СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae Российский патент 2013 года по МПК C12N1/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия гена ompW, кодирующего белок внешней мембраны.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для увеличения продукции L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (патент США 4,278,765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).

Ген ompW кодирует белок OmpW, который относится к семейству белков внешней мембраны, обнаруженному у различных видов энтеробактерий. Первоначально белок OmpW из Escherichia coli был идентифицирован на основе сходства его последовательности с последовательностью белка OmpW из Vibrio cholerae. Было показано, что OmpW является субъединицей транспортной системы колицина S4 у Е. coli и функционирует как рецептор колицина S4 или как основная часть указанного рецептора (Pilsl H, etal. J Bacteriol. 181(11):3578-81 (1999)). Однако недавние исследования дают основания предполагать, что известны не все функции семейства белков внешней мембраны и что указанные белки могут принимать участие в ответе на воздействия окружающей среды. Было показано, что экспрессия гена ompW у Salmonella enterica serovar Typhimurium активируется окислительным стрессом, а также что белок OmpW принимает участие в обеспечении устойчивости к параквату (Gil et al. Microbiology, 155, 2490-2497 (2009)). В других исследованиях было выявлено, что уровень экспрессии гена ompWy V. cholerae зависит от таких параметров как доступность питательных веществ и кислорода, температура и соленость (Nandi et al. Microbiology, 151, 2975-2986 (2005)).

С помощью кристаллографического анализа белка OmpW из E.coli было установлено, что указанный белок имеет структуру, нетипичную для белков внешней мембраны. Белок OmpW формирует 8-цепочечный β-«бочонок» (β-barrel) с гидрофобным каналом в отличие от других белков внешней мембраны, имеющих гидрофильную внутреннюю часть. Такая структура позволяет белку OmpW связывать гидрофобные молекулы, в соответствии с этим, исследователи предполагают, что белок OmpW может участвовать в транспорте малых гидрофобных молекул (Hong H, et al. J Biol Chem 281(11); 7568-77 (2006)).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих использование усиления экспрессии гена ompW для получения L-аминокислот.

Раскрытие изобретения

Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматических или ароматических L-аминокислот с использованием этих штаммов.

Вышеуказанные цели были достигнуты благодаря обнаружению того факта, что усиление экспрессии гена ompW может приводить к увеличению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-цитруллин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Предоставляется бактерия семейства Enterobacteriaceae, обладающая способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-цитруллин, L-орнитин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae - продуцента L-аминокислоты, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена ompW в указанной бактерии усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой указанная экспрессия усилена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию renaompW.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-цитруллина, L-орнитина и L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя выращивание описанной выше бактерии в питательной среде и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L- глутаминовой кислоты, L-пролина, L-цитруллина, L-орнитина и L-аргинина.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

1. Бактерия

Бактерия - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия гена ompWв указанной бактерии усилена.

Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» может означать бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия выращивается в указанной питательной среде.

Термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также может означать бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом Е. coli, таким, как штамм Е. coli K-12, и, может означать, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, или не менее чем 1.0 г/л в другом примере. Термин «L-аминокислота» может включать в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цитруллин, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «ароматическая L-аминокислота» может включать в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» может включать в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин, L-цитруллин, L-орнитин и L-аргинин. L-треонин и L-аргинин являются конкретными примерами.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543). Примерами могут служить бактерии, принадлежащие к роду Escherichia или Pantoea.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» может означать, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol, 43, 162-173 (1993)).

Термин "усиление экспрессии гена" может означать, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например, в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций могут включать увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, усиление экспрессии гена и т.д. Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и т.п. Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Кроме того, штаммы, которые могут быть использованы в качестве контроля, включают, например, Escherichia coli K-12 или Pantoea ananatis PERM BP-6614.

Ген ompW (синонимы: yciD, ECK1250, b1256) кодирует белок внешней мембраны OmpW. Ген ompW (нуклеотиры, комплементарные нуклеотидам с 1312044 по 1312682; в последовательности с инвентарным номером МС_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположен между генами yciC и yciE на хромосоме E. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена ompWn аминокислотная последовательность белка OmpW, кодируемого геном ompW представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.

Поскольку у представителей различных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, ген ompW не ограничивается геном, последовательность которого приведена в SEQ ID NO:1, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO:1. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном ompW, может иметь гомологию не менее 80% или не менее 90% в другом примере, или не менее 95% в другом примере, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, при условии, что он имеет активность белка OmpW. Термин "вариант белка", может означать белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, или от 1 до 15 в другом примере, или от 1 до 5 в другом примере, в SEQ ID NO:2. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру.

Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков являются консервативной(-ыми) мутацией(-ями), если сохраняется активность. Типичным примером консервативной мутации является консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Туг, замену Не на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на He, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на He, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, He или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Туг, замену Туг на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, He или Leu.

В связи с этим ген ompW может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что он кодирует функциональный белок OmpW. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 60%, 70%, 80%, 90% или 95% в разных примерах, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная или многократная отмывка, или двух- или трехкратная в другом примере, при концентрации солей 1 × SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1 × SSC, 0.1% SDS, при 60°C. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N⁺ (Amersham) в жестких условиях - 15 минут. Отмывка может быть выполнена два или три раза. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, в данном конкретном случае она может быть около 100-1000 п.н.

Методы, которые могут быть использованы для усиления экспрессии гена, включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в бактерии семейства Enterobacteriaceae, может увеличивать число копий гена. Могут использоваться низкокопийные векторы. Примеры низкокопийных векторов включают, но не ограничиваются ими, pSC101, pMW118, pMW119, и т.п. Термин "низкокопийный вектор" используется для векторов, число копий которого в клетке достигает пяти.

Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и т.п. Например, один акт Ми интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.

Число копий гена также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому может быть выполнена гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.

Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, pr или pl промоторы фага λ. Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.

С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на трансляционную способность мРНК. Например, обнаружен 20-кратный разброс в уровне экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих стартовому кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984).

Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на бактериальной хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, можно осуществить, например, таким же способом, что и замена гена с использованием чувствительной к температуре плазмиды, как раскрыто в международной заявке WO 00/18935 и заявке Японии JP 1-215280 А.

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия-продуцент L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена ompW усилена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии гена ompW в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена ompW уже усилена, способности к продукции L-аминокислот.

Бактерия-продуцент L-треонина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-треонина, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е. coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е. coli PERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е. coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е. coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е. coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.

В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина также может быть использован штамм Е. coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, и чувствительный к температуре С1 репрессор фага λ и P_R-промотор замещает регуляторную область в треониновом опероне на плазмиде pVIC40. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером В-5318.

Бактерия может быть дополнительно модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу). Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е. coli К-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е. coli К-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е. coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания yaaX. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона, из оперона может быть удалена область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO 2005/049808, заявка РСТ WO 2003/097839).

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е. coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е. coli около оперона gInHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и отрХ. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (тезисы 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская заявка ЕР 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина также может быть использован штамм Е. coli ВКПМ В-10647. Штамм ВКПМ В-10647 является штаммом, производным от штамама В-3996. Указанный штамм был получен из штамма В-3996 путем делегирования района puuB - narW с использованием Red-зависимой интеграции (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45). Штамм ВКПМ В-10647 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 21 мая 2010 г с инвентарным номером ВКПМ В-10647.

Бактерия-продуцент L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АЛ 1442 (PERM BP-1543, NRRL B-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибаракикен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер PERM BP-5252 (патент США 5827698).

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу(дрс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка EP 1253195 A). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (cyo) (европейская заявка ЕР 1170376 A), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), rena ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов, которые могут использоваться для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, катализирующих реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).

Бактерия-продуцент L-цистеина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-цистеина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е. coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е. coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571А2); штамм Е. coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307A1) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-лейцина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е, coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающим, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е. coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке PCT 96/06926; Е. coli штамм Н-9068 (JP 8-70879 A), и подобные им.

Бактерия может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, которые могут быть представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка EP 1239041 A2).

Бактерия-продуцент L-гистидина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-гистидина, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е. coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е. coli; NRRL B-12116-B12121 (патент США 4388405); штаммы Е. coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (PERM BP-6676) (патент США 6344347); штамм Е. coli Н-9341 (FERM ВР-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е. coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают гены, кодирующие АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (,hisl), фосфорибозил- АТФ- фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е. coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка EP 1016710 A), штамм Е. coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ. 2119536), и т.д.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е. coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilνA (патент США 4278765). В этот штамм был перенесен природный аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е. coli K 12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961), который обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, дефектные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, или штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу(gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gl(AB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, IpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgml), фосфоглицераткиназу (pgK), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу(tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках EP 1078989 A, EP 955368 A и EP 952221 A.

