ПЕРХАРИДИНЫ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ CDK Российский патент 2013 года по МПК C07D471/04 A61K31/437 A61P35/00 A61P29/00 A61P25/00 

Изобретение относится с тризамещенным или тетразамещенным имидазо[4,5b]пиридинам, их применению, а также к способу их получения.

Циклин-зависимые киназы (CDK - cyclin dependent kinases) играют важную регулирующую роль в регуляции деления клетки, апоптоза, транскрипции, функций нейронов и экзоцитоза.

Частое нарушение регуляции CDK в человеческих опухолях и вовлеченность CDK5 в течение болезней Альцгеймера, Паркинсона и Нимана-Пика, ишемии и инсульта, а также различных заболеваний почек, таких как мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, полулунный гломерулонефрит, коллапсирующая гломерулопатия, пролиферативный волчаночный нефрит, поликистоз почек (PKD - polycystic kidney disease), диабетическая нефропатия и острое повреждение почек, индуцированная цисплатином нефротоксичность, воспалений, таких как плевральное воспаление, артрит, глаукома, диабета 2-го типа, вирусных инфекций (вирус простого герпеса, цитомегаловирус, папилломавирус человека, ВИЧ), заболеваний, вызываемых одноклеточными паразитами, например, вызываемых Plasmodium, Leishmania, и т.д., стимулировали активный поиск химических ингибиторов CDK.

Среди многочисленных ингибиторов росковитин, одно из идентифицированых первыми соединений, является относительно эффективным и селективным.

Росковитин представляет собой пурин, имеющий следующую формулу:

Благодаря своей нейропротекторной активности и ингибирующему действию в отношении роста клеток, этот пурин в настоящее время рассматривают в качестве потенциального лекарственного препарата для лечения, соответственно, раковых опухолей, болезней почек, различных нейродегенеративных заболеваний и воспалений.

Кроме того, важным моментом является селективность фармакологических ингибиторов киназ белка, причем росковитин является относительно селективным ингибитором CDK по сравнению с другими ингибиторами, включая уже имеющийся в продаже ингибитор Gleevec®.

Однако росковитин взаимодействует с пиридоксалькиназой.

Об исследовании взаимодействия росковитина и его производных с пиридоксалькиназой сообщается в публикации Tang et al. J. Biol. Chem, 280, 35, September 2, 2005, 31220-31229.

Пиридоксалькиназа катализирует фосфорилирование пиридоксаля, пиридоксамина и пиридоксина в присутствии АТФ и Zn²⁺, что является важной стадией в синтезе пиридоксаль-5′-фосфатов, активной формы витамина B₆, кофактора для более чем 140 ферментов. Таким образом, взаимодействие с пиридоксалькиназной системой, вероятно, приводит к нежелательным побочным эффектам.

Таким образом, это взаимодействие, с одной стороны, оказывает отрицательное воздействие на синтез активной формы витамина B₆, и/или, с другой стороны, оказывает отрицательное воздействие на возможность применения росковитина и его производных у пациентов, которых подвергают лечению этим типом ингибиторов CDK.

Поэтому, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить производные росковитина, имеющие свойства ингибитора CDK, проявляющие меньшее взаимодействие или вообще не взаимодействующие с пиридоксалькиназой.

С этой целью, в настоящем изобретении предлагаются соединения следующей формулы I:

где

А представляет собой СН или N или О,

R₃ представляет собой:

- Н, или

- С₁-С₅ алкильную группу, или

- =O, или

- (C₁-С₃)алкил-С=O группу, в которой алкильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами,

R₄ представляет собой:

- Н, или

- C₁-C₆ алкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами,

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами, или

- (С₁-С₅)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами, или

- =O, или

- O=CCF₃, или

- С₁-С₆ алкильную группу, замещенную сложноэфирной группой, например, O-ацильной группой или аминоацильной группой, полученной из природных или неприродных аминокислот, или ацетильной группой или никотинильной группой,

или А, R₃ и R₄ вместе образуют С₅-С₇ циклоалкильную группу, необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, предпочтительно пиперазиновую группу,

В представляет собой О или S или NH или атом галогена,

R₁ представляет собой:

- C₁-C₆ алкильную группу, необязательно разветвленную, и/или необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- С₁-С₅ алкиларильную группу, где арильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкильными группами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов,

R₂ представляет собой:

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или

- метилбиарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами,

и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами; и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- метиларильную группу, где арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами; и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа,

- биарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно содержит один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами,

или В и R₂ вместе образуют неароматическое кольцо,

R₅ представляет собой:

- атом галогена, или

- атом водорода, или

- С₁-С₅ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот, или

- (С₁-С₄)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, в которой циклоалкильная группа необязательно замещена одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот,

а также их соли, гидраты и стереоизомеры.

Применяемый в настоящем документе термин "биарил" служит для обозначения двух арильных колец, связанных друг с другом через одинарную связь, а термин "группа карбоновой кислоты" обозначает группу -СООН.

В первом предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения в Формуле IA представляет собой N.

Во втором предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения в Формуле IA представляет собой СН.

В третьем предпочтительном примере осуществления настоящего изобретения в Формуле IA представляет собой О.

В каждом из предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения в Формуле I R₁ предпочтительно представляет собой этил, или метил, или изопропил, или метилциклопропил, или циклопентил, фенильную группу, или бензильную группу или метилпиридильную группу, или

или

В каждом из предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения в Формуле I группа B-R₂ предпочтительно представляет собой одну из групп, представленных в следующей Таблице 1:

Таблица 1  

Кроме того, в каждом из предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения в Формуле 1 заместитель R₄-A-R₃ предпочтительно представляет собой одну из групп, представленных в следующей Таблице 2:

Таблица 2   или или или или или или или или или или или или или   4    

Кроме того, в каждом из предпочтительных примеров осуществления настоящего изобретения группа R₄-A-R₃ предпочтительно является сложноэфирной.

Действительно, хотя эти сложные эфиры проявляют умеренную или низкую активность in vitro, in vivo они выступают как пролекарства биологически активных соединений Формулы I по изобретению.

В таких пролекарствах, являющихся сложными эфирами соединения формулы 1 по изобретению, предпочтительными группами R₄-A-R₃ являются группы, представленные в следующей Таблице 3.

Таблица 3

Предпочтительное соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение, имеющее следующую Формулу Ia:

Это соединение имеет абсолютную (R)-конфигурацию и далее упоминается как "перхаридин А".

Однако (S)-изомер перхаридина А, имеющий следующую формулу Iб, также является предпочтительным:

Это соединение далее упоминается как "перхаридин Б".

Другое предпочтительное соединение по настоящему изобретению имеет следующую Формулу Iв:

Это соединение далее упоминается как "перхаридин В".

Кроме того, другое предпочтительное соединение по настоящему изобретению имеет следующую Формулу Iг:

Это соединение далее упоминается как "перхаридин Г".

Однако предпочтительным также является соединение по настоящему изобретению, имеющее следующую Формулу Iд:

Также предпочтительным является соединение по настоящему изобретению, имеющее следующую Формулу Iе.

Также предпочтительным является соединение по настоящему изобретению, имеющее следующую Формулу Iж.

Кроме того, предпочтительным является также соединение по настоящему изобретению, имеющее следующую Формулу Iз.

Стереоизомеры, гидраты и соли всех и каждого соединения по настоящему изобретению, упомянутые выше, также охватываются рамками настоящего изобретения.

Как будет показано далее, в соединениях Формул Ia-Iж группа А представляет собой N.

Однако другие предпочтительные соединения по настоящему изобретению представляют собой соединения, соответствующие указанным соединениям Формул Ia-Iж, где группа А представляет собой СН или группа А представляет собой О.

Соединения по настоящему изобретению можно получать любым удобным способом, известным специалисту в данной области.

Однако когда группа А представляет собой N, с одной стороны, эти соединения нельзя получить традиционным способом синтеза с использованием в качестве исходных соединений из 2,6,9-тризамещенных пуринов.

Этот традиционный способ включает стадию, на которой 2-хлор-замещенный пурин нагревают в присутствии аминоспирта с получением, например, росковитина при температуре от 145°С до 170°С.

Однако при выполнении этого способа с участием 3,5,7-тризамещенного имидазо[4,5-b]пиридина реакция не протекает.

При поднятии температуры образуются только продукты распада.

С другой стороны, было обнаружено, что традиционный способ получения деазапурина также неприменим.

Действительно, этот традиционный способ, описанный в публикации Francis, JE and Moskal, MA, Can J Chem 1992, 70 pages 1288-1295, включает вначале образование амидина путем реакции вторичного амида с аминоцианоимидазолом с использованием в качестве реагента фосфорилхлорида. На второй стадии амидин циклизуется в имидазопиридин с использованием NaH в качестве основания. Этот способ неприменим для получения целевых соединений по настоящему изобретению, поскольку он позволяет получать только производные, содержащие незамещенную аминогруппу в положении 7. Кроме того, если заместители содержат гидроксильные группы, их следует защищать при образовании гетероцикла. В другом способе синтеза, описанном в публикации Koch M, WO 2006/027366, природа заместителя, который можно ввести в положение 5, ограничена, поскольку он образуется из нитрозогруппы и в ходе того же процесса, так что описана только незамещенная 7-аминогруппа.

