СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ АУТОАНТИТЕЛА К МУСКАРИНОВОМУ М2-РЕЦЕПТОРУ Российский патент 2013 года по МПК C07K14/705 A61K38/17 G01N33/53 A61P9/06 

Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии, и служит для определения аутоантител, специфичных к мускариновому М2-рецептору, которое может быть использовано для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма.

Фатальные нарушения ритма и проводимости сердца являются одной из главных причин внезапной сердечной смерти в развитых странах ([1] - Zheng Z., Croft J., Giles W., MensahG. Sudden cardiac death in the United States, 1989 to 1998. Circulation 2001; 104: 2158-2163). Наиболее часто встречающейся формой нарушения ритма сердца является мерцательная аритмия (МА), которая обычно возникает как осложнение различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. Однако в 10-30% случаев даже при тщательном клинико-инструментальном обследовании пациентов с аритмиями и блокадами сердца выявить причину подобных нарушений не удается, т.е. МА проявляется у пациентов без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы ([2] - Бекбосынова М.С. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М: ФГУ РКНПК, 2007). В этих случаях аритмию принято квалифицировать как «идиопатическую». В ряде исследований показана вероятность развития у таких пациентов вторичной, аритмогенно обусловленной, кардиомиопатии с ухудшением сократительной функции миокарда, которая восстанавливается при хирургическом или медикаментозном устранении аритмии ([3] - Ардашев А.В., Склярова Т.Ф., Шаваров А.А. Особенности центральной гемодинамики у пациентов с идиопатическими нарушениями ритма сердца из области выходного тракта правого желудочка до радиочастотной катетерной аблации и в течение года после нее. Кардиология 2009; 3: 4-9, [4] - Chugh S.S., Shen W - K., Luria D.M. First evidence of premature ventricular complex-induced cardiomyopathy: a potentially reversible cause of heart failure. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 2000; 11: 328-329). Есть клинические описания развития аритмогенной дисплазии правого желудочка через 15 лет от момента выявления у пациентов «идиопатической» желудочковой экстрасистолии ([5] - Kuhn А., Kottkamp Н., Thiele Н. Idiopathic right ventricular tachycardia or arrythmogenic right ventricular tachycardia? Dtsch. Med. Woch. 2000; 25 (22): 692-697). Эти и другие данные позволяют предположить, что «идиопатические» нарушения ритма могут быть первым, наиболее ранним проявлением заболеваний сердца.

В настоящее время установлено, что аутоантитела, обнаруженные в сыворотках крови больных с аритмиями и острой сердечной недостаточностью, являются антителами к собственным антигенам, целому ряду рецепторов, в частности к β₁-адренорецептору, белку мускаринового М2-рецептора и др., что свидетельствует об аутоиммунном характере данного спектра заболеваний ([6] - Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy.// Artificial Organs. - 2004.- V.28(2).-P.171-181). Большинство аутоантител является иммуноглобулинами класса G (IgG) с молекулярной массой около 150 кДа.

Опубликованые данные свидетельствуют о том, что у больных с постоянной формой «идиопатической» МА антитела к мускариновому М2-рецептору присутствуют в 3 раза чаще, чем у здоровых лиц ([7] - Chiale Р.А, et al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001;103(13):1765-71). Добавление сыворотки крови, содержащей антитела к мускариновому М2-рецептору к изолированным сердцам лабораторных животных и куриным эмбрионам, вызывало снижение частоты сердечных сокращений и индукцию суправентрикулярных аритмий ([8] - Baba A., Yoshikawa Т., Fukuda Y., Sugiyama Т. et al. Autoantibodies against M2-muscarinic acetylcholine receptors: new upstream targets in atrial fibrillation in patients with dilated cardiomyopathy.// Eur. Heart. J. 2004; 25: 1108-1115). Таким образом, есть основания полагать, что аутоиммунные механизмы, в частности, действие аутоантител к мускариновому М2-рецептору, могут способствовать возникновению и сохранению МА у пациентов без органического заболевания сердца.

