СПОСОБ ХРАНЕНИЯ ДОНОРСКОЙ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ МАССЫ Российский патент 2013 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно, к фармакологии и трансфузиологии, и может быть использовано для консервирования эритроцитарной массы и хранения донорских эритроцитов до 30 суток при t=+4°С.

Консервирование донорской крови и эритроцитарной массы проводится с использованием гемоконсервантов и дополнительных веществ, способствующих укреплению клеточной мембраны эритроцитов, в качестве которых используются вещества, уплотняющие мембрану и частично обезвоживающие ее (сахароза, маннит, сорбит), а также коллоидные препараты (растворы желатина, поливинилпирролидона), которые, обволакивая эритроцитную мембрану, повышают ее стабильность при консервировании (Шевченко Ю.Л., Шабалин В.Н., Заривчатский М.Ф., Селиванов Е.А. «Руководство по общей и клинической трансфузиологии.» - Спб: ООО «Фолиант», 2003, с.127-128.).

Недостатком существующего способа является значительное снижение эффективности: отсутствие влияния на процессы перекисного окисления липидов и образование свободных радикалов при хранении донорских эритроцитов, что неизбежно приводит к ускоренному старению клеток.

Также известен способ консервирования донорской крови путем дополнительного введения 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцината (мексидола, далее ОПС) в состав стандартного гемокон-серванта глюгицир в концентрации 0,25 мг/мл глюгицира. При этом консервант содержит в 1 литре воды натрия гидроцитрат двузаме-щенный 20 г, глюкозы безводной 30 г, а также дополнительно ОПС 0,25 г. Соотношение крови и консерванта 4:1 (Патент РФ №2410103).

Недостатком данного способа, несмотря на успешную коррекцию процессов перекисного окисления липидов в донорской крови и повышение ее качества по сравнению с кровью, консервированной только с использованием глюгицира, является снижение защитной активности заявленной комбинации глюгицира ОПС к 14-ым, 21-ым и 30-ым суткам хранения донорской крови.

Целью изобретения является более эффективная защита клеточных мембран эритроцитов, в большей степени ограничение процессов гемолиза и предупреждение образование микросгустков на поздних сроках хранения эритроцитарной массы (14-21-30 сутки).

Поставленная цель решается дополнительным введением 3-окси-6-метил-2-этилпиридина малата (этоксидола, далее ОПМ) в состав гемоконсерванта глюгицир в концентрации 0,25 мг/мл глюгицира. Консервант содержит в 1 литре воды натрия гидроцитрат двузамещенный 20 г, глюкозы безводной 30 г, ОПМ 25 г. Соотношение крови и консерванта 4:1.

Технический результат заключается в повышении качества эритроцитарной массы при ее хранении до 14-21-30 суток. Консервант позволяет сохранить морфофункциональную полноценность эритроцитов в течение 30 суток.

Изобретение иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1.

Исследование влияния ОПМ проводилось в образцах эритро-цитной массы, заготовленной на гемоконсерванте глюгицир, который содержал 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл ОПМ.

Контролем служила эритроцитарная масса, заготовленная на глюгицире без добавок.

Серией сравнения явились образцы донорской эритроцитарной массы, заготовленной на гемоконсерванте глюгицир, который содержал 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл ОПС.

Исследования ряда показателей, отражающих качество эритроцитов, проводили в образцах эритроцитарной массы сразу после заготовки, затем, в процессе хранения при t=+4°С через 7 суток, 14 суток, 21 сутки и 30 суток.

Влияние ОПМ на морфо-функциональную полноценность донорских эритроцитов исследовали путем определения содержания свободного гемоглобина бензидиновым методом, доли осмотически неустойчивых эритроцитов (по содержанию свободного гемоглобина после помещения эритроцитов в 0,6% раствор натрия хлорида), количества микросгустков (подсчет под микроскопом), определяли процент гемолиза, среднего объема эритроцита (MCV) и ширины распределения эритроцитов (анизоцитоз) на гематологическом анализаторе МЕК-6410К (Япония).

Хранение донорской эритроцитной массы сопровождается увеличением проницаемости клеточной мембраны, ростом осмотической неустойчивости эритроцитов и увеличением содержания свободного гемоглобина, нарастанием количества микросгустков.

На сроках хранения свыше 7 суток в образцах эритроцитарной массы с добавлением ОПМ наблюдалось достоверно более значительное снижение количества микросгустков во всех изученных дозах (0,25 мг/мл, 0,5 и 1,0 мг/мл глюгицира), чем при добавлении к глюгициру ОПС. Так, при использовании препарата в концентрации 0,25 мг/мл показатель снижался относительно данных контроля на 14-е сутки 48%, на 21-е сутки - 47% и на 30-е сутки хранения - на 50% и был меньше серии сравнения, соответственно, на 41%, 31% и 34%.

