ПРОИЗВОДНОЕ ДИТИОКАРБАМАТА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОДЕРЖАЩЕЕ УКАЗАННОЕ ПРОИЗВОДНОЕ Российский патент 2013 года по МПК C07C333/20 A61K31/27 A61P35/00 

Изобретение относится к новому соединению - производному дитиокарбаминовой кислоты, которое может быть применено в медицине, фармакологии, в производстве биологически активных добавок и лекарственных препаратов с противоопухолевым действием.

Ранее были описаны производные N-фенилметил-S-карбоксиметил-дитиокарбаматов, обладающие противогрибковым (CHENEY LEE S. et al., Journal of Medical Chemistry, 1971, 14(8), 770-772), антибактериальным (US 3944580), антигельминтным (BAXI A.J. et al., J. Institution of chemists, 1985, 57(4), 165-166), инсектицидным, фунгицидным, пестицидным действиями (SHANKAR СИ RAVI et al, Indian J. of Chemystry, sect. B, 1985, 24B(5), 580-582; ERTAN M. Et al., Microbiyoloji Bulteni, 1982, 16(4), 268-78; WEUFAFEN WOLFGANG, Pharmazie, 1966, 21(11), 695-9).

Также известно использование N-(1-фенилэтил)- или N-фенилметил- S-карбоксиметилдитиокарбаматов и этилового эфира N-фенилметил-S-(1-карбокси)этилдитиокарбаматов для синтеза биологически активных соединений или полимеров (см. WO 2004043955, WOOD MURRAY R. et al., Organic Letters, 2006, 8(4), 553-556; Knoppova V. et al., Collection of Czechoslovak Chemical Communications, 1974, 39(6) 1589-95; WOOD MURRAY R. et al., Polimer Preprints, 2005, 46(2), 320-321).

Известно применение в качестве профилактического средства экстрактов растительного происхождения, содержащих в качестве активного начала гликозиды изотиоцианатов, растений семейства крестоцветных. При этом в результате ферментативного гидролиза двойного эфира фенилэтилизотиоцианата (ФЭИТЦ) с бисульфитом калия и глюкозой образуется фенилэтилизотиоцианат.

Известны противоопухолевые хемозащитные агенты растительного происхождения, например глюкозинолаты, которые являются метаболическими предшественниками изотиоцианатов (US 5968505, US 5968567). Такие агенты снижают развитие канцерогенеза у животных.

Однако применение природных изотиоцианатов ограничено низкой их концентрацией в растительном сырье, при этом они не подлежат длительному хранению.

Известно также, что S-конъюгаты изотиоцианатов обладают биологической активностью, сходной с активностью изотиоцианатов растительного происхождения. Например, тиоловые конъюгаты ФЭИТЦ, образованные путем присоединения меркаптуровой кислоты, ингибируют рост культуры клеток лейкемии in vitro /Adesida, A.; Edwards, L.G. and Thomalley, P.J. (1996) Food Chem. Toxicol., 34(4), 385-392. Xu, К. and Thomalley, P. J. (2000) Biochem. Pharmacol., 60(2), 221-231/ тормозят рост клеточных линий рака человеческой простаты /Chiao, J.W.; Chung, F.-L.; Krzeminski, J.; Amin, S.; Arshad, R.; Ahmed, T. and Conaway, C.C. (2000) International J. Oncology, 16(6), 1215-1219/. ФЭИТЦ-NAC ингибирует индуцированную бензпиреноы аденому легких у мышей /Yang, Y.M.; Conaway, С.С.; Chiao, J.W.; Wang, С.-Х.; Amin, S; Whysner, J.; Dai, W.; Reinhardt, J. and F.-L. Chung (2002) Cancer Res., 62(1), 2-7/. Однако, химический синтез природных ФЭИТЦ S-конъюгатов достаточно сложен. Более того, ФЭИТЦ - маслянистая жидкость с резким запахом, со свойствами лакриматора, и его использование в технологическом процессе изготовления профилактического средства таблетированной формы проблематично. В синтезе ФЭИТЦ используют водорастворимые соли тяжелых металлов. В результате производства ФЭИТЦ образуется большое количество жидких и твердых отходов, содержащих соль тяжелого металла и обладающих резким запахом.