Чтобы уменьшить недостатки указанных способов согласно предшествующему уровню техники, в настоящем изобретении предлагается оригинальный и универсальный способ, в котором применяют соединения следующей Формулы II:

где

В представляет собой О или S или NH или атом галогена,

R₁ представляет собой:

- C₁-C₆ алкильную группу, необязательно разветвленную, и/или необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- С₁-С₆ алкиларильную группу, причем арильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкильными группами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержит один или несколько гетероатомов,

R₂ представляет собой:

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или

- метилбиарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или необязательно содержит один или несколько гетероатомов, или

- метиларильную группу, где арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержит один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа,

- биарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно содержит один или несколько гетероатомов, образуя при этом 2-пиридильную группу, или 3-пиридильную группу, или 4-пиридильную группу, или 2-тиенильную или 3-тиенильную группу, или каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами,

или В и R₂ вместе образуют неароматическое кольцо,

R₅ представляет собой:

- атом галогена, или

- атом водорода, или

- C₁-С₅ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот, или

- (С₁-С₄)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, в которой циклоалкильная группа необязательно замещена одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот,

Х представляет собой Cl или Br или I или NH₂.

Такие соединения формулы II также охватываются рамками настоящего изобретения.

Предпочтительными соединениями Формулы II являются соединения, в которых Х представляет собой I.

Таким образом, в настоящем изобретении также предлагается способ получения соединений следующей формулы I:

где

А представляет собой N,

R₃ представляет собой:

- Н, или

- C₁-C₅ алкильную группу, или

- =O, или

- (С₁-С₃)алкил-С=O группу, в которой алкильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами,

R₄ представляет собой:

- Н, или

- С₁-С₆ алкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами,

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами, или

- (С₁-С₅)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами, или

- =O, или

- O=CCF₃, или

- C₁-C₆ алкильную группу, замещенную сложноэфирной группой, например, O-ацильной группой или аминоацильной группой, полученной из природных или неприродных аминокислот, или ацетильной группой или никотинильной группой,

или А, R₃ и R₄ вместе образуют C₅-C₅ циклоалкильную группу, необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, предпочтительно пиперазиновую группу,

В представляет собой О или S или NH или атом галогена,

R₁ представляет собой:

- C₁-C₆ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- C₁-С₅ алкиларильную группу, причем арильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкильными группами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов,

R₂ представляет собой:

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильна или 3-тиенильная группа, или

- метилбиарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами,

и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- метиларильную группу, где арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа,

- биарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно содержит один или несколько гетероатомов, образуя при этом 2-пиридильную группу, или 3-пиридильную группу, или 4-пиридильную группу, или 2-тиенильную или 3-тиенильную группу, или каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами,

или В и R₂ вместе образуют неароматическое кольцо,

R₅ представляет собой:

- атом галогена, или

- атом водорода, или

- C₁-С₅ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот, или

- (С₁-С₄)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, в которой циклоалкильная группа необязательно замещена одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот,

а также их соли, гидраты и стереоизомеры,

включающий стадию осуществления реакции соединения следующей формулы II:

где В, R₂, R₁ и R₅ являются такими, как определено выше для соединений Формулы I и Х представляет собой Br, Cl, I или NH₂.

В первом воплощении способа по настоящему изобретению эта стадия реакции представляет собой стадию сочетания соединений Формулы II, в которой Х представляет собой Cl, Br или I, с соединением следующей Формулы III:

где A, R₃ и R₄ такие, как определено в Формуле I, в присутствии катализатора, выбранного из Pd(OAc)₂, Pd₂dba₃, также именуемого трис(дибензилиденацетон)дипалладий, или CuI, и необязательно в присутствии лиганда, такого как 2,2′-бис(дифенилфосфино)-1,1-бинафтил, также именуемого Binap, или этиленгликоля или дикетона.

Во втором воплощении способа по настоящему изобретению эта стадия реакции представляет собой стадию сочетания соединения Формулы II, в которой Х представляет собой NH₂, с соединением следующей Формулы IV:

где Y представляет собой I, Br или Cl, и R₆ представляет собой R₃ или R₄, с получением соединения следующей Формулы V:

и если R₃ и R₄ отличны от Н, затем следует стадия сочетания соединения Формулы V с соединением следующей Формулы VI:

где Y представляет собой I, Br или Cl, и R₇ представляет собой R₃, если R₆ представляет собой R₄, или R₇ представляет собой R₄, если R₆ представляет собой R₃, причем стадии сочетания осуществляют в основных условиях.

Во всех воплощениях способа по настоящему изобретению, в каждом случае Х и Y предпочтительно представляют собой I или Br, более предпочтительно I.

В настоящем изобретении также предлагается соединение по изобретению или полученное согласно способу по изобретению для применения в качестве лекарственного препарата.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере одно соединение по изобретению или полученное согласно способу по изобретению, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.

Еще одним объектом изобретения является применение по меньшей мере одного соединения по изобретению или полученного согласно способу по изобретению, для получения лекарственного препарата для лечения заболеваний, вызванных аномальной пролиферацией клеток, имеющих опухолевую или неопухолевую природу.

В одном воплощении указанного применения по изобретению, указанное заболевание представляет собой опухоль, например, солидную опухоль, являющуюся или не являющуюся метастатической, или же лейкемию.

В другом примере осуществления настоящего изобретения указанное заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание, в которое вовлечена аномальная активность CDK5 и/или CDK1.

Более конкретно, указанное нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона.

Однако указанное нейродегенеративное заболевание также может представлять собой болезнь Альцгеймера и ассоциированные таупатии.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения указанное заболевание представляет собой вирусное заболевание, например ВИЧ, герпес, цитомегаловирус и т.д.

Кроме того, изобретение охватывает применение по меньшей мере одного соединения по изобретению или полученного согласно способу по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли.

Кроме того, по меньшей мере одно соединение по изобретению или полученное согласно способу по изобретению применяют преимущественно для получения лекарственного препарата для лечения или в способе лечения заболеваний почек, таких как мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, полулунный гломерулонефрит, коллапсирующая гломерулопатия, пролиферативный волчаночный нефрит, поликистоз почек, диабетическая нефропатия, острое повреждение почек и индуцированная цисплатином нефротоксичность.

Однако, по меньшей мере одно соединение по изобретению или по меньшей мере одно соединение, полученное согласно способу по изобретению, также представляет интерес для получения лекарственного препарата или в способе лечения воспалений, например, плеврального воспаления, артрита, кистозного фиброза или глауком.

Наконец, соединения по изобретению также представляют интерес для увеличения производства инсулина поджелудочной железой в случае диабета 2-го типа.

Во всех воплощениях и вариантах применения по меньшей мере одного соединения по изобретению, предпочтительно по меньшей мере одно указанное соединение имеет следующую Формулу Ia:

Более предпочтительно, по меньшей мере одно указанное соединение представляет собой соединение следующей Формулы Iб:

Однако в другом предпочтительном варианте, по меньшей мере одно указанное соединение представляет собой соединение следующей Формулы Iв:

Однако в другом предпочтительном варианте применения по меньшей мере одного соединения по изобретению по меньшей мере одно указанное соединение представляет собой соединение следующей Формулы Iг:

В другом варианте применения по меньшей мере одного соединения по изобретению по меньшей мере одно указанное соединение представляет собой соединение следующей Формулы Iд:

Однако по меньшей мере одно указанное соединение может также представлять собой соединение следующей Формулы Iе:

Однако по меньшей мере одно указанное соединение может также представлять собой соединение следующей Формулы Iж:

Кроме того, по меньшей мере одно указанное соединение может также представлять собой соединение следующей Формулы Iз:

в качестве по меньшей мере одного соединения также могут применяться соли, гидраты и стереоизомеры соединений Формулы Ia-Iз.

Изобретение будет лучше понятно и дополнительные особенности и преимущества его станут очевидными при прочтении нижеследующего описания, в котором дана ссылка на Примеры, которые являются только иллюстративными и которые не ограничивают объем настоящего изобретения, а также ссылка на рисунки, в которых:

- На Фиг.1 представлены результаты анализа с окраской серебряным красителем, выполненным с 500 мкМ или 100 мкМ, соответственно, (R)-росковитина или соединения Формулы Iв, или соединения Формулы Iг, для определения взаимодействия соединения по изобретению и росковитина с пиридоксалькиназой,

- На Фиг.2 представлен иммуноблот, соответствующий Фиг.1, демонстрирующий эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Iв и соединения Формулы Iг при концентрации 500 мкМ и 100 мкМ на киназу PDXK и CDK5,

- На Фиг.3 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia и соединения Формулы Iб при различных концентрациях в отношении жизнеспособности клеток нейробластомы SH-SY5Y,

- На Фиг.4 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia и соединения Формулы Iб при различных концентрациях в отношении активности каспаз (DEVDase) клеток нейробластомы SH-SY5Y, измеренной в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ),

- На Фиг.5 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia и соединения Формулы Iв, при различных концентрациях, на восстановление клеток нейробластомы SH-SY5Y с помощью MTS,

- На Фиг.6 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении активности каспаз (активность DEVDase) клеток нейробластомы SH-SY5Y, измеренной в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ),

- На Фиг.7 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении фосфорилирования белка ретинобластомы клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.8 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении общего содержания белка ретинобластомы клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.9 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении фосфорилирования РНК-полимеразы II по Ser2 клеток нейобластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.10 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении общего уровня белка РНК-полимеразы II клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.11 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении 1-альфа-фосфорилирования фосфатазы белка по Thr320 клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.12 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении фактора выживаемости МсI-1 клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.13 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении общего уровня белка р53 клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.14 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении общего уровня белка р27 клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв,

- На Фиг.15 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении расщепления ПАРП клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв, и

- На Фиг.16 показан эффект (R)-росковитина, соединения Формулы Ia, соединения Формулы Iб и соединения Формулы Iв при различных концентрациях в отношении общего уровня белка актина клеток нейробластомы SH-SY5Y. На этом рисунке верхняя шкала относится к (R)-росковитину, соединениям Формулы Ia и Формулы Iб, а нижняя шкала относится к соединению Формулы Iв.

