют собой активированные Tr1 клетки.

13. Фармацевтическая композиция по п. 12, отличающаяся тем, что указанные клетки являются специфичными к опухолевому антигену.

14. Фармацевтическая композиция отдыхающих Tr1 клеток и активированных Tr1 клеток, которые получены путем размножения in vitro выделенной популяции отдыхающих Tr1 клеток способом по п. 3, и размножение осуществляют путем культивирования клеточной популяции в присутствии антитела к CD3, которое активирует отдыхающие Tr1 клетки.

15. Способ мониторинга in vitro эффекта терапии у субъекта, отличающийся тем, что идентифицируют популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток в биологическом образце, полученном от субъекта до начала лечения и после лечения, способом по п. 1 или 2, при этом увеличение популяции отдыхающих и/или активированных Tr1 клеток после лечения расценивается как ответ на проводимую терапию.