В связи с вышесказанным, определение уровня антител к мускариновому М2-рецептору чрезвычайно важно для диагностики нарушений ритма и проводимости сердца у больных без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы.

Из уровня техники известны синтезированные пептиды из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, соответствующие линейным участкам 171-182 и 168-192 данного белка, которые были использованы для изучения активности антител к мускариновому М2-рецептору ([9] - Elies R. et al. Immunochemical and functional characterization of an agonist-like monoclonal antibody against the M2 acetylcholine receptor. //Eur. J. Biochem. l998; 251:659-666). Также использовался для наработки антипептидных антител и скриннинга сывороток больных с различными сердечно-сосудистыми патологиями пептид, соответствующий последовательности 169-193 второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора ([8], [10] - Fu L.X. et al. Localization of a Functional Autoimmune Epitope on the Muscarinic Acetylcholine Receptor-2 in Patients with Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. // J. Clin.Invest. 1993; 91:1964-1968).

Подробное исследование ИФА с использованием пептида, соответствующего последовательности 169-193 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, дано в статье [8]. Показано, что в ИФА с использованием данного пептида антитела к мускариновому М2-рецептору были обнаружены у 40% пациентов с дилатационной кардиомиопатией и 23% пациентов с идиопатическими нарушениями ритма.

Таким образом, наиболее близким к заявляемому синтетическому антигену является индивидуальный пептид, соответствующий последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора [8, 10].

Недостатком используемого пептида является его ограниченная специфичность, так как с данным пептидом могут реагировать только аутоантитела, направленные к соответствующей этому пептиду антигенной детерминанте 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора. В то же время у больных с идиопатическими патологиями сердца аутоантитела могут быть направлены как к 1-й, так и ко 2-й петлям, а также к комплексу двух петель, сближенных в природной молекуле мускаринового М2-рецептора ([11]. - Johren К., Holtje H.-D. A model of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor.// J. Comp. - Aided Mol.Design. 2002; 16:795-801). Таким образом, ограниченная антигенная специфичность последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, в свою очередь, объясняет заниженную чувствительность (количество положительных ответов) ИФА крови больных с использованием данного пептида. Кроме того, данный пептид характеризуется плохой растворимостью в водных буферных системах, обусловленной присутствием кластера гидрофобных аминокислотных остатков, что также может отрицательно сказываться на чувствительности к данному пептиду.

Задачей и техническим результатом изобретения является создание конформационного антигена, обладающего более высокой специфичностью к аутоантителам и лучшей растворимостью в водных буферных системах, а также способов диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма с использованием созданного антигена.

Изобретение поясняется диаграммой (фиг.1), на которой представлен уровень аутоантител у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы к антигенам мускаринового М2-рецептора.

Поставленная задача решается тем, что синтетический антиген, обладающий способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающий пептид, соответствующий аминокислотной последовательности из второй внеклеточной петли белка мускаринового М2-рецептора, согласно изобретению содержит пептид, соответствующий аминокислотной последовательности из первой внеклеточной петли белка мускаринового М2-рецептора, сшитый с пептидом второй внеклеточной петли дисульфидной связью. При этом линейная аминокислотная последовательность из первой петли белка содержит Cys⁹⁶, а линейная аминокислотная последовательность из второй петли белка содержит Cys¹⁷⁶. Наилучший результат достигается при использовании линейной аминокислотной последовательности из первой внеклеточной петли белка, содержащей фрагмент (83-98), и линейной аминокислотной последовательности из второй внеклеточной петли белка, содержащей фрагмент (171-182).

Поставленная задача решается также созданием способа получения синтетического антигена, обладающего способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающего синтез пептидов из первой и второй внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, и сшивку синтезированных пептидов посредством реакции тиол-дисульфидного обмена. При этом реакцию тиол-дисульфидного обмена осуществляют взаимодействием тиола пептида последовательности 83-98 и S-пиридинсульфенильного производного пептида последовательности 171-182 в водно-органической среде при рН 8-8.5.