Соединения по изобретению имеют структуру, которая является близкой структуре росковитина, но они представляют собой деазапурины.

Более конкретно, соединения по изобретению имеют следующую формулу I:

где

А представляет собой СН или N или О,

R₃ представляет собой:

- Н, или

- C₁-C₅ алкильную группу, или

- =O, или

- (C₁-С₃) алкил-С=O группу, в которой алкильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами,

R₄ представляет собой:

- Н, или

- С₁-С₆ алкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами,

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами, или

- (С₁-С₅)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или алкилоксигруппами, и/или кетонными группами, или

- =O, или

- O=CCF₃, или

- C₁-C₆ алкильную группу, замещенную сложноэфирной группой, например, O-ацильной группой или аминоацильной группой, полученной из природных или неприродных аминокислот, или ацетильной группой или никотинильной группой,

или A, R₃ и R₄ вместе образуют C₅-C₇ циклоалкильную группу, необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, предпочтительно пиперазиновую группу,

В представляет собой О или S или NH или атом галогена,

R₁ представляет собой:

- С₁-С₆ алкильную группу, необязательно разветвленную, и/или необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- C₁-С₅ алкиларильную группу, причем арильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкильными группами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов,

R₂ представляет собой:

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или

- метилбиарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами,

и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- метиларильную группу, где арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа,

- биарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно содержит один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или каждая арильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами,

или В и R₂ вместе образуют неароматическое кольцо,

R₅ представляет собой:

- атом галогена, или

- атом водорода, или

- C₁-C₅ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот, или

- (С₁-С₄)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, в которой циклоалкильная группа необязательно замещена одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот,

а также их соли, гидраты и стереоизомеры.

Предпочтительные заместители А, В, и R₁-R₆ в Формуле I, а также в предпочтительных соединениях формулы I были определены ранее.

Существенное отличие соединений формулы I от росковитина заключается в том, что в соединениях формулы I азот в положении 7 в ядре росковитина заменен углеродом.

Если не оговорено особо, в соединениях по изобретению пиримидиновое кольцо в ядре росковитина заменено пиридиновым кольцом.

Это отличие является ключевой особенностью соединений по изобретению, которая придает соединениям по изобретению их уникальные свойства: они меньше взаимодействуют с пиридоксалькиназой, чем соединения пуринового типа согласно предшествующему уровню техники, как показано на Фиг.1.

Фактически, взаимодействие соединений по изобретению с пиридоксалькиназой определяли по следующей методике (анализ с окраской серебряным красителем).

1000 мкг лизата свиного мозга (100 мкл лизата с концентрацией 10 мкг/мкл) вместе с 100 мкМ росковитина или 100 мкМ соединения формулы 1 г, или 100 мкМ соединения формулы Iд наносили на гранулы агарозы и промывали буфером (50 мМ буфера Tris с pH 7,4, 5 мМ NaF, 250 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 5 мМ EGTA, 0,1% раствора NP-40, 10 мкг/мл лейпептина, апротинина и ингибитора трипсина из бобов сои и 100 мкМ бензамидина).

Результаты этих испытаний представлены на Фиг.1.

Как видно из Фиг.1, соединения по изобретению проявляют конкурирующий эффект в отношении CDK5, что показывает, что они действительно взаимодействуют с этим ферментом.

Росковитин проявляет конкурирующий эффект в отношении вторичных мишеней Erk2 и PDXK. Напротив, соединения по изобретению не показали никакого эффекта или только незначительный конкурирующий эффект в отношении пиридоксалькиназы и Erk2, что показывает, что эти белки не являются мишенями или являются очень слабыми целями для соединений по изобретению.

Другими словами, по сравнению с росковитином соединения по изобретению проявляют повышенную специфичность в отношении CDK.

Кроме того, было отмечено, что по сравнению с производными пурина они обладают несколько меньшим ингибирующим эффектом по отношению к CDK9 киназе, которая не должна ингибироваться из-за ее ключевой роли в транскрипции.

Кроме того, было обнаружено, что когда в формуле I B-R2 отличается от NH₂ или имеет короткую длину цепи и предпочтительно содержит по меньшей мере одну арильную группу, эффект соединений формулы 1 в отношении жизнеспособности клетки усиливается несмотря на малую разницу в эффекте в отношении CDK. Кроме того, тонкие различия в их селективности (уменьшенный эффект в отношении CDK9) дают возможность предположить, что для этих молекул следует ожидать меньшего проявления неспецифических эффектов по сравнению с их пуриновыми аналогами.

Таким образом, соединения по настоящему изобретению представляют собой тризамещенные или тетразамещенные имидазо[4,5-b]пиридины, то есть 1-деазапурины.

Соединения по изобретению испытывали относительно их эффектов на различные CDK и клеточные линии по сравнению с росковитином.

Об этих тестах и их результатах сообщается далее в разделе, озаглавленном "Результаты".

Кроме того, для тех соединений по изобретению, в которых А представляет собой N, авторы изобретения открыли особенно выгодный способ их получения.

Этот способ основан на применении промежуточного вещества, которое имеет следующую формулу II:

где

В представляет собой О или S или NH

R₁ представляет собой:

- С₁-С₆ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- С₃-С₆ циклоалкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, или

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- С₁-С₅ алкиларильную группу, причем арильная группа необязательно замещена одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкильными группами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов,

R₂ представляет собой:

- арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или

- метилбиарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или C₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, или

- метиларильную группу, где арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или необязательно содержащую один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа,

- биарильную группу, где каждое арильное кольцо необязательно содержит один или несколько гетероатомов, причем при этом образуется 2-пиридильная группа, или 3-пиридильная группа, или 4-пиридильная группа, или 2-тиенильная или 3-тиенильная группа, или каждое арильное кольцо необязательно замещено одним или несколькими атомами галогена, и/или гидроксигруппами, и/или С₁-С₃ алкилоксигруппами, и/или CF₃ группами, и/или группами карбоновых кислот, и/или группами эфиров карбоновых кислот, и/или аминогруппами,

или В и R₂ вместе образуют неароматическое кольцо,

R₅ представляет собой:

- атом галогена, или

- атом водорода, или

- C₁-C₅ алкильную группу, необязательно замещенную одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот, или

- (С₁-С₄)алкил(С₃-С₆)циклоалкильную группу, в которой циклоалкильная группа необязательно замещена одной или несколькими гидроксигруппами, и/или аминогруппами, и/или атомами галогена, и/или группами карбоновых кислот,

Х представляет собой Cl или Br или I или NH₂.

Эти промежуточные продукты также охватываются рамками настоящего изобретения. Получение этих соединений Формулы II представлено на следующей Схеме 1.

Для получения предшественников Формулы II применяли три пути синтеза:

Путь а = 5,7-Дихлоримидазопиридин 1, полученный как описано в публикации G. Cristalli and al, "Nucleosides and nucleotides", 1985, 4, 625-639, подвергали реакции с R₁X (X=Br или I) в основных условиях с получением соединения 2, которое далее подвергали реакции с R₂BH в бутаноле с использованием третичного алкиламина (например, NEt₃ или NBu₃) в качестве основания, при 90-100°С с получением соединения IIa, Х=Cl.

Путь б = В результате алкилирования соединения 3, полученного согласно известной методике в условиях, аналогичных таковым для соединения 1, получали соединение 4, которое подвергали раекции с нитратом тетрабутиламмония с получением динитросоединения 5. В результате реакции соединения 5 с R₂BH в горячем бутаноле или ДМФ при 20-30°С получали соединение 6, которое восстанавливали с получением соединения IIб, Х=NH₂ с помощью Fe, HCl; IIб, Х=NH₂. Соединение IIб можно превратить в соединение IIв, Х=Br или в соединение IIе, если Х=I. Превращение соединения IIб в соединение Не осуществляют путем нагревания в CH₂I₂ и органическом нитрите, таком как трет-бутилнитрит или изопентилнитрит.

Путь в = Третий путь близко связан со вторым путем. Стадию алкилирования, то есть введение группы R₁, осуществляют раньше.

В способе получения соединений Формулы I применяют соединения Формулы II.

В первом воплощении способа применяют соединения Формулы II, в которых Х представляет собой Cl, Br или I, предпочтительно I.

Этот способ включает стадию связывания соединения формулы II с нуклеофильным агентом следующей Формулы III:

с получением соединения формулы I.

В реакции сочетания применяют металлический катализатор, например, Pd(OAc)₂, Pd₂dba₃ или CuI в основных условиях.

Основание может представлять собой карбонат, например, Cs₂CO₃, алкоголят металла, например, трет-бутилOK или трет-бутилОNа.

Металлические катализаторы в большинстве случаев используют с дополнительными лигандами, такими как (+)Binap, Xantphos или этиленгликоль или дикетоны. Примеры лигандов-дикетонов описаны в публикации Shafir et al., Amer. Chem. Soc. 2006, 126, 8742-8743 и Shafir, J. Amer. Chem. Soc 2007, 129, 3490-3491.

Однако во воплощении способа по изобретению в нем применяют соединения формулы I, где Х представляет собой NH₂.

В этом втором воплощении одну или две стадии связывания следует осуществлять в зависимости от природы требуемого заместителя R₃ и R₄.

Таким образом, нуклеофильное соединение формулы II, в которой Х представляет собой NH₂, связывается с электрофилом, имеющим следующую Формулу IV:

в которой Y представляет собой I, Br или Cl, и R₆ представляет собой R₃ или R₄, с получением соединения следующей Формулы V:

Наиболее предпочтительно, Y представляет собой I.

Затем, если R₃ и R₄ отличны от Н, соединение Формулы V связывается с соединением следующей Формулы VI:

в которой Y представляет собой Br или Cl или I, наиболее предпочтительно I, и R₇ представляет собой R₃, если в Формуле V группа R₆ представляет собой R₄, или R₇ представляет собой R₄, если в Формуле V группа R₆ представляет собой R₃.

