СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИИ И АКТИВАЦИИ ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ ПРИ МАНИФЕСТАЦИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и отражает способ прогнозирования наличия гиперкоагуляции и тромбогенности у больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) без инфекционных осложнений в дебюте заболевания. Сущность способа заключается в том, что определяют показатели, характеризующие плазменное звено гемостаза: протромбиновый индекс, время Хагеман-зависимого эуглобулинового лизиса, концентрацию фибриногена, растворимых фибрин-мономерных комплексов, D-димеров, активность ф. VIII, антитромбина III, протеина С и плазминогена. Исследуют также показатели, отражающие нарушение функции эндотелия: антиген фактора Виллебранда (ФВ:Ag) и тромбомодулин (ТМ). По отклонению результатов исследования плазменного гемостаза констатируют наличие гиперкоагуляции и сопоставляют его с изменением маркеров эндотелиальной дисфункции: ФB:Ag и ТМ, а также уровнем D-димеров, являющихся показателем активации внутрисосудистого свертывания. При увеличении уровней ФВ:Ag, ТМ и D-димеров выше нормы и определенных величин наличие состояния гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания с высокой долей вероятности констатируют без определения показателей плазменного гемостаза.

Изобретение относится к медицине и касается выявления методов исследования показателей дисфункции эндотелия и их значений, при которых имеет место гиперкоагуляция и тромбогенность у больных ОЛЛ без инфекции в дебюте заболевания.

В литературе широко дискутируются различные механизмы нарушения свертывания крови у больных острыми лейкозами (ОЛ), в том числе зависящие от самого лейкозного процесса: повышенная активность протеиназ лейкоцитов, активация свертывания и фибринолиза [12]. Освещаются также вопросы нарушения функции эндотелия, повреждение которого вызывает запуск коагуляционного каскада [7]. Следовательно, ОЛ ассоциируются с гиперкоагуляцией и высоким риском тромбогеморрагических осложнений [15, 17]. Эндотелиальные клетки (ЭК) играют ключевую роль в регуляции циркуляции крови и процессов гемостаза. В норме эндотелиальная стенка атромбогенна, однако при повреждении эндотелия развивается его дисфункция, которая приводит к утрате тромборезистентности, продуцированию веществ, стимулирующих адгезию и агрегацию тромбоцитов, выработку тканевого фактора (ТФ). Все это приводит к запуску свертывания крови. Важным фактором регуляции гемостаза является высвобождение в местах повреждения сосудистого эндотелия фактора Виллебранда (ФВ) [16]. Последний принадлежит к адгезивным белкам и представляет собой гетерогенную популяцию гликопротеиновых мультимеров. Повышенный уровень его антигена (ФB:Ag) в крови является общепризнанным маркером повреждения ЭК.

Ключевым звеном комплекса реакций, регулирующих скорость и направление процессов гемостаза, является гликопротеид эндотелиальной мембраны - тромбомодулин (ТМ) [1]. Экспрессию ТМ на эндотелии снижают цитокины, увеличивая его содержание в крови [5]. Поскольку часть ТМ находится в растворимой форме, концентрация которой повышается при повреждении ЭК, его также относят к маркерам повреждения эндотелия [1, 6]; помимо того, он является предиктором органной дисфункции и неблагоприятного прогноза ДВС. Повышенное содержание ТМ отражает активацию эндотелия и может прогнозировать риск развития тромботических осложнений [13].

Понятие «гиперкоагуляция» было впервые введено А.И.Воробьевым (2002). Иначе это состояние называют гиперкоагуляционным синдромом [3, 8]; это повышенная готовность к свертыванию при отсутствии образования тромбов. Длительность его зависит от компенсаторных возможностей организма. Гиперкоагуляция характерна для целого ряда патологических состояний. При ОЛ она может привести как к клинически выраженному ДВС-синдрому с тяжелыми геморрагиями, так и возникновению тромбозов [11]. ДВС-синдром может развиваться как длительно, так и молниеносно. Учитывая это, очень важно определять четкие ранние диагностические критерии предшествующей ему гиперкоагуляции. Несмотря на значительные успехи в изучении нарушений плазменного звена гемостаза, несовершенство ряда существующих методов особенно сильно проявляется при диагностике гиперкоагуляции [8]. Лабораторными критериями ее считают: увеличение времени лизиса сгустков эуглобулинов [8, 11], повышенную активность ф. VIII, характерную для злокачественных заболеваний [9, 18], увеличенное содержание маркеров тромбинемии (РФМК и ПДФ), нормальную или сниженную активность антитромбина III (AT III), возможный низкий уровень протеина С (ПрС) [14] и повышенное содержание фибриногена [11].

