СВЕЖЕВЫДЕЛЕННЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ BORDETELLA PERTUSSIS - ПРОДУЦЕНТ КОКЛЮШНОГО ТОКСИНА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области медицины, а именно - медицинской микробиологии и может быть использовано для получения коклюшных вакцин и диагностических коклюшных препаратов.

Известен штамм бактерий B.pertussis ГИСК №203 - продуцент коклюшного токсина, используемый в производстве коклюшных вакцин для получения очищенных антигенных комплексов и коклюшного токсина (SU 1761795 А1, C12N 1/20, А61К 39/10, 1992 г.).

Недостатком известного штамма является невысокая токсигенная активность.

Проблема получения высокоэффективных коклюшных вакцин остается актуальной, поскольку широкая иммунизация населения против коклюшной инфекции привела к адаптации коклюшных микробов к новым условиям и к изменениям в генетическом аппарате у циркулирующих среди населения штаммов B.pertussis. Эти изменения повлияли на эффективность вакцинных препаратов, применяемых для профилактики коклюша.

Задачей изобретения является получение нового высокопродуктивного свежевыделенного токсигенного штамма Bordetella pertussis, который может быть использован для производства коклюшных вакцин и диагностических препаратов.

Для решения указанной задачи предлагается свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis ГИСК им. Л.А.Тарасевича №287 - продуцент коклюшного токсина.

Сущность изобретения состоит в том, что для получения коклюшного токсина, применяемого для производства коклюшной вакцины и диагностических препаратов, используют новый свежевыделенный штамм Bordetella pertussis, депонированный в ФГУН ГНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером №287 - продуцент коклюшного токсина. Штамм культивируют в жидкой синтетической питательной среде с добавлением анионообменной смолы в статических условиях в течение 72-120 часов при температуре (36±1)°С. Концентрация бактерий в конце культивирования составляет 50±5 МОЕ/мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатанта - 15,0±2,0 лейкоцитозстимулирующих единиц (ЛСЕд) в 0,1 мл, количество коклюшного токсина, определенного иммуноферментным методом, составляло - 68,4±12,2 нг/МОЕ.

Молекулярно-генетические исследования вакцинных и свежевыделенных штаммов B.pertussis показали, что ген субъединицы А коклюшного токсина, ptxA, вакцинных штаммов характеризуется аллельным вариантом ptxA2 (AJ245367) - штаммы 267, 305, или вариантом ptxA4 (AJ245368) - штаммы 475 и 203, в то время как свежевыделенные штаммы несут аллель ptxA1 (AJ245366).

Все это свидетельствует о необходимости использования свежевыделенных штаммов для изготовления коклюшных профилактических и диагностических препаратов.

Получение новых свежевыделенных штаммов B.pertussis, обладающих повышенной токсигенной активностью, для производства коклюшной вакцины, является одним из важных условий совершенствования этих препаратов.

Свежевыделенный токсигенный штамм B.pertussis, полученный от больного ребенка в г.Москве в 2001 г., был адаптирован к синтетической среде культивирования вакцинных штаммов.

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические и культуральные свойства. Грамотрицательные коккобактерии - типичные, овоидной формы мелкие палочки, в мазках располагаются отдельно или парами; на среде Борде-Жангу с добавлением 20-25% дефибринированной крови человека колонии мелкие, диаметром 0,5-1,0 мм, выпуклые, круглые, края ровные, блестящие (с характерным «жемчужным» блеском), полупрозрачные, сероватого цвета, в тонком (1,5-2 мм) слое среды окружены нерезко ограниченной зоной гемолиза. Культура агглютинируется адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1 и 3 до 1:1600 и 1:800 соответственно.

Молекулярно-генетическая характеристика штамма. Ген субъединицы А коклюшного токсина характеризуется как аллельный вариант ptxA1 (AJ 245366).

Пример. Для культивирования Bordetella pertussis используют жидкую синтетическую среду, содержащую аминокислоты (цистеин, глутаминовая кислота, пролин), соли (K₂HPO₄, KH₂PO₄, KCl, MgSO₄, CaCl₂, NaCl) и витамины (аскорбиновая и никотиновая кислоты).

Лиофилизированный штамм №287 восстанавливают из сухого состояния на чашках Петри со средой Борде-Жангу с 20-25% крови человека. Чашки инкубируют при температуре (36±1)°С в течение 48-72 часов. Проверяют морфологию и чистоту культуры путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Затем с чашки делают пересев 10-15 типичных колоний на пробирки со средой Борде-Жангу или с казеиново-угольным агаром и инкубируют в течение 48-72 часов. После 2-3 пассажей на плотных средах смывы культуры используют в качестве посевного материала для выращивания штамма в жидкой синтетической среде. Первый пассаж в жидкой среде проводят в колбах Эрленмейера (100 мл среды + анионообменная смола) на шуттель-аппарате при температуре (36±1)°С в течение 16-18 часов. После проверки морфологических свойств культуру B.pertussis из колб пересевают в матрацы с жидкой синтетической средой, в которую добавлена анионообменная смола. Выращивание ведут в статических условиях в течение 72-120 часов при температуре (36±1)°С.

В конце культивирования концентрация бактерий составляет 50±5 Международных оптических единиц (МОЕ), лейкоцитозстимулирующая активность супернатанта - (15,0±2,0) ЛСЕд. в 0,1 мл, количество коклюшного токсина при определении иммуноферментным методом - (68,4±12,2) нг/МОЕ.

При сравнительном изучении токсигенных свойств предлагаемого и известного штаммов B.pertussis было показано, что предлагаемый штамм обладал более высокой токсигенной активностью (табл.1), чем известный штамм.

Результаты показали, что лейкоцитозстимулирующая активность штамма двукратно превышала таковую известного штамма, а количество коклюшного токсина, продуцируемого заявляемым штаммом, пятикратно превышало таковой известного штамма. Различия статистически достоверны. Это свидетельствует о высокой продуктивности свежевыделенного токсигенного штамма B.pertussis в сравнении с известным вакцинным штаммом.

Из заявленного штамма была получена коклюшная вакцина, обладающая выраженной протективной активностью: в 1 мл (20 МОЕ/мл) содержалось 10,8 международных защитных единиц (МЗЕ).

Таким образом, получен новый свежевыделенный токсигенный штамм Bordetella pertussis, депонированный в ФГУН ГНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером №287, обладающий высокопродуктивными качествами, который может быть использован для производства коклюшных вакцин и диагностических препаратов.

Табл. 1 Токсигенная активность штаммов B.pertussis №№ штаммов Лейкоцитозстимулирующая активность (ЛСЕд/0,1 мл) Кол-во коклюшного токсина нг/МОЕ Кол-во опытов М±m Достоверность Кол-во опытов М±m Достоверность 203 10 7,6±2,3 (Р<0,001) 10 14,6±3,1 (Р<0,001) 287 18 15,0±2,0 18 68,4±12,2

Сущность изобретения: получен новый свежевыделенный от больного штамм бактерий Bordetella pertussis №162-01, который депонирован в ФГУН ГНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича под номером №287. Штамм адаптирован к синтетической среде культивирования вакцинных штаммов. Изучены его культурально-морфологические свойства, молекулярно-генетическая характеристика и продуцирующая способность. Испытания показали, что штамм по изобретению обладает высокопродуктивными качествами и может быть использован для производства коклюшных вакцин и диагностических препаратов. 1 табл.

Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis ГИСК им. Л.А.Тарасевича №287 - продуцент коклюшного токсина.