Поставленная задача решается также созданием набора для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающий указанный синтетический антиген и сорбент для нанесения антигена.

Поставленная задача решается также разработкой способа диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающего исследование крови пациента с использованием указанного набора для диагностики методом ИФА.

Таким образом, поставленная задача решается за счет создания искусственного конформационного антигена, который включает в себя пептидные фрагменты из двух внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, сшитые дисульфидной связью, и который способен связывать аутоантитела к данному рецептору с чувствительностью, превышающей таковую для линейного прототипа или механической смеси данных линейных пептидных фрагментов. При этом синтетический антиген представляет собой индивидуальное химическое соединение, содержащее пептид, соответствующий последовательности 1-й внеклеточной петли и пептид из 2-й внеклеточной петли, соединенные дисульфидной связью между остатками Cys⁹⁶ и Cys¹⁷⁶.

Заявляемый синтетический антиген может быть использован для создания диагностического набора для выявления антител к мускариновому М2-рецептору в крови пациентов с идиопатическими аритмиями методом ИФА, подробное описание которого представлено ниже. При этом в качестве сорбента может быть применен стандартный 96-луночный полистироловый планшет.

Заявляемое техническое решение характеризуется неочевидностью, т.к. в ряду пептидов и их аналогов не существует четкой взаимосвязи между структурой и активностью, поэтому способность заявляемого синтетического антигена связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору не является очевидной. В случае линейных эпитопов, в частности прототипа, антигенность можно предсказать, используя компьютерные программы для анализа аминокислотной последовательности белка ([12] - Норр N., Woods К. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 72. 72. P.3824-3828). Для поиска конформационных антигенных эпитопов используют сложную и дорогостоящую технологическую методологию, сопряженную с синтезом, выделением и тестированием десятков полипептидов ([13] - Евстигнеева Р.П., Палькеева М.Е. Методы поиска антигенных детерминант для белков с известной первичной структурой// Биоорг. химия. 2000, 26(4):243-262). Заявляемый конформационный антиген получают методологически значительно более простым способом. Он представляет собой искусственную конструкцию, не являющуюся линейным эпитопом, включающую в себя 2 фрагмента мускаринового М2-рецептора (например, 83-98 и 171-182), далеко отстоящие друг от друга и соединенные в одну молекулу с помощью направленного замыкания дисульфидного мостика между фрагментами 83-98 и 171-182 мускаринового М2-рецептора. Дисульфидная связь в заявляемом антигене образована между остатками цистеина 96 и 176. По данным наших исследований, любые пептиды из данных петель, содержащие остатки Cys⁹⁶ и Cys¹⁷⁶, способны связывать антитела к мускариновому М2-рецептору, в той или иной степени воспроизводя свойства белка. Наиболее оптимальный результат был достигнут при выборе последовательности 83-98, соответствующей 1-й внеклеточной петле т.к., с одной стороны, данный фрагмент состоит из 16-ти аминокислотных остатков, и синтез его легко осуществим; а, с другой стороны, меньшая длина пептида сопряжена с его пониженной иммуногенностью. Выбор последовательности 171-182 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, близкой к прототипу, обусловлен тем, что этот фрагмент лишен того кластера гидрофобных аминокислотных остатков, который есть в пептиде-прототипе, что повышает растворимость антигена в водных буферных системах, применяемых в тестах. В пользу такой оптимальной конструкции искусственного антигена говорит тот факт, что синтезированный конформационный антиген оказался значительно лучше растворим в водных буферных системах, чем пептид-прототип, практически нерастворимый в воде, и чем пептиды - составные части искусственного антигена.