При использовании для добавления к глюгициру ОПМ в концентрации 0,5 мг/мл количество микросгустков в образцах эритроцитарной массы снижалось по сравнению с контролем к 14-м суткам на 41%, к 21-м - на 47% и к 30-м - на 52%, в том числе, по сравнению с показателями серии сравнения (с применением ОПС в соответствующей концентрации), на 33%, 30% и 46%, соответственно.

ОПМ в концентрации 1,0 мг/мл позволило ограничить рост количества микросгустков на 14-е, 21-е и 30-е сутки хранения на 41%, 34% и 47%, соответственно, по сравнению с контрольными данными. Кроме того, показатель был ниже серии сравнения на 34%, 14% и 41%.

Таблица 1. Влияние ОПС и ОПМ на количество микросгустков (в 10⁶ л) при хранении эритроцитной массы (n=20). Метод коррекции Сроки хранения эритроцитной массы. исход 7 сут. 14 сут. 21 сут. 30 сут. (контроль)   4,500±0,224 47,30±1,14 145,45±1,60 198,8±6,35 3-ОПС 1,01±0,04∗ 41,9±0,73∗ 111,4±1,48∗ 151,7±1,73∗ 0,25 мг/мл 3-ОТП 2,587±0,112∗# 24,73±0,712∗# 77,39±1,95∗# 100,13±1,46∗# 0,25 мг/мл 3-ОПС 0,000±0,001 0,91±0,04∗ 41,7±0,42∗ 110,6±1,26∗ 176,7±2,25∗ 0,5 мг/мл 3-ОПМ   2,787±0,107∗# 27,933±0,530∗# 77,200±1,797∗# 94,75±1,98∗# 0,5 мг/мл 3-ОПС 0,90±0,05∗ 42,2±0,62∗ 111,5±1,72∗ 177,7±2,07∗ 1,0 мг/л 3-ОПМ 2,693±0,111∗# 27,800±0,500∗# 96,41±2,13∗# 105,59±0,89∗# 1,0 мг/мл Примечание: ∗ - достоверность различий р<0,05 по сравнению с данными контроля соответствующего срока наблюдения; # - по сравнению с данными при введении ОПС соответствующей концентрации и срока наблюдения.

Минимальное содержание микросгустков определялось в образцах с добавлением ОПМ в концентрации 0,5 мг/мл. Динамические изменения гематологических показателей эритроцитов, свидетельствуют о целесообразности применения ОПМ при консервировании эритроцитарной массы (табл.1).

Пример 2.

Уровень свободного гемоглобина на 7-е сутки хранения донорской эритроцитарной массы на фоне добавления к консерванту ОПМ в концентрации 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл был ниже контрольных данных на 24%, 33% и 22%, соответственно, и достоверно не отличался от показателей группы сравнения с добавлением ОПС (табл.2).

К 14 суткам хранения эритроцитарной массы в образцах с добавлением к консерванту ОПМ уровень свободного гемоглобина был меньше контрольных данных на 20%, 42% и 27%. При этом в группе сравнения, где к консерванту глюгицир добавлялся ОПС в соответствующих дозах, достоверного снижения содержания свободного гемоглобина не наблюдалось (табл.2).

На 21 сутки хранения эритроцитарной массы с добавлением к консерванту глюгицир ОПМ уровень свободного гемоглобина был ниже показателей контроля на 58%, 69% и 61%, в то время как в серии сравнения с добавлением ОПС показатель снижался относительно контроля только при использовании концентрации 0,25 мг/мл на 34% (табл.2).

К 30-м суткам хранения донорской эритроцитарной массы наибольшее снижение уровня свободного гемоглобина наблюдалось при использовании концентрации ОПМ 0,5 мг/мл.

Таблица 2. Влияние ОПМ на уровень свободного гемоглобина (г/л) при хранении эритроцитарной массы (М±m). Метод коррекции Сроки хранения эритроцитной массы, сут. исход 7 сут. 14 сут. 21 сут. 30 сут. (контроль)   0,051±0,001 0,079±0,007 0,206±0,008 0,583±0,018 3-ОПС 0,039+0,001∗ 0,069±0,001 0,135±0,015∗ 0,219±0,010∗ 0,25 мг/мл 3-ОПМ 0,03910,001∗ 0,063+0,003∗ 0,086+0,002∗# 0,301±0,007∗# 0,25 мг/мл 3-ОПС 0,029+0,001 0,039+0,001∗ 0,069±0,001 0,239±0,010 0,284+0,010∗ 0,5 мг/мл 3-ОПМ 0,034±0,002∗ О,046±0,002∗# 0,064±0,003∗# 0,274±0,031∗ 0,5 мг/мл 3-ОПС 0,039+0,001∗ 0,069±0,001 0,239±0,010 0,284±0,010∗ 1,0 мг/л 3-ОПМ 0,040±0,001∗ Э,058±0,001∗# 0,080+0,003∗# 0,380±0,015∗# 1,0 мг/мл Примечание: ∗ - достоверность различий р<0,05 по сравнению с данными контроля соответствующего срока наблюдения; # - по сравнению с данными при введении ОПС соответствующей концентрации и срока наблюдения.