Известны металлсодержащие производные дитиокабаматов и тиурамы, обладающие антинеопластическими свойствами, хорошо растворимые в воде, что позволяет их использовать внутривенно, причем при их применении в качестве лекарственного средства не отмечено никаких побочных эффектов /US 4938949/. Недостатком известных соединений, как правило, является их очень высокая токсичность.

В патенте США 6747061 описываются полученные синтетическим путем N-дитиокарбаматы близкие по структуре к предлагаемым соединениям, обладающие противоопухолевой активностью, в которых аминогруппа замещена арилалкилом или гетероциклилалкилом. Известные соединения обеспечивают лечение гиперпролиферативных нарушений, таких как рак, а также могут быть использованы для лечения воспалительных и сердечно-сосудистых заболеваний. Известные соединения соответствуют следующей структурной формуле:

Х - (линкер) - NH - S -(линкер 2) - Y,

где линкер 1 может означать -(СН₂)_n-группу,

линкер 2 может означать - (СН₂)_m-группу,

m - целое число от 0 до 12,

n = целое число от 0-4, предпочтительно целое число n=1, a m=1-3;

Х - означает арил, гетероциклил,

Y может означать группу -C(O)OR, где R - водород, низший алкил или замещенный низший алкил.

В указанном патенте раскрывается получение соединений общей формулы X-(CH₂)_n-NH-C(S)-S-(CH₂)_m-Y, где X и Y имеет вышеуказанные значения.

Наиболее близким аналогом является соединение, представленное в заявке 2007113880/04, 13.04.2007, однако исследование показало нестойкость соединений заявленной формулы при хранении, что существенно ограничивает их применение в качестве фармацевтической субстанции при создании профилактических и лечебных средств.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является изыскание соединений на основе производных дитиокарбамата, лишенных данных недостатков, т.е. устойчивых при хранении, обладающих необходимой физиологической активностью. Технический результат настоящего изобретения заключается в повышении стабильности заявленных соединений и их физиологической активности.

Согласно настоящему изобретению предлагается новое производное фенилэтилдитиокарбамата общей структурной формулы (I):

Изобретение также относится к способу получения фенилэтилдитиокарбамата структурной формулы (I), взаимодействием галогенорганической кислоты формулы (II) с фенилэтилдитиокарбаматом формулы (III),

Предлагается указанное средство применять для профилактики и лечения опухолевых заболеваний.

Процесс может быть осуществлен в условиях известного способа, описанного, например, в патенте США 6747061, с выделением или без выделения образующегося дитиокарбамата формулы (III). В настоящем патенте предлагается изменить порядок прибавления реактивов и вести процесс при контроле показателя рН реакционной смеси в диапазоне рН 9-11. При этом выход увеличивается с 40-60% (из литературных данных) до 80-90%. Взаимодействие дитиокарбамата формулы (III) с галогенорганической кислотой формулы (II) желательно проводить в водной среде, предварительно переведя, кислоту в соль в мягких условиях при взаимодействии с карбонатом натрия при температуре 20-30°С.Либо может быть использован соответствующий эфир или амид галогенорганической кислоты формулы (II). При этом выделение целевого продукта в виде кислоты обычно осуществляют добавлением к реакционной массе кислоты до рН 3-4. В этих условиях выход целевого продукта достигает 85-96%.

В отличие от ранее известных соединений, соединение настоящего изобретения не обладает неприятным запахом. Получаемое соединение, представляют собой порошок, обладающий слабым запахом крестоцветных, которое легко поддается таблетированию. В организме в результате метаболических превращений C-S связь предлагаемого соединения гидролизуется, при этом образуется производное изотиоцианата и соответствующее производное тиогликолевой кислоты. Помимо свойств, присущих производным изотиоцианатов, предлагаемый дитиокарбамат обладает дополнительными качествами, благодаря присутствию в нем остатка тиогликолевой кислоты, который связывают высокотоксичные водорастворимые соли тяжелых металлов. Дитиокарбамат согласно изобретению может также использоваться для выведения ионов тяжелых металлов, профилактики воздействия неблагоприятных факторов на людей, проживающих в экологически загрязненных районах, нейтрализации воздействия вредных веществ в промышленных условиях, особенно металлургической промышленности.

Соединение настоящего изобретения может быть получено по нижеследующей методике.