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что снижена экспрессия генов цитратсинтетазы и/или фосфоенолпируваткарбоксилазы, и/или дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках EP 1078989 A, EP 955368 A и EP 952221 A.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы и способы их получения описаны в патентах США 5,378,616 и 5,573,945. Конкретно, примеры таких штаммов могут включать в себя следующие штаммы:

Е. coli W3110sucA::Km^r

Е. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

Е. coli AJ12628 (FERM ВР-3854)

Е. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

Е. coli W 3110sucA::Km^r - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е. coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ 13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5,908,768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5,393,671); штамм Е. coli AJ 13138 (FERM BP-5565) (патент США 6,110,714) и подобные им.

Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6,331,419), штамм Pantoea ananatis AJ 13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агентство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибаракикен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ 13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ 13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ13356, был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм АЛ 2739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий rwpheA34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL В-12145, NRRL В-12146 и NRRL B-12147 (патент США 4407952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (PERM ВР-3566), штамм E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ 12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент EP 488424 BB1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).

Бактерия-продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli JP 4735/pMU3028 (DSM 10122) и JP 6015/pMU91 (DSM 10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е. coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не ингибируемую серином по типу обратной связи и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не ингибируемую триптофаном по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), в которых отсутствует активность триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696), и подобные им. Также могут быть использованы бактерии- продуценты L-триптофана принадлежащие к роду Escherichia, в которых увеличена активность белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (заявки на патент США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы, и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е. coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е. coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка PCT WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-триптофана, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 A, заявка Японии 62-244382 A, патент США 4,371,614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).

Бактерия-продуцент L-пролина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий-продуцентов L-пролина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену UvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент EP 1172433). Бактерия может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина, включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, участвующие в выведении L-аминокислоты из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка EP 1239041 A2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е. coli: NRRL B-12403 и NRRL B-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ B-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al. (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.

Бактерия-продуцент L-аргинина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-аргинина, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 237 (ВКПМ B-7925) (патентная заявка США 2002/058315 A1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е. coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка EP 1170361 A1), и подобные им.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).

Бактерия-продуцент L-цитруллина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента цитруллина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как мутантные по N-ацетилглутаматсинтазе штаммы Е. coli 237/pMADS11, 237/pMADS12 и 237/pMADS13 (RU 2215783, EP 1170361 B1, US 6790647 B2).

Также бактерия - продуцент L-цитруллина может быть получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например, из штамма Е. coli 382 (ВКПМ B-7926), путем инактивации аргининсукцинатсинтазы, кодируемой геном argG.

Фраза "инактивация аргининсукцинатсинтазы" означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит неактивную аргининсукцинатсинтазу или также она может означать, что бактерия не способна синтезировать аргининсукцинатсинтазу. Инактивация аргининсукцинатсинтазы может быть осуществлена путем инактивации гена argG.

Фраза "инактивация гена argG" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Также возможно, что область модифицированной ДНК не способна к естественной экспрессии гена из-за делеции части гена или всего гена, сдвига рамки считывания гена, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации прилегающих к гену областей, включая последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор, энхансер, аттенюатор, сайт связывания рибосомы и т.д.

Наличие или отсутствие гена argG на хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество белка, кодируемого геном argG, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.

Экспрессия гена argG может быть ослаблена введением в ген на хромосоме такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка уменьшена по сравнению с таковой в немодифицированном штамме. Такой мутацией гена может быть замена одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику, или деления гена или его части (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена argG также может быть ослаблена путем модификации экспрессии регуляторных последовательностей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D, Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).

Например, следующие методы могут применяться для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известный как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645 (2000), заявка РСТ WO 2005/010175) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 A). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.

Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин).

Бактерия-продуцент L-орнитина

Бактерия-продуцент L-орнитина может быть легко получена из любой бактерии-продуцента аргинина, например, штамма Е. coli 382 (ВКПМ B-7926), путем инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы, кодируемой генами argF и argl. Методы для инактивации орнитинкарбамоилтрансферазы описаны выше.

Бактерия-продуцент L-валина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Н-81 (ВКПМ B-8066), NRRL B-12287 и NRRL B-12288 (патент США 4,391,907), ВКПМ B-4411 (патент США 5,658,766), ВКПМ B-7707 (европейская патентная заявка EP 1016710 А2), и подобные им.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilνGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilνGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем, чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, в опероне может быть разрушен ген ilvA для того, чтобы снизить активность треониндеаминазы.

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-валина, также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E. coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ B-4411.

Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством Н⁺-АТФазы (заявка РСТ WO 96/06926).

Бактерия-продуцент L-изолейцина

Примеры родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерии-продуцента L-изолейцина, включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивость к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882 A). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458 A, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).

2. Способ

Способом является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В зависимости от типа ассимиляции используемого микроорганизма может также использоваться спирт, включая этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.

Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°C, или в пределах от 30 до 38°C в другом примере. pH среды поддерживают в пределах от 5 до 9, или от 6.5 до 7.2 в другом примере. pH среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструкция штамма E.coli MG1655 P_L-tacompW

Штамм Е. coli MG1655 PL-iacOmpW получили путем замены области нативного промотора reHSiompWB штамме MG1655 промотором P_L-tac.

Для замены области нативного промотора гена ompW фрагмент ДНК, содержащий промотор P_L-tac и маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), кодируемый геном cat, интегрировали в хромосому штамма Е. coli MG1655 вместо области нативного промотора методом, описанным Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645), также называемым "Red-зависимая интеграция" и/или "Red-направляемая интеграция".

Фрагмент, содержащий промотор P_L-tac соединенный с геном cat, получили в ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК штамма Е. coli MG1655P_L-tacXylE (WO 2006/043730). Нуклеотидная последовательность промотора P_L-tac представлена в Перечне последовательностей (SEQ ID NO:3). Для амплификации использовали праймеры PI (SEQ ID NO:4) и Р2 (SEQ ID NO:5). Праймер P1 содержит 36 нуклеотидов, комплементарных области, локализованной в 262 п.н. перед стартовым кодоном гена ompW, введенных в праймер для дальнейшей интеграции в бактериальную хромосому, а праймер P2 содержит 36 нуклеотидов, идентичных 5'-последовательности гена ompW.

ПЦР проводили с использованием амплификатора "Gene Amp PCR System 2700" (Applied Biosystems). Реакционная смесь для ПЦР (общий объем - 50 мкл) состояла из 5 мкл 10х ПЦР- буфера с 15 мМ MgCl₂ ("Fermentas", Lithuania), по 200 мкМ каждого dNTP, 25 пкМ каждого используемого праймера и 1 Ед. Taq-полимеразы ("Fermentas", Lithuania). В качестве матрицы для ПЦР в реакционную смесь добавляли приблизительно 20 нг геномной ДНК E.coli MG1655P_L-tacxylE.

Температурные условия были следующие: начальная денатурация ДНК в течение 5 мин при 95°C; затем 35 циклов: денатурация при 95°C в течение 30 сек, отжиг при 54°C в течение 30 сек и элонгация при 72°C в течение 1,5 мин; конечная элонгация в течение 5 мин при 72°C. Затем амплифицированный фрагмент ДНК очищали путем электрофореза в агарозном геле, выделяли с использованием "GenElute Spin Columns" ("Sigma", USA) и осаждали этанолом. Полученный фрагмент ДНК использовали для электропорации и Red-зависимой интеграции в бактериальную хромосому штамма Е. coli MG1655/pKD46.

Клетки MG1655/pKD46 выращивали в течение ночи при 30°C в жидкой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), затем разбавляли 1:100 средой SOB (Дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl₂, 0.5 г/л; Триптон, 20 г/л; KCl, 2.5 мМ; MgCl₂, 10 мМ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и L-арабинозу (10 мМ) (арабинозу используют для индукции плазмиды, содержащей гены Red системы) и выращивали при 30°C до достижения оптической плотности бактериальной культуры OD₆₀₀=0.4-0.7. Выросшие клетки из 10 мл бактериальной культуры трижды отмывали ледяной деионизованной водой и суспендировали в 100 мкл воды. 10 мкл фрагмента ДНК (100 нг), растворенного в деионизованной воде, добавляли к суспензии клеток. Электропорацию осуществляли в электропораторе "Bio-Rad" (USA) (No. 165-2098, version 2-89) в соответствии с инструкциями изготовителя. После электропорации клетки добавляли к 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), инкубировали в течение 2 часов при 37°C, затем высевали на L-агар, содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола. Колонии, выросшие в течение 24 ч проверяли на присутствие маркера Cm^R вместо области нативного промотора гена ompW, с помощью ПЦР с использованием праймеров Р3 (SEQ ID NO:6) и Р4 (SEQ ID NO:7). Для этого свежевыделенные колонии суспендировали в 20 мкл воды, затем 1 мкл полученной суспензии использовали в ПЦР. Температурные условия были следующие: начальная денатурация ДНК в течение 10 мин при 95°C; затем 30 циклов: денатурация при 95°C в течение 30 сек, отжиг при 55°C в течение 30 сек и элонгация при 72°C в течение 1 мин; конечная элонгация в течение 7 мин при 72°C. Несколько проверенных Cm^R колоний содержали требуемый фрагмент ДНК ~2000 п.н., что подтверждает присутствие промотора P_L-tac и ДНК маркера Cm^R вместо 285 п.н. области нативного промотора гена ompW. Один из полученных штаммов излечили от термочувствительной плазмиды pKD46 путем культивирования при 37°C, полученный штамм был назван Е.coli MG1655 P_L-tacompW.

Пример 2. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382 P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompW под контролем промотора P_L-tac на продукцию L-аргинина, в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 переносили фрагменты ДНК из хромосомы описанного ранее штамма Е.coli MG1655P_L-tacompW с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.

Оба штамма, 382 и 382 P_L-tacompW, по-отдельности выращивали с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°C и при 37°C в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.

Состав использованной ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 КН₂РО₄ 2.0 MgSO₄7H₂O 1.0 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 CaCO₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. CaCO₃ стерилизовали сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. pH доводили до 7.0.

Результаты пробирочных ферментации представлены в Таблице 1. Как следует из Таблицы 1, штамм 382 P_L-tacompW с усиленной экспрессией гена ompW при обеих температурах выращивания накапливал большее количество L-аргинина, чем родительский штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382.

Пример 3. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-10647 P_l-tacompW

Для оценки влияния усиления экспрессии гена ompW на продукцию треонина в штамм-продуцент L-треонина Е.coli ВКПМ B-10647 переносили ДНК фрагменты из хромосомы описанного ранее штамма Е.coli MG 1655 P_L-tacOmpW с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма B-10647 P_l-tacompW. Штамм ВКПМ B-10647 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 21 мая 2010 г. с инвентарным номером ВКПМ B-10647.

Оба штамма, B-10647 и B-10647 P_l-tacompW, выращивали при 37°C в течение 18-24 часов на L-агаре. Для получения посевной культуры, штаммы выращивали в течение ночи при 37°C на роторной качалке (250 об/мин) 18 часов в пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл среды, содержащей (per I): дрожжевой экстракт - 0.5 г, (NH₄)₂SO₄ - 11.0 г, NaCl - 0.4 г, K₂HPO₄ - 1.0r, MgSO₄*7H₂O - 0.31 г, FeSO₄ - 10 мг, MnSO₄ - 10 мг, тиамин - 0.1 мг, глюкоза - 2%. Затем, в ферментационную среду 0.2 мл посевного материала. Ферментацию проводили в 2 мл минимальной среды для ферментации в пробирках 20×200 мм. Клетки выращивали в при 34°C в течение 72 часов на роторной качалке при 250 об/мин.

После культивирования количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: 2-пропанол, ацетон, аммиак (жидкий) и вода в следующем соотношении (w): 50/50/12/8. Для визуализации использовали раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали; L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего оценивали количество L-треонина спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.

Была использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 40.0 (NH₄)₂SO₄ 22.0 NaCl 0.8 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄ 7H₂O 0.8 FeSO₄ 7H₂O 0.02 MnSO₄ 5H₂O 0.02 Тиамин гидрохлорид 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 CaCO₃ 30.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали.отдельно. CaCO₃ стерилизовали сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотики добавляли в среду после стерилизации.

Результаты пробирочных ферментации приведены в Таблице 3. Как следует из Таблицы 3, штамм B-10647 P_l-tacpmpW с усиленной экспрессией гена ompW накапливал большее количество L-треонина по сравнению с родительским штаммом B-10647.

Пример 4. Продукция L-лизина штаммом Е. coli AJ 11442 P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompW на продукцию L-лизина можно получить штамм AJ 11442 P_l-tacompW путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 P_l-tacompW в штамм-продуцент L-лизина Е. coli AJ 11442.

Оба штамма Е. coli, AJ 11442 и AJ 11442 P_l-tacompW, могут быть культивированы в L-среде при 37°C, и 0.3 мл полученной культуры может быть инокулировано в 20 мл среды для ферментации, содержащей необходимые антибиотики, в колбах объемом 500 мл. Культивирование может проводиться при 37°C в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech -analyzer AS210, производитель- Sakura Seiki Co.). Затем выход L-лизина может быть рассчитан относительно израсходованной глюкозы для каждого штамма.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 40 (NH₄)₂SO₄ 24 K₃HPO₄ 1.0 MgSO₄7H₂O 1.0 FeSO₄7H₂O 0.01 MnSO₄5H₂O 0.01 Дрожжевой экстракт 2.0

pH доводят до 7.0 с помощью КОН, и среду автоклавируют при 115°C в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄ 7H₂O стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов и добавляют в среду до концентрации 30 г/л.

Пример 5. Продукция L-цистеина штаммом Е. coli JM15 (ydeD) P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompW на продукцию L-цистеина можно получить штамм JM15 (ydeD) P_l-tacompW путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG 1655 P_l-tacompW в штамм - продуцент L-цистеина Е. coli JM15 (ydeD).

Штамм Е. coli JM15 (ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей renydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663). Штамм JM15 (CGSC# 5042) может быть получен в Коллекции Генетического Фонда Coli при Центре Генетических Ресурсов E.coli (The Coli Genetic Stock Collection at the E.coli Genetic Resource Center, MCD Biology Department, Yale University) (http://cgsc.biology.yale.edu/).

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.

Пример 6. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57 P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompW на продукцию L-лейцина можно получить штамм 57 P_l-tacompW путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 P_l-tacompW в штамм - продуцент L-лейцина Е. coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6,124,121). Штамм 57 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1ый Дорожный проезд, 1) 19 мая 1997 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7386.

Оба штамма Е.coli 57 и 57 P_l-tacompW могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°C на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°C в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.2 мл (10%) посевного материала. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1). Может быть использована ферментационная среда (pH 7.2) следующего состава (г/л):

Глюкоза 60.0 (NH₄)₂SO₄ 25.0 K₂HPO₄ 2.0 MgSO₄H₂O 1.0 Тиамин 0.01 CaCO₃ 25.0

Глюкозу и CaCO₃ стерилизуют отдельно.

Пример 7. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80 P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompWna продукцию L-гистидина можно получить штамм 80 P_l-tacompW путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 PL-tacOmpW в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80. Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1)15 октября 1999 г. с инвентарным номером ВКПМ B-7270. Затем, 12 июля 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Оба штамма Е.coli, 80 и 80 P_l-tacompW, могут быть по-отдельности выращены на L-бульоне при 29°C в течение 6 часов. Затем по 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°C в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: n-бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.

Может быть использована ферментационная среда (pH 6.0) следующего состава (г/л):

Глюкоза 100.0 Мамено (гидролизат соевых бобов) 0.2 общего азота L-пролин 1.0 (NH₄)₂SO₄ 25.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄7H₂O 1.0 FeSO₄ 7H₂O 0.01 MnSO₄ 0.01 Тиамин 0.001 Бетаин 2.0 СаСО₃ 60.0

Глюкоза, пролин, бетаин и CaCO₃ стерилизуют отдельно. pH доводят до 6.0 перед стерилизацией.

Пример 8. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC⁺ P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompWna продукцию L-глутаминовой кислоты можно получить штамм VL334thrC⁺ - P_l-tacompW путем переноса с помощью Р1 трансдукции(Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 P_L-tacompW в штамм-продуцент L- глутаминовой кислоты Е. coli VL334thrC⁺ (EP 1172433). Штамм VL334thrC+ депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 г. с инвентарным номером ВКПМ B-8961. Затем, 8 декабря 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Оба штамма Е.coli, VL334thrC⁺ и VL334thrC⁺ P_l-tacompW, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°C в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда может содержать глюкозу (60 г/л), сульфат аммония (25 г/л), KH₂PO₄ (2 г/л), MgSO₄(1 г/л), тиамин (0.1 мг/мл), L-изолейцин (70 мкг/мл), и CaCO₃ (25 г/л). pH доводят до 7.2. Глюкозу и мел стерилизуют отдельно. Выращивание может производиться при 30°C в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы:бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl₂.

Пример 9. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ 12739 P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompWna продукцию L-фенилаланина можно получить штамм Е.coli AJ 12739 P_l-tacompW путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 P_l-tacompW в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ 12739. Штамм AJ 12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197. Затем, 23 августа 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Оба штамма Е.coli, AJ 12739 и AJ 12739 P_l-tacompW, могут быть выращены при 37°C в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°C в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат:25% водного аммиака:вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 40.0 (NH₄)₂SO₄ 16.0 K₂HPO₄ 0.1 MgSO₄7H₂O 1.0 FeSO₄7H₂O 0.01 MnSO₄ 5H₂O 0.01 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 2.0 Тирозин 0.125 СаСО₃ 20.0

Сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. pH доводят до 7.0.

Пример 10. Продукция L-триптофана штаммом Е. coli SV164 (pGH5) P_l-tacompW Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompWna продукцию L-триптофана можно получить штамм Е.coli SV164(pGH5) путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 р]. tacOmpW в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 P_l-tac(pGH5). Штамм SV164 содержит аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не подверженную ингибированию триптофаном по типу обратной связи. Плазмида pGH5 содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не подверженную ингибированию серином по типу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 и Европейском патенте 0662143.

Оба штамма E.coli, SV164 (pGH5) и SV164 (pGH5) P_1-tacOmpW, могут быть выращены с перемешиванием при 32°C в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 10 мг/мл). Полученные культуры (по 0.3 мл каждой) могут быть внесены в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (10 мг/мл), в пробирках размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 32°C в течение 72 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 9.

Компоненты используемой ферментационной среды представлены в Таблице 2; группы компонентов A, B, C, D, E, F и H стерилизуют отдельно, как и показано в Таблице 2, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.

Пример 11. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompWna продукцию L-пролина можно получить штамм 702ilvA P_l-tacompW путем переноса с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е. coli MG1655 P_l-tacompW в штамм-продуцент L-пролина E.coli 702ilvA. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ B-8012. Затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.

Оба штамма Е. coli, 702ilvA и 702ilvA P_l-tacompW, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°C на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может проводиться в тех же условиях, как описано в Примере 8.

Пример 12. Продукция L-цитруллина штаммом Е.coli 382ΔargG P_l-tac ompW

Для оценки влияния усиления экспрессии гена ompWna продукцию L-цитруллина может быть получен штамм 382ΔargG P_l-tacompW путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 P_l-tacompW в штамм-продуцент цитруллина Е. coli 382AargG. Штамм 382ΔargG может быть получен в результате делеции гена argG на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, гомологичные как области, прилегающей к гену argG, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).

Оба штамма Е.coli, 382ΔargG и 382ΔargG P_l-tacompW, могут быть по-отдельности выращены с перемешиванием при 37 C в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32 C в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде цитруллина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее цитруллин пятно может быть вырезано, цитруллин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl₂, и количество цитруллина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

Возможный состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 L-аргинин 0.1 СаСО₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO₃ стерилизуют сухим жаром при 180 C в течение 2 часов. Значение pH доводят до 7.0.

Пример 13. Продукция L-орнитина штаммом Е.coli 382ΔargFΔargI Р P_L-tacompW

Для оценки влияния усиления экспрессии гена ompW на продукцию L-орнитина может быть получен штамм 382ΔargFAargI P_l-tacompW путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 P_l-tacompW в штамм-продуцент L-орнитина E.coli 382ΔargFΔargI. Штамм 382ΔargFΔargI может быть получен в результате последовательных делеций генов argF и argi на хромосоме штамма 382 (ВКПМ В-7926) с использованием метода, предложенного Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), называемого "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой могут быть сконструированы две пары ПЦР-праймеров, гомологичных как областям, прилегающим к генам argF и argi, так и гену, отвечающему за устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы в ПЦР может быть использована плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175).

Оба штамма Е.coli, 382ΔargFΔargI и 382ΔargFΔargI P_l-tacompW, могут быть по-отдельности выращены с перемешиванием при 37°C в течение 18 часов в 3 мл питательной среды, и 0.3 мл полученных культур могут быть перенесены в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200-мм и могут быть культивированы при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде орнитина может быть определено с помощью бумажной хроматографии с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Последующее окрашивание может быть выполнено нингидрином (2% раствор в ацетоне). Содержащее орнитин пятно может быть вырезано, орнитин может быть элюирован с использованием 0.5% водного раствора CdCl₂, H количество орнитина может быть определено спектрофотометрически при длине волны 540 нм.

Возможный состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 Тиамин HCl 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 L-аргинин 0.1 CaCO₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. CaCO₃ стерилизуют сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. Значение pH доводят до 7.0.

Пример 14. Продукция L-валина штаммом Е.coli H-81 P_l-tacompW

Для анализа влияния усиления экспрессии гена ompWHa продукцию L-валина может быть использован штамм H-81 P_l-tacompW, полученный путем переноса с помощью P1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) фрагментов ДНК хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 P_l-tacompW в штамм-продуцент L-валина.Е.coli H-81.

Оба штамма, H-81 и H-81 Pi-tacOmpW, могут быть выращены при 37° в течение 18 часов в питательном бульоне и по 0.1 мл каждой из полученных культур могут быть инокулированы в 2 мл ферментационной среды в пробирках 20×200 мм, и выращены при 32°C в течение 72 часов на роторной качалке. После культивирования в течение 48 часов и 72 часов количество накопленного L-валина может быть определено методом тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат:25% водного аммиака:вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Состав ферментационной среды:

Глюкоза 60 г/л (NH₄)₂SO₄ 18 г/л KH₂PO₄ 1.8 Г/Л MgSO₄·7H₂O 1.2 г/л СаСО₃ 20 г/л Тиамин 0.1 мг/л

СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°C в течение 2 часов. pH доводили до 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники, очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Таблица 1 Штамм Количество L-аргинина, г/л 32°С 37°С 382(контроль) 11.2±0.1 6.2±0.1 382 P_ltacompW 12.4±0.1 7.4±0.1

Таблица 2 Растворы Компонент Конечная концентрация, г/л A KH₂PO₄ 1.5   NaCl 0.5   (NH₄)₂SO₄ 1.5   L-метионин 0.05   L-фенилаланин 0.1   L-тирозин 0.1   Мамено (общий N) 0.07 B Этанол 20.0   MgSO₄ 7H₂O 0.3 C CaCl₂ 0.011 D FeSO₄ 7H₂O 0.075   Цитрат натрия 1.0 E Na₂MoO₄ 2H₂O 0.00015   Н₃ВО₃ 0.0025   COCl₂ 6H₂O 0.00007   CuSO₄ 5H₂O 0.00025   MnCl₂ 4H₂O 0.0016   ZnSO₄ 7 H₂O 0.0003 F Тиамин 0.005 G СаСО₃ 30.0 H Пиридоксин 0.03 pH раствора A - 7.1, доводится с использованием NH₄OH

Таблица 3 Штамм OD₅₄₀ Количество L-треонина, г/л В10647 9.2±1.3 20.0±3.0 B10647 P_l-tacompW 7.9±3.0 24.2±4.0

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой бактерию семейства Enterobacteriaceae, которая является продуцентом L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-метионина, L-изолейцина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина. При этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена ompW в указанной бактерии усилена. Изобретение относится также к способу получения L-аминокислоты с использованием указанной бактерии. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 14 пр.

1. Бактерия семейства Enterobacteriaceae - продуцент L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-метионина, L-изолейцина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина, модифицированная таким образом, что экспрессия гена ompW в указанной бактерии усилена.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся, тем, что указанная экспрессия усилена за счет модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена ompW.

3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

4. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

5. Способ получения L-аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-метионина, L-изолейцина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина, L-аргинина, L-цитруллина и L-орнитина, включающий выращивание бактерии по любому из пп.1-4 в питательной среде и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.