Пример 3.

Процент гемолиза в образцах донорской эритроцитарной массы снижался при добавлении ОПМ к консерванту глюгицир к 7 суткам хранения по сравнению с контролем на 52%, 69% и 70%, соответственно, при использовании концентрации ОПМ 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл. При этом показатель во всех исследованных концентрациях снижался достоверно в большей степени, чем при добавлении к глюгициру ОПС.

На 14 сутки хранения процент гемолиза также был ниже контроля на 64%, 69% и 63% при использовании концентрации ОПМ 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл, соответственно, и был достоверно меньше данных серии сравнения, где добавлялся ОПС, на 59%, 65% и 61%.

На 21 сутки хранения эритроцитарной массы процент гемолиза был ниже контрольных данных на 49% и 22% в образцах с использованием концентрации ОПМ 0,5 и 1,0 мг/мл. При этом более выраженное снижение процента гемолиза по сравнению с добавлением в консервант ОПС наблюдалось при использовании концентрации ОПМ 0,5 мг/мл (на 56%).

На 30-е сутки хранения эритроцитарной массы процент гемолиза был ниже контрольных данных на 46%, 58% и 48% в образцах с добавлением к консерванту ОПМ в концентрации 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл. Причем, при использовании концентрации 0,5 мг/мл показатель был ниже данных группы сравнения на 19%.

Таким образом, процент гемолиза снижался в большей степени при различных сроках хранения эритроцитарной массы в образцах, где к консерванту глюгицир добавлялся ОПМ в концентрации 0,5 мг/мл.

Таблица 3. Влияние ОПС и ОПМ на % гемолиза при хранении эритроцитарной массы (М±m). Метод коррекции Сроки хранения эритроцитной массы, сут. Исход 7 сут. 14 сут. 21 сут. 30 сут. (контроль)   0,113±0,003 0,175±0,015 0,458±0,017 1,456±0,044 3-ОПС 0,085±0,002∗ 0,153+0,003 0,29910,034∗ 0,54510,024∗ 0,25 мг/мл 3-ОПМ 0,054±0,006∗# 0,063±0,003∗# 0,398±0,071 0,793±0,021∗# 0,25 мг/мл 3-ОПС 0,058±0,002 0,089±0,004∗ 0,157±0,004 0,53010,021 0,75010,038 ∗ 0,5 мг/мл 3-ОПМ 0,035±0,002∗# 0,055±0,006∗# 0,235±0,013∗# 0,61±0,06∗# 0,5 мг/мл 3-ОПС 0,08710,002∗ 0,166±0,008 0,51410,025 0,71110,025∗ 1,0 мг/л 3-ОПМ 0,034±0,002∗# 0,065±0,004∗# 0,357±0,064# 0,756±0,033∗ 1,0 мг/мл Примечание: ∗ - достоверность различий р<0,05 по сравнению с данными контроля соответствующего срока наблюдения; # - по сравнению с данными при введении ОПС соответствующей концентрации и срока наблюдения.

Пример 4.

Доля осмотически неустойчивых эритроцитов снижалась по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения при добавлении к консерванту глюгицир ОПМ в изученных концентрациях (табл.4). При этом при добавлении ОПМ в концентрации 0,5 мг/мл показатель не отличался от данных серии сравнения, а в концентрации 1,0 мг/мл был ниже, чем при добавлении ОПС на 32%, 7% и 17% на сроках хранения 14, 21 и 30 суток.

Таблица 4. Влияние ОПМ на долю осмотически неустойчивых эритроцитов (%) при хранении эритроцитной массы (n=20). Метод коррекции Сроки хранения эритроцитной массы. исход 7 сут. 14 сут. 21 сут. 30 сут. (контроль)   7,45±0,11 12,24+0,12 16,97+0,09 22,905+0,36 3-ОПС 3,54±0,08∗ 5,09+0,07* 11,33±0,16∗ 13,84±0,15∗ 0,25 мг/мл 3-ОПМ 3,93±0,07∗ 7,35±0,13∗# 12,28+0,18∗# 14,11+0,10∗ 0,25 мг/мл 3-ОПС 0,03 7±0,003 3,50±0,07∗ 4,98±0,08∗ 11,32±0,14∗ 13,57±0,11∗ 0,5 мг/мл 3-ОПМ 3,47+0,11∗ 4,93+0,11∗ 11,43+0,20∗ 13,67+0,16∗ 0,5 мг/мл 3-ОПС 3,94±0,06∗ 7,45±0,08∗ 12,24+0,13∗ 16,99+0,11∗ 1,0 мг/л 3-ОПМ 3,60+0,11∗ 5,07±0,07∗# 11,43±0,20∗# 14,03+0,21∗# 1,0 мг/мл Примечание: ∗ - достоверность различий р<0,05 по сравнению с данными контроля соответствующего срока наблюдения; # - по сравнению с данными при введении ОПС соответствующей концентрации и срока наблюдения.