Пример

Сероуглерод объемом 303 мл интенсивно смешивают с 1290 мл водного 14% раствора аммиака. При охлаждении до 10-15°С к эмульсии в течении 30 минут прибавляют 3,25 моля соответствующего 2-фенилалкиламина. Суспензию перемешивают еще 30 минут. Смесь оставляют еще на 1 час. Суспензию постепенно растворяют в 6 л воды, подогревают до 30-40°С, получаемый раствор используют при проведении следующей стадии, не выделяя полученный соответствующий 2-феналкилдитиокарбамат.

Готовят раствор 408 г хлоруксусной кислоты в 430 мл воды и 230 г карбоната натрия в 1 л воды, постепенно добавляя к раствору хлоруксусной кислоты раствор карбоната натрия. Полученный раствор соли в течение 20 минут добавляют к раствору соответствующего 2-феналкилдитиокарбамата. После окончания добавления перемешивают еще 30 минут при комнатной температуре. К полученному раствору при постоянном перемешивании постепенно добавляют раствор соляной кислоты до рН 4. Суспензию перемешивают еще 10-20 минут, переносят на фильтр, фильтруют с помощью вакуума. Осадок промывают подкисленной дистиллированной водой, затем дистиллированной водой и высушивают под вакуумом.

Физико-химические свойства 2-фенилэтилдитикарбамата уксусной кислоты: Т_пл. - 116-118°С, УФ: λ_1мах - 251,5 нМ, λ_2мах - 270 нМ, λ_1min - 235 нМ, λ_2min - 263 нМ

Получают около 1 кг (3,9 моль) целевого продукта.

Выход - 90%.

Структура полученного продукта подтверждена данными ПК и ЯМР спектров.

Аналогичным образом получают сукцинимиддитиокарбамат натрия (без подкисления), выход 52%, Т_пл. - 92.5-93°С, фтальимиддитиокарбамат натрия (выход 65%, Т_пл. - 192.5-193*С).

Фенилэтилдитиокарбамат и его производные могут быть превращены в натриевые или аммонийные соли в результате действия соответствующих спиртовых растворов оснований в стехиометрических соотношениях на вышеуказанные соединения.

Все эти соединения хорошо растворимы в воде, легко чистятся перекристаллизацией. В результате получают целевой продукт обычно в виде порошка.

Для доказательства превращения производного дитиокарбамата в 2-фенилэтилизотиоцианат были проведены in vivo эксперименты на крысах.

Первой группе крыс однократно вместе с кормом (не содержащем крестоцветных) задавали 2-фенилэтилизоцианата в количестве 20 мг на животное. Второй группе с тем же кормом давали 2-фенилэтилдитиокарбамат аммония (П1), в количестве 26 мг на животное (в пересчете на аналогичное мольное количество изотиоцианата). Животных содержали по группам и собирали суточную мочу.

Анализ изотиоцианата в моче проводили по методу, описанному в /S.M. Getahum, F-L. Chung. (1999) Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, V.8, 447-451/. Этот метод основан на том, что изотиоцианат и его метаболиты взаимодействуют с 1,2-бензилдиолом с образованием циклического окрашенного продукта.

Результаты проведенных экспериментов показали, что в моче животных обеих опытных групп обнаруживается пик, соответствующий продукту реакции соответствующего изотиоцианата со специфическим реагентом. Согласно калибровочной кривой по 2-фенилэтилизотиоцианату, у крыс первой группы за сутки с мочой было выведено 25% потребленного с пищей изотиоцианата, а у животных второй группы - 7%. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об образовании в организме животных второй группы фенилэтилизотиоцианата или его физиологических метаболитов из соответствующего дитиокарбамата.

Для количественной оценки превращения дитиокарбаматов в метаболиты изотиоцианатов были проведены эксперименты с калибровкой концентрации по коньюгатам ФЭИТЦ в сыворотке крови.