Как и в случае первого воплощения, эти стадии связывания проводят в основных условиях.

Более предпочтительно, в каждом случае Х и Y представляют собой I или Br, и наиболее предпочтительно I.

Настоящее изобретение сейчас будет описано с помощью предпочтительных примеров осуществления изобретения.

Пример 1: Получение Перхаридина Б (соединение Формулы Iб) 5,7-Дихлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин 2

Перемешиваемый раствор 5,7-Дихлоримидазо[4,5-b]пиридина (5 г, 26,5 ммол) в ДМСО (50 мл) охлаждали в ледяной бане и обрабатывали K₂CO₃ (14,6 г, 106,2 ммол) и 2-бромпропаном (12,47 мл, 132,8 ммол). Реакционной смеси давали согреться до 18°С и перемешивали в течение ночи. ДМСО удаляли в вакууме. Смесь остатка и воды (100 мл) экстрагировали этилацетатом (3×300 мл). Экстракты объединяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия (300 мл), сушили над Na₂SO₄ и концентрировали. Хроматографическая очистка остатка на силикагеле с использованием смеси толуол-AcOEt-CH₂Cl₂ 3:1:1 дала 5,7-дихлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин (Выход: 57%).

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,67 (д, 6Н); 5,01 (м, 1Н,); 7,95 (с, 1Н); 8,39 (с, 1Н)

7-Бензиламино-5-хлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин IIa

Смесь соединения 2 (1,87 г, 8,1 ммол), бензиламина (1,4 мл, 13 ммол) и 1,5 мл Et₃N в 10 мл ДМФ перемешивали при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере N₂. ДМФ удаляли в вакууме. Добавляли воду (150 мл) и экстрагировали CH₂Cl₂ (3×100 мл). Органическую фазу сушили (Na₂SO₄) и концентрировали. Хроматографическая очистка остатка на силикагеле с использованием смеси толуол-AcOEt 3:2 дала соединение 3 (82%). Таким же образом можно получить соединение 3а при нагревании в течение 1 часа смеси соединения 2, бензиламина и триэтиламина в н-бутаноле при 90°С. После концентрирования в вакууме, соединение 3а выделяли с помощью колоночной хроматографии с выходом 75%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,5 (д, 6Н); 4,49 (д, 2Н,); 4,88 (м, 1Н); 5,75 (т, 1Н); 6,31 (с, 1Н); 7,3-7,25 (м, 5Н); 7,7 (с, 1Н).

Перхаридин Б: (S)-7-Бензиламино-5-[(2-бутил-1-ол)амино]-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин Iб

К суспензии 540 мг, (1,8 ммол) 7-бензиламино-5-хлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридина 3а в толуоле (20 мл) и (S)-(+)-2-амино-1-бутанола, в присутствии ацетата палладия (4 мол.%) и BINAP (4 мол.%) в кипящем толуоле (20 мл) с использованием трет-бутоксида калия (282 мг, 2,5 ммол). Реакционную смесь нагревали в атмосфере N₂ в течение 5 часов. После охлаждения добавляли воду (10 мл) и экстрагировали CH₂Cl₂ (3×10 мл). Органический слой сушили (Na₂SO₄) и концентрировали. После хроматографической очистки остатка на силикагеле с помощью смеси AcOEt-1% МеОН дала соединение Iб (42%).

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 0,95 (т, 3Н); 1,49 (м, 8Н); 3,55 (м, 1Н); 3,77 (м, 2Н); 4,48 (д, 2Н); 4,62 (гептет, 1Н); 4,85 (шт, 1Н); 5,35 (с, 1Н); 6,10 (шс, 1Н); 7,30 (м, 5Н); 7,65 (с, 1Н).

Пример 2: Получение Перхаридина А (соединение Формулы Ia)

Проводили синтез Перхаридина А согласно первому Примеру осуществления настоящего изобретения из соединения 3а как описано для Перхаридина Б, за исключением того, что на последней стадии применяли (R)-(-)-2-амино-1-бутанол. Выход: 38%.

Пример 3: Получение Перхаридина Г (соединение Формулы Iг)

Соединение получали согласно той же методике, детально описанной в Примере 1.

Этот продукт получали как описано для соединения 3а путем нагревания в 50 мл н-бутанола смеси трифторацетата 4-(2-пиридил)-бензиламина (0,15 мол), 5 мл триэтиламина и 5,7-дихлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридина 2 (0,1 мол). 5-Хлор-3-изопропил-7-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-имидазо[4,5-b]пиридин IIб

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,52 (д, 6Н, 2 СН₃); 4,56 (д, 2Н, СН₂); 4,94 (гептет, 1Н, СН, iPr); 5,89 (т, 1Н, NH); 6,35 (с, 1Н, 6-Н); 7,35 (м, 1Н, пиридил); 7,45 (д, 2Н, фенил); 7,75 (м, 2Н, пиридил); 7,83 (с, 1Н, Н-2); 7,95 (д, 2Н, фенил); 8,70 (д, 1Н, пиридил).

Перхаридин Г: (S)-7-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-5-[(2-бутил-1-ол)амино]-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин 1 г

Выход: 35%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,03 (т, 3Н, СН₃); 1,50 (д, 6Н, 2 СН₃); 3,51 (м, 1Н, СН-ОН); 3,75 (м, 2Н, СН-ОН+CH-NH); 4,20 (шс, 1Н, ОН); 4,50 (д, 2Н, СН₂-Ar); 5,44 (с, 1Н, Н-6) 5,85 (т, 1Н, NH); 7;25 (м, 1Н, пиридил); 7,45 (д, 2Н, фенил); 7,65 (с, 1Н, Н-2); 7,75 (м, 2Н, пиридил); 7,98 (д, 2Н, фенил); 8,70 (д, 1Н, пиридил).

Пример 4: Получение Перхаридина В (соединение Формулы Iв)

Синтез Перхаридина В проводили, используя в качестве исходного соединения IIб, как описано для Перхаридина Г, за исключением того, что на последней стадии применяли (R)-(-)-2-амино-1-бутанол. Выход: 47%.

Пример 5: Получение Перхаридинов из 7-нитроимидазо[4,5-b]пиридина 3-Изопропил-7-нитроимидазо[4,5-b]пиридин 4

Алкилирование 7-нитро-имидазо[4,5-b]пиридина 3 проводили в тех же условиях, что и для синтеза соединения 2. Выход: 76%.

¹H-NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,61 (д, 6Н, 2 СН₃); 4,99 (гептет, 1Н, СН, iPr); 7,90 (д, 1Н, Н-6); 8,36 (с, 1Н, Н-2); 8,52 (д, 1Н, Н-5).

3-Изопропил-5,7-динитро-имидазо[4,5-b]пиридин 5

К раствору 22,63 г нитрата тетрабутиламмония в 100 мл CH₂Cl₂ при 0°С добавляли 10,33 мл трифторуксусного ангидрида. После перемешивания в течение 20 мин при 0°С, этот раствор добавляли к 3-изопропил-7-нитроимидазо[4,5-b]пиридину 3 (10,21 г, 0,049 мол) в 130 мл CH₂Cl₂ при 0°С. После перемешивания в течение 2 часов при 0°С раствор выливали в холодный (5°С) насыщенный раствор NaHCO₃. Органический слой промывали один раз H₂O, сушили и концентрировали в вакууме. Выход 97%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,76 (д, 6Н, 2СН₃); 5,10(гептет, 1Н, СН, iPr); 8,63 (с, 1Н, Н-2); 8,96 (с, 1Н, Н-6).

7-Бензиламино-3-изопропил-5-нитроимидазо[4,5-b]пиридин 6а

К раствору 5,7-динитро-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридина 5 в ДМФ добавляли NEt₃ и бензиламин. После перемешивания в течение 6 часов при 20°С, добавляли 15 мл Et₂O и выпадающий в осадок твердый продукт отфильтровывали и промывали Et₂O.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,65 (д, 6Н, 2СН₃); 4,65 (д, 2Н, СН₂); 4,92 (гептет, 1Н, СН, iPr); 6,95 (т, 1Н, NH); 7,24 (с, 1Н, Н-6); 7,42 (м, 5Н, фенил); 7,98 (с, 1Н, Н-2).

Биарильные производные получали тем же способом.

3-Изопропил-5-нитро-7-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-имидазо[4,5-b]пиридин 6б

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,55 (д, 6Н, 2 СН₃); 4,63(д, 2Н, CH₂); 5,01 (гептет, 1Н, СН, iPr); 6,88 (шс, 1Н, NH); 7,22 (м, 1Н, пиридил); 7,49 (д, 2Н, фенил); 7,68 (дд, 1Н, пиридил); 8,01 (д, 2Н, фенил); 8,04 (с, 1Н, Н-2); 8,66 (д, 1Н, пиридил).

5-Амино-3-изопропил-7-бензиламино-имидазо[4,5-b]пиридин IIб

К суспензии 5,5 г Fe в 30 мл EtOH медленно добавляли 2 мл 12 N раствора HCl. Реакционную смесь перемешивали при 75°С в течение 1 часа. После охлаждения до 65°С, добавляли 12 мл 25% раствора NH₄Cl. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут и добавляли соединение 6а (0,02 мол, в 5 мл EtOH). Реакционную смесь нагревали при 75°С в течение 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 5 г целита, и реакционную смесь фильтровали через целит, а образующийся твердый продукт промывали несколько раз этанолом. Объединенные фильтраты концентрировали и экстрагировали CH₂Cl₂ и 10% раствором Na₂CO₃. После концентрирования органического слоя достигали кристаллизации амина IIб. Yield: 98%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1.45 (д, 6Н, 2СН₃); 4.12 (шс, 2Н, NH₂); 4.68 (гептет, 1Н, СН, iPr); 5.48 (с, 1Н, Н-6); 5.53 (т, 1Н, Н-2); 7.15-7.35 (м, 5Н, фенил); 7.55 (с, 1Н, Н-6). Биарильное производное Ид получали тем же способом.