Запуск коагуляции осуществляется посредством ТФ, который экспрессируется на многих типах клеток организма [5]. Прокоагулянтная активность лейкозных клеток также реализуется посредством ТФ, образующего комплекс с ф. VII, активирующим ф. Х и XI [2]. Властные клетки способны активировать эндотелий посредством секреции провоспалительных цитокинов [10]. Вне зависимости от факторов, вызвавших появление цитокинов, будь то экспрессия бластными клетками или воспаление, они могут привести к дисфункции эндотелия и активировать свертывающую систему крови.

Учитывая изложенное, следует обратить внимание на поиск ранних маркеров, которые отражают возможность возникновения гиперкоагуляции или пре-ДВС. Это позволит своевременно предотвратить развитие ДВС-синдрома и обеспечить профилактику тромбозов или геморрагии.

В качестве прототипа использовали публикацию М.А.Пантелеева и соавт. (2011, с.62-65) [8]. Метод исследования нарушений свертывания, по мнению авторов, наиболее близок к условиям in vivo. Он выполняется с помощью прибора, который фиксирует скорость роста сгустка фибрина. Принцип метода состоит в том, что используя этот прибор, исследование проводят без перемешивания в тонком слое плазмы; свертывание активируется по внешнему пути на пластинке, воспроизводящей участок поврежденного эндотелия, вокруг которого формируется сгусток. Производится видеосъемка растущего сгустка; анализ последней дает информацию о динамике свертывания во времени и пространстве. Авторы считают, что прибор позволяет проводить раннюю диагностику состояния гиперкоагуляции у пациентов с различной патологией.

Недостатком прототипа является то, что покрытая тканевым фактором (тромбопластином) пластинка не является полным воспроизведением процессов in vivo, так как в качестве исследуемого образца берется плазма, отделенная от форменных элементов крови, в том числе тромбоцитов. In vivo в месте повреждения сосуда кровь контактирует не только с тканевым фактором, но и с коллагеном. Таким образом, активация свертывания происходит не только по внешнему, но и внутреннему пути.

Источник получения тканевого фактора четко не указан. Являясь реагентом биологического происхождения (из тканей млекопитающих или рекомбинантным - из культуры клеток), он мало стабилен, кроме того, имеет разную активность, поэтому должен быть стандартизован. Все это также требует затрат и усилий. В заключение следует особо отметить, как широко может внедриться метод выявления гиперкоагуляции в практику научных и клинико-диагностических лабораторий с помощью этого прибора и какова будет стоимость исследований.

Принцип работы прибора не дает конкретных указаний на объективность выявления гиперкоагуляции при сниженном числе тромбоцитов, характерном для больных ОЛЛ.

Целью настоящего изобретения явилось достоверное определение факторов прогноза развития состояния гиперкоагуляции у больных ОЛЛ при манифестации заболевания.

Поставленная цель достигается тем, что при исследовании показателей дисфункции эндотелия и постановки тестов, отражающих нарушения в плазменном звене гемостаза и подтверждающих гиперкоагуляцию у больных, и сопоставлении их с результатами здоровых лиц использовали ряд методов.

Применяли следующие методы:

- время Хагеман-зависимого эуглобулинового лизиса (ХIIа-ЗЭЛ), метод Г.Ф.Еремина, А.П.Архипова (норма 7,0-12,0 мин)

- активность фактора VIII (ф. VIII:К) по унифицированному одностадийному методу Л.П.Папаян и П.В.Хроловой (норма 70-150%);

- растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) исследовали количественным методом с помощью ортофенантролинового теста по В.А.Елыкомову и А.П.Момоту (норма 30-40 мкг/мл);

- продукты деградации фибрина - D-димеры, определяемые полуколичественно методом латексной агглютинации. Результаты теста получали в следующих интервалах:<500, 500, 501-1000, 1001-1500, 1501-2000, 2001-2500, 2501-3000,>3000 нг/мл (норма<500 нг/мл); им присвоены соответственные баллы от 1 до 8. Использовали набор реагентов "D-dimer Test" Diagnostica Stago, Roche, Франция;