Синтез пептидов последовательности 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (гексадекапептид) и последовательности 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (додекапептид), может быть осуществлен по стандартной технологии синтеза на твердой фазе ([14] - Barany G., Merrifild R.B. Solid phase synthesis.// The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V 2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. // Ed. E. Gross, J. Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P. 3-254) с использованием Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил) - методологии на полимере Ванга.

Ниже представлено подробное описание синтеза пептидов последовательности 83-98 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (гексадекапептид) и последовательности 171-182 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора. Для синтеза пептидов были использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIPEA (N-изопропил-N-этиламин), НОВТ (1-гидроксибензотриазол), TBTU (N, N, N', N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил) урония тетрафторборат), TIB S (триизобутилсилан) фирмы Fluka (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, 4-метилпиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту (Applied Biosystems, США). DMF (N,N-диметилформамид) очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутияъную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильных функций серина, треонина и тирозина; тритильную (Trt) группу для карбоксамидной функции глутамина и сульфгидрильной функции цистеина. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием в качестве конденсирующего реагента TBTU с добавкой 1-гидроксибензотриазола в присутствии DIPEA.

Синтез пептидов проводили с С-конца в соответствии с нижеприведенным протоколом твердофазного синтеза. Синтез проводили в ручном режиме, исходя из 0.6 ммоль Fmoc-аминоацилполимера (Bachem, Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария). В Таблице 1 представлен Протокол твердофазного синтеза пептидов с описанием последовательности реализуемых стадий.

Таблица 1 Протокол твердофазного синтеза пептидов № Операция Реагент Время обработки Цикл 1 - n 1 Промывка 5×DMF или 5×DMF/NMP (N-метилпирролидон) (1:1) 3 мин 2 Деблокирование α-аминогрупп 25% 4-Ме Pip/DMF или DMF/NMP (1:1) 10 мин 3 Промывка 5×DMF или 5×DMF/NMP (1:1) 3 мин 4 Активация 1 ммоль Fmoc-AA+1 ммоль TBTU+1 ммоль НОВТ+2 ммоль DIPEA в NMP/DMF 20 мин 5 Конденсация 1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP/DMF 90 мин 6 Промывка 5×NMP 3 мин 7 Тест Кайзера с нингидрином на наличие незамещенных аминогрупп 3% раствор нингидрина в бутаноле, 100°С 5 мин 8 При наличии в пептидилполимере свободных аминогрупп операции 4-6 повторяются    

Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Линейные гексадекапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография) до 97-98% чистоты. Аналитическую ВЭЖХ проводили на проводили на хроматографах (Gilson, Франция) и Knauer (ФРГ). Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Applied Biosystems (Германия), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA (трифторуксусная кислота). Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил и изопропиловый спирт фирмы Раnrеас (Испания).

Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Диасорб С16 (РФ) и Spherisorb ODS (США) (4,6×250 мм) с сорбентами С18 с размером пор порядка 100А - Nucleosil С18 и Kromasil 100-5 С18, на хроматографе фирмы Gilson (Франция). Для анализа синтетического антигена кроме этих сорбентов использовали Vydac С18 с размером пор 300А. В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, рН 2.0, буфер Б - 80% ацетонитрила или изопропанола в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.

Синтезированные пептиды характеризовали данными ¹Н-ЯМР-спектроскопии (¹Н-ЯМР- спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d (d6 - дейтерированный диметилсульфоксид) при 300°К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл, химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана) и масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе VISION 2000, Termobioanalysis corp., Finnigan, США).

Синтез заявляемого синтетического антигена осуществляли с помощью реакции тиол-дисульфидного обмена между предшественниками - гексадекапептидом (83-98) и додекапептидом (171-182), взятыми в эквимолярном соотношении. При этом Cys¹⁷⁶ додекапептида (171-182) защищали временной 2-пиридинсульфенильной (PyS) защитной группой ([15] - Andreu D., Albericio F., Sole N.A., Munson M.C., Ferrer M., Barany G. // Peptide Synthesis Protocol. Eds. M.W. Pennington, B.M. Dunn. New Jersey, Totowa: Humana Press Inc. 1994. P. 91-169; [16] - Сидорова M.В., Палькеева M.E., Молокоедов А.С, Азьмуко А.А., Секридова А.В., Овчинников М.В., Левашов П.А., Афанасьева О.И., Берестецкая Ю.В., Афанасьева М.И., Разова О.А., Беспалова Ж.Д., Покровский С.Н., Синтез и свойства нового конформационного антигена, моделирующего внеклеточную часть β1-адренорецептора // Биоорг. химия. 2009, 35 (3): 311-322), которая снимается при действии тиольной группы Cys⁹⁶ гексадекапептида (83-98) с образованием дисульфида.

Реакция тиол-дисульфидного обмена, использованная для получения заявляемого синтетического антигена, ранее была предложена для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей в линейных пептидах в водных средах [15]. При синтезе заявляемого антигена данный способ был использован для сшивки разных пептидных фрагментов, удаленных друг от друга в белке, а также была проведена данная реакция в водно-органической среде при рН 8-8.5.

Сравнительный анализ биологической активности заявляемого синтетического антигена, пептида-прототипа последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, а также пептидов - предшественников I и II, являющихся составными частями заявляемого синтетического антигена, проводили в одинаковых условиях унифицированным непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА) ([17] - Principles and practice of immunoassay, Sec. edition, ed. Price C.P., Newman D.J., London, Macmillan Reference Ltd, 1997), используя клинически охарактеризованную панель сывороток пациентов. Методика и условия постановки ИФА были аналогичны описанным в литературе [8-10]. Антиген-пептид сорбировали на твердую фазу - полистироловый планшет для ИФА. Аутоантитела, содержащиеся в исследуемой сыворотке крови, после взаимодействия с антигеном на твердой фазе определяли с помощью моноклональных антител к иммуноглобулинам человека, ковалентно меченых ферментом-пероксидазой из хрена. Ферментативная активность, определяемая в колориметрической реакции пероксидазы с хромогеном, была прямо пропорциональна концентрации определяемых антител. Ниже, в Примере 4, представлено подробное описание иммуноферментного анализа связывания заявляемых пептидных синтетических антигенов с аутоантителами к мускариновому-М2 рецептору и полученных результатов сравнительного анализа биологической активности заявляемого синтетического антигена и пептида-прототипа.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Синтез додекапептида последовательности 83-98 из 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (предшественник I).

Твердофазный синтез H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (предшественник I) проводили, исходя из 1.0 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0.75 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом.

Заключительное деблокирование и отщепление гексадекапептида (I) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего гексадекапептидилполимера смесью 20 мл TFA, 0.5 мл Н₂O, 0.5 мл TIBS и 0.5 мл 2-меркаптоэтанола в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой холодный эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.65 г сырого продукта (I), содержащего, по данным ВЭЖХ, 54% целевого пептида.

Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Applied Biosystems (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.25 г (21% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (I). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии: Туг 2, Thr 1, Не 1, Val 3, Gly 2, Pro 2, Leu 2, Asp 1, Trp 1, Cys 1. Масс-спектр: m/z: 1794.5 [M+H]⁺, вычислено 1795.7, для C₈₇H₁₂₇N₁₇O₂₂S₁.

Пример 2. Синтез додекапептида последовательности 171-182 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора H-Val¹²¹-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys¹⁷⁶(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser¹⁸²-OH (предшественник II_Pys).

Стадия 1. Твердофазный синтез H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II) проводили, исходя из 1.0 г Fmос-Sеr(Вu^t)-полимера, содержащего 0.6 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом.

Заключительное деблокирование и отщепление додекапептида (II) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего гексадекапептидилполимера смесью 20 мл TFA, 0.5 мл Н2О, 0.5 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой холодный эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.63 г сырого продукта (II), содержащего, по данным ВЭЖХ, 82% целевого пептида.

Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Applied Biosystems (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.22 г (24.9% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (II). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 95%. Аминокислотный состав по данным ¹Н-ЯМР-спектроскопии: Val 1, Glu 2, Asp 1, Gly 1, Cys 1, Туr 1, He 1, Gin 1, Phe 2, Ser 1. Масс-спектр: m/z 1436.4, 1474.3 [M+K]⁺, вычислено 1436.6 для C₆₅H₈₉N₁₃O₂₂S.

Стадия 2. Получение додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II_PyS).

К раствору 0.02 г (0.016 ммоль) додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II) в 8 мл смеси ацетонитрила и 0.1% водного раствора трифторуксусной кислоты (8:2) прибавляли раствор 10 мг (Pys)₂ в 2 мл ацетонитрила и выдерживали 16 ч при 20°С. Исчезновение исходного пептида контролировали с помощью аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil 4.6×250 мм, размер зерна сорбента 5 мкм; подвижная фаза - буфер А: 0.1% TFA, буфер Б: 80% ацетонитрил в буфере А; пептиды элюировали градиентом Б в А от 30 до 90% за 30 мин со скоростью 1 мл/мин, детекция при 226 нм. Время удерживания (I) - 13.56 мин, время удерживания (II_PyS) - 14.21 мин). Реакционную смесь упаривали досуха, для удаления избытка (PyS)₂ и пиридин-тиола (контроль ВЭЖХ), остаток несколько раз растирали с сухим эфиром, эфир декантировали. Полученный продукт хроматографировали на колонке с колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS, 10×250 мм, в условиях, описанных для стадии 1. Получено 0.015 г Н-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II_PyS) с чистотой 98%.

Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя гексадекапептид (83-98) и додекапептид (171-182) из последовательности мускаринового М2-рецептора, соединенные дисульфидной связью.

К раствору 0.015 г додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II_PyS) 2.5 мл смеси 0.1 М ацетата аммония рН 6.8 и изопропилового спирта (4:1) прибавляли раствор 0.015 г гексадекапептида H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (I) в 4 мл смеси того же буфера и спирта (1:1), доводили рН до 8-8.5 раствором гидроокиси аммония и выдерживали при 20°С 5-8 ч. Для контроля происходящих превращений использовали тест на свободную SH-группу с реактивом Эллмана и аналитическую ВЭЖХ.

По окончании реакции рН реакционной смеси доводили до 4 уксусной кислотой, спирт упаривали, остаток хроматографировали на колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS, 10×250 мм, размер зерна сорбента - 10 мкм, подвижная фаза: буфер А - 0.1М NH₄OAc, рН 6.8, буфер Б - 40% водный изопропиловый спирт. Целевой продукт элюировали градиентом буфера Б в буфере А от 0 до 30% за 10 мин, далее от 30 до 90% за 60 мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, собирали, спирт упаривали, остаток лиофилизировали. Получено 0.01 мг (37.3%) синтетического антигена. Масс-спектр, m/z: 3228.5 [М+Н⁺]. Вычислено 3228.8 для C₁₅₂H₂₁₆N₃₀O₄₄S₂.

Пример 4. Описание методики проведения иммуноферментного анализа пептидных антигенов.

Перед проведением анализа выдерживали компоненты набора при комнатной температуре (18-25°С) не менее 30 мин.

1. Для иммобилизации пептидных антигенов на планшетах для проведения ИФА пептид растворяли в концентрации 2 мМ в КББР (0,05 М Na-карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,6). Вносили в лунки планшетов по 100 мкл раствора пептида и инкубировали 16-20 часов при +20-25°С.

Для удаления несвязанных антигенов и блокирования неспецифических реакций лунки планшета промывали ФСБ-Т (0,01М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20) с БСА (бычьим сывороточным альбумином) в концентрации 5 г/л.

3. Вносили пипеткой во все лунки планшета по 80 мкл буферного раствора для разведения образцов.