Пример 5.

На всех сроках хранения эритроцитарной массы при добавлении к консерванту глюгицир ОПМ в изученных концентрациях наблюдается уменьшение процессов анизоцитоза (табл.5) и ограничение роста объема эритроцитов (табл.6). При этом предотвращается увеличение ширины распределения размеров эритроцитов и их объема свыше нормы при хранении образцов донорской эритроцитарной массы до 30 суток, в то время как в контроле в 80% случаев на поздних сроках хранения наблюдается увеличение размеров эритроцитов.

Таблица 5. Влияние ОПС и ОПМ на анизоцитоз (ширина распределения эритроцитов) (%CV) при хранении эритроцитарной массы (М±m). Метод коррекции Сроки хранения эритроцитной массы, сут. исход 7 сут. 14 сут. % 21 сут. % 30 сут. % (контроль)   14,23±0,17 15,66±0,06 0 16,22±0,05 10 17,02+0,1 0 80 3-ОПМ 0,25 мг/мл 12,68+0,12∗ 13,65±0,27∗ 0 13,72+0,29∗ 0 14,52±0,31∗ 0 3-ОПМ 0,5 мг/мл 10,90 ±0,16 12,28+0,24∗ 13,65+0,27∗ 0 13,72+0,29∗ 0 14,52±0,31∗ 0 3-ОПМ 1,0 мг/мл 13,06±0,34∗ 14,27+0,19∗ 0 14,25±0,61∗ 0 14,73±0,61∗ 0 Примечание: ∗ - достоверность различий р<0,05 по сравнению с данными контроля соответствующего срока наблюдения; % - процент эритроцитов, размеры которых превышают норму контроль - 21 сутки, контроль - 30 сутки. При добавлении ОПМ - 21 сутки. При добавлении ОПМ - 30 сутки.

Таблица 6. Влияние ОПС и ОПМ на средний объем эритроцитов (fl) при хранении эритроцитарной массы (М±m). Метод коррекции Сроки хранения эритроцитной массы, сут. Исход 7 сут. 14 сут. % 21 сут. % 30 сут. % - (контроль)   91,28±0,45 91,68±0,46 0 97,45+0,66 15 99,86+0,39 55 3-ОПМ 90,55±0,33 94,57±0,40 0 92,76±0,38∗ 0 97,24+0,52∗ 0 0,25 мг/мл 3-ОПМ 87,38±0,62 91,53±0,70 91,29±0,27 0 96,00±0,41 0 97,19±0,38∗ 0 0,5 мг/мл 3-ОПМ 91,66+0,67 94,57±0,38 0 95,71±0,33∗ 0 96,88±0,66∗ 0 1,0 мг/мл Примечание: ∗ - достоверность различий р<0,05 по сравнению с данными контроля соответствующего срока наблюдения; % -процент эритроцитов, содержание гемоглобина в которых не соответствует норме (норма - 80-l00fl).

Дополнительное применение 3-окси-6-метил-2-этилпиридина малата в составе гемоконсерванта «глюгицир» позволяет пролонгировать сроки хранения донорских эритроцитов и снизить уровень деструктивных процессов в хранящейся до востребования эритроцитной массе.

Изобретение относится к медицине. Проводят получение донорской крови, смешивание с гемоконсервантом глюцир в соотношении 4:1, разделение донорской крови на плазму и эритроцитную массу с последующим хранением эритроцитной массы в течение 30 суток при t=+4°С. Дополнительно в состав гемоконсерванта вводят 3-окси-6-метил-2-этилпиридина малат. Изобретение позволяет повысить эффективность защиты клеточных мембран эритроцитов, ограничить процесс гемолиза, предупредить образование микросгустков на поздних сроках хранения эритроцитарной массы. 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 5 пр.

1. Способ консервирования донорской эритроцитарной массы, включающий получение донорской крови, смешивание с гемоконсервантом в соотношении 4:1, разделение донорской крови на плазму и эритроцитную массу, с последующим хранением эритроцитной массы в течение 30 суток при t=+4°С, отличающийся тем, что дополнительно в состав гемоконсерванта глюгицир вводят 3-окси-6-метил-2-этилпиридина малат.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что 3-окси-6-метил-2-этилпиридина малат вводят в концентрации 0,5 или 1,0 мг/мл глюгицира.