- активность антитромбина III (AT III) в % методом Ю.Л.Кацадзе и М.А.Котовщиковой (норма 75-125%);

- активность протеина С (ПрС) методом хромогенных субстратов (норма 70-140%). Использовали наборы "Реахром-Протеин С" (НПО РЕПАМ, г.Москва). Результаты оценивали на фотоэлектрическом фотометре КФК-3;

- активность плазминогена с применением хромогенного субстрата по методу А.П.Момота и соавт. (норма 75-140%). Использовали набор реагентов "ХромоТех-Плазминоген" ("Технология - Стандарт", г.Барнаул). Результаты оценивали на фотоэлектрическом фотометре КФК-3;

- протромбиновое время (ПВ) в секундах по Квику выражали как протромбиновый индекс (ПТИ) по общепринятой формуле: ПТИ=(ПВ контрольной стандартной плазмы/ПВ больного)×100% (норма 85-115%);

- концентрацию фибриногена определяли хронометрическим методом по Клауссу (норма 2,00-4,00 г/л). При исследовании дисфункции эндотелия применяли следующие тесты:

- антиген фактора Виллебранда (ФB:Ag) плазмы - твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА) «сендвич-Elisa» методом. Использовали тест-системы фирмы «Technoclone», Австрия (норма 60-110%);

- концентрацию тромбомодулина (ТМ) сыворотки крови - методом ИФА. Использовали тест-системы фирмы «Diaclone» (Diaclone CD141 Thrombomodulin), Франция (норма 0,15-1,60 нг/мл).

Для оценки полученных результатов применяли программу «BIOSTAT 4.03». Поскольку полученные выборки не подчинялись закону нормального распределения, данные представляли с помощью медианы, минимального и максимального значений [4]. Для сравнения выборки с нормой использовали непараметрический критерий Данна. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным 0,05.

ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА

Больной З., 40 лет, поступил в гематологическую клинику ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России» 20.10.2008 г. Диагноз: острый лимфобластный лейкоз, впервые выявленный, острый период, пре-В вариант, высокий риск; был подтвержден морфологическими, цитохимическими, генетическими методами исследования и иммунофенотипированием. При поступлении гемоглобин 89 г/л, количество тромбоцитов 30·10⁹/л, лейкоцитов 25,7·10⁹/л, бластов 79%, гранулоцитов 0,514·10⁹/л. Состояние плазменного гемостаза на 21.10.2008 г: индекс АПТВ снижен (0,71), ПТИ и концентрация фибриногена в пределах нормальных значений (98% и 3,69 г/л соответственно), время ХIIа-ЗЭЛ удлинено (48, 17 мин) при нормальной активности плазминогена (101%), содержание маркеров тромбинемии и активации внутрисосудистого свертывания и фибринолиза повышено (РФМК в ортофенантролиновом тесте 270 мкг/мл, D-димеры - 2001-2500 нг/мл); содержание ф. VII, ФВ:Ag и ТМ высокое (197%, 298% и 3,72 нг/мл соответственно); активность AT III компенсаторно повышена (134%), а ПрС - в пределах нормальных величин (95%). Таким образом, у пациента при поступлении выявлена гиперкоагуляция и активация внутрисосудистого свертывания. Она установлена на основании показателей, отражающих плазменный гемостаз, и подтверждена результатами исследования дисфункции эндотелия и высоким уровнем D-димеров.

