Способ профилактики хронической свинцовой коагулопатии у экспериментальных животных Российский патент 2019 года по МПК G09B23/28 A61K31/4045 A61P7/02 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, экологии и токсикологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики хронической свинцовой коагулопатии при длительном воздействии ацетата свинца.

Исследователями последних лет установлена прямая зависимость между ростом заболеваемости и уровнем антропогенного загрязнения тяжелыми металлами среды обитания (Romero A. at all, 2014), при этом подчеркивается рост частоты сердечно-сосудистой патологии и тромбогеморрагических осложнений (Брин В.Б. и др. 2017, Mutch N.J. at all, 2012). На фоне внешнего «благополучия» у работающих в контакте со свинцом обнаруживаются активация процессов свертывания крови и гемолиза, лабораторные проявления эндотелиальной дисфункции (Карлова Е.А. Шейман Б.С., 2014). Данные литературы позволяют утверждать, что гемокоагуляционные сдвиги при воздействии свинца на организм в эксперименте и клинике представляют собой начальные этапы ДВС синдрома (Romero A., Ramos F., 2014; Solov'ev A.V. et al., 1993).

В этой связи следует считать, несомненно, актуальным как в общенаучном фундаментальном, так и прикладном плане поиск эффективных способов профилактики и коррекции токсической коагулопатии формирующейся под влиянием соединений свинца.

Известен способ профилактики нарушений системы гемостаза у экспериментальных животных при свинцовой интоксикации в течение двух недель с использованием препаратов простациклинового ряда (Подолян С.К. Вплив хлористого свинцю на систему агрегатного стану кровi у бiлих щурiв // Буковинський медичний вiсник. - 1998. - №3-4. - С. 131-136). Показано, что применение стабильного негалогенизированного аналога простациклина (ММ-706) при внутрижелудочном введении хлорида свинца в дозе 0,5 мг/кг массы тела в течение двух недель способствует снижению индекса спонтанной агрегации тромбоцитов и уменьшению процента адгезированных тромбоцитов, за счет стабилизации их мембран у крыс.

Недостатком данного способа является то, что воздействие хлорида свинца на организм в течение короткого времени (две недели) не позволяет получить способ профилактики хронической свинцовой коагулопатии. Эксперимент проводимый в течение двух месяцев является более приближенным к натуральным условиям, моделирует поступление свинца в организм с пищей и водой из окружающей среды в условиях антропогенного загрязнения. Более информативно в разные сроки (один и два месяца) в динамике, изучение механизмов профилактики нарушений звеньев системы гемостаза при длительном воздействии свинца.

Известен способ профилактики хронической никелевой коагулопатии у экспериментальных животных (Гаглоева Э.М., Брин В.Б. "Способ профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных", Заявка №2018116518 от 03.05.2018, решение о выдаче патента на изобретение от 26.02.2019) при внутрижелудочном введении мелаксена в дозе 5 мг/кг одновременно с хлоридом никеля в дозе 5 мг/кг в течение двух месяцев.

Недостатком данного способа является то, что с его помощью невозможна разработка способа профилактики свинцовой коагулопатии, так как в данной работе не рассматривалось профилактическое влияние мелатонина на свертывающую систему крови при длительном воздействии свинца на организм экспериментальных животных. Разные металлы имеют преимущественные органы - «мишени» повреждающего воздействия. Особенностью воздействия свинца является цитотоксическое действие, разрушение эритроцитов, увеличение тромбопластической активности форменных элементов. Показано (Подолян С.К., 1998), что нарушения гемостаза начинаются с токсического влияния на мембраны тромбоцитов, что приводит к изменению адгезивной и агрегационной активности тромбоцитов, освобождению индукторов агрегации и вторичной активации коагуляционного гемостаза при воздействии свинца. При этом значимую роль в механизмах увеличения гемостатического потенциала играют эритроцитарные факторы гемокоагуляции и гемолиз (Бышевский А.Ш. и др., 2005). Таким образом, эффективность данного способа при никелевой коагулопатии (никель необходимый для живых организмов микроэлемент) не доказывает возможность профилактического использования антиоксиданта при развитии свинцовой коагулопатии (свинец относится к первому классу опасных токсикантов).

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ профилактики нарушений системы гемостаза у экспериментальных животных при свинцовой интоксикации с помощью витаминов-антиоксидантов (Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Ральченко И.В., Рудзевич А.Ю., Алборов Р.Г., Винокурова Е.А., Волков А.И., Умутбаева М.К. Влияние комбинации витаминов-антиоксидантов на гемостаз при экспериментальной гипероксидации // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2005, 68(3), С. 34-36). При этом, модель свинцовой коагулопатии воспроизводили путем ежедневного введения ацетата свинца в дозе 0,5 мг/кг в течение 15 дней с потребляемой пищей. С целью профилактики свинцовой коагулопатии экспериментальным животным вводили препарат компливит в дозе 1,8 мг/кг (из расчета по витамину А) в сутки - одновременно с рационом. Избыток витамина А на фоне влияния свинца ослабляет сдвиги показателей системы гемостаза, вызванные металлом, сдерживает активацию тромбоцитов и вызывает снижение уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови.

Недостатками прототипа является то, что, во-первых, сложно определить количество поступающего в организм свинца на единицу массы тела животного с пищей; во-вторых, сложность определения количества антиоксиданта (витамина А), поступающего с пищей в организм на единицу массы тела животного; в-третьих, используемый в избыточных количествах витамин А в качестве профилактического средства может оказывать побочные влияния; в-четвертых, профилактическое введение антиоксиданта (витамина А) и свинца в течение двух недель не позволяет получить способ профилактики хронической коагулопатии. При хроническом эксперименте (в течение двух месяцев) возможно более подробное изучение механизмов профилактического действия антиоксиданта на формирование нарушений звеньев системы гемостаза в условиях токсического воздействия свинца в разные сроки в динамике, что особенно важно в коагулологии.

В качестве средства профилактики коагулопатии при хронической свинцовой интоксикации нами был выбран синтетический аналог гормона эпифиза мелатонина Мелаксен. Показано, что мелатонин обладает широким спектром фармакологических эффектов - антистрессовым, антитоксическим, десенсибилизирующим, противовоспалительным, антиоксидантным действием, выраженным адаптогенным и др. (Арушунян Э.Б., 2014). В отличие от применяемых в гематологии препаратов (антиагрегантов, антикоагулянтов и др.), имеющих однонаправленное действие, мелатонин является своеобразным модулятором и проявляет уникальную неспецифическую способность к оптимизации любых физиологических процессов в организме, которые могут усиливаться мелатонином на фоне исходно сниженных показателей, но ограничивает их рост в случае чрезмерной активации (Арушанян Э.Б., 2014; Vacas M.I., 1991). Показана корригирующее влияние мелатонина на сосудисто-тромбоцитарное звено системы гемостаза в дозе 1 мг/кг на фоне гипоагрегации тромбоцитов, индуцируемой введением ацетилсалициловой кислоты и в условиях гиперагрегации, вызываемой внутрибрюшинным введением раствора кальция хлорида (Лазарева Е.Н., 2013). Однако, введение мелатонина в дозе 10 мг/кг вызывало подавление функциональной активности тромбоцитов (Лазарева Е.Н. и др., 2013). Вместе с тем, в нашей лаборатории было показано, что применение мелатонина в дозе 10 мг/кг эффективно профилактирует патологические сдвиги показателей морфофункционального состояния почек, печени и сердца при токсическом воздействии тяжелых металлов у крыс в эксперименте (Брин В.Б., 2017).

В настоящей работе с целью профилактики хронической свинцовой коагулопатии мы использовали дозу мелатонина - 5 мг/кг. В доступной литературе сведений о применении мелатонина с целью профилактики нарушений системы гемостаза при хронической свинцовой коагулопатии мы не обнаружили.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики хронической свинцовой коагулопатии у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное уменьшение патологических сдвигов показателей системы гемостаза при хроническом отравлении свинцом у экспериментальных животных, что сопровождается уменьшением интенсивности процессов липопероксидации.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической свинцовой коагулопатии у экспериментальных животных, включающий ежедневное введение антиоксиданта и ацетата свинца, отличается тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг в пересчете на металл.

Ежедневное профилактическое введение мелатонина через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением раствора ацетата свинца приводит к уменьшению патологических сдвигов показателей клеточного и плазменного гемостаза, уменьшение концентрации маркеров внутрисосудистого свертывания крови, активности антикоагулянтного и фибринолитического звеньев системы гемостаза, за счет уменьшения цитотоксичности свинца, мембранопротекторного и антиоксидантного действия мелатонина. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической свинцовой коагулопатии, отличающегося тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора ацетата свинца в дозе 40 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хронической свинцовой коагулопатии, путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации, восстановления активности антиоксидантной системы, препятствуя патологической активации системы гемостаза и восстановления противосвертывающего и фибринолитического потенциала крови, уменьшения уровня маркеров тромбинемии при хроническом воздействии свинца, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом: для приготовления раствора соли свинца в дистиллированной воде растворяют ацетат свинца таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 20 мг свинца, в пересчете на металл. На каждые 100 г массы крысы вводят 0,2 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм крыс. Раствор мелатонина готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением, для чего в дистиллированной воде растворяют таблетки Мелаксена таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 2,5 мг мелатонина.

Двум группам животных (по 10 особей) вводят раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг через атравматичный зонд в желудок ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней. Одновременно с первого дня введения ацетата свинца одной из групп каждый день вводят раствор мелаксена в дозе 5 мг/кг через внутрижелудочный зонд.

Исследуются показатели состояния системы гемостаза и процессов перекисного окисления липидов. Определяется количество тромбоцитов и их агрегационная активность, содержание фибриногена, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ). Для оценки состояния конечного этапа свертывания крови определяют относительное время полимеризации фибрин-мономера (ВПФМ) (Момот А.П., 2009). По активности антитромбина (АТIII) судят о состоянии противосвертывающей системы, по времени спонтанного эуглобулинового лизиса исследуется состояние фибринолитического звена, по концентрации растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и Д-димеров судят об уровне тромбинемии.

Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. С целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ) определяют активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах.

Опыты показали, что изолированное внутрижелудочное введение препарата мелатонина - Мелаксен в течение двух месяцев не вызывало изменений показателей свертывающей системы крови у животных. Выявлялась лишь незначительная тенденция к уменьшению количества тромбоцитов, степень АДФ индуцированной агрегации относительно интактного контроля не изменялась.

Результаты исследования у крыс с сочетанным введением антиоксиданта Мелаксена и ацетата свинца демонстрируют эффективность его применения с целью профилактики хронической свинцовой коагулопатии. Мелатонин способствует уменьшению выраженности изменений клеточного и плазменного гемостаза, снижает уровень тромбинемии благодаря выраженной антиоксидантной активности в условиях хронической свинцовой интоксикации.

Пример конкретного выполнения.

Двум опытным группам крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг каждый день в течение двух месяцев. Одновременно, с первого дня введения ацетата свинца, опытной группе №2 каждый день интрагастрально вводился мелаксен в дозе 5 мг/кг. Контролем служили интактные животные (Контроль №1 - 10 крыс) содержащиеся в стандартных условиях вивария.

Исследовали показатели свертывающей системы, состояние противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза, активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты.

Материалом для исследования являлась цельная кровь, а также плазма крови, богатая и бедная тромбоцитами. Стабилизацию и получение образцов плазмы крови осуществляли с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Момот А.П. и др., 2011).

Для оценки функционального состояния свертывающей системы крови определяли агрегационную активность тромбоцитов турбидиметрическим методом. В качестве индуктора агрегации использовали аденозиндифосфат в конечной концентрации 10,0 мкг/мл. Определяли содержание фибриногена по методу Клаусса; активированное частичное тромбопластиновое время; протромбиновое время, относительное время полимеризации фибрин-мономера (Момот А.П. и др., 2011), активность антитромбина III; время спонтанного эуглобулинового лизиса; концентрацию растворимых фибрин-мономерных комплексов определяли количественным вариантом фенантролинового теста. Исследования проводились по стандартным методикам с применением диагностических наборов фирмы «Технология стандарт» (Россия). Тесты выполнялись на спектрофотометре «Solar-300», турбидиметрическом коагулометре «CGL-2110» Solar, агрегометре АР 2110 Solar (Беларусь). Уровень D-димеров определяли набором реактивов «INNOVANCE D-dimer", Siemens.

Для оценки интенсивности процессов липопероксидации и антиоксидантного потенциала определяли: содержание малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах (Asakawa Т., 1980), гидроперекиси (ГП) (диеновые конъюгаты и диеновые кетоны) в плазме крови (с исп. феррицианида калия), активность супероксиддисмутазы (СОД), активность каталазы в эритроцитах по методу E. Beutler (Solar-300», Беларусь).

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.). Исходя из того, что наблюдаемые признаки не все подчинялись нормальному распределению, данные исследований представлены в виде (Me [25-75%]), где Me - медиана в выборочной совокупности, [25-75%] - 25-й и 75-й процентиль, достоверность различий оценивали при помощи U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости р≤0,05. Для оценки статистической зависимости двух рядов наблюдений проводили корреляционный анализ с использованием коэффициента ранговой корреляции (r_s) Спирмена.

Проведенные исследования показали, что внутрижелудочное введение ацетата свинца в дозе 40 мг/кг массы тела способствовало развитию свинцовой коагулопатии (Таблица 1.).

Результаты опытов уже через один месяц экспериментов выявили разнонаправленные изменения параметров системы гемостаза. Происходило уменьшение количества тромбоцитов и повышение их агрегационной функции. Концентрация фибриногена была выше контроля. В плазменном звене системы гемостаза регистрировалась гиперкоагуляция по внутреннему пути, гипокоагуляция по внешнему пути. Выявлялось укорочение времени полимеризации фибрин мономеров. Регистрировалось истощение резервных возможностей противосвертывающей и фибринолитической систем гемостаза, о чем свидетельствует уменьшение активности АТ(III) и замедление времени спонтанного эуглобулинового лизиса. Выявлялось достоверное увеличение концентрации РФМК (Таблица 1).

При свинцовой интоксикации через два месяца увеличивалась степень тромбоцитопении на фоне повышения агрегационной функции тромбоцитов. Совокупность целого ряда фактов позволяет предположить наличие признаков ДВС синдрома. Со стороны плазменного гемостаза по данным хронометрических тестов было зарегистрировано смещение гемостазиологического профиля крови в сторону гипокоагуляции, вместе с тем происходила депрессия противосвертывающих и фибринолитических механизмов. На конечном этапе свертывания регистрировалась выраженная тромбинемия, что подтверждалось увеличением концентрации Д-димеров и РФМК. Кроме того, наблюдалось уменьшение концентрации фибриногена. Удлинение времени полимеризации фибрин-мономерных комплексов также подтверждает факт снижения фибриногена в плазме крови.

Опыты показали, что профилактическое ведение мелатонина на фоне хронической интоксикации отдаляло время и уменьшало выраженность патологических сдвигов показателей клеточного и плазменного гемостаза. Из данных таблицы 1 видно, что профилактическое применение мелатонина в течение месяца сопровождалось исчезновением большинства признаков состояния тромботической готовности - повышенной концентрации РФМК, угнетения физиологических антикоагулянтов и фибринолиза, регистрируемых у крыс с изолированным введением свинца. Концентрация фибриногена достоверно не отличалась от показателей у свинцовых крыс, вместе с тем и от уровня контроля отличия были недостоверны. Зарегистрировано смещение гемостатического потенциала в сторону гиперкоагуляции по данным АЧТВ и ПВ, однако оно компенсировалось активацией антикоагулянтной и фибринолитической систем. Сохранялось увеличение степени АДФ-агрегации, снижалось количество тромбоцитов, но изменения были менее выражены.

При профилактическом введении мелатонина в течение двух месяцев выявлялись признаки стабилизации гемостазиологической картины и снижение вероятности развития состояния тромботической готовности, описанного у крыс с изолированным введением свинца. Об этом свидетельствовало уменьшение выраженности изменений РФМК и Д-димеров, угнетения физиологических антикоагулянтов и фибринолиза, регистрируемых у свинцовых крыс (Таблица 1). На фоне тромбоцитопении увеличивалась агрегационная активность тромбоцитов, но изменения были также менее выражены, чем у свинцовых крыс.

Результаты проведенных экспериментов у крыс при хронической свинцовой коагулопатии выявили взаимосвязь активности систем гемокоагуляции и липопероксидации. Внутрижелудочное введение ацетата свинца вызывало увеличение активности процессов перекисного окисления липидов и угнетение антиоксидантного ферментного звена с развитием оксидативного стресса (Таблица 2.), подтверждая ранее полученные данные (Брин В.Б., 2017). Выявлялось увеличение концентрации малонового диальдегида по срокам экспериментов, истощение уровня гидроперекисей в плазме крови и снижение активности СОД и каталазы (Таблица 2.).

Профилактическое применение естественного антиоксиданта мелаксена способствовало повышению уровня активности каталазы в эритроцитах с одновременным снижением концентрации малонового диальдегида и восстановлением уровня гидроперекисей в плазме крови, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии мелаксена в условиях хронической свинцовой интоксикации (Таблица 2).

Корреляционный анализ результатов проведенных экспериментов у крыс на фоне профилактического введения мелатонина выявил статистические связи положительной динамики гемостазиологических показателей с восстановлением активности процессов липопероксидации.

Выявлялась значимая положительная корреляционная связь восстановления активности каталазы с повышением активности антитромбина III (через 1 месяц r_s=0,64; P<0,05; и через два месяца r_s=0,58; P<0,05), а также высокая степень обратной корреляции со временем спонтанного эуглобулинового лизиса (через 1 месяц r_s=0,61; P<0,05; и через два месяца r_s=0,57; P<0,05). Тесно положительно были ассоциированы изменения показателей РФМК и сдвиги МДА (r_s=0,72; P<0,05) через один месяц, Д-димеров и сдвиги МДА (r_s=0,55; Р<0,05) через два месяца под влиянием естественного антиоксиданта мелатонина.

Таким образом, профилактическое применение естественного антиоксиданта мелатонина препятствует патологической активации системы гемостаза, способствует восстановлению противосвертывающего и фибринолитического потенциала крови, уменьшает концентрацию маркеров тромбинемии путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации и восстановления активности антиоксидантных ферментов при длительном воздействии свинца. Полученные данные могут стать экспериментальным основанием для разработки способов профилактики и лечения свинцовой коагулопатии с использованием мелаксена у населения, проживающего в районах экологически неблагополучных по свинцу.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, экологии и токсикологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции проявлений хронической свинцовой коагулопатии у экспериментальных животных при длительном воздействии ацетата свинца. Способ включает ежедневное введение антиоксиданта и ацетата свинца. В качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг. Раствор ацетата свинца вводят в дозе 40 мг/кг в пересчете на металл. Способ обеспечивает уменьшение патологических сдвигов показателей. 2 табл., 1 пр.

Способ профилактики хронической свинцовой коагулопатии у экспериментальных животных, включающий ежедневное введение антиоксиданта и ацетата свинца, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг в пересчете на металл.