Крысам вместе с кормом однократно давали 2-фенилэтилизотиоцианат (ФЭИТЦ), 2-фенилэтилдитиокарбамат аммония (П1) и 2-фенилэтилдитиокарбамата уксусной кислоты (Т) в расчете 1 г/кг живой массы (в молярном пересчете на изотиоцианат - 6 мМ, 4,7 мМ и 3,9 мМ на 1 кг живой массы соответственно). Контрольные животные не получали добавок. Кровь брали через час, три и пять часов (16 часов дополнительно - для П1) Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Определение 1,2-бензилдитиол активных продуктов в сыворотке крыс Добавка Контроль ФЭИТЦ П1 Т Проба К Ф1 Ф3 Ф5 П1 П3 П5 П16 Т1 Т3 Т5 Проба, мл 1,0 0,8 1,0 1,0 0,8 1,0 1,0 1,0 1,0 0,9 1,0 Абсорбция, ед 0,00 3 0,11 0,14 0,07 0,04 0,039 0,020 0,018 0,145 0,08 0,08 Конц. 0 >10 >10 >7 >5 5 2,5 2,5 >10 >7 >7 (мкМ)*                       Примечание: -*- по ФЭИТЦ

Показано, что в сыворотке крови крыс всех опытных групп после приема испытуемых веществ обнаружен продукт циклоконденсации - 1,3-бензилдитиол-2-тион, определяемый методом ВЭЖХ на 365 нм.

Концентрация суммарных реакционноспособных соединений на протяжении 3-х часов после приема превышала 5 мкМ с постепенным ее снижением.

Полученный результат может быть свидетельством успешного превращения 2-фенилэтилдитиокарбамата аммония и 2-фенилэтилдитиокарбамата уксусной кислоты в 2-фенилэтилизотиоцианат и продукты его метаболизма.

Эффективность профилактического действия предлагаемого препарата в отношении опухолей в печени продемонстрировано на фоне применения химического канцерогена - N-диэтил нитрозам и на (ДЭНА) (Nitrosodiethylamin (N-N)) в эксперименте на крысах-самцах линии Wistar. Сущность изобретения поясняется примером конкретного выполнения.

Пример. Для решения поставленной задачи были сформированы 2 группы крыс-самцов линии Wistar с живой массой 300 г по 25 животных в каждой. Крысам контрольной группы вводили внутрибрюшинно N-Nitrosodiethylamin (N-N) в дозе 30 мг/кг/неделя. Доза вводилась в 2 приема: понедельник и пятница. Животным опытной группы N-Nitrosodiethylamin (N-N) вводили аналогичным образом. Дополнительно крысам опытной группы препарат добавляли в питьевую воду из расчета, что с водой они получать 2 мг/кг массы тела/сутки. Прием препарата животные начинали за 3 недели до начала введения N-диэтил нитрозам и на для создания защитного фона в организме животного и далее в течение всего эксперимента. В ходе проведения эксперимента контролировали живую массу крыс. После вскрытия животных проводили взвешивание печени, визуальный подсчет опухолей на ее поверхности, фотографирование и дальнейший подсчет количества опухолей на единицу печени.

Результаты исследований показали, что препарат обладает противоопухолевым действием (табл.2). У крыс опытной группы, которым вводили препарат на фоне применения химического канцерогена, количество животных с индуцированными опухолями составило 8, а у самцов контрольной группы - 15. При этом у индуцированных опухолями животных при выпаивании с водой препарата отмечается достоверное снижение количества опухолей на поверхности печени по сравнению с контролем. Аналогичные данные получены в расчете на 10 г печени.

Таким образом, препарат обладает превентивным действием в отношении опухолей в печени крыс при химическом канцерогенезе. Препарат может быть использован в качестве профилактического средства, поскольку он малотоксичен и не обладает мутагенным действием.

Таблица 2 Количество опухолей в печени у крыс Показатели Группы контроль опыт Количество животных в группе 25 24 Масса крыс, г 301±2,96 305±3,41 Масса печени, г 12,9±0,08 13,3±0,07 Количество животных с индуцированными опухолями 15 8 Количество опухолей в печени 5,16±0,11 3,50±0,25* Количество опухолей в расчете на 10 г печени 4,05±0,29 2,63±0,21* Примечание - * р<0,01

Эффективность противоопухолевых и анти-метастатических свойств предлагаемого препарата показана в эксперименте на мышах-самцах гибридов первого поколения (F1) (СВА×С57В1/6) с имплантированной в лапку Карциномой Льюис. Сущность изобретения поясняется примером конкретного выполнения.

