СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СВИНОЙ КРОВИ НА ПЛАЗМУ И ЭРИТРОЦИТАРНУЮ МАССУ Российский патент 2012 года по МПК A61K35/16 A61K35/18 A61K38/42 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии выделения биологических веществ из животного сырья. Изобретение может найти применение при получении пищевых и лечебно-профилактических препаратов из боенской крови свиньи, а также при исследовании свиной крови в научно-исследовательских лабораториях.

Наиболее распространенными убойными животными являются КРС и свиньи. Кровь свиньи перед кровью КРС имеет преимущества, обуславливающие ее широкое применение в производстве пищевых и лечебно-профилактических препаратов. К преимуществам относится высокое содержание форменных элементов (эритроцитов) и более низкая доля влаги в крови. В таблице 1 представлены сравнительные данные качественного состава крови КРС и свиньи [1].

Таблица 1 Сравнительные данные качественного состава крови КРС и свиньи   Содержание, % от общего объема Вид животного Плазма Форменные Влага     элементы   КРС 56 44 81 Свинья 63 37 79

Известно, что сбор крови проводят на специальных бойнях, при этом для сохранения наиболее важных белков крови (альбумин, глобулин, фибриноген и гемоглобин) при ее сборе осуществляют стабилизацию. В качестве стабилизаторов крови убойных животных чаще всего используют натриевые соли фосфорной кислоты, либо цитрат натрия, которые нейтрализуют белок фибриноген тем самым, предотвращая свертывание крови. Выбор того или иного стабилизатора влияет на параметры (частота вращения и продолжительность) разделения крови [2].

Как известно, эритроциты при центрифугировании крови могут разрушаться (гемолизоваться). Степень разрушения эритроцитов зависит от степени воздействия на его оболочку центробежной силы и наличия и вида антикоагулянта крови. В пищевой промышленности проблема гемолиза эритроцитов при фракционировании до конца не решена, поэтому чистота разделяемых фракций не совершенна. В практике донорства человеческой крови используют гемоконсерванты, повышающие нативность эритроцитов и прочность его оболочки, что позволяет достаточно чисто разделять кровь на необходимые фракции. Гемоконсерванты донорской крови содержат лимонную кислоту и, соответственно, среда гемоконсерванта кислая [3].

Именно поэтому, для качественного разделения крови свиньи на необходимые фракции с целью сохранения ее ценных белков необходим комплексный подбор как стабилизаторов, так и параметров фракционирования крови при выбранных стабилизаторах.

Известен способ разделения крови убойных животных на плазму и форменные элементы для получения гемоглобина из выделенных эритроцитов, предусматривающий стабилизацию крови крупного рогатого скота или свиней, сепарирование в течение 30 мин при 6000 об/мин при 4°С [4].

Недостатком данного способа является применение сепараторов, что требует большого количества крови для однократного применения (не менее 3 литров) и длительность процесса разделения (30 минут).

В качестве прототипа выбран способ разделения крови животных, описанный в патенте на способ изготовления антигена для приготовления вакцины против анаплазмоза крупного и мелкого рогатого скота. Способ разделения крови на плазму и эритроцитарную массу предусматривает обескровливание животного, смешение крови с антикоагулянтом и центрифугирование при 3000÷3500 об/мин, в течение 10-15 минут. Способ, выбранный за прототип, позволяет сократить процесс разделения крови до 10÷15 минут и позволяет использовать для однократного опыта кровь в малых количествах [5].

Недостатком данного изобретения является имеющаяся возможность преждевременного разрушения эритроцитов при фракционировании крови, что требует своевременной и быстрой переработки крови.

Техническим результатом является усовершенствование способа разделения крови посредством применения предварительных стабилизаторов-консервантов, имеющих кислую рН и подбор параметров фракционирования крови при соответствующих стабилизаторах-консервантах.

Технический результат достигается тем, что в качестве антикоагулянта используют двухкомпонентный раствор: 4% раствор цитрата натрия (Na₃C₆H₅O₇) с добавлением лимонной кислоты до достижения рН от 5,0 до 6,0, который смешивают с кровью в соотношении 1:10, или 0,75% раствор натрия фосфат двузамещенного (Na₂HPO₄) с добавлением лимонной кислоты до достижения рН от 5,0 до 5,5, который смешивают с кровью в соотношении 1:4, затем охлаждают смешанную с антикоагулянтом кровь до температуры 4°С, центрифугируют при частоте вращения 4000÷5000 об/мин и продолжительности процесса 5÷15 мин. Полученные после центрифугирования фракции отделяют друг от друга с помощью дозаторов автоматических одноканальных переменного объема сливанием в специально подготовленные стерильные емкости.

Разработанные стабилизаторы-консерванты действуют направленно на нейтрализацию процесса свертывания крови с последующим ее консервированием. Стабилизаторы-консерванты характеризуются кислой средой. Кислая среда необходима для поддержания нативности эритроцитов и предотвращения их преждевременного гемолиза во время фракционирования при высоких скоростях вращения.

В таблице 2 представлены используемые в изобретении стабилизаторы-консерванты (антикоагулянты).

Таблица 2 Используемые в изобретении стабилизаторы-консерванты Применяемый реактив Варианты состава антикоагулянта №1 №2 №3 №4 №5 Лимонная кислота Добавляют до рН 6,0 Добавляют до рН 5,5 Добавляют до рН 5,0 Добавляют до рН 5,0 Добавляют до рН 5,5 Цитрат натрия 4% раствор 4% раствор 4% раствор - - Натрия фосфат двузамещенный - - - 0,75% раствор 0,75% раствор

Стабилизаторы-консерванты №1-3 добавляют в кровь в количестве 1:10 от общего объема стабилизированной крови, а образцы №4 и №5 в количестве 1:4.

После стабилизации проводят центрифугирование. Параметры центрифугирования находятся в пределах 4000-5000 об/мин и продолжительность 5-15 минут.

Пример. Подготовленный антикоагулянт (вариант №1 из таблицы 2) в количестве 10 мл налили в стерильные емкости объемом 100 мл. При забое свиньи осуществляли сбор крови в эти емкости до полного заполнения. Затем тщательно перемешивали раствор собранной крови и антикоагулянта. После этого стерильные емкости со стабилизированной кровью укладывались в холодильные камеры для охлаждения и при достижении температуры 4°С проводили фракционирование крови на лабораторной центрифуге при параметрах: частота вращения - 4000 об/мин, продолжительность - 15 минут. Исследуемая кровь разделялась в соотношении плазма/эритроциты 56,6/43,4%.

Таблица 3 Разработанные параметры фракционирования крови при соответствующих стабилизаторах-консервантах Параметр №1 №2 №3 №4 №5 Частота вращения, об/мин 4000 4000 4000 5000 5000 Продолжительность процесса центрифугирования, мин 15 15 15 5 5

Отличительной особенностью данного изобретения является то, что перед центрифугированием проводят предварительную стабилизацию собранной крови специальными растворами, имеющими кислую среду для поддержания нативности эритроцитов и предотвращения их преждевременного гемолиза, чего не имели аналог и прототип. Немаловажным фактом для изобретения является то, что выбор параметров фракционирования основан на измеренных значениях массовых плотностей полученных фракций. К преимуществам данного изобретения можно также отнести малую продолжительность процесса центрифугирования (5-15 минут). Получаемая при этом эритроцитарная масса может применяться для производства препаратов на основе гемоглобина, а полученная чистая плазма - для производства различных препаратов на основе полноценных белков альбумина, глобулина и фибриногена.

Источники литературы

1. Зайцев С.Ю. Биохимия животных. Фундаментальные и биохимические аспекты: Учебник. 2-е изд., испр. / С.Ю. Зайцев, Ю.В. Конопатов. - СПб.: Издательство «Лань», 2005. - 384 с.

2. Рогов И.А. Технология мяса и мясных продуктов. Книга 1. Общая технология мяса / И.А.Рогов, А.Г.Забашта, Г.П.Казюлин. - М.: КолосС, 2009. - 565 с.: ил.

3. Румянцев, А.Г. Клиническая трансфузиология / А.Г.Румянцев, В.А.Аграненко. - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1997. - 576 с.

4. Патент (РФ) №2080865 (1997). Способ получения гемоглобина / С.Л.Люблинский, Р.Г.Дзадзамия, А.В.Назаров, А.Б.Гобечия, О.В.Софронова, И.Н.Люблинская, Е.Д.Ермолаев, М.А.Каплан, Н.С.Орлов (аналог).

5. Патент (РФ) №2337706 (2007). Способ изготовления антигена для приготовления вакцины против анаплазмоза крупного и мелкого рогатого скота, способ изготовления вакцины против анаплазмоза, вакцина против анаплазмоза и способ профилактики анаплазмоза крупного и мелкого рогатого скота / Н.А.Казаков В.Т.Заблоцкий З.П. (прототип).

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа разделения свиной крови на плазму и эритроцитарную массу. Представленный способ предусматривает смешивание крови с антикоагулянтом при ее сборе с животного. В качестве антикоагулянта используют двухкомпонентный раствор: 4% раствор цитрата натрия (Nа₂С₆Н₅O₇) с добавлением лимонной кислоты до достижения рН от 5,0 до 6,0, смешивают с кровью его, в соотношении 1:10, или 0,75% раствор натрия фосфат двузамещенного (Na₂HPO₄) с добавлением лимонной кислоты до достижения рН от 5,0 до 5,5, смешивают с кровью его, в соотношении 1:4. Смешанную с антикоагулянтом кровь охлаждают до температуры 4°С, центрифугируют при частоте вращения 4000÷5000 об/мин и продолжительности процесса 5÷15 мин. Представленное изобретение позволяет сохранить нативность и предотвратить нежелательный гемолиз эритроцитов, вследствие чего увеличивается чистота получаемых фракций крови. 3 табл., 1 пр.

Способ разделения свиной крови на плазму и эритроцитарную массу, характеризующийся тем, что он предусматривает смешивание крови с антикоагулянтом при ее сборе с животного и центрифугирование, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта используют двухкомпонентный раствор: 4%-ный раствор цитрата натрия (Na₂C₆H₅O₇) с добавлением лимонной кислоты до достижения рН от 5,0 до 6,0, смешивают его с кровью в соотношении 1:10 или 0,75%-ный раствор натрия фосфат двузамещенного (Na₂HPO₄) с добавлением лимонной кислоты до достижения рН от 5,0 до 5,5, смешивают его с кровью в соотношении 1:4, охлаждают смешанную с антикоагулянтом кровь до температуры 4°С, центрифугируют при 4000÷5000 об/мин и продолжительности процесса 5÷15 мин.