5-Амино-3-изопропил-7-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-имидазо[4,5-b]пиридин IIд

Выход: 95%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,55 (д, 6Н, 2 СН₃); 4,55 (д, 2Н, CHz); 4,92 (гептет, 1Н, СН, iPr); 5,80 (т, 1Н, NH); 6,74 (с, 1Н, Н-6); 7,22 (м, 1Н, пиридил); 7,47 (д, 2Н, фенил); 7,62 (м, 2Н, пиридил); 7,98 (д, 2Н, фенил); 8,70 (м, 1Н, пиридил).

5-Бензиламино-3-изопропил-7-иод-имидазо[4,5-b]пиридин IIг

Соединение IIг получали согласно методике, описанной на следующей схеме.

На первой стадии путем алкилирования 7-хлоримидазо[4,5-b]пиридина, как описано в синтезе соединения 2, получали 7-хлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин 7. Затем проводя нитрование смесью нитрата тетрабутиламмония и трифторуксусного ангидрида как описано в синтезе соединения 5 получали 7-хлор-3-изопропил-5-нитроимидазо[4,5-b]пиридин 8. При восстановлении нитрогруппы, как описано в методике, применяемой при синтезе соединения IIб, получали 5-амино-7-хлор-3-изопропил-имидазо[4,5-b]пиридин 9. На следующей стадии получали амин 9, который затем превращали в 7-хлор-5-иод-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин 10 с использованием CH₂I₂ и алкилнитрита (трет-бутилнитрита или изоамилнитрита). Наконец, из соединения 10 получали производное IIг, как описано в получении соединения IIa.

Соединения общей Формулы V, которые отличаются группой R₁ как определено выше, можно получить согласно той же методике.

7-Хлор-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин 7

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃):δ 1,65 (д, 6Н, 2СН₃); 4,98 (гептет, 1Н, СН(СН₃)₂); 7,28 (д, 1Н, Н-5); 8,18 (с, 1Н, Н-2); 8,3 (д, 1Н, Н-6);

7-Хлор-3-изопропил-5-нитроимидазо[4,5-b]пиридин8

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,75 (д, 6Н, 2СН₃); 5,12 (гептет, 1Н, СН(СН₃)₂); 8,35 (с, 1Н); 8,45 (с, 1Н).

5-Амино-7-хлор-3-изопропил-имидазо[4,5-b]пиридин 9

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,60 (д, 6Н, 2СН₃); 4,50 (шс, 2Н, NH₂); 4,80 (гептет, 1Н, СН(СН₃)₂); 6,53 (с, 1Н, Н-8); 7,84 (с, 1Н, Н-2).

7-Хлор-5-иод-3-изопропилимидазо[4,5-b]пиридин 10

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,65 (д, 6Н, 2СН₃); 4,95 (гептет, 1Н СН(СН₃)₂); 7,68 (с, 1Н,); 8,07 (с, 1Н).

Получение соединения IIг

К суспензии 0,1 мол 5-амино-3-изопропил-7-бензиламино-имидазо[4,5-b]пиридина IIб в 100 мл CH₂I₂ при 60°С при перемешивании медленно добавляли 0,2 мол изопентилнитрита. После перемешивания в течение 1 часа при 60°С, дийодметан отгоняли в вакууме (0,1 мм). Остаток обрабатывали смесью CH₂Cl₂ и насыщенного раствора NaHCO₃. Органический слой отделяли и промывали H₂O, сушили и концентрировали с получением соединения IIг.

Выход: 95%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,51 (д, 6Н, 2 СН₃); 4,40 (д, 2Н, СН₂); 4,82 (гептет, 1Н, СН, iPr); 5,56 (т, 1Н, NH); 6,64 (с, 1Н, Н-6); 7,28 (м, 5Н, фенил); 7,75 (с, 1Н, Н-2).

Таким же способом получали биарильное производное IIд.

3-Изопропил-7-иод-5-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-имидазо[4,5-b]пиридин IIд

Выход: 95%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,55 (д, 6Н, 2 СН₃); 4,55 (д, 2Н, СН₂); 4,92 (гептет, 1Н, СН, iPr); 5,80 (т, 1Н, NH); 6,74 (с, 1Н, Н-6); 7,22 (м, 1Н, пиридил); 7,47 (д, 2Н, фенил); 7,62 (м, 2Н, пиридил); 7,98 (д, 2Н, фенил); 8,70 (м, 1Н, пиридил).

3-Изопропил-5-(4-N-ацетилциклогексиламино)-7-(бензиламино)-имидазо[4,5-b]пиридин Iз

К смеси K₃PO₄ (900 мг, 0,022 мол), CuI (50 мг, 0,25 ммол) добавляли 4 мл 1-бутанола, 0,5 мл этиленгликоля, (0,010 мол) 5-бензиламино-3-изопропил-7-иод-имидазо[4,5-b]пиридина IIг и транс-N-ацетиламиноциклогексиламин (0,010 мол), Колбу продували азотом, закрывали и нагревали в течение 18 часов при 90°С. После охлаждения до комнатной температуры остаток обрабатывали смесью CH₂Cl₂ и H₂O. Органический слой сушили и концентрировали. После колоночной хроматографии получали 3-изопропил-5-N-ацетилциклогексиламино-7-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-имидазо[4,5-b]пиридин. Выход 94%.

¹H NMR (400 МГц, CDCl₃): δ 1,35 (м, 4Н, циклогексил); 1,56 (д, 6Н, 2СН₃); 1,98 (с, 3Н, СН₃СО); 2,20 (м, 4Н, циклогексил); 3,45 (м, 1Н, циклогексил); 3,75 (м, 1Н, циклогексил); 4,5 (д, 2Н, СН₂); 4,69 (гептет, 1Н, iPr); 5,32 (д, 1Н, NH); 5,35 (с, 1Н, Н-6); 5,65 (шс, NH); 7,35 (м, 5Н, фенил); 7,58 (с, 1Н, Н-2).

Аналогично, из йодпроизводных IIг или IIд получали перхаридины А, Б, В и Г с выходом от 79 до 95%.

Пример 6: 3-Изопропил-5-(1,3-дигидроксипропиламино)-7-[4-(2-пиридил)-бензиламино]-имидазо[4,5-b]пиридин Iи, Перхаридин Д

¹H-NMR: 1,45 (д, 6Н); 3,55-3,80 (м, 5Н); 4,38 (д, 2Н); 4,55 (гептет, 1Н); 4,90 (шс, 1Н); 5,35 (с, 1Н); 5,75 (т, 1Н); 7,15 (м, 1Н); 7,30 (д, 1Н) 7,5 (с, 1Н); 7,65 (м, 2Н); 7,85 (д, 2Н); 8,6 (д, 1Н).

Соединения, полученные в Примерах 1-6, анализировали для определения их влияния на различные киназы и клеточные линии.

Применяли следующие материалы и методы.

Буферы

Буфер А: 10 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 25 мМ Tris-HCl pH 7,5, 50 мкг гепарина на мл.

Буфер В: 60 мМ β-глицерофосфата, 15 мМ п-нитрофенилфосфата, 25 мМ MOPS (pH 7,2), 5 мМ EGTA, 15 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 1 мМ ванадата натрия, 1 мМ фенилфосфата.

Получение киназы и анализ активности

Анализ активности киназ проводили в Буфере А или В, при 30°С, при конечной концентрации АТФ 15 мкМ. Вычитали значения для холостых проб, и активность выражали в % от максимальной активности, т.е., активности в отсутствие ингибиторов. Контрольные измерения проводили на соответствующих разбавленных растворах диметилсульфоксида.

CDK1/циклин В (ооциты морской звезды в М-фазе, нативная) и CDK5/р25 (человеческая, рекомбинантная) получали как описано ранее (Leclerc S. et al., J Biol Chem 2001; 276:251-60). Активность киназы определяли в Буфере В, содержащем 1 мг гистона Н1 на мл, в присутствии 15 мкМ [γ-³³P] АТФ (3,000 Ки/ммол; 10 мКи/мл) при конечном объеме 30 мкл. Через 30 мин инкубирования при 30°С, аликвоту супернатанта объемом 25 мкл наносили на кусочки фосфоцеллюлозной бумаги Whatman P81 размером 2,5×3 см, и через 20 секунд фильтры промывали пять раз (каждый раз по меньшей мере в течение 5 мин) в растворе, содержащем 10 мл фосфорной кислоты на литр воды. Проводили измерение радиоактивности влажных фильтров в присутствии 1 мл сцинтилляционной жидкости ACS (Amersham).

CDK2/циклин А (человеческая, рекомбинантная, экспрессируется в клетках насекомых) подвергали анализу как описано для CDK1/циклина В.

CDK1/циклин Т (человеческая, рекомбинантная, экспрессируется в клетках насекомых) подвергали анализу как описано для CDK1/циклина В, но с использованием фрагмента pRB (аминокислоты 773-928) (3,5 мкг на анализ) в качестве субстрата.

GSK-3α/β (из свиного мозга, нативная, очищенная с помощью аффинной хроматографии) анализировали, как описано для CDK1, но в Буфере А и с использованием субстрата, специфичного для GSK-3 (GS-1: YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSpEDEEE) (Sp обозначает фосфорилированный серин) (Bach S. et al. J Biol Chem 2005:280:31208-19).

CK1δ/ε (из свиного мозга, нативная, очищенная с помощью аффинной хроматографии) анализировали, как описано для CDK1, но с использованием пептидного субстрата, специфичного для СК1 RRKHAAIGSpAYSITA (Reinhardt J. et al. Protein Expr&Purif 2007; 54:101-9).