4. Вносили пипеткой в соответствующие лунки по 20 мкл подготовленных образцов. Закрывали планшет крышкой и инкубировали его в термостате при температуре 37°С в течение 60±2 мин.

5. Промывали планшет раствором для отмывки с помощью устройства для отмывки планшета не менее 4-х раз.

6. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора коньюгата, индивидуально подобранного для каждого антигена.

7. Закрывали планшет крышкой и инкубировали его в термостате при температуре 37°С в течение 30±2 мин.

8. Промывали планшет раствором для отмывки с помощью устройства для отмывки планшета не менее 4-х раз.

9. Вносили в лунки по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси. Субстратная смесь готовилась непосредственно перед внесением в лунки. К 7 объемам субстратного буферного раствора добавляли 1 объем раствора ТМБ (тетраметилбензидина), тщательно перемешивали полученную смесь. Данный раствор хранили при комнатной температуре не более 5 мин.

10. Закрывали планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 20±1 мин.

11. Вносили в лунки по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь.

12. В течение 5 мин после добавления стоп-реагента просчитывали планшет на фотометре для ИФА при длине волны 450 нм.

Положительными образцами считались образцы, оптическая плотность (ОП_крит.) которых была равна или более суммы среднего значения оптической плотности плюс удвоенное значение стандартного отклонения по выборке с исключенными значениями, выходящими за рамки нормального распределения:

ОП_крит=ОП_cред+2×станд. откл

Уровень аутоантител представлен в результатах как отношение оптической плотности (ОП) А₄₅₀ иммуноферментной реакции исследуемого образца к ОП_крит.

Далее представлено описание способа выявления аутоантител к мускариновому рецептору.

Для доказательства способности синтетического антигена, не являющегося линейным эпитопом, как описанный прототип, связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору было проведено определение уровня аутоантител IgG и IgM классов на большой панели больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Результаты чувствительности ИФА для определения аутоантител представлены в таблице 2.

Таблица 2 Уровень аутоантител к антигенам мускаринового М2-рецептора у пациентов с органическими заболеваниями сердца Антиген Аутоантитела IgG класса Аутоантитела IgM класса   Количество образцов % позитивных результатов Количество образцов % позитивных результатов Пептид последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (прототип) 611 6,5 578 10,0 Синтетический антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью 150 9,0* 150 16,8*

Представленные результаты показывают, что чувствительность ИФА с использованием в качестве антигена синтетического пептида, включающего в себя предшественники I и II, сшитые дисульфидной связью, достоверно выше (вероятность F-тест *р<0,05), чем в случае использования линейного пептида с последовательностью 168-192 (прототипа). Это различие показано как для аутоантител IgG класса, так и для аутоантител IgM класса.

Литературные данные [8-10] свидетельствуют о возможности применения пептидов, соответствующих последовательностям 168-192 (прототип) и 169-193 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора для диагностики повышения уровня аутоантител к мускариновому М2-рецептору у больных кардиомиопатией, патологией с выраженными органическими поражениями. Об этом же свидетельствуют результаты собственных исследований авторов, приведенные в таблице 2. Однако важно было сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом последовательности 168-192 (прототипом) для определения уровня антител IgG-класса к мускариновому М2-рецептору у больных с аритмиями без признаков органического заболевания сердца. Сравнительный анализ биологической активности прототипа и заявляемого синтетического антигена проводили в унифицированных условиях. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Аутоантитела у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Антиген Аутоантитела IgG класса   Количество образцов %позитивных результатов Пептид последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (прототип) 91 18,7 Синтетический антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью 126 25,4*

Как видно из приведенных результатов, заявляемый синтетический антиген, включающий в себя пептиды-предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью, позволяет обнаружить достоверно (вероятность F-тест *р<0,05) большее число пациентов с повышенным уровнем аутоантител по сравнению с пептидом последовательности 168-192 из 2-й петли мускаринового М2-рецептора (прототипом).