Пример. В исследованиях противоопухолевых и анти-метастатических свойств препарата были использованы 30 мышей-самцов F1 СВА×С57В1/6. В каждой группе было по 10 животных. В заднюю лапку животных имплантировали Карциному Льюис, в количестве ~10⁶ клеток (~0,2 см³). Препарат вводили per os, добавляя его в питьевую воду, которая давалась животным. Вводили соединение в двух схемах: в течение 3 недель только после имплантации и в течение 4 недель с началом введения предшествующим имплантации. Экспериментальные группы, доза и сроки введения указаны в таблице 3.

Таблица 3 Экспериментальные группы # Группы Схема введения препарата Кол-во животных 1 Контроль - 10 2 25 мг/кг До и после имплантации опухоли (схема 1) 10 3 Только после имплантации опухоли (схема 2) 10

Противоопухолевая и анти-метастатическая эффективность препарата оценивалась по изменению объема опухоли и количеству метастазов в легких. Количество метастазов оценивалось на 21-й день после имплантации опухоли (28-й день после начала введения препарата по 1-й схеме). Для этого у декапитированных под наркозом животных извлекали легкие и переносили последние в жидкость Буэна. Подсчет метастазов производился визуально. Объем новообразования оценивали по формуле эллипсоида (1). Сроки измерения: 7, 14 и 21 сутки после имплантации.

$$V=\pi \cdot \frac{d_1\cdot d_2\cdot d_3}{6}\begin{array}{ccc}& & \end{array}\left(1\right)$$

где d₁, d₂, d₃ - взаимно перпендикулярные размеры опухоли.

Результаты проведенных исследований показали, что введение животным препарата значительно снижает у них объем опухоли по сравнению с контрольной группой (табл.4) уже через 7 суток. Для опытных групп отмечены достоверные отличия от контроля.

Таблица 4 Изменение объема опухоли у животных в зависимости от схемы введения препарата ¹ Доза и схема введения Сутки после начала введения препарата 1 7 15     V, мм³ 1 Контроль 39±10 891±98 2832±170 2 25 мг/кг До и после имплантации 41±14 598±88 2245±159 ² 3 После имплантации 37±9 674±100 2410±112 ^{2 2} - р<0,05
Примечание: ¹ Здесь и далее объем опухоли указан мм³, ее размер в мм, вес тела в граммах, после знака ± дается ошибка среднего значения.
² По критерию Стьюдента при сравнении с контрольной группой.

Удлинение курса введение препарата до четырех недель, с началом за одну до имплантации опухоли, приводило к уменьшению объема опухоли на 7%.

Количество метастазов в легких достоверно отличалось от контроля только у мышей 3-й группы, которым препарат в дозе 25 мг/кг вводили непосредственно после имплантации (табл.5).

Таблица 5. Количество метастазов в легких в зависимости от схемы введения препарата

Доза и схема введения   1 Контроль 39,8±3,8 2 25 мг/кг До и после имплантации 32,8±4,3 3 После имплантации 29,6±2,9²

Таким образом, установлено, что предлагаемый препарат обладает способностью ингибировать рост карциномы Льюиса у мышей. Введение соединения в течение 1 недели до перевивки опухолей усиливает эффективность препарата. Также отмечено, что препарат в дозе 25 мг/кг массы животных достоверно снижает количество метастазов в легких при введении после имплантации опухоли.

Изобретение относится к новому соединению - производному дитиокарбаминовой кислоты структурной формулы (I):

Изобретение также относится к способу получения указанного соединения путем взаимодействия галогенорганической кислоты формулы (II) с дитиокарбаматом общей формулы (III):

Технический результат: получено новое соединение, которое может найти применение в медицине, фармакологии, в производстве биологически активных добавок и лекарственных препаратов с противоопухолевым действием, в частности в отношении лейкемии и для лечения и профилактики рака легких и рака молочной железы. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. 2-Фенилэтилдитиокарбамат уксусной кислоты структурной формулы (I):

2. Способ получения 2-фенилэтилдитиокарбамата структурной формулы (I) по п.1, взаимодействием соответствующей галогенорганической кислоты формулы (II) или ее эфира или амида с дитиокарбаматом общей формулы (III)

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в случае использования кислоты формулы (II) процесс ведут в водной среде при добавлении карбоната натрия при температуре 20-30°С и целевой продукт выделяют при подкислении реакционной смеси до рН-4.