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Был проведен анализ результатов 25 больных с впервые выявленным ОЛЛ в возрасте 16-70 лет (медиана - 42; м/ж - 16/9). При поступлении им выполняли общепринятые в гематологии клинические и лабораторные методы обследования. Показатели коагулограммы при диагностике заболевания оценили у 19 больных. При диагностике заболевания установлено повышенное по сравнению с нормой содержание ФВ:Ag и ТМ, которые являются маркерами дисфункции эндотелия (табл.1; р<0,05). Так как дисфункция эндотелия приводит к запуску свертывания крови, мы исследовали основные показатели плазменного гемостаза, изменение которых характеризует состояние гиперкоагуляции, являющейся стадией пре-ДВС. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1
Лабораторные показатели больных с впервые выявленным ОЛЛ (медиана, размах) Показатели ОЛЛ Здоровые лица ТМ, нг/мл 3,99*
(0,9-13,5) 0,55
(0,12-1,98) ФB:Ag, % 152*
(69-298) 82
(46-146) Ф.VIII, % 178*
(98-241) 86
(41-166) ПТИ, % 90*
(74-98) 100
(85-114) Фибриноген, г/л 3,69
(2,00-7,18) 2,83
(1,94-3,59) Время ХIIа-ЗЭЛ, мин 14,00*
(5,00->60,00) 7,0
(5,0-12,5) AT-III, % 114
(69-178) 105
(84-162) ПрС, % 90
(41-154) 87
(58-146) Плазминоген, % 88
(66-124) 96
(72-139) РФМК в ортофенантролиновом тесте, мкг/мл 90*
(30-280) 35
(30-55) D-димеры, нг/мл 2001-2500*
(501->3000) ≤500 Примечание: * - отличие от нормы; р<0,05

В целом по группе больных ОЛЛ до лечения выявлено состояние гиперкоагуляции: достоверное (р<0,05) по отношению к норме увеличение ф. VIII, угнетение фибринолитической активности (ХIIа-ЗЭЛ), повышение РФМК и D-димеров. Последние являются продуктами деградации фибрина, следовательно, маркерами активации внутрисосудистого свертывания. Следует также отметить снижение прокоагулянтов, протромбинового комплекса (ПТИ), вероятнее всего, вследствие их усиленного потребления. Физиологические антикоагулянты AT III и ПрС в среднем от нормы не отклонялись, как и активность плазминогена, и концентрация фибриногена. Следует отметить, что гипофибриногенемия не была выявлена ни у одного пациента, в то время как гиперфибриногенемия установлена у 31,6% больных. D-димеры были повышены у всех больных. Выявлена положительная корреляция между содержанием РФМК и временем ХIIа-ЗЭЛ (r_s=0,496; p<0,05). Это дополнительно подтверждает, что у больных ОЛЛ в дебюте заболевания существует риск микротромбирования, который может при последующей терапии привести к тромбоэмболиям. Таким образом, статистически доказано, что показатели плазменного звена гемостаза подтверждали наличие гиперкоагуляции у больных ОЛЛ при диагностике заболевания. Чтобы это устанавливать с высокой долей вероятности, необходимо выполнить многочисленные исследования. Учитывая это, мы рекомендуем такое состояние определять по повышению показателей, являющихся маркерами дисфункции эндотелия, а также D-димеров; они были повышены статистически значимо в целом по группе больных одновременно с показателями плазменного гемостаза, характеризующими гиперкоагуляцию и активацию внутрисосудистого свертывания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Баринов, В.Г. Эндотелиальная регуляция гемостаза: система тромбомодулина [Текст]/ В.Г.Баринов, О.Ю.Кудряшова, Т.Е.Цимбалова, Д.А.Затейщиков// Лабораторная медицина - 2001. - №4. - С.27-30.

2. Баркаган, З.С. ДВС-синдром и тромботическая тромбоцитопеническая пурпура при онкогематологических заболеваниях [Текст]/ З.С.Баркаган, А.П.Момот// Проблемы клинической медицины. - 2005. - №1. - С.22-24.

3. Воробьев, А.И. Гиперкоагуляционный синдром: патогенез, диагностика, лечение [Текст]/ А.И.Воробьев, С.А.Васильев, В.М.Городецкий// Терапевтический архив. - 2002. - №7. - С.73-76.

4. Гланц, С. Медико-биологическая статистика [Текст]/ С.Гланц. - пер. с англ. - М.: Практика, 1999. - 459 с.

5. Зубаиров, Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования [Текст]/ Д.М.Зубаиров. - Казань: «Фэн», 2000. -364 с.

6. Клиническая биохимия/ под ред. В.А.Ткачука. - М.: «ГЭОТАР-МЕД», 2002. - 360 с.

7. Момот, А.П. Роль гемостатических и воспалительных реакций в формировании очагов гнойной деструкции органов и тканей [Текст]/ А.П.Момот, Я.Н.Шойхет// Тромбоз, гемостаз и реология. - 2009. - №1. - С.23-39.

8. Практическая коагулология/ М.А.Пантелеев, С.А.Васильев, Е.И.Cинауридзе и др; под ред. А.И.Воробьева// М.: «Практическая медицина». - 2011. - 192 с.

9. Претромботическое состояние: Тромбоз и его профилактика [Текст]/ В.П.Балуда, М.В.Балуда, А.П.Гольдберг [и др.]// М.: Зеркало - М. - 1999. - 297 с.

10. Червонцева, A.M. Влияние цитарабина на экспрессию молекул клеточной адгезии и взаимодействие эндотелий-лейкоцит in vitro [Текст]/ A.M.Червонцева, Ю.А.Романо, В.Г.Савченко// Терапевтический архив. - 2006. - №7. - С.67-72.

11. Черепанова, В.В. Нарушения свертывающей системы крови при острых лейкозах взрослых [Текст]/ В.В.Черепанова, Л.Н.Тарасова, В.И.Андрюхин. - Киров, 2011. - 110 с.

12. Hemostatic balance on the surface of leukemic cells: the role of tissue factor and urokinase plasminogen activator recetor [Text]/ Y.Nadir, T.Katz, G.Sarig [et al.]// Haematologica. - 2005. - Vol.90. - P.1549-1556.

13. Increased levels of the soluble adhesion molecule E-selectin in patients woth chronic myeloproliferative disorders and thromboembolic complications [Text]/ C.Musolino, A.Alonci, A.Allegra [et al.]// Am. J.Hematol. - 1998. -Vol.57, №2.-P. 109-112.

14. Knoebl, P.N. Human protein С concentrates for replacement therapy in congenital and acquired protein С deficiency [Text]/ P.N.Knoebl// Drugs Today (Bare). - 2008. - Vol.44, №6. - P.429-441. 15. Kwaan, H.C. Double Hazard of Thrombophilia and Bleeding in Leukemia [Text]/ H.C.Kwaan// Hematology. - 2007. - №1. - P.151-158.

16.Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress [Text]/ K.Shim, P.J.Anderson, E.A.Tuley [et al.]// Blood. - 2008. - Vol.111, №2. - P.651-657.

17. Venous thromboembolism in patients with acute leukemia: incidence, risk factors, and effect on survival [Text]/ G.H.Ku, R.H.White, H.K.Chew [et al.]// Blood. - 2009. - Vol.113, №17. - P.3911-3917.

18. Von Willebrand factor and its propeptide: the influence of secretion and clearance on protein levels and the risk of venous thrombosis [Text]/ A.Y.Nossent, V. van Marion, N.H. van Tilburg [et al.]// J.Thromb. Haemost. - 2006. - Vol.12, №4. - P.2556-2562.

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ выявления наличия гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания у больных с впервые выявленным острым лимфобластным лейкозом путем лабораторного исследования антигена фактора Виллебранда, тромбомодулина, D-димеров, где без исследования целого ряда показателей плазменного гемостаза, таких как протромбиновый индекс, концентрация фибриногена и РФМК, время ХIIа-ЗЭЛ, активность антитромбина III, протеина С, плазминогена и ф.VIII, отклонения которых характеризуют состояние гиперкоагуляции, при уровне указанных маркеров нарушения функции эндотелия, превышающих 152% (ФB:Ag) и 3,99 нг/мл (ТМ), и увеличении D-димеров до 2001-2500 нг/мл и более с высокой долей вероятности устанавливают наличие гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания. Способ обеспечивает определение наличия гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания у больных острым лимфобластным лейкозом без инфекционных осложнений при диагностике заболевания. 1 табл., 1 пр.

Способ выявления наличия гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания у больных с впервые выявленным острым лимфобластным лейкозом путем лабораторного исследования антигена фактора Виллебранда, тромбомодулина, D-димеров, отличающийся тем, что без исследования целого ряда показателей плазменного гемостаза, таких как протромбиновый индекс, концентрация фибриногена и РФМК, время ХIIа-ЗЭЛ, активность антитромбина III, протеина С, плазминогена и ф. VIII, отклонения которых характеризуют состояние гиперкоагуляции, при уровне указанных маркеров нарушения функции эндотелия, превышающих 152% (ФB:Ag) и 3,99 нг/мл (ТМ), и увеличении D-димеров до 2001-2500 нг/мл и более с высокой долей вероятности устанавливают наличие гиперкоагуляции и активации внутрисосудистого свертывания.