При этом заявляемый антиген более специфичен при определении аутоантител к фрагментам мускаринового М2-рецептора у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердца, чем у больных с установленными сердечно-сосудистыми заболеваниями, поскольку позволяет с большой долей достоверности (вероятность F-тест р<0,001) определять большее число пациентов с повышенным уровнем аутоантител - 25,4% против 9% (таблица 2).

Прямым подтверждением влияния структурных особенностей заявляемого антигена на способность к связыванию аутоантител является следующий модельный эксперимент. В описанном ИФА методе на планшет сорбировали: 1) пептид-предшественник I, 2) пептид-предшественник II 3) механическую смесь пептидов-предшественников I и II, 4) заявляемый антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью. Для сорбции антигены брали в концентрации 2 мМ, в механической смеси пептидов I и II брали по 1 мМ каждого пептида. Уровень IgG аутоантител определяли у 16 больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Результаты эксперимента представлены на диаграмме (фиг.1). На диаграмме представлены следующие обозначения: 1 - предшественник I, 2 - предшественник II, 3 - механическая смесь предшественников I и II, 4 - заявляемый антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью, р* - вероятность сходства с заявляемым пептидом по F-тесту.

Таким образом, модельный эксперимент наглядно подтверждает, что заявляемый антиген обладает принципиально иными функциональными свойствами, нежели механическая смесь его составных структур, что подтверждает предположение о том, что антитела более специфичны к конформационным эпитопам, образованным линейными эпитопами, сближенными в молекуле белка благодаря дисульфидной связи. Кроме того, лучшая по сравнению с прототипом растворимость заявляемого синтетического антигена позволяет использовать его для создания более точных диагностических наборов для обнаружения аутоантител к мускариновому М2-рецептору в крови больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Заявляемый синтетический антиген может быть использован для ранней диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.

Изобретение предназначено для определения аутоантител, специфичных к мускариновому М2-рецептору, которое может быть использовано для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма. Создан искусственный конформационный антиген, включающий в себя пептидные фрагменты из двух внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, сшитые дисульфидной связью, и который способен связывать аутоантитела к данному рецептору с чувствительностью, превышающей таковую для линейного прототипа или механической смеси данных линейных пептидных фрагментов. Синтетический антиген представляет собой индивидуальное химическое соединение, содержащее пептид, соответствующий последовательности 1-й внеклеточной петли и пептид из 2-й внеклеточной петли, соединенные дисульфидной связью между остатками Cys⁹⁶ и Cys¹⁷⁶ (структура антигена раскрыта в формуле и описании). Описаны способы получения и использования антигена по изобретению для создания диагностического набора для выявления антител к мускариновому М2-рецептору в крови пациентов с идиопатическими аритмиями методом ИФА. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Синтетический антиген, обладающий способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающий пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям (83-98) из первой внеклеточной петли и (171-182) из второй внеклеточной петли из белка мускаринового М2-рецептора, сшитые дисульфидной связью между остатками Cys⁹⁶ и Cys¹⁷⁶:

2. Способ получения синтетического антигена по п.1, обладающего способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающий твердофазный синтез пептидов: I - H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH) (83-98) из первой и II - H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (171-182) из второй внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, получение S-пиридинсульфенильного производного пептида
сшивку последнего с пептидом I, взятым в эквимолярном количестве, посредством реакции тиол-дисульфидного обмена.

3. Способ по п.2, характеризующийся тем, что реакцию тиол-дисульфидного обмена осуществляют в водно-органической среде при рН 8-8.5.

4. Набор для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающий синтетический антиген по п.1 и сорбент для нанесения антигена.

5. Способ диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающий исследование крови пациента с идиопатической аритмией с использованием набора для диагностики по п.4 методом ИФА, путем сорбции на 96-луночный планшет заявляемого синтетического антигена и определения уровня связывания с ним аутоантител к мускариновому М2-рецептору, регистрируемому по изменению оптической плотности исследуемого образца.