Клеточная биология

Антитела и реагенты

AcDEVDafc и Q-VD-OPh приобретали у MPbiomedicals (Ванн, Франция). Комплекты Cell Titer 96®, содержащий реагент MTS, и CytoTox 96® приобретали у Promega (Мэдисон, Висконсин, США). Использовали коктейль ингибиторов протеаз от Roche (Пенцберг, Германия). Если не оговорено особо, реагенты, не приведенные в списке, были от Sigma.

Моноклональное антитело против актина приобретали у Calbiochem (Мэдисон, Висконсин, США). Моноклональное антитело против белка ретинобластомы (Rb) приобретали у BD Biosciences (Сан-Диего, Калифорния, США). Поликлональное антитело против фосфо-Ser249/Thr252-Rb приобретали у Biosource (Камарилло, Калифорния, США). Поликлональное антитело против 1α-фосфатазы фосфо-Thr320-белка (РР1α) и моноклональное антитело против каспазы-9 приобретали у Cell Signalling (Дэнверс, Массачусетс, США). Поликлональное антитело против РНК-полимеразы II и фосфо-Ser2-РНК-полимеразы II приобретали у Covance Research Products (Беркли, Калифорния, США). Поликлональное антитело против McI-1 приобретали у Santa Cruz Biotechnology (Санта Круз, Калифорния, США).

Клеточные линии и условия культивирования

Клетки невробластомы человека SH-SY5Y выращивали в среде DMEM (Invitrogen, Кержи Понтуаза, Франция). Эмбриональные клетки почек человека НЕК 293 выращивали в среде MEM от Invitrogen. Первичные фибробласты крайней плоти человека (любезно предоставлены доктором Gilles Ponzio) выращивали в среде DMEM с добавлением 2 мМ L-глутамина и 20 мМ HEPES. Во все среды добавляли антибиотики (пенициллин-стрептомицин) от Lonza и 10 об.% FCS от Invitrogen. Клетки культивировали при 37°С с 5% CO₂. Обработку лекарственными препаратами проводили на экспоненциально растущих культурах в течение указанного времени и при указанных концентрациях. Контрольные эксперименты проводили с использованием соответствующих разбавленных растворов ДМСО. Клеточные линии MDCK применяли для тестирования соединений в отношении поликистоза почек (PKD).

Анализы клеточной смерти и жизнеспособности клетки

Анализ жизнеспособности клеток проводили путем измерения восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (MTS). Анализ клеточеной смерти проводили путем измерения уровня активности лактат-дигидрогеназы (LDH), высвобождающейся при лизисе клетки. Обе методики были ранее описаны подробно (Ribas J. et al. Oncogene 2006; 25:6304-18).

Аналитическая система для каспаз

Активность капсаз измеряли, опредяя флуоресценцию, испускаемую синтетическим субстратом AcDEVDafc после его добавления непосредственно в культуральную среду, лизиса в присутствии детергента и инкубирования при 37°. Этот метод разработан в формате 96-луночного планшета. Он позволяет осуществлять кинетическое определение активации каспаз и одновременно характеризовать несколько лекарственных препаратов (Ribas J. et al. Oncogene 2006, 25:6304-18).

Электрофорез и Вестерн-блоттинг

Клетки ресуспендировали и подвергали лизису в течение 30 минут при 4°С в буфере для гомогенизации [60 мМ β-глицерофосфата, 15 мМ п-нитрофенил фосфата, 25 мМ MOPS (pH 7,2), 15 мМ EGTA, 15 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитола, 1 мМ ванадата натрия, 1 мМ NaF, 1 мМ фенилфосфата, 0,1% препарата Nonidet Р-40 и коктейль ингибиторов протеаз] и подвергали воздействию ультразвуком. После центрифугирования (14000 оборотов в минуту в течение 15 минут при 4°С), концентрацию белка в супернатанте определяли путем анализа белка по Брэдфорду (Bio-Rad).

Экстракты целых клеток получали в буфере, содержащем 100 мМ Tris/HCl (pH 6,8), 1 мМ EDTA, 2% SDS и коктейль ингибиторов протеаз. После денатурации под действием температуры в течение 5 минут, белки отделяли на 10% или 7% NuPAGE готовых бис-, трис или трис-ацетат поликриламидных минигелях (Invitrogen) с MOPS SDS (все, кроме Вестерн-блоттинга с цитохромом С, РНК-полимеразой II и фосфо-Ser2-РНК-полимеразой II), MES SDS (цитохром С), или трис-ацетатом SDS (РНК-полимераза II и фосфо-Ser2-РНК-полимераза II), используя буфер в зависимости от размера белка. Белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры с размером пор 0,45 мкм (Schleicher and Schuell). Их блокировали с помощью 5% молока с низкой жирностью в солевом растворе, содержащем буфер Tris и Твин-20, инкубировали в течение 1 часа с антителами (анти-актин: 1:2000) или в течение ночи при 4°С (цитохром С: 1:500), Rb (1:500), фосфо-Rb (1:500), фосфо-Thr320-РР1α (1:1000), РНК-полимеразы II (1:500), фосфо-Ser2-РНК-полимеразы II (1:500), McI-1 (1:500), каспазы-9 (1:1000) и анализировали с помощью улучшенного метода хемилюминесценции (Enhanced Chemiluminescence, ECL, Amersham).

Результаты биологических испытаний

Эффекты соединений по изобретению

Эффекты очищенных киназ

Перхаридин А и Б (S- и R-изомеры) и их предшественники тестировали на различных выделенных и очищенных киназах белков, ассоциированных с заболеваниями. Параллельно тестировали (R)-Росковитин, который использовали в качестве эталонного соединения. Результаты в виде значений IC₅₀, выраженные в мкМ, представлены в следующих Таблицах 4 и 5.

Таблица 4 Эффекты перхаридина и его предшественников на киназы и жизнеспособность клетки в двух клеточных линиях Испытуемые соединения Название CDK1 CDK5 CDK7 GSK3 СК1 SH-SY5Y НЕК293 Формула Iд 1,0 0,8 - >10,0 1,0 74,0 46,0 Формула Iе 4,0 3,8 - >10,0 8,0 >100,00 >100,00 Формула Iж 0,53 0,63 - >10,0 3,0 >100,00 >100,00 (R)-перхаридин А Формула Ia 0,35 0,20 0,9 >30,0 4,0 16,2 35,6 (R)-росковитин 0,35 0,20 0,8 >10,0 2,3 19,0 18,2 60,6 39,2

В результатах, представленных в Таблице 4, показаны различные промежуточные соединения, которые синтезированы для осуществления синтеза перхаридинов. Пример 16 является самым близким гомологом росковитина, и их биологический эффект сопоставим. Это показывает, что соединение 16 проявляет эффект в отношении изолированных киназ, очень похожий на эффект росковитина, но с улучшенной эффективностью относительно пролиферации клеток.

Что касается Перхаридина Д, Соединение Iи проявляет значение IC₅₀ по CDK5, равное 0,34 мкМ, и по СК1, равное 0,28 мкМ.

Соединения испытывали при различных концентрациях при анализе активности киназ, как описано в разделе Методы. Значения IC₅₀, рассчитанные на основании кривых доза-ответ и выраженные в мкМ, представлены в следующей Таблице 5.

Таблица 5 Эффекты росковитина и его аналогов перхаридина на активность 10 целевых белковых киназ Киназа (R)-Росковитин (R)-Перхаридин А (Соединение Ia) (S)-Перхаридин Б (Соединение Iб) (R)-Перхаридин В (Соединение Iв) (S)-Перхаридин Г (Соединение Iг) CDK1/циклин В 0,33 0,43 0,73 0,46 0,27 CDK2/цициин А 0,21 0,30 0,42 0,36 0,15 CDK2/циклин Е 0,17 0,18 0,31 0,25 0,10 CDK5/p25 0,28 0,40 0,50 0,60 0,20 CDK7/циклин Н 0,80 0,90 - - - CDK9/циклин Т 0,23 0,48 1,30 0,53 0,12 СК1 4,00 11,0 4,80 1,10 1,90 DYRK1A 3,00 2,80 22,00 11,00 2,80 Erk2 11,00 7,00 9,00 22,00 9,00 GSK-3α/β 60,00 >100,00 >30,00 11,00 24,5

Таблица 5 показывает, что как и (R)-перхаридин (соединение формулы Ia), его (S)-изомер (соединение формулы Iб), а также соединения формулы Iв и Iг проявляют активность в отношении CDK, которая подобна активности (R)-росковитина. Однако CDK9 и DYRK1A, по-видимому, несколько менее чувствительны к этим деазапуринам, чем к (R)-росковитину.

Эффекты перхаридинов в отношении жизнеспособности клеток

Перхаридин А и Б (R- и S-изомеры) и их предшественники, а также соединения формулы Iв и Iг, испытывали на различных клеточных линиях (анализ уровня выживаемости с использованием MTS). Параллельно тестировали (R)-Росковитин, который использовали в качестве эталонного соединения. Результаты в виде значений IC₅₀, выраженные в мкМ, представлены на Фиг.3 и 5 и в Таблице 4, а также в следующей Таблице 6:

Таблица 6 Эффекты росковитина и перхаридина на жизнеспособность клеток в 5 клеточных линиях Клетки (R)-Росковитин (R)-Перхаридин А (S)-Перхаридин Б Соединение Формулы Ib Соединение Формулы Iг SH-SY5Y 17,0 14,3 28,0 1,46 0,66 НЕК293 21,0 27,4 45,0 - - LS174T 26,0 21,5 37,5 - - LS 174T (Oncodesign) 9,25 - - 0,29 0,099 HCT116 20,8 - - - - HCT116 (Oncodesign) 6,97 - - 0,60 0,30 HCT116 (Сфероиды) 7+4 10+1,5   0,35+0,05   Хронический лимфоцитарный лейкоз 8,96 7,05 15,27 0,31 0,13

Эффекты этих соединений также оценивали по:

- выживаемости клеток. Результаты представлены на Фиг.3 и 5,

- активации каспаз. Результаты представлены на Фиг.4 и 6,

- фосфорилированию белка ретинобластомы по сайтам CDK2/CDK4.

Результаты представлены на Фиг.6 и 7.

На основании Фиг.6 можно сделать вывод, что соединение Iв ингибирует CDK2/4 в клетках при более низких концентрациях чем (R)-росковитин, в то время как соединение Формулы Ia и соединение Формулы Iб имеют эффект, подобный эффекту (R)-росковитина, а на основании Фиг.8 можно сделать вывод, что для (R)-росковитина и соединений Формулы Ia, Iб и Iв общее значение Rb является практически постоянным.

- фосфорилированию РНК-полимеразы II по Ser2, сайту фосфорилирования CDK9/циклин Т.

Результаты представлены на Фиг.9 и 10.

На основании Фиг.9 можно сделать вывод, что соединение Iв ингибирует CDK9 в клетках при более низких концентрациях чем (R)-росковитин, в то время как соединение Формулы Ia и соединение Формулы Iб имеют эффект, подобный эффекту (R)-росковитина, и на основнаии Фиг.10 можно сделать вывод, что общее количество РНК-полимеразы II остается практически постоянным как для (R)-росковитина, так и для соединений Формулы Ia, Формулы Iб и Формулы Iв,

- 1-α фосфорилированию фосфатаз белков по сайту фосфорилирования Thr320 в CDKI/циклине.

Результаты представлены на Фиг.11.

На основании Фиг.11 можно сделать вывод, что соединение Формулы (в ингибирует CDKI/циклин В в клетках при более низких концентрациях чем (R)-росковитин, в то время как соединения Формулы Iа и Формулы Iб имеют эффект, подобный эффекту (R)-росковитина,

- понижающей регуляции фактора жизнеспособности Мс1-1.

Результаты представлены на Фиг.12.

На основании Фиг.12 можно сделать вывод, что соединение Формулы Iв проявляет супрессирующий эффект в отношении фактора жизнеспособности Мс1-1 в клетках при более низких концентрациях чем (R)-росковитин, в то время как соединения Формулы Ia и Формулы Iб имеют эффективность, подобную эффективности (R)-росковитина,

- общей экспрессии белка р53.

Результаты представлены на Фиг.13.

На основании Фиг.13 можно сделать вывод, что соединения Формулы Iв инициируют общую экспрессию белка р53 в клетках при более низких концентрациях чем (R)-росковитин, в то время как соединения Формулы Ia и Формулы Iб имеют эффективность, подобную эффективности (R)-росковитина,

- общей понижающей регуляции белка р27.

Результаты представлены на Фиг.14.

на основании Фиг.14 можно сделать вывод, что соединения Формулы Iв оказывают супрессирующий эффект в отношении общего белка р27 в клетках при более низких концентрациях, чем (R)-росковитин, в то время как соединения Формулы Ia и Формулы Iб имеют эффективность, подобную эффективности (R)-росковитина,

- расщеплению ПАРП.

Результаты представлены на Фиг.15.

на основании Фиг.15 можно сделать вывод, что соединения Формулы Iв инициируют расщепление ПАРП в клетках при более низких концентрациях, чем (R)-росковитин, в то время как соединения Формулы Ia и Формулы Iб имеют эффективность, подобную эффективности (R)-росковитина,

- В качестве контрольной нагрузки для всех соединений использовали общий уровень белка актина. На Фиг.16 представлены результаты, которые показывают одинаковую загрузку в гелях.

Суммируя вышесказанное, можно сказать, что эти результаты показывают следующее:

[1] соединения Формулы Ia и Формулы Iб проявляют антипролиферативную активность, подобную активности, проявляемой (R)-росковитином. (S)-Изомер (соединение формулы Iб) несколько менее эффективен, чем сообщалось для (S)-изомера росковитина.

[2] напротив, и это очень неожиданно, соединения формулы Iв и Iг проявляют существенно большую антипролиферативную активность по сравнению с (R)-росковитином (20-100 раз), несмотря на то, что они имеют довольно похожий эффект в отношении киназ. Неожиданно также, что, в отличие от (R)-росковитина, (S)-изомер более активен, чем (R)-изомер (Таблица 6).

[3] эти эффекты и порядок эффективности подтверждаются анализом молекулярных агентов, вовлеченных в маркеры ингибирования CDK (CDK2/CDK4: фосфорилирование белка ретинобластомы; CDK1: 1α-фосфорилирование фосфатазы белка по Thr320; CDK9: фосфорилирование РНК-полимеразы II по Ser2, понижающая регуляция р27), и апоптотической смерти клетки (экспрессия р53, понижающая регуляция фактора жизнеспособности Мс1-1, активация каспазы, расщепление ПАРП) (Фиг.4-9).

Эти соединения, таким образом, особенно предпочтительны по сравнению с росковитином в отношении их эффектов на индукцию клеточной смерти и остановку пролиферации клетки, несмотря на очевидно подобные эффекты на их целевые CDK. Эти результаты, по-видимому, коррелируют с уменьшением взаимодействия с вторичными мишенями, такими как пиридоксалькиназы (Фиг.1).

Эффекты росковитина и аналогов в отношении выживаемости лимфоцитов B2-CLL и киназной активности типичного представителя CDK. (R)-росковитин и некоторые из перхаридинов тестировали при различных концентрациях на изолированных лимфоцитах B2-CLL, полученных от пациентов. Жизнеспособность клеток определяли, измеряя восстановление 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (MTS). Клеточную смерть определяли, измеряя уровень активности лактат-дегидрогеназы (LDH), высвобождающейся при лизисе клетки. Обе процедуры ранее были детально описаны в публикации Ribas J, Boix J. Cell differentiation, caspase inhibition, and macromolecular synthesis blockage, but not BCL-2 or BCL-XL proteins, protect SH-SY5Y cells from apoptosis triggered by two CDK inhibitory drugs. Exp.Cell Res. 2004; 295, 9-24.

Те же соединения испытывали на В-клетках карциномы легкого Льюиса (LLC - Lewis lung carcinoma). Значения IC₅₀, рассчитанные из кривых доза-ответ, выраженные в мкМ, представлены в следующей таблице.

Соединения Индукция смерти клетки Росковитин 8,96 (R) - Перхаридин А 7,05 (S) - Перхаридин Б 15,27 (R) - Перхаридин В 0,31/0,28 (S) - Перхаридин Г 0,13

Чтобы оценить возможности применения перхаридинов при поликистозе почек (PKD), соединения по изобретению также проверяли на клетках почки собак Madin-Darby (MDCK Madin Darby canine kidney). Были найдено, что Перхаридины Е и Д являются в 50-70 раз более эффективными, чем росковитин.

Кроме того, было испытано соединение Iи. По-видимому, оно является мощным ингибитором киназ, имеющим, в частности, величину IC₅₀ в отношении CDK5 и СК1, равную 0,35 и 0,28.

Таким образом, соединения по изобретению или соединения, полученные согласно способу по изобретению, благодаря своим уникальным биологическим свойствам, как показано в вышеупомянутых примерах, представляют значительный интерес для применения при получении лекарственного препарата.

Действительно, они не только имеют биологические эффекты, по меньшей мере идентичные и даже лучшие, чем эффекты росковитина, но помимо этого они меньше взаимодействуют или вообще не взаимодействуют с пиридоксалькиназой.

Иначе говоря, их можно применять в качестве активного компонента в фармацевтической композиции. Их применение представляет значительный интерес для получения лекарственного препарата для лечения заболеваний, в которых участвует аномальная пролиферация клеток, как опухолевых, так и неопухолевых. Такие заболевания представляют собой, в частности, опухоль, или лейкемию, или неопухолевую, но аномальную пролиферацию, наблюдаемую при различных заболеваниях почек. Но, из-за своих эффектов на CDK5 и их антиапоптотического действия в отношении дифференцированных клеток, в частности, нейрональных клеток, их также можно применять при лечении нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона, или при лечении инсульта, ишемии и боли. Кроме того, их также можно применять для получения лекарственного препарата для лечения вирусного заболевания благодаря их эффекту в отношении CDK2 и CDK9.

Кроме того, их можно применять для получения лекарственного препарата и в способе лечения заболеваний почек, в частности, таких как мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, полулунный гломерулонефрит, коллапсирующая гломерулопатия, пролиферативный волчаночный нефрит, поликистоз почек, диабетическая нефропатия и острое повреждение почек, а также для лечения воспаления, плеврального воспаления, артрита или глаукомы, благодаря их эффектам в отношении CDK5 и апоптоза. Их можно также применять для лечения диабета II типа, учитывая их эффект в отношении CDK5 и, следовательно, их способность увеличивать секрецию инсулина в клетках поджелудочной железы.

Соединения по изобретению или полученные согласно способу по изобретению могут применяться для получения лекарственного препарата или для лечения конкретного заболевания, по отдельности или в смеси из двух или нескольких соединений по изобретению, или даже совместно с другими соединениями, известными из предшествующего уровня техники, про которые известно, что они обладают эффектом в отношении конкретного заболевания, которое следует лечить.

Соединения Формулы Ia-Iи, в частности, пригодны при лечении вышеупомянутых заболеваний.

Получение Перхаридина Г (соединение Формулы Iг) с использованием катализатора CuI.

Смесь соединения формулы IIд (2,41 г, 5,13 ммоль), иодида меди (0,200 г, 1,05 ммоль) и трехосновного фосфата калия (2,72 г, 12,8 ммоль) промывают при перемешивании с азотом в течение 10 минут. Бутанол (6,8 мл), этиленгликоль (0,6 мл) и в-1-амино-2-бутанол (2,4 мл, 24,2 ммоль) добавляют через перегородку с помощью шприца. Затем в течение 48 часов проводят нагревание при температуре 105°C. После охлаждения до 20°C, смесь экстрагируют CH₂Cl₂ (3 раза по 10 мл) и органический слой промывают 1 М раствором динатриевой соли ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (3 раза по 10 мл) и затем водой (1 раз по 10 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом и концентрируют в вакууме. Соединение формулы Ir кристаллизуют при перемешивании с 5 мл этилацетата. Выход составляет 65-78%.

Исследование активности соединений по изобретению в отношении хронического лимфолейкоза (ХЛЛ).

1. Образцы пациентов и выделение клеток ХЛЛ.

Образцы периферической крови были получены после информированного согласия пациентов с подтвержденным диагнозом В-ХЛЛ, которые не подвергались лечению или подвергались лечению, но не в предыдущие три месяца. Исследования были одобрены местными этическими комитетами (Брестский комитет защиты людей (Франция) и Западношотландский институт этических исследований, входящий в Национальную службу здравоохранения Агломерации Глазго и Клайд (Великобритания)). Связанные данные о клинической стадии и прогностические показатели пациентов с ХЛЛ были сохранены. ХЛЛ-лимфоциты выделяли с помощью смеси Rosettesep™ для выделения человеческих В-клеток (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), следуя инструкциям производителя. После отделения была определена чистота ХЛЛ-клеток методом проточной цитометрии, которая составила более 95% во всех случаях. ХЛЛ-клетки криоконсервировали в 90% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, Пейсли, Великобритания) и 10% ДМСО (диметилсульфоксид, Sigma-Aldrich). Нормальные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были выделены из образцов лейкоцитарной пленки и периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием Histopaque (Sigma-Aldrich).

2. Реагенты и антитела.

Все антитела используемые для вестерн-блоттинга были получены от Cell Signaling Technology (Данверс, Миннесота), за исключением анти-Bcl-2 (Millipore, Биллерика, Миннесота), анти-Bcl-x (BD Biosciences, Оксфорд, Великобритания), cFLIP (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Kpyc, Калифорния), анти-фосфо-РНК-полимеразы II (Ser2; Covance Research Products Emeryville, Калифорния). Все антитела для проточной цитометрии были приобретены у BD Biosciences. Карбоксифлуоресцеина сукцинимидиловый эфир (CFSE) и колцемид были получены от Invitrogen.

3. Клеточные линии и условия культивирования

ХЛЛ-клетки культивировали при концентрации 1×10⁶/мл в RPMI-1640, содержащей 10% FBS, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (полная среда; Invitrogen). Мышиные фибробласты L клеток (NT-L) и NT-L клетки, стабильно экспрессирующие CD154 (CD154L), полученные от профессора Дж. Гордон (Университет Бирмингема, Великобритания), облучали дозой 30 Гр перед совместным культивированием с ХЛЛ-клетками. При совместном культивировании ХЛЛ-клеток с CD154L клетками, в полную среду добавляли 10 нг/мл IL-4 (Peprotech EC, Лондон, Великобритания). ХЛЛ-клетки совместно культивировали в течение по меньшей мере 18 часов с NT-L или CD154/L/IL4 перед обработкой Перхаридином А формулы Ia.

4. Оценка смерти клеток.

После обработки ингибиторами, ХЛЛ-клетки собирали, окрашивали аннексином V-APC и Viaprobe, затем были получены данные проточной цитометрии с помощью цитометра FACSCantoll (BD Biosciences). Клетки, охарактеризованные аннексином как «V7AAD"» считались жизнеспособными.

Результаты приведены в таблице ниже. Формулы соединений MRT1-012 и MRT1-07 представлены ниже.

Ингибиторы киназ Индукция смерти клеток (IC₅₀) CDK2/циклин А CDK9/циклин Т Росковитин 8,96 0,23 0,7 (R)-перхаридин А: соединение Ia 7,05 0,30 0,48 (S)-перхаридин В: соединение Iб 15,27 0,42 1,30 (R)-перхаридин С: соединение Iв 0,30 0,18 0,61 (S)-перхаридин D: соединение Iг 0,13 0,42 0,65 MRT1-012 0,174 0,25 0,52 MRT1-07 0,063 0,14 0,21

Влияние соединений по изобретению на В-клетки больных хроническим лимфолейкозом.

Исследование активности соединений по изобретению в отношении поликистоза почек.

Также была исследована активность соединения формулы la по изобретению в отношении поликистоза почек. Использовали мышей jck (мыши с ювенильным кистозом почек). На основании краткосрочных исследований переносимости у мышей дикого типа соединения формулы la были подобраны дозы для основного исследования активности на мышах jck. Мышам jck ежедневно вводилисоединение Ia (или MRT-100) концентрацией 250 мг/мл через желудочный зонд в течение 26-60 дней. Предварительные данные об эффективности у мышей jck свидетельствуют о значительном снижении отношения K/BW (масса почки к массе тела) и BUN (остаточный азот мочевины в крови) под действием соединения формулы la по сравнению с отрицательным контролем (раствор без активного соединения) при неизменной массе тела (BW). Соединение формулы la оказалось способным не только уменьшить размеры почек, но и привести содержание остаточного азота мочевины в крови к нормальному для мышей значению. Результаты исследования представлены на Фиг.17.

Дополнительные исследования эффектов соединений по изобретению на активность целевых белковых киназ.

Соединения Iг, Iи, Iк и Iл испытывали при различных концентрациях при анализе активности киназ, как описано в разделе Методы. Значения IC₅₀, рассчитанные на основании кривых доза-ответ и выраженные в мкМ, представлены ниже.

Киназа Соединение Iг Соединение Iи Соединение Iк Соединение Iл CDK1/циклин В 0,27 0,51 0,15 - СОК2/циклин А 0,15 0,48 0,09 - CDK5/p25 0,20 0,34 0,18 0,81 СОК9/циклин Т 0,12 0,26 0,14 - СК1 1,60 0,28 0,53 1,20 CLK1 6,70 2,20 7,80 - DYRK1A 2,80 2,80 1,30 >10,00 GSK3B 24,50 >10,00 13,00 >10,00 SHSY-5Y 0,66 0,50 0,15 1,50

Настоящее изобретение относится к новым производным имидазо[4,5-b]пиридина формулы I, а также к их солям, гидратам и стереоизомерам, где B-R₂ и R₄-A-R₃ выбраны из групп, указанных в п.1 формулы изобретения, R₁ представляет собой С₁-С₆ алкильную группу, необязательно разветвленную, R₅ представляет собой атом водорода. Также, изобретение относится к соединению формулы II, 3-замещенному 7-хлор-5-иод-имидазо[4,5-b]пиридину, способу получения производных имидазо[4,5-b]пиридина формулы I, фармацевтической композиции на основе соединения формулы I и их применению. Технический результат: получены новые производные имидазо[4,5-b]пиридина, обладающие свойствами ингибитора CDK. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 17 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Соединения, имеющие следующую Формулу I:

где B-R₂ выбран из следующих групп:
, ,
, , , ,
, , ,
, , , .
R₄-A-R₃ выбран из следующих групп:
, , , ,
, , , ,
, и
R₁ представляет собой С₁-С₆ алкильную группу, необязательно разветвленную,
R₅ представляет собой атом водорода,
а также их соли, гидраты и стереоизомеры.

2. Соединения по п.1, где R₁ в Формуле I представляет собой этильную группу, метильную группу или изопропильную группу.

3. Соединения по п.1 или 2, имеющие следующие формулы:





.

4. Соединение по п.1 или 2 для применения в качестве лекарственного средства, имеющего свойства ингибитора CDK.

5. Соединения следующей Формулы II:

где R₁ представляет собой С₁-С₆ алкильную группу, необязательно разветвленную,
R₅ представляет собой атом водорода,
В и R₂ такие, как определено для соединений по п.1, и
X представляет собой Cl, или Br, или I, или NH₂.

6. Соединения следующей Формулы

где R₁ является таким, как определено в п.5.

7. Способ получения соединений по п.1, включающий стадию реакции соединения Формулы II:

где В, R₂, R₁ и R₅ такие, как определено для соединений по п.1, а X представляет собой Br, Cl, I или NH₂,
с соединением следующей Формулы III:

где A, R₃ и R₄ такие, как определено для Формулы I в п.1, в присутствии катализатора, выбранного из Pd(OAc)₂, Pd₂dba₃ или CuI, необязательно в присутствии лиганда, выбранного из лиганда Binap или этиленгликоля в основных условиях.

8. Фармацевтическая композиция, имеющая свойства ингибитора CDK, содержащая по меньшей мере одно соединение по любому из пп.1-3 и один фармацевтически приемлемый наполнитель.

9. Применение одного соединения по любому из пп.1-3 для изготовления лекарственного препарата для лечения заболевания, вызванного аномальной пролиферацией клеток, например, выбранного из
хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелолейкоза,
опухоли,
нейродегенеративного заболевания, например, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и инсульта,
вирусного заболевания,
заболевания, выбранного из заболеваний почек, таких как мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, полулунный гломерулонефрит, коллапсирующая гломерулопатия, пролиферативный волчаночный нефрит, поликистоз почек, диабетическая нефропатия и острое повреждение почек, индуцированная цисплатином нефротоксичность воспаления, такого как плевральное воспаление, артрит, глаукома, и
диабета 2-го типа,
или для лечения боли.

10. Применение по п.9, отличающееся тем, что одно указанное соединение выбирают из группы, состоящей из